Експрес-спосіб імуноферментного аналізу для виявлення специфічних антитіл у сироватці крові до вірусу ензоотичного енцефаломіеліту свиней (хвороби тешена)

Експрес-спосіб імуноферментного аналізу для виявлення специфічних антитіл у сироватці крові до вірусу ензоотичного енцефаломіеліту свиней (хвороби Тешена), що включає набір діагностикумів, який відрізняється тим, що для діагностики захворювання використовують ентеровірус, очищений і концентрований методом адсорбційної і молекулярно-ситової хроматографії на макропористих сорбентах Винахід відноситься до ветеринарної медицини, а саме до лабораторної діагностики і може бути використаний для експресної діагностики захворювання свиней на ензоотичний енцефалоМІЄЛІТ (хвороба Тешена), дозволить своєчасно застосувати лікувально-профілактичні заходи та зменшити економічні збитки у свинарських господарствах Аналог винаходу - реакція дифузної преципітації в агаровому гелі Для постановки реакції використовують агаровий гель, приготовлений по стандартному пропису, антиген, позитивну та негативну сироватки крові Розтоплений агар вноситься в чашку Петрі Після затвердіння геля в ньому вирізуються лунки діаметром 7мм Розведений антиген вноситься в центральну лунку, а специфічну преципітовану сироватку в дві діаметрально протилежні перефирічні лунки Останні ВІЛЬНІ лунки заповнюються дослідними сироватками Чашки витримують при температурі 25-28°С протягом 48-72 годин, після чого проводиться облік реакції Результати реакції з дослідними сироватками оцінюють візуально по розташуванню КІНЦІВ лінії преципітації, що створились в гель агарі між лунками з антигеном і лунками з специфічною преципітованою сироваткою Тешена Суть реакції полягає у нейтралізації вірусу специфічними антитілами, які містяться у сироватці крові тварин При цьому втрачається інфекційна активність вірусу Для постановки РН використовують сироватки крові від тварин всіх вікових груп, а також парні сироватки, отримані від тих самих тварин з двохтижневим інтервалом Дворазове розведення прогрітої до 56°С сироватки змішують з постійною дозою вірусу і після інкубації протягом години при -t-37°C вводять в культуру клітин Інкубування інокульованих пробірок проводять протягом 7-8діб Позитивним результатом вважають відсутність цитопатичної дм ЦПД в 50% пробірок, інокульованих сумішшю вірусу з сироваткою Контролем при даних реакціях є чотири пробірки з культурами клітин не заражених вірусом Облік результатів проводять на 7-8 добу Негативною стороною реакції являються низька чутливість, специфічність, нетривалість реакції та візуальний облік результатів (1) Прототипом винаходу є реакція нейтралізації (РН) для діагностики хвороби Тешена Постановку реакції нейтралізації здійснюють у культурі клітин з використанням еталонних штамів вірусів хвороби Недоліки прототипу реакція нейтралізації не являється експресною, для постановки реакції необхідна культура клітин, яка часто контамінується сторонньою мікрофлорою і стає непридатною для використання в реакції, облік результатів проводиться на 7-8 добу Використання РН при масових обстеженнях господарств дуже ускладнено В основу винаходу поставлено завдання Розробити експрес-метод імуноферментного аналізу для виявлення специфічних антитіл у сироватці крові до вірусу ензоотичного енцефаломієліту свиней (хвороби Тешена), який дав би можливість уникнути перелічених недоліків прототипу і володів новими якостями, такими як експресність, короткий термін одержання кінцевого результату, автоматизований облік реакції та простотою при ю ю 55272 використанні для масових обстежень свинарських господарств Вирішення поставленого завдання досягається шляхом розробки активних та специфічних компонентів, з яких створюється набір придатний для постановки реакції імуноферментного аналізу Суть винаходу в тому, що для проведення експрес-методу розроблена технологія отримання компонентів та виготовлення набору діагностикумів до хвороби Тешена методом імуноферментного аналізу (ІФА) Використання набору дозволяє за 2-3 години провести дослідження та виявити специфічні антитіла в сироватці крові хворих свиней при діагностиці захворювання