Спосіб експрес-діагностики вірусу інфекційної анемії коней за допомогою флуоресціюючого імуноглобуліну

Винахід відноситься до біології, зокрема до біотехнології конструювання препаратів для індикації вірусу інфекційної анемії коней (ІНАН) методом імунофлуоресцентної мікроскопії. Відомий спосіб отримання, препарату для індикації вірусу інфекційної анемії коней може служити спосіб одержання препарату для діагностики сказу прямим методом імунофлуоресцентної мікроскопії з сироватки крові/ Патент України № 30910 А від 15 .12. 2000 року/. Аналоги отримання флуоресцентного імуноглобуліну для експрес-діагностики вірусу інфекційної анемії коней методом флуоресціюючих антитіл в доступній науковій літературі відсутні. Винаходом ставиться завдання встановити можливість використання прямого методу імунофлуоресцентної мікроскопії для індикації антигену вірусу інфекційної анемії коней та розробити компоненти вітчизняної тест-системи, зокрема створити специфічний високоактивний флуоресціюючий імуноглобулін. Метод флуоресціюючих антитіл є одним із серологічних методів, що має ряд переваг, а саме: високу чутливість та специфічність, швидкість виконання та обліку результатів. Спосіб експрес-діагностики за допомогою цього методу може вважатись як сигнальний, орієнтовний метод, що не виключає проведення класичних серологічних методів у разі потреби. Цей метод використовують в експериментах по визначенню окремої клітини або місця, з яким з'єднується антитіло. За своєю суттю метод аналогічний методу преципітації, тому що, тут антиген фіксується на предметному склі, а позначені антитіла осідають навколо нього. Маючи відому антисироватку, цією реакцією можна визначити наявність специфічного антигену та ідентифікувати його. Антиген та імуноглобуліни можна мітити барвниками, які флуоресціюють при опроміненні ультрафіолетовими променями. Із барвників найбільш придатний для цього - флюоресцеїн. Він здатний поглинати невидимі ультрафіолетові промені з довжиною хвилі 290-495ммк і випромінювати видимий зелений колір з довжиною хвилі близько 525ммк. Флуоресценція спостерігається при надзвичайно малих концентраціях досліджуваних агентів, що досягають 10-6-10-9. Для досліджень використовували мазки-відбитки органів і тканин від коней хворих на інфекційну анемію та препарати тканинних культур. Мазки-відбитки зрізів органів і тканин готували після підсушування зрізу на фільтрувальному папері. За звичай на одному накривному скельці готували 2-3 мазка. З одного органу виконували не менше 5 препаратів. Для імунофлуоресцентного дослідження препаратів культур клітин їх вирощували на накривних скельцях різної форми. Найзручнішими для роботи є скельця розміром 1,5x1,5см та завтовшки 0,11-0,2мм, так як вони забезпечували найкращу візуалізацію клітин при великому збільшенні. Препарати відмивали в 0,15М розчині хлористого натрію в фосфатному буфері (PSB) pH7,2-7,4, підсушували і фіксували. При роботі з флуоресціюючими барвниками важливе значення має правильний підбір методу фіксації. При виборі фіксатору враховували характер його дії на досліджуваний антиген. Встановлено, що найкраще для фіксації застосовувати о холоджений до - 15°С-2О°С ацетон, він згладжує власну флуоресценцію тканин, яка зберігалась при роботі з іншими фіксаторами. Для отримання специфічних імунних сироваток до вірусу ІНАН використали коней 2-х і 3-х річного віку. Гіперімунізацію проводили шляхом 6-ти разового з інтервалом 30 днів, підшкірного введення (в середній третині шиї) по 1cм 3 вірусу з ти тром 105,5 ТЦД 50. Виділення гамма-глобулінової фракції із сироватки крові коней проводили сульфатно-риваноловим методом. Отримавши специфічний високоактивний імуноглобулін проти вірусу інфекційної анемії коней приступили до з'єднання його з флуоресцеінізотіоціанатом /ФІТЦ/. Визначення концентрації білку та з'єднання імуноглобуліну з ФІТЦ. Спочатку готували розчин імуноглобуліну де концентрація білку повинна складати 1-2%, яку визначали за допомогою рефрактометра чи спектрофотометра /СФ-46/. Для розчину ФІТЦ та утворення оптимальних умов з'єднання флуорохрому з білком антитіл використовували карбонатно-бікарбонатний буфер /КББ/ з pH9,0, а ФІТЦ брали з розрахунку 3мг на 100мг білку. Кон'югація проходила при температурі 2-4°С протягом 24 годин при постійному перемішуванні за допомогою магнітної мішалки. Очищення кон'югату. Після закінчення процесу кон'югації в реакційній суміші могли міститись залишки ФІТЦ, органічні розчинники та солі буферних розчинів. Ці залишки є однією з причин неспецифічного світіння при фарбуванні досліджуваних