Спосіб виявлення протиадена в біологічних рідинах

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в системе химикотоксикологического анализа биологических проб при количественном определении протиадена методом хроматографии в тонком слое сорбента для лекарственной коррекции во время проведения курса лечения больных. Протиаден - вещество со структурной формулой является психотропным препаратом, который при накоплении в организме обладает токсическим воздействием. Поэтому лечение необходимо проводить под наблюдением и контролем его накопления в организме. Известен способ определения протиадена с помощью газовой хроматографии, который заключается в выделении н-гексаном исследуемого вещества (протиадена), концентрировании экстракта и хроматографи-ровании с помощью пламенно-ионизационного детектора на фазе ОУ-17 (1). Однако данный метод требует сложного дорогостоящего оборудования, специальных реактивов импортного производства, а также специально подготовленных специалистов для обслуживания оборудования. Наиболее близким по технической сути является способ определения протиадена, описанный Кларком (2), заключающимся в хроматографировании протиадена в тонком слое окиси алюминия, в качестве подвижной фазы используется смесь хлороформ - метанол в соотношении 90:10, удаление подвижной фазы, проявление, при котором в качестве проявляющих реагентов применяются или серная кислота, или реактив Марки или реагент Либермана. Недостатками этого способа являются: неспецифичность проявляющих реагентов; при применении подвижной фазы хлороформ - метанол в соотношении 90:10 коэкстрактивные вещества мочи мешают определению протиадена в пробе. Задачей настоящего изобретения является создание такого способа определения протиадена, который за счет подбора совокупности операций, режимов и определенных реагентов позволяет достичь специфичности метода и повысить чувствительность определения. Поставленная задача решается тем, что в способе определения протиадена в биологических жидкостях, включающим хроматог-рафирование в тонком слое сорбента с использованием подвижной фазы, удаление остатков подвижной фазы, проявление определяемого препарата проявляющим реагентом. Согласно изобретению, готовят биологическую пробу с консервантом, экстрагируют протиаден смесью хлороформа с этилацетатом в соотношении 15:5, концентрируют полученный экстракт, после чего проводят хроматографирование в тонком слое силикагеля, причем в качестве подвижной фазы используют смесь ацетон-хлороформ-аммиак в соотношении 24:12:1, затем после удаления остатков подвижной фазы осуществляют проявление определяемого препарата хлористым палладием или ацетоновым раствором бромфено-лового синего в качестве проявляющих реагентов. Авторами было показано, что совокупность подобранных операций, режимов и соответствующих реагентов, позволили достичь специфичности определения протиадена в биологических жидкостях и повысить чувствительность определения. Для осуществления данного способа определения протиадена в биологических жидкостях необходимо пробу приготовить с консервантом, в качестве которых используют 5%-ный раствор лимоннокислый натрий или 1-2 капли гепарина. Без добавления этих веществ в результате анализа отмечено потеря препарата до 30%. Из ряда органических растворителей в качестве экстраген-тов выбрана смесь хлороформа с этилацетатом в соотношении 15:5. Этой смесью протиаден извлекается из биологических проб до 95-99%. Для удовлетворительного разделения протиадена и коэкстрактивных веществ подобрана подвижная фаза, состоящая из ацетона, хлороформа и аммиака в соотношении 24:12:1 (по объему). При применении этой системы значение Rf протиадена составляет 0,67+0,05, коэкстрактивные вещества остаются на старте. В качестве проявляющих реагентов применены 0,02%-ный раствор хлористого палладия или ацетоновый раствор бромфенолового синего с нижним пределом определения 0,5 мкг в анализируемом объеме. Способ определения протиадена пригоден для различных биологических жидкостей, наиболее информативными объектами являются кровь и моча. Исследуемые биологические пробы (кровь, моча) отбирают в подготовленную посуду с консервантом