Основою при створенні набору діагностикумів хвороби Тешена для імуноферментного аналізу є розробка ефективного технологічного методу очищення і концентрування вірусу на базі адсорбційної та молекулярно-ситової хроматографії на макропористих сорбентах (МПС) При розробці експрес-методу ІФА для очищення і концентрування використовували культуральний ентеровірус 1-і серо-групи штаму "Закарпатський", який попередньо очищали хлороформом від ЛІПІДОВМІСНИХ компонентів Хроматографію проводили за допомогою ультрафіолетового детектора типу "Увікорд" Концентрування ентеровірусів методом адсорбційної хроматографії провадили на МПС При цьому були підібрані оптимальні умови найкращої сорбції вірусів на поверхні сорбенту, умови десорбції Успішне концентрування вірусів було можливе лише після вибору оптимальних розмірів діаметра пор сорбенту, розміру гранул, швидкості подачі вірусної суспензії на колонку, значення рН Найкраща адсорбція ентеровірусів проходила при рН 5,5-6,0 на МПС з діаметром пор 1500 А, оптимальна швидкість подачі культуральної вірусної суспензії на колонку становила 5см/хв Максимальна десорбція ентеровірусів з колонки була при використанні десорбційного буферного розчину 0,5 М трис і 1 М NaCI рН 8,7-8,8 ) Для остаточного очищення вірусів, повного звільнення від тканинних білків одержаний елюат після адсорбційної хроматографії піддавали гельхроматографічному очищенню на модифікованому полівшілпіралідоном МПС При цьому при оптимальних умовах вдалось досягти чіткого відділення вірусної фракції від фракції клітинних білків Сенсибілізацію полістиролових мікропланшет робочим розведенням очищеного антигену проводили в умовах 0,01 М калій-фосфатного буферного розчину з 0,15 М NaCI рН 7,2-7,4 протягом 18 годин і при 1=+4°С Мікропланшети з адсорбованим антигеном зберігали активність упродовж 2 років Для блокування вільних сорбційних зон після адсорбції очищеного антигену використовували 3%-ний розчин альбуміну Одержані таким чином сенсибілізовані мікропланшети застосовували для виготовлення набору діагностикумів хвороби Тешена для імуноферментного аналізу До складу набору увійшли дві полістиролові мікропланшети, сенсибілізовані очищеним антигеном вірусу хвороби Тешена, сироватка крові, позитивна щодо вірусу хвороби Тешена, сироватка крові негативна, антивидовий імунопе-роксидазний кон'югат та індикаторна система (ортофенілендіамін) Постановка реакції ни явлении антитіл до збудника хвороби Тешена У лунки з адсорбованими антигенами вносять по 0,1мл специфічної (ряд А), контрольної (негативної, ряд В) та дослідних сироваток свиней (ряди С, О, Е, F, G, Н) Потім їх розтитровують методом подвійних розведень, шкубують у термостаті 1 годину при t=+37°C Після ЦЬОГО планшети відмивають твін-фосфатно-буферним розчином (ТФБР) та вносять по 0,1 мл антивидового імунопероксидазного кон'югату, шкубують 1 годину при t=+37°C, відмивають ТФБР і вносять субстратний розчин Облік результатів ферментативної реакції проводять на автоматичному спектрометрі при довжині хвилі 492нм чи візуально за інтенсивністю забарвлення пероксидазної реакції Експериментальне дослідження по застосуванню експрес-методу імуноферментного аналізу для виявлення специфічних антитіл у сироватці крові до вірусу хвороби Тешена з застосуванням розробленого набору провели на боці господарств п'яти областей (Харківська, Запорізька, Черкаська, Херсонська та Дніпропетровська) Всього досліджено експрес-методом 1214 проб сироваток крові від свиней, що вакцинували проти хвороби Тешена Отже, розроблений експрес-метод з використанням одержаних компонентів набору для діагностики хвороби Тешена в реакції імуноферментного аналізу дає можливість за 2-3 години провести діагностику, автоматизувати облік реакції, уникнути використання культур клітин, які за короткий термін стають непридатні для використання, та широко використовувати при масових обстеженнях господарств Використана література 1 Романенко В П Хворба Тешена Видав "Урожай", Київ, 1974 2 Собко АЛ Справочник по болезням свиней Видав "Урожай", Київ, 1988, С 59-64 Підписано до друку 03 04 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24