Спосіб серологічної діагностики інфекційного ринотрахеїту або вірусної діареї великої рогатої худоби

Спосіб серологічної діагностики вірусів, що включає досліджування тест-об'єктів методом реакції імунофлуоресценціі (РІФ), використання мічених флуоресцеїнізотиціонатом (Ф'ТЦ) у- імуноглобулінів, який відрізняється тим, що як тест-об'єкти використовують гіперімунні сироватки крові курей або голубів. Корисна модель відноситься до ветеринарної вірусології, а саме до серологічної діагностики інфекційного ринотрахеїту (ІРТ) і вірусної діареї хвороби слизових (ВД-ХС) великої рогатої худоби {ВРХ). Збудники цих хвороб відіграють провідну роль в етіології респіраторних, генітальних та шлунково-кишкових захворювань ВРХ, причиняючи економічні збитки внаслідок загибелі тварин, а також зниження продуктивності та приросту живої' маси, порушення відтворювальної функції у телиць, корів та бугаїв, бракування хворих тварин. Вірус ВД викликає пневмоентерити телят, аборти в корів у першій половині тельності, внутрішньоутробну інфекцію. Вірус ІРТ вражає респіраторну, генітальну і нервову системи, слизові оболонки. Існують способи визначення вірусів з використанням реакцій нейтралізації, імуноферментного аналізу (ІФА), реакцій імунофлуоресценцм (РІФ) та інші [Фримель Г. Иммунологические методы. М.: Медицина. 1987. - 472 с ] - в цих способах використовують перещеплені клітини, що дорого коштують. Є спосіб одержання флуоресцентно мічених антитіл [SU №1551089, от 20.04.88, кл. G01N 33/533] - за цим способом одержують кон'югати. (снує спосіб діагностики вірусів визначенням флуоресценції клітин [UA №23678 від 19.11.96, кл. C12N 7/00, "Спосіб визначення вірусів"]. Це рішення може бути прототипом, але його не використовують саме для визначення вірусів ІРТ або ВД. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб серологічної діагностики вірусів, що включає досліджування тест-об'єктів методом РІФ, використання мічених флуоресцеінізотіционатом (ФІТЦ) чмуноглобулінів, шляхом використан ня, як тест-об'єкта гіперімунної сироватки крові курей або голубів, щоб забезпечити спосіб серологічної діагностики інфекційного ринотрахеїту або вірусної діареї" великої рогатої худоби. Спосіб виконується таким чином: Вірусом ІРТ шт. "Молдавський" з титром вірусу 10' 7 5 ТЦПД5о /0,1см3 або вірусом ВД-ХС шт. "Орегон" з титром Ю"6'5 ТЦПД5о/О,1см3 з додаванням неповного ад'юванта Фрейнда імунізують триразове півнів (курей) м'ясних порід масою 2-2,5кг або статевозрілих голубів: 1 -й раз внутрішньошкірно по 0,2см3 у 4 ділянки спини, та внутрішньом'язево по 0,5см3 - у 2 ділянки плечевих м'язів, та по 0,2см3 - у подушечки пальців КІНЦІВОК. 2-й раз через 23 дні після 1-го введення у дозі 3 по 0,5см внутрішньом'язово у плечову та стегнові м'язи. 3-й раз через 21 день після 2-го введення таким же чином як і в попередніх. Птахам контрольної групи вводили відповідно фізрозчин. Заморожену контрольну сироватку крові курей або голубів, яка не мала специфічних антитіл до вірусів ІРТ або ВД-ХС, розморожували при ЗОООоб/ хв. протягом 10 хвилин і одержували -глобулінову фракцію білка за допомогою висолювання сульфатом амонія. Фракцію -глобулінів з імунної сироватки птиці, яку одержали за допомогою неочищених антигенів і додаванням неповного ад'юванта Фрейнда, виділяли сульфатно-ріваноловим методом. Очищені сироватки мітили ФІТЦ, попередньо дослідивши співвідношення флюорохромом - бі LO CM со о 10625 лок (—) на спектрофотометрі. Якщо показник (—) Р Р був 3 одиниці і нижче, то фракціонування угпобулінів не проводили. В інших випадках проводили розподіл у-глобулінів на фракції за допомогою колоночної хроматографії на сефадексі Г-50. Якщо очищення фракцій було