Спосіб підвищення імунологічної реактивності при стресі тварин

Винахід відноситься до області біофізики, однією з проблем якої є вивчення біологічної ефективності електромагнітних випромінювань (ЕМВ) різного діапазону. Проблема підвищення імунологічної реактивності в останні роки здобуває усе більшу актуальність у зв'язку з ростом імунодефіцитних станів різного характеру. Тому у даний час активно ведеться пошук нетоксичних імуномодуляторів для підвищення резистентності організму. В якості такого індуктора може бути використане електромагнітне випромінювання надто високої частоти (ЕМВ НВЧ) низької інтенсивності, що ефективно використовується для лікування і профілактики широкого спектра захворювань. Отже, дослідження імуномодулюючої дії цього фактора становить значний інтерес. Оскільки людина і тварини постійно піддаються дії стресорів, а більшість імунологічних процесів розгортається на тлі стресу (Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. -М.: Медицина. -1960. -254с.), тому вивчення механізмів імунокорегуючої дії будь-якого фактора, у тому числі і ЕМВ НВЧ, доцільно проводити на моделях з експериментально викликаною стрес-реакцією. Розвиток такої реакції викликає, зокрема, обмеження рухливості (гіпокинезії) (Коваленко Е.А., Гуровский Н.Н. Гипокинезия. -М.: Медицина. -1980. -307с.), широко розповсюджене в даний час. Прототипом винаходу є «Спосіб профілактики і корекції стресу» (Деклараційний патент України №53128, МПК 7: А61N2/00, опублікований 15.01.03, Бюл. №1), що включає вплив на живі організми ЕМВ НВЧ, що здійснюють попередньо, до впливу стрес-фактора, за допомогою терапевтичного генератора НВЧ-випромінювання з фіксованою довжиною хвилі 7,1мм і щільністю потоку потужності 0,1мвт/см2 на зону голови щодня по 30 хвилин протягом 9 днів. Недоліком цих досліджень є те, що показано можливість лімітувати стрес-реакцію при використанні ЕМВ НВЧ до обмеження рухливості тварин, тоді як зовсім не вивченим є можливість застосування малопотужного ЕМВ НВЧ для корекції імунологічної реактивності в інфікованих тварин, що одночасно знаходяться в умовах експериментально викликаної стрес-реакції. Крім того, у вище названих дослідженнях був використаний вплив на зону голови. Однак така локалізація не застосовується в клінічній практиці, тому необхідні дослідження антистресорної та імуномодулюючої дії ЕМВ НВЧ на рефлексогенну зону, яка широко використовується у фізіотерапії. У зв'язку з цим, необхідні додаткові дослідження дії ЕМВ НВЧ на зміну імунологічної реактивності при стресі, оскільки проблема «стрес та імунітет» у даний час здобуває особливе значення. В основу винаходу було поставлено задачу виявлення імуномодулюючої дії ЕМВ НВЧ із довжиною хвилі 7,1мм і щільністю потоку потужності 0,1мвт/см2 при його дії на інфікованих тваринах, що знаходяться в умовах як звичайного, так і обмеженого рухового режиму. Сутність винаходу полягає в тім, що спосіб підвищення імунологічної реактивності при стресі включає вплив на організм ЕМВ НВЧ за допомогою терапевтичного генератора з фіксованою довжиною хвилі 7,1мм і щільністю потоку потужності 0,1мвт/см2 щодня по 30 хвилин протягом 9-ти днів. При цьому, відповідно до винаходу, вплив ЕМВ НВЧ здійснюють на потилично-комірну зону тварин, які знаходяться в умовах стрес-реакції до інфікування. Причинно-наслідковий зв'язок між істотними ознаками винаходу і результатом, що досягається, полягає в здатності ЕМВ НВЧ низької інтенсивності підвищувати опірність організму до зовнішніх факторів, що репресують, і знижувати ефект гноблення імунної системи при стресі, що вказує на можливість використання ЕМВ даного діапазону для імуностимуляції при стресі. Вибір потилично-комірної зони локалізації впливу ЕМВ НВЧ обумовлений тим, що ця зона є однією з рефлексогенних зон, у