Засіб визначення імунологічної реактивності організму

Изобретение относится к медицине и может найти применение в д и а г н о с тике спефицпческого клеточного иммунитета при острых и хронических з а болеваниях инфекциошю-аллергического или аутоиммунного г е н е з а . Ц е л ь и з о б р е тения - повьціеїшє гочности за с ч е т определения р е и е п г о р и о г о а п п а р а т а лимфоцитов и ф а г о ц и т о в . Производят измерение люминолзависимой хемолюмпиесцеиции песгимулироватшых с е н с и б и лизированных пгчзкоцитов, л е г к о ц п т о в , стимулированных л л г е к с о м без а н т и г е на и лейкоцит on, стимулированных л а т е к с о м , нагруженным бакг ериальным или тканевым антителом, с о п о с т а в л я ют полуді с иные данные и при повышении ХЄМИЛІОМШІРСЦЄПЦИИ В ПрОбР, ГОДОржащен специфический стимулятор, и отсутствии разницы ме>фу показателями реакции па неспецифичоскии (.чімуляюр и без него опредеаяпт гипері ітчесі чи тип иммунной реакции, а при наличии ра шицы меядду пнми ог'ределяют гипергическии тип иммунной реакции, Точ~ ~ носі ь способа составляет 6Z%, попрототипу - 32%. Ь; Изобретение относится к медицине и может найти применение в диагностике специфического клеточного иммунитета, а также установления его типа при острьіх и хронических заболеваниях инфекционного, аллергического, аутоиммунного, профессионального и др. генеза. Цель изобретения - повышение точности способа за счет опредетеішя рецепторного аппарата лимфоцитов и клеток. Способ осуществляется следующим образом в два этапа, 1-й этап включает наслоение антигена на л а т е к с . К 1 мл суспензии из і Iі частиц латекса в концентрации 10** добавляют 1 мл антигенов (используются стандартные бактериапъпые, грибковые, пыльцевые, шщевпе или производственные антигены, а іакке тглревые антигены ; полученные общепринятым методом. Смесь латекса и антигена помещают в морозильное отделение холодильлпка на 18 ч, после чего ее центрифугируют, над осад очную ы-щкость выливают, добавляют 1 мл йизиолоїического раствора,, На 2-м этапе проводят исследова~ ние люминалзависимой хемилюминесценции сенсибилизированных лейкоцитов. 1629848 Кровь из пальца или вены набирают в 4 гепаринизированные капилляры. Герметически закрытые капилляры центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. Лейковзвесь из четырех капилляров, образованную на границе плазма эритроцит, растворяют в 8 мл раствора Хенкса, образуя 16 проб (2 контрольных и 14 опытных)Ф При необходи- 10 мости исследовать одновременно большее или меньшее к-оли^ество антигенов описанным способом готовят нужное количество проб из расчета: 1 к а пилляр периферической крови, раство- 15 ренный в 1,5 мл раствора Хенкса на каждые 3 пробы. Смесь лейковзвеси и раствора Хенкса разливают по 0,5 мл во фпаконы для хемилюминесцентного исследова20 ния, после чего добавляют: в 1-й контрольный флакон 0,1 мл физиологического раствора,во Р-й контрольный флакон 0,1 мл раствора частиц л а т е к са в дистиллированной воде в концен- 25 трации Ш 9 , в 3 - 14-й опытные флаконы по 0,1 мл частиц латекса, нагруженного бактериальными, грибковыми или тканевыми антигенами в конечной концентрации 10 . 30 В каждую пробу добавляют 0,1 мл 2,8 М раствора люминола, пробы инМ кубируют в термостате 30 мин и проводят замер хемилюминесценции в р е жиме счета фотонов с помощью ФЭУ-39а. Сопоставляют результаты хемилюми- 35 несценции, полученные во 2-й контрольной пробе с опытными, выявляя пробу, хемилюминесцентное свечение которой существенно выше по сравнению с о 2-й контрольной, на основании 40 чего диагностируют наличие специфической иммунной реакции по отношению к данному антигену. Для уточнения напряженности имму45 нитета, т . е . типа' иммунологической реакции сопоставляют показатели 1-й и 2-й контрольных проб, диагностируя гипергический тип клеточного иммунитета при отсутствии разницы между показателями спонтанной хемилюминес- 50 ценции и стимулированной .инертным і латексом (неспецифическим*стимулятором) , тогда как гиперерический тип иммунной реакции определяют при наличии разницы между этими показателями. 55 П р и м е р 1. Больной К., 7 л е т , поступил в детское отделение с диагнозом: левосторонняя очаговосливнля бронхопневмония ДІЇ, , левосторонний экссудативныч плеврит. Иммунологическое исследование выполнено согласно методике, описанной в предыдущем разделе. У больного из пальца произведен забор крови в 3 г е паринизированные капилляра. Лейковзвесь из капилляров получали описанным способом, растворяли в 6 мл раствора Хенкса, смесь распределяли по 0,5 мл на 12 проб. Ко всем пробам добавляли 0,1 мл 2,8 М люминола, пробы инкубировали в М термостате в течение 30 мин и проводили измерение хемилюминесценции каждой пробы в течение 10 с. Получают хемилюминесцентное свечение в 1-й контрольной пробе в течение 12500 имп/с, а во 2-й контрольной пробе - 11950 имп/с. Значения хемилюминесценции 1~й опытной пробы (стимулированной частицами л а т е к с а , нагруженными антигеном гемолитического стафилококка составили 19200 имп/с, что существенно выше по сравнению со второй контрольной пробой. Данные хемилюминесценции других опытных проб достоверно не отличались от 2-й Контрольной пробы. На основании полученных данных диагностировано наличие специфической иммунной реакции по отношению к гемолитическому стафилококку. Отсутствие существенной разницы в показателях хемилюминесцентного свечения 1-й и 2-й контрольных проб позволяет определить гипергическую иммунную реакцию к выявленному антигену гемолитического стафилококка. Низкая напряженность иммунитета указывает на активный инфекционно-воспалительный процесс, вызванный стафилококковой инфекцией, что было подтверждено выявлением в плевральной жидкости гемолитического стафилококка в высоких титріх - 10 . Полученные данные подтверждены также нарастанием гитров антьстафилококковых антител в динамике заболевания (через 2 недели от начала Ьолезни титр антистафилококковых антител вырос в 6 раз по сравнению с исходным уровнем. При исследовании известным способом существенной разницы в показателях спонтанной, стимулированной ФГА и стимулированной гемолитическим стафилококком РЬТЦ не выявлено (процент бластных клеток соответственно 5 1629848 составил: П%, 17,2% и 18,1%), в связи с чем определение реактивности специфического клеточного иммунитета было невозможным. Это свидетельствует о преимуществе предлагаемого способа по сравнению с известным, диагностика с помощью которого невозможна при гипергических реакциях иммунитета. П р и м е р 2. Больная К., 13 лет, поступила в стационар с диагнозом: хроническая пневмония в стадии ремиссии, деформирующий бронхит. Проведено иммунологическое обследование по предлагаемому способу.Из двух капилляров крови, взятых у больной из пальца приготовлено 6 проб: 1-я контрольная с физиологическим раствором, 2-я контрольная с латексом без антигена, 1-я опытная с латексом, нагруженным легочным аьтигеном, 2-я опытная с латексом, нагруженным стафилококковым антигеном, 3-я опытная с латексом, нагруженным ' стрептококковым аллергеном, 4-я опытная с латексом, нагруженным комплексным пневмококковым аллергеном, 5-я опытная с латексом, нагруженным аллергеном' нейссерия катарралис, 6-я опытная с латексом, нагруженным сине гнойной палочкой, 7-я опытная с латексом, нагруженным туберкулином. " • В результате измерения хемилюминесценции подготовленных проб получены следующие результаты: 1-я контрольная проба 11200 имп/с, 2-я коптрольная проба 17020 имп/с. Среди опытных проб повышение хемилюмииес-т ценции отмечалось в пробах 1-й, 5-й и 7-й, на основании чего диагностирована специфическая реакция иммунитета по отношению к легочному антигену, антигену нейссерни катарралис и туберкулину. Сопоставление результатов исследования 1-й и 2-й контрольной проб позволило установить существенное повышение хемилюминесцентного свечения в 1-й пробе по сравнению со 2-й, что свидетельствует о повышенной (гиперергической) реакции иммунитете к данным антигенам, что может быть связано с хроническим инфекционным процессом. Проведенное обследование позволило уточнить окончательный диагноз: хроническая пневмония, гиперчувствительность замедленного типа в отношении легочного антигена, антигена нейссерия катарралис и туберкулина. 10 15 20 25 30 35 40 АС CQ Установленный диагноз подтвержден ' ' путем проведения комплекса иммуноло- * гичесхих исследований. Аутоиммунную реакцию на легочной антиген выявлено путем проведения реакции поглощения комплемента (по Коидрашовой Н.И.), которая была положительная (+++). : Специфичность антигена нейссерия ' , катарралис и туберкулина подтверждена путем постановки кожных проб. Кожная проба с аллергеном нейссерия катарралис была положительна (+++) через 48 ч (отмечался волдырь в диаметре более 12 мм). Проба Манту - папула 19 мм (через 32 ч ) . При исследовании известным способом РБТЛ спонтанная составляет 12%, : РБТЛ с ФГА - 2 3%, .РБТЛ с аллергеном нейссерия катарралис - 22,6%, Р-БТЛ с • легочным антигеном - 23,6%, РБТЛ с туберкулином - 41,4%, что свидетельствует об отсутствии положительных реакций со специфическими антигенами легких (нейссермя катарралис): поло-.; жительная реакция отмечена только в отношении туберкулина. • ' "* . ' В приведенном примере высокая точность предлагаемого способа подтверждена комплексом иммунологических исследований , выявляющих наличие специфической сенсибилизации к антигенам различного віща. •; • ; ' В то же время обследование предлагаемым способом не дало положительных реакций к двум из трех специфи- : ческих антигенов. Это указывает па большую /точность предлагаемого способа по сравнению с известным. 'г П р и м е р 3. Больной К., 36 лет, поступил в клинику В11ШІГИНТОКСА с диагнозом; бронхиальная астма, про- • фессионалытого геиеза. Из проф. анамнеза выяснено, что в течение 11 лет работает аппаратчиком г цеху антибиотиков по производству з биомицин^ на Немешаевском биохимзаводе . Для подтверждения диагноза необходимо установить наличие сенсибилизации к производственному антигену (биомицину) и выявить напряженность • иммунитета по отношению к выявленному специфическому антигену. Для решения поставленной задачи согласно методике предлагаемого способа создано три пробы: 1-я контрольная нестш-гмулнрованная, 2-я контрольная, стимулированная инертным латексом, 3-я опытная, стиммулировапная 1629848 S латексом, нагружённым раствором биовить специфический антиген, но и опмицина в разведении 1:10. ределить напряженность иммунитета в Получены следующие результаты: отношении данного антигена, з плане хемилюминесцентное свечение 1-й уточнения гиперерической или гиперконтрольной пробы составляв і эргической реакции иммунитета, что 12950 имп/с. 2-й контрольной пробы позволяет также отдифференцировать 28732 имп/с, 3-й опытной пробы острый и хронический инфекционный, 44260 имп/с. аллергический или аутоиммунный проНа основании полученных данных, цесс. 10 свидетельствующих о существенном поПрактическая значимость способа вышении хемилюминесценции в пробе, определяется широкой информативноссодержащей производственный антиген тью, позволяющей исследовать специфи(биомицин) по сравнению с контролем, ческие реакции иммунитета в отношеа также повышение свечения во 2-й нии самых различных антигенов (инконтрольной пробе по сравнению с 1-й фекционных, тканевых, атопических, контрольной диагностировано наличие производственных, медикаментозных сенсибилизации к биомицину и гиперэри др.), быстрым получением результагическуго реакцию иммунитета по отнотов (через час после взятия крови шению к этому антигену. Это подтверж- 20 для исследования), тогда как при исдает возможность возникновения хроследовании известным способом - тольнического заболевания (бронхиальной ко на 5 - 7-е сутки, а также высокой астмы), вызванного производственным объективностью, поскольку результаантигеном. ты исследований регистрируются печатДиагноз гиперчувствительности за- 25 ным устройством установки по измерению хемилюминесценции. медленного типа, вызванный производФ о р м у л а и з о б р е т е н и я ственным антигеном (биомицином), подтвержден постановкой реакции тормоСпособ определения иммунологичесжения миграции лейкоцитов (миграция кой реактивности организма путем долейкоцитов в агарозе, содержащей 30 бавления к лейкоцитам крови больного биомицин в разведении 1:100 , была специфического и неспецифического на 20(?% меньше по сравнению с контростимулятора с последующим учетом лем). показателей реакции на стимуляторы и( При постановке РБТЛ (по известному способу) существенной разницы между 35 без них, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности спопоказателями спонтанной, стимулирособа за счет определения состояния ванной ФГА и стимулированной специрецепторного аппарата лимфоцитов.и фическим антигеном (биомицином) не фагоцитирующих клеток,в качестве стивыявлено, что свидетельствует о больмулятора используют частицы латекса, шой точности предлагаемого способа 40 нагруженные специфическим и неспеци— по сравнению с известным. фическим антигеном, далее проводят Предлагаемым способом обследовано реакцию хемилюминесценции и при повы110 детей с различной соматической шении специфической хемилюминесцени инфекционной патологией, а также более 280 взрослых лиц в отделениях 45 ции и отсутствии разницы между показателями реакции на неспецифический клиник терапевтического профиля, стимулятор и без него определяют гипрофзаболеваний и туберкулеза. Точ'пергический тип иммунной реакции, а ность способа при этом возрастала при наличии разницы между ними опрена 62% (по известному 32%). Преимущества способа заключаются 50 деляют гипергический тип иммунной ре-, акции. также в возможности не только выяСоставитель Г.Крюкова Редактор Н.Лазаренко Техред Л.Сердюкова Корректор М,Демчик Заказ 436 Тираж 407 - Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101