Спосіб отримання фракції мононуклеарних клітин кісткового мозку собак із високою проліферативною активністю

Спосіб отримання фракції мононуклеарних клітин кісткового мозку собак із високою проліфе 3 50905 нюється центрифугування у градієнті щільності 1,074 і відцентровій силі 1200g. Отже, згідно запропонованого способу можна відділити мононуклеарні клітини від еритроцитів; отримати фракцію мононуклеарних клітин з високою проліферативною активністю; отримати аспірат кісткового мозку. Спосіб здійснюють наступним чином: в умовах стерильного боксу потрібно відмити в фосфатнобуферному розчині жовтий кістковий мозок від червоного. Жовтий кістковий мозок перенести в пробірку об'ємом 15см3 та поставити на 12годинну холодну трипсинізацію (температура 24°С) в 0,25% р-ні трипсину у співвідношенні 1:3. Потім необхідно трипсинізований жовтий кістковий мозок розпіпетувати та профільтрувати через 2 шари стерильної марлевої серветки для видалення клітинних агрегатів. Отриману суспензію клітин відцентрифугувати при 300g протягом 5хв. Злити надосадову рідину (розчин трипсину), до осаду клітин додати 1см3 фосфатно-буферного розчину, клітини розпіпетувати. До суспензії отриманих клітин додати фосфатно-буферний розчин або середовище для культивування клітин у співвідношенні 7:1 (6см3 фосфатно-буферного розчину чи культурального середовища +1см3 суспензії клітин). Потім обережно нашарувати 7см3 розведеної суспензії клітин на розчин фіколу з градієнтом щільності 1,074 та об'ємом 2см3, попередньо внесеного в стерильну центрифужну пробірку об'ємом 15см3. Відцентрифугувати при 1200g протягом 25хв. Після центри Комп’ютерна верстка О. Рябко 4 фугування зняти верхній шар над осадової рідини, не порушуючи цілісності розташованого нижче шару мононуклеарних клітин. Обережно перенести шар мононуклеарних клітин в нову стерильну 3 пробірку, додавши до нього 10см фосфатнобуферного розчину. Клітини розпіпетувати та відцентрифугувати при 300g протягом 5хв. Для подальшого застосування ресуспензувати осад клітин у відповідній кількості поживного середовища. При проведенні досліду, було апробовано градієнти щільності (1,078; 1,076; 1,074; 1,072; 1,070) при різній відцентровій силі центрифугування (300g; 1200g). Фракції мононуклеарних клітин, отриманих при різних параметрах центрифугування, культивували у живильному середовищі (DMEM - 80%, ембріональна сироватка теляти - 20%). Оцінку результату досліду здійснювали через 12 діб культивування на основі проліферативної активності отриманих фракцій клітин. Параметри центрифугування з градієнтом щільності 1,074 та відцентровою силою 1200g забезпечують отримання фракції клітин з найвищою проліферативною активністю. Таким чином, розроблено спосіб отримання фракції мононуклеарних клітин кісткового мозку собак, збагаченої популяцією МСК, який може бути використаний для напрацювання біологічного матеріалу з метою подальшого його застосування при корекції репаративних процесів в тваринному організмі. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601