препаратів. Для очищення кон'югату використовували метод гель-фільтрації через колонку з сефадексом різних дисперсних форм (G50, G25). Скляну колонку 150Х20мм закріплювали в вертикальному положенні. На кожні 10cм 3 отриманого кон'югату імуноглобулінів необхідна колонка з сефадексним гелем розміром не менше 150x20мм. В таку колонку вносять збалансований 0,01 ФБР гельсефадекс, якому давали відстоятись впродовж 10-12 годин, щоб шар гелю став рівномірно щільним. Колонку промивали 0,01М ФБР /pH 7,2/. Висихання гелю не допускається. Кон'югат обережно переносили в колонку піпеткою, щоб не порушити поверхні гелю сефадексу. Після того, коли кон'югат пройде повністю гель, додавали декілька мілілітрів 0,01М ФБР. По мірі проникнення його в гель додавали нові порції ФБР до повного проходження отриманого кон'югату через колонку. При проходженні кон'югату по колонці він розділяється на дві фракції оранжевого кольору. Збирали всю першу фракцію, яка швидко досягає нижнього кінця колонки, до того часу, поки забарвлення не стане менш інтенсивним. Після проведення кон'югації преципітат, який іноді може утворитись, вилучали центрифугуванням. Були підібрані оптимальні умови проходження кон'югату через колонку, що дозволило скоротити втрати білку до мінімуму. Повноту очистки препарату визначали методом висхідної хроматографії на папері. Для цього краплю очищеного кон'югату наносили на смужку хроматографічного паперу на відстані 1,5- 2см від її нижнього краю. В циліндр наливали робочий розчин (55 частин етилового спирту та 4,5 частин ФБР). Смужку паперу підвішували вгорі, занурюючи її нижнім кінцем у розчинник. Циліндр щільно закривали та лишали при кімнатній температурі на 2-3 години для проведення реакції. Для отримання результату смужку піддавали дії УФ променів. На хроматограмі була зафіксована одна яскрава флуоресціююча пляма на місці внесення кон'югату. Отриманий результат вказує на високу ступінь очищення препарату. Очищений кон'югат фільтрували та розливали по 1см 3 в стерильні ампули чи флакони, а потім піддавали ліофільному висушуванню. Кожний знову виготовлений препарат перевіряли на активність та специфічність. Активність кон'югату (титр) при певному терміні і температурі (як правило кімнатній), встановлювали шляхом фарбування мазків із культури лейкоцитів коня зараженої еталонним штамом вірусу ІН АН а потім перевіряли прямою реакцією імунофлуоресценції в мазках-відбитках із патологічного матеріалу від коней хворих ІН АН. Для цього готували 6-7 послідовних двократних розведень кон'югату, починаючи з 1:2. Всіма розведеннями зафарбовували паралельні мазки і визначали найвище розведення (титр), що забезпечує діагностично позитивну інтенсивність світіння антигену вірусу ІН АН (не менше ніж на ++++ та +++). За робоче розведення кон'югату приймали його розчин в два рази нижче титру. Були поставлені наступні контролі: - Від'ємний - паралельне фарбування препарату - відбитку здорового коня та культури клітин не зараженої вірусом. - На специфічність - паралельне фарбування препарату-відбитку із органів коня хворого на ринопневмонію та культури клітин заражену цим вірусом. Результати досліджень визначали за інтенсивністю специфічного світіння комплексів антиген-антитіло. Виходячи з отриманих даних встановлено, що отриманий ФІТЦ-кон'югат є чутливим і специфічним для індикації антигену вірусу інфекційної анемії коней. Доведена доцільність використання методу флуоресціюючих антитіл для діагностичних досліджень на ІНАН коней. Була розроблена схема отримання компонентів реакції. Відпрацьовані методи фіксації антигенного матеріалу , які дозволили б зберегти його в процесі багатократної відмивки після нанесення ФІТЦкон'югату та не впливати на специфічність світіння. Встановлено, що найкращим фіксатором є охолоджений до - 18°С ацетон. Розробили та дослідили на практиці діагностичну систему на ІНАН коней, яка відповідає сучасним вимогам, що висуваються до таких діагностикумів. Розроблена технологічна схема отримання діагностичних препаратів уможливлює серійний випуск набору для діагностики ІНАН коней в реакції імунофлуоресценції. Індикація антигену вірусу ІН АН коней за допомогою реакції імунофлуоресценції є ефективною, специфічною та чутливою, що підтверджено ідентичністю результатів досліджень в порівнянні з закордонними аналогами. Впровадження методу флуоресціюючих антитіл для індикації антигену вірусу ІН АН в практику лабораторій ветеринарної медицини дозволить значно підвищити рівень обстеження коней та провадити серологічну діагностику інфекційної анемії коней в Україні.