якій виявлена велика кількість рецепторних закінчень, судин мікроциркуляторного русла, лімфатичних судин, БАК, гладких кліток. Відомо, що саме судини мікроциркуляторного русла, нервові закінчення й елементи APUD-системи, до якої, зокрема, відносяться гладкі клітки, відіграють важливу роль у механізмах фізіологічної дії ЕМВ НВЧ. З цих позицій не дивно, що найбільш виражений ефект нами виявлений при впливі ЕМВ НВЧ саме на потилично-комірну зону, в якій у великій кількості присутні первинні мішені для впливу хвиль НВЧ-диапазона. Реалізація винаходу здійснюється в такий спосіб. Для вивчення імуномодулюючої здатності ЕМВ НВЧ була проведена серія експериментів на самцях білих безпородних пацюків. Для експериментів відбирали тварин однакового віку і ваги, із середнім рівнем рухової активності і низькою емоційністю, обумовлених у тесті «відкритого поля». Подібний добір дозволив сформувати однорідні групи тварин з однаковими конституціональними особливостями, що однотипно реагують на дію різних факторів. Попередньо відібрані тварини були розділені на 5 груп. До першої і другої груп відносилися тварини, що містяться в звичайних умовах віварію. Третю групу складали пацюки, піддані дії стресу. Стрес моделювався обмеженням рухливості (гіпокінезією, ГК), що досягалося приміщенням пацюків у спеціальні касети з оргскла, у яких вони знаходилися протягом 9 діб по 22 години щодня. Тварини четвертої групи піддавалися дії ЕМВ НВЧ. П'яту групу склали тварини, що знаходилися в умовах ГК і одночасно піддавалися впливу ЕМВ НВЧ (ГК+НВЧ). Вплив ЕМВ НВЧ здійснювалося щодня по 30 хвилин на потилично-комірну зону протягом 9 діб експерименту за допомогою генератора «ПРОМІНЬ. КВЧ - 071» з довжиною хвилі 7,1мм, щільністю потоку потужності 0,1мвт/см2. Після превентивних впливів, на 10 добу експерименту було проведене зараження пацюків. З цією метою використовувалася Micoplasma Hominis, отримана з промивних вод бронхів хворих у лабораторії мікробіології інституту нефрології й урології (м. Київ). Micoplasma Hominis вводилася по 0,2мол (концентрація 106 мікробних тіл у 1мол) у хвостову вену пацюкам 2-ий (інфіковані, ДО+И), 3-їй (ГК+И), 4-ої (НВЧ+И) і 5-ої (ГК+НВЧ+И) груп. 1-а група служила біологічним контролем (ДО). Відповідно до сучасних представлень, адекватними методами, що характеризують неспецифічну резистентність, є цитохімічні методи оцінки функціонального стану нейтрофілів і лімфоцитів крові. Кров для дослідження брали з хвостової вени щодня протягом 28 діб експерименту. Досліджувалися бактерицидні (пероксидаза (ПО), катіонні білки (КБ)), гідролітичні системи (кисла фосфатаза (КФ), протеаза (ПР)), зміст ліпідів у нейтрофилах і окислювально-відновний ферменти (сукцинатдегидрогеназа (СДГ) і (-глицерофосфатдегидрогеназа ((-ГФДГ)) у лімфоцитах і нейтрофілах крові. Цитохімічний зміст ПО визначали за допомогою реакції Грехема (Лилли, 1969), КБ за способом М.Г. Шубича (1974), ліпідів за допомогою судану чорного Б (Sheehan, Sforey, 1947). Кількісну оцінку досліджуваних показників робили відповідно до принципу Kaplow (1955) на підставі обчислення цитохімічного показника змісту (ЦПС) у розрахунку на 100 нейтрофілів. Середній зміст СДГ і (-ГФДГ визначали по методу Р.П. Нарцисова (1969) шляхом кількісного підрахунку сферичних гранул формазана. Крім того, у мазках крові, пофарбованих по Романовському - Гимзі визначалася лейкоцитарна формула (ЛФ). Через 19 днів після зараження тварин декапитирували. У плазмі крові визначали концентрації фактора некрозу пухлини (ФНО-() і інтерферону (ИФН-(). ФНО-(тестирували по цитопатичній дії на клітках (-929 (мишачі фібробласти). Результати оцінювали на мультискані «Dynatech» (Швейцарія) при довжині хвилі 556нм. Активність ФНО визначали у виді індексу цитотоксичності по формулі: ИЦ=(ДО-Д)/ДО*100%, де К - оптична щільність у контрольній, Д - у досвідчених пробах. Тестування ИФН-(проводили на первинній культурі кліток ембріонів пацюків по придушенню цитопатичної дії тест-вірусу (вірусу везикулярного стоматиту - ВВС). Клітки вирощували в 96-ти ямкової культуральної панелі. Після утворення клітинного монослоя, у лунки вносили по 0,1мол. досліджуваних зразків у 2-кратних розведеннях. Проби сироватки попередньо розводилися середовищем культивування в пропорції 1:10. Як контроль у лунки вносили такий же обсяг середовища. Через 18 годин додавали по 0,1мол попередньо відтитрований вірус (ВВС) у робочому розведенні. Плати інкубували протягом 24-х годин при t=24ос в атмосфері О2. Облік результатів проводили мікроскопічно. За титр ИФН приймають величину, зворотну розведенню проби, при якому спостерігається 50% захист кліток від цитопатичної дії тест-вірусу. Титр ИФН- (виражали в умовних одиницях (ум.од.). З огляду на наявність тісного зв'язку коагуляційних властивостей крові з клітинними елементами неспецифічної резистентності, а також зміни згортаємості крові в процесі запальної реакції було проведене дослідження змін системи гемостазу: Визначалися показники коагулограми: протромбиновий індекс (ПІ), час рекальцифікації (ВР), концентрація фібриногену «А» (ФА), зміст фібрину (Ф), фібриногену «У», фибринолітична активність плазми (ФАП) і толерантність плазми до гепарину (ТПГ) по стандартних методиках, широко застосовуваним у клінічній і лабораторній практиці (Меньшиков, 1987). Статистичний аналіз результатів проводили з використанням параметричних і непараметричних методів на PC "Pentium III 800" з використанням пакета статистичних програм «Statistica-5.5». Вірогідність відмінностей між показниками оцінювали за допомогою t-критерію Стьюдента. Силу і спрямованість зв'язку між досліджуваними показниками оцінювали за допомогою кореляційного аналізу. Результати досліджень свідчать про те, що зміна імунологічної реактивності в інфікованих тварин залежить від вихідного стану організму. Так, послідовна дія гіпокінетичного стресу і Micoplasma Hominis приводить до істотного зниження продукції фактора некрозу пухлини (ФНО-(), інтерферону (ИФН-(), гнобленню неспецифічних захисних реакцій нейтрофілів і лімфоцитів крові (бактерицидних, гідролітичних, енергетичних систем), розвитку гіперкоагуляційного зрушення крові на тлі депресії противозвертуваючої і фібринолітичної систем, що є причиною виникнення тромботичних ускладнень. Превентивний вплив ЕМВ НВЧ на інфікованих тваринах, що знаходяться в умовах як звичайного, так і обмеженого рухового режиму, привів до значного збільшення продукції ФНО- (і інтерферону ИФН- (підвищенню захисно-пристосувального потенціалу системи крові, що виражалося в збільшенні функціональної активності бактерицидних, гідролітичних, енергетичних систем нейтрофілів і лімфоцитів. Зміни в системі гемостазу в результаті інфекційного процесу, що розвивається, у тварин, що піддавалися як ізольованому, так і комбінованому з гіпокінезією дією ЕМВ НВЧ свідчать про збільшення потенціалу прокоагулянтної ланки, що супроводжується компенсаторним підвищенням потенціалу фібринолітичної і антикоагуляційної систем. Таким чином, ЕМВ НВЧ низької інтенсивності лімітує розвиток стрес-реакції і знижує ефект гноблення імунної системи при стресі, що вказує на можливість використання ЕМВ даного діапазону для імуномодуляції. Отримані результати дозволяють значно підвищити ефективність і розширити можливості застосування КВЧ терапії для корекції і профілактики імунодефіцитних станів, викликаних стрес - реакцією. Ці дані можуть бути використані у тваринництві, ветеринарії, виробничій діяльності людей і практичній охороні здоров'я, наприклад, можливе застосування ЕМВ НВЧ по заданому способу перед проведенням вакцинації.