успішним, то відбувається зростання показника (—) Фракцію, в якій Р був самий низький показник (—) і самий високий Р відсоток білка, відкидали, а інші фракції перевіряли на фарбуючий титр та неспецифічне свічення. Доброю вважали таку фракцію у-глобулінів, яка мала співвідношення (—) не більше 3-х та кільР кість білку від 0,5 до 1 %. Фарбуючий титр специфічної сироватки відповідав титру віруснейтралізуючих антитіл. Приклад 1 Фарбуючий титр і робоче розведення ФІТЦконюгатів встановлювали на культурі клітин нирки вівці, або тестікулів ембріона корови, вирощених на предметних скельцях і заражених вірусами ІРТ або ВД-ХС. Через 14-16 годин після зараження, скельця з культурами клітин витягали з чашок Петрі, промивали забуферним фізіологічним розчином (ЗФР), висушували на повітрі і фіксували в ацетоні при температурі -20DC протягом 25 хвилин, а потім фарбували прямим методом РІФ з використанням дворазових розведень цих сироваток. Фарбуючий титр встановлювали по яскравозеленому кольору специфічного антигена ІРТ, або ВД-ХС при мінімальному забарвленні оточуючого фону. Оцінку інтенсивності свічення проводили за допомогою системи обліку на 4 хреста. Препарати, які давали свічення на 3-4 хреста вважали позитивними. Приклад 2 При виявленні антигена ІРТ або ВД-ХС, пофарбовані специфічними і контрольними кон'югатами, мазки витримували у вогкій темній камері при температурі 20-25°С, протягом 30хв. Після чого з мазків струшували залишки кон'югату, промивали їх дистильованою водою та двічі промивали забуферним фізіологічним розчином протягом 10хв., добавляючи у другу порцію (ЗФР), фарбу синій Комп'ютерна верстка А. Крулевський Еванса (0,1см3 0,1% розчину фарби на 100см3 ЗФР) для гасіння неспецифічного свічення. Для препаратів з культурою клітин добавляли 0,3см3 0,1% розчину фарби синій Еванса на 100см3 (ЗФР). Пофарбований І висушений мазок досліджували у синє-фіолетових променях люмінесцентного мікроскопа. Для виявлення антигена ІРТ або ВД-ХС непрямим методом РІФ, на зафіксований ацетоном мазок (культуру тканин) наносили не флуоресцюючу специфічну противірусну сироватку у робочому розведенні. Мазки вміщували у вогку камеру і інкубували при +37°С протягом 30хв. Надлишок сироватки змивали дистильованою водою і мазок занурювали на 10хв. У ЗФР, після чого знову промивали дистильованою водою і висушували на повітрі. На мазок нашаровували антивидову сироватку у робочому розведенні, витримували у вогкій камері протягом 30хв. при кімнатній температурі. Надлишок ФІТЦ-антиглобуліна струшували, промивали дистильованою водою і двічі по 10 хвилин відмивали ЗФР, додаючи в останню порцію фарбу синій Еванса. Приклад З При проведенні досліджень використовували слідуючі контролі: - препарати фарбували стандартними специфічними, міченими ФГТЦ-імунними сироватками у робочому титрі; - препарати фарбували міченою ФІТЦ контрольною сироваткою птиці (негативний К) і стандартними нормальними флуорисцюючими сироватками; - препарати фарбували гетерологічними міченими ФІТЦ сироватками (контроль на специфічність і диференційний діагноз); - обробка препаратів, які не містять досліджувані антигени. При обліку РІФ позитивною реакцією вважали наявність специфічної флуоресценції у препаратів в якому антиген вірусу ІРТ або ВД-ХС виявлявся у вигляді яскраво-зеленого дифузного свічення цитоплазми клітин, а також яскраво-зеленої зернистості, яка повністю або частково заповнює ядра КЛІТИН. Спосіб серологічної діагностики інфекційного ринотрахеїту або вірусної діареї великої рогатої худоби є ефективним, економічним, простим у використанні, дає можливість у 8-10 разів збільшити об'єкт досліджень. Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ-42, 01601