Спосіб діагностики коронавірусної інфекції великої рогатої худоби за допомогою експрес-методу

Спосіб діагностики коронавірусної інфекції великої рогатої худоби за допомогою експрес 3 61416 Приєднання ФІТЦу до білка проводять з розрахунку 2,0 мг ФІТЦа на кожні 100 мг білка. На спектрофотометрі визначають співвідношення флюорохром - білок (F/P). Якщо показник F/P дорівнює трьом одиницям і нижче, а відсоток білка становив від 0,5% до 1,0%, то цей білок використовують для подальшої роботи, а за інших умов проводять розділення на фракції за допомогою гельхроматографії на Тоуореаr/650М. Специфічність і активність флуоресціюючого імуноглобуліну до коронавірусу ВРХ визначають в реакції імунофлуоресценції за фарбуючим титром і в реакції гасіння флуоресценції. Фарбуючий титр і робоче розведення кон'югатів, які одержані лабораторним шляхом, визначають на культурі клітин ТрТ, НВ, КСТ, ЛЕК, які вирощені на накривних скельцях і заражені коронавірусом ВРХ. Через 48 годин після зараження, скельця з культурою клітин виймають з пробірок, промивають забуференим фізіологічним розчином (ЗФР), висушують на повітрі та фіксують в ацетоні впродовж 25 хв. за температури мінус (10,0±2,0)°С, а потім фарбують прямим методом РІФ за загальноприйнятою методикою з використанням дворазових розведень флуоресціюючого імуноглобуліну до коронавірусу ВРХ від 1:2 до 1:32. Специфічна флуоресценція у препаратах з антигеном коронавірусу ВРХ виявляється у вигляді яскраво-зеленого дифузного світіння цитоплазми інфікованих клітин на фоні ледь помітного світіння не інфікованих клітин. По мірі збільшення розведення флуоресціюючого імуноглобуліну яскравість світіння зменшується. Фарбуючим титром флуоресціюючого імуноглобуліну вважають те останнє його розведення, яке забезпечує світіння клітин, а робоче розведення імуноглобуліну - на порядок нижче, ніж фарбуючий титр. Фарбуючий титр повинен бути не менше ніж 1:8. Для діагностичного дослідження у РІФ використовують шматочки слизової оболонки тонкого кишечника, брижеєчні лімфатичні вузли, а також інфіковані культури клітин. Приклад Методика постановки реакції імунофлуоресценції для діагностики коронавірусної інфекції. З поверхні зрізу проб патологічного матеріалу роблять мазки-відбитки на предметному склі або Комп’ютерна верстка А. Рябко 4 наносять на його поверхню суспензію із зскрібків слизових оболонок, патматеріалу та інфікованих клітин, розподіляють тонким шаром і висушують при кімнатній температурі. Мазки фіксують у охолодженому ацетоні, в морозильній камері побутового холодильника при температурі від мінус 6°С до мінус 10°С 30 хвилин. Зафіксовані мазки висушують на повітрі 3-5 хвилин, переносять у вологу камеру і фарбують специфічним флуоресцентним імуноглобуліном (ФІТЦ-кон'югатом) 30 хвилин, у темряві, при кімнатній температурі. Через 30 хвилин ФІТЦ-кон'югат змивають дистильованою водою. Предметні скельця з мазками занурюють у забуферений фізіологічний розчин (pH 7,2-7,4) на 10 хвилин, після чого переносять на 3 10 хвилин у ЗФР, в який додають на кожні 100 см 3 0,1 см 0,1%-вого розчину синьки Еванса. Потім мазки просушують на повітрі й досліджують під імерсією у люмісцентному мікроскопі. Облік реакції проводять за інтенсивністю світіння інфікованих клітин і оцінюють за чотирихрестовою системою, а саме: ++++ - дуже яскрава флуоресценція зеленого кольору в цитоплазмі клітин; +++ - яскрава флуоресценція зелено-жовтого кольору в цитоплазмі клітин; ++ - слабка флуоресценція жовтого кольору в цитоплазмі клітин; "0" - цитоплазма клітин має темно-коричневе забарвлення. Позитивною реакцією вважається флуоресценція клітин на ++++ та +++ хрести при негативних результатах контролів. У способі використовують наступні контролі: 1. Обробка позитивних препаратів специфічною сироваткою (реакція гасіння флуоресценції); 2. Обробка позитивних препаратів негативною сироваткою; 3. Обробка препаратів, які не утримують вірусний матеріал. Спосіб діагностики коронавірусної інфекції великої рогатої худоби за допомогою експрес-методу є ефективним, економічним, простим у використанні, дає можливість встановити діагноз протягом 2-3 годин. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601