для крови или мочи. Пробы экстрагируют смесью хлороформа и этилацетата, полученный экстракт упаривают до объеме 0,5 мл. Сконцентрированную пробу наносят на закрепленный слой сорбента и хроматографирование проводят с помощью подвижной фазы смесью ацетона-хлороформа-аммиака (24:12:1). После хроматографирования пластинку высушивают на воздухе до полного удаления остатков органических растворителей. Протиаден проявляют 0,02%-ным раствором хлористого палладия или 0,02 N соляной кислоте или 0,05%-ным ацетоновым раствором бромфенолового синего. Осуществление способа подтверждается примерами конкретного выполнения. Пример 1. Для определения протиадена в крови готовят пробу с консервантом. В пробирку, содержащую 0,5 мл 5%-ного раствора лимоннокислого натрия или 1-2 кап ли гепарина и 1-2 капли 10%-ного раствора фтористого натрия, вносят 5 мл цельной крови. Приготовленную пробу крови количественно переносят в делительную воронку и дважды экстрагируют в течение 10 минут смесью хлороформа и этилацетета (15:5). Экстракты объединяют и сушат над безводным сернокислым натрием. Объединенный экстракт сливают в круглодонную колбу и при помощи ротационного испарителя при температуре 55-60°С проводят концентрирование экстракта до объема 0,5 мл. Сконцентрированную пробу количественно наносят на хроматографическую пластинку ВЭТСХ. Параллельно на пластинку наносят стандартные растворы, содержащие протиаден в количестве 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 и 25,0 мкг. Пластинку помещают в хроматографическую камеру с подвижной фазой - хлароформ-ацетон-аммиак (12:24:1). После того, как растворитель поднялся на 10 см, пластинку вынимают и оставляют на воздухе до полного удаления следов растворителя. Для проявления протиадена пластинку обрабатывают 0,02%-ным раствором хлористого палладия на 0,02 N соляной кислоте. При наличии в пробе протиадена и стандартные растворы на пластинке проявляются пятна окрашенные ярко желтого цвета на белом фоне. ЗначениеRf протиадена составляет 0.67+0,05. Пример 2. Для определения протиадена в моче в качестве консерванта используют 0,1 N раствор соляной кислоты, добавляя по 15 мл этого консерванта в 50 мл исследуемой пробы мочи. Отобранную пробу с консервантом количественно переносят в делительную воронку и дважды экстрагируют в течение 10 минут смесью хлороформа и этилацетата (15:5). Экстракты сушат над безводным сернокислым натрием и сливают в круглодонную колбу, в которой с помощью ротационного испарителя объединенный экстракт упаривают при температуре 55-60°С до объеме 0,5 мл. Сконцентрированную пробу наносят на хроматографическую пластинку ВЭТСХ. Параллельно на пластинку наносят стандартные растворы протиадена, содержащие протиаден в количестве 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 и 25,0 мкг. Пластинку помещают в хроматографическую камеру с подвижной фазой ацетон-хлороформ-аммиак (24:12:1). После того, как растворитель поднялся на 10 см, пластинку вынимают и оставляют на воздухе до полного удаления запаха растворителя. Для проявления протиадена пластинку обрабатывают 0,02 %-ным раствором хлористого палладия на 0,02 N соляной кислоте. Стандартные растворы и при наличии протиадена в пробе на пластинке проявляются пятна окрашенные ярко желтого цвета на белом фоне. Значение Rf протиадена составляет 0.67±0,05. Пример 3,4. Аналогично примеру 1,2 производят все операции: подготовка проб к анализу, концентрирование, хроматогра-фирование в тонком слое силикагеля, высушивание. Проявление осуществляют ацетоновым раствором бромфенолового синего. Стандартные растворы и при наличии протиадена в пробе на пластинке проявляются окрашенные пятна оранжевого цвета. Значение Rf протиадена составляет 0,67+40,05. Относительная ошибка определения протиадена в биологических пробах (кровь, моча) составляет 2,33%. Способ определения протиадена в крови и моче позволяет определить на уровне 0,5 мкг исследуемого соединения в пробе, коэкстрактивные вещества не мешают определению протиадена в биологических пробах. Осуществление способа определения пpoтиадена в биологических пробах не требует сложной аппаратуры, и дорогостоящих импортных реактивов.