Спосіб виявлення та ідентифікації мікобактерій

Изобретение относится к биологии и медицине. Известен бактериоскопический способ выявления и идентификации микобактерий (см.Bares J.H. Diagnosis of tuberculosis Chest 1979. ν. 76, p. 757-763), заключающийся в приготовлении препарата, его окрашивании по Циль-Нильсону и визуализации под микроскопом. Однако при обнаружении микобактерий под микроскопом невозможно не только идентифицировать, но и определить наличие микобактерий, если количество микробных клеток не превышает 100000 в 1 мл жидкости. Известен бактериологический способ выявления микобактерий (см.Bates J. Improvements in the diagnosis of tuberculosiS.Am. Rev. Resplr DIs 1987, v.134; p.415-417), заключающийся в посеве культуральной жидкости на питательную среду и помещении ее в термостат при 37°С на 4-10 недель. Однако данному способу присущи следующие недостатки: во-первых, он длительный, так как, для его осуществления необходимо культивирование микобактерий в течение 4—10 недель; во-вторых, для обнаружения микобактерий необходимо не менее 40-100 клеток в 1 мл жидкости, что также снижает информативность способа. Известен биологический способ выявления и идентификации микобактерий (см. Р.Драбкина. Микробиология туберкулеза. М.. 1963 г., с.100-103) путем введения в организм животного (кролики, морские свинки) исследуемого материала. По истечении 3-4 недель животных забивают и производят учет результатов, По изменению внутренних органов судят о наличии микобактерий и их видовой принадлежности. Однако данному способу присущи следующие недостатки: во-первых, он длительный, так как для его осуществления необходимо от 3 до 4 недель; во-вторых, он недостаточно информативен, так как позволяет идентифицировать патогенные только для данного животного микобактерий. Известен способ выявления и идентификации микобактерий (см.Roberts Μ.С. Me МІІІап. Whole cromosomal DNA probes for rapid identification of Micobactetlum tuberculosis and Micobacterium avium compex. J. Clln. Microbil. 1987, v.25. p.1239-1243) путем выделения микобактериальной ДНК из чистой культуры и гибридизации микобактериальной ДНК со специфическими РНК, ДНК-зондами. При наличии микобактериальной ДНК в исследуемом образце образуется ковалентная связь между участками ДНК микобактерий и меченной ДНК-зондом, что позволяет судить о наличии или отсутствии микобактерий определенного вида. Однако данный способ неприменим для выявлений и идентификации микобактерий в клиническом материале из-за присутствия в нем не только ДНК микобактерий, что, следовательно, снижает информативность способа. Наиболее близким предложенному является способ выявления и идентификации микобактерий (см; Pao C.C., Lin S.S. et. al. The detection of mlcobacterial DNA sequnces in incultured clinical specimeus with cloned Micobacterium tuberculosis DNA as probes. Tubercle 1988; v.69, N 1, p. 27-36), включающий посев мокроты на питательную среду, инкубацию посевного материала в термостате в течение 4-10 недель, выявление микобактерий туберкулеза, выделение суммарной микобактериальной ДНК, клонирование микобактериальной ДНК, получение радиоактивных ДНК-зондов из клонированных фрагментов, выявление и идентификацию микобактерий с помощью гибридизации радиоактивных ДНК-зондов с микобактериальной ДНК. Выявление и идентификация микобактерий проводилась из клинического материала в то время, как выявление и идентификация других видов микобактерий проводилась из чистых, несмешанных между собой культур. Следует отметить, что гибридизация ДНК-зонда с ДНК микобактерий туберкулеза равна 100%, а для ДНК прочих микобактерий и микроорганизмов других классов она составила: Однако и данному способу присущи следующие недостатки: во-первых, он трудоемкий, т.к. для выявления и идентификации микобактерий туберкулеза необходимо выделить из клинического материала чистую культуру микобактерий туберкулеза, т.е. провести дополнительно бактериологическое и бактериоскопическое исследования; во-вторых, он длительный, т.к. для его осуществления необходимо не менее 4-х недель; в-третьих, он небезопасен, поскольку для получения меченных ДНК-зондов при меняется радиоактивный фосфор; в четверть он не позволяет идентифицировать один вид микобактерий от другого и прочих классов микроорганизмов, что снижает его информативность; кроме того, для выявления микобактерий туберкулеза необходимо, чтобы в среде было не менее 50000 клеток микобактерий туберкулеза, что в свою очередь снижает чувствительность способа. В основу изобретения поставлена задача создания способа выявления и идентификации микобактерий, в котором выделяют из клинического материала суммарную ДНК, амплифицируют ДНК микобактерий, проводят гель-электрофорез амплифицированно-го фрагмента ДНК микобактерий, расщепляют его рестрикционными эндонук-леазами с последующим Гель-электрофорезом, чем обеспечивают быстрое, точное и безопасное выявление микобактерий из культуральной жидкости, даже при наличии единичных микобактериальных клеток, что позволяет рекомендовать его в качестве экспресс-способа для выявления и идентификации микобактерий. а следовательно, назначать, в случае необходимости, адекватное лечение в минимальные сроки. Поставленная задача решается тем, что в способе выявления и идентификации микобактерий, включающем выделение суммарной ДНК микобактерий из клинического материала, выявление микобактерий с помощью маркеров и их идентификацию согласно изобретению выделяют из клинического материала суммарную ДНК, амшшфицируют ДНК микