Спосіб отримання аскоспор фітопатогенного гриба diaporthe helianthi

Спосіб отримання аскоспор фітопатогенного гриба Diaporhe hehanthi, що включає культивування ІЗОЛЯТІВ на картопляно-глюкозному агарі, вне сення культури патогенного гриба на синтетичне живильне середовище, вирощування його до утворення плодових тіл (перитецмв), при позитивній температурі, який відрізняється тим, що як синтетичне використовують модифіковане живильне середовище наступного складу КН2РО4 1,25, MgSO4 - 0,625, пептон - 0,625, мальтоза 12,5, агар - 20,0, дистильована вода - 1000 мл (рН 8), а вирощування патогенного гриба до утворення плодових тіл (перитецмв) проводять в діапазоні позитивних температур (+20°С - +25°С) Винахід стосується мікробіологічної промисловості і може бути використаний в галузі захисту рослин при культивуванні грибних патогенів зокрема з селекції с\г рослин на СТІЙКІСТЬ ДО хвороб Одним з лімітуючих факторів селекції на СТІЙКІСТЬ до патогена Diaporhte hehanthi генотипів соняшнику є складність отримання інфекційного джерела (спор) в штучних умовах Відомий спосіб отримання КОНІДІЙ ентомопатогенного гриба Aschersoma aleyorodis Webber, при якому культивування гриба, після утворення щільного газону міцелію на поверхні середовища, проводять в діапазоні синього світла з довжиною хвилі 455-485н м [1] Однак відомий спосіб вирішує завдання отримання КОНІДІЙ гриба іншого класу ніж у способі, що заявляється Відомий також спосіб отримання аскоспор гриба Diaporhte hehanthi Munt-Cvet, який є найбільш близьким технічним рішенням, та обраний нами як прототип [2] Після культивування ІЗОЛЯТІВ на картопляно-глюкозному агарі він передбачає культивування гриба на живильному середовищі до складу якого входять (м моль 1 ~1) КН2РО4 5,9, Са(РО4Н2)2.2Н2С - 0,74, MgSO4-7H2O - 2,0, MnSO4-H2O - 0,06, ZnSO4- 7H2O - 0,035, CuSO4-5H2O - 0,02, FeSO4-7H2O - 0,0035, L-аланш 1,8, L-серін - 1,8, глюкоза - 25,2, тіамін - 3*10 4 біотин - 2*10 5 (рН6) Однак відомий спосіб передбачає використання у синтетичному живильному середовищі значну КІЛЬКІСТЬ компонентів серед яких такі високовартісні як амінокислоти та фітогормони, що робить цей етап більш тривалим та вартісним і не сприяє одержанню стабільної продукції Так максимальна продукція аскоспор спо стерігається при +20°С (при підвищенні температури до 23°С продукція перитецмв зменшується більше ніж у два рази, а при 27°С перитецм взагалі не утворюються) Все це разом робить відомий спосіб мало прийнятним для практичного використання у селекційних програмах тому що він не забезпечує одержання високої та стабільної продуктивності гриба В основу винаходу поставлене завдання створити спосіб отримання аскоспор фітопатогенного гриба Diaporhte hehanthi у якому нове виконання послідовних прийомів та дій дозволить підвищити та стабілізувати продуктивність гриба і одночасно знизити вартість та тривалість процесу приготування штучного живильного середовища Поставлене завдання вирішується тим, що в способі отримання аскоспор фітопатогенного гриба Diaporhte hehanthi, що включає культивування ІЗОЛЯТІВ на картопляно-глюкозному агарі, внесення культури патогенного гриба на синтетичне живильне середовище та вирощування його при позитивній температурі до утворення плодових тіл (перитецмв), згідно з винаходом, як синтетично використовують модифіковане відоме живильне середовище Леоніана, а вирощування патогенного гриба до утворення плодових тіл (перитецмв) проводять при більш широкому діапазоні позитивних температур Відоме штучне середовище Леоніана включає (г\л) КН2РО4 - 1,25, MgSO4 - 0,625 пептон - 0,625, мальтоза - 6,25, солодова витяжка - 6,25, агар 20,0, дистильована вода - ЮООмл [3] У винаході використовують модифіковане живильне середовище Леоніана до складу якого входять (г\л) ю о (О KH2PO4 - 1,25, MgSO4 - 0,625 пептон - 0,625, мальтоза - 12,5, агар - 20,0, дистильована вода 1000мл Солодова витяжка (6,25г\л) також як і мальтоза (6,26г\л) є джерелом вуглеводів, тому виключивши и із складу живильного середовища, ВДВІЧІ збільшили вміст у середовищі мальтози (12,5г\л) На відміну від живильного середовища прототипу, яке включає 12 компонентів у т ч 4 (три амінокислоти та гормон) високовартісні, модифіковане середовище Леоніана включає тільки 5 компонентів серед яких відсутні вартісні амінокислоти та гормони Виходячи з цього, на приготування модифікованого живильного середовища по винаходу витрачається втричі менше часу ніж для приготування живильного середовища по прототипу Таким чином, у винаході склад живильного середовища менш вартісний, а процес приготування середовища менш тривалий ніж у прототипі Вирощування патогенного гриба до утворення плодових тіл (перитецмв) на такому живильному середовищі при більш широкому діапазоні позитивних температур (+20°С - +25°С) дає змогу підвищити продуктивність спор гриба та м стабільність Саме внаслідок послідовного використання у винаході запропонованих прийомів стало можливим знизити вартість та тривалість процесу приготування штучного живильного середовища, а в підсумку - підвищити та стабілізувати продуктивність гриба На телеоморфній стадії розвитку Diaporhte hehanthi утворює плодові тіла - перитецм, які містять аскосумки У кожній аскосумці міститься по 8 60520 двоклітинних аскоспор, які є основним джерелом інфекції хвороби Тому завдання винаходу - одержання стабільно максимальної продукції аскоспор для використання у селекційних програмах Продуктивність аскоспор оцінювали за КІЛЬКІСТЮ перитецмв на одиницю площі поверхні середовища 2 (шт /1см ) Заявлений спосіб здійснюється таким чином Інфекційний матеріал збудника виділяють з уражених стебел соняшнику в КІНЦІ вегетації Частинки зразків, на яких помітне пікнідіальне спороношення, промивають протягом двох годин під проточною водою та стерилізують у розчині перманганату калію протягом 15 хвилин Після промивки дистильованою водою зразки залишають на добу у вологій камері при температурі +24°С - +25°С, що є оптимальною для культивування патогена Виділення в чисту культуру проводять на картопляно-глюкозному агарі Отримані чисті культури пересаджують на модифіковане живильне середовище Леоніана складом (г\л) КН2РО4 - 1,25, MgSO4 - 0,625 пептон - 0,625, мальтоза - 12,5, агар - 20,0, дистильована вода - ЮООмл (рН 8) Культивування проводять при освітленні 1000 люкс та температурному діапазоні +20°С-+25°С Через ЗО діб в культурі патогена утворюються перитецм, верхівки яких ПОМІТНІ над поверхнею неозброєним оком Ізоляти патогена добре ростуть та утворюють сумчасте спороношення Дані про вплив модифікованого живильного середовища в умовах різного температурного режиму, які заявляються у винаході, на продуктивність та стабільність гриба наведені у таблиці Таблиця Продукція перитецмв на штучних живильних середовищах при різних температурних режимах КІЛЬКІСТЬ перитецмв - шт \1 см^ Живильне середовище Прототипу Винаходу Температурні режими 20°С 25°С 8+0,5 7+0,7 1,5+1,3 16+1,8 15°С 3+1,5 8+2,1 Як свідчать наведені дані найвища і більш стабільна продуктивність перитецмв спостерігається на живильному середовищі винаходу при температурному режимі +20°С-+25°С Так, найвища продуктивність 15-16шт \1 с м 2 спостерігається в діапазоні температур +20°С-+25°С, в той час як при температурі +15°С вона зменшується майже ВДВІЧІ (8 шт\1см 2 ), а при температурі +30°С - в 4 рази (4 шт\1см 2 ) Ці дані свідчать про високу і стабільну продуктивність перитецмв одержаних на середовищі винаходу в діапазоні температур +20°С-+25°С коли вона була майже однаковою (15-16 шт\1см 2 ) і майже ВДВІЧІ ВИЩОЮ проти продуктивності перитецмв одержаних на середовищі прототипу Комп'ютерна верстка А Крулевський 30°С 0+0,9 14+2,0 Наведені дані підтверджують досягнення технічного результату при здійсненні заявленого способу Джерела інформації 5 1 Патент Україні №10385А МПК C12N30, 25 12 1996 р Лаппа Н В , Швецова Л Г, Гораль В М Спосіб одержання КОНІДІЙ ентомопатогенного гриба Aschersoma aleyorodis Webber 2 Р Assemat, J Fay ret Differencial:! on des pentheces de Diaporthe hehanthi MUNT-CVET, parasite du Tournesol, en cultures in vitro \\ С г Acad Sci Pans, t 305, Sene III, p 221-224, 1987) 3 Кирай и др Методы фитопатологии \\ Москва, "Колос", 1974, с 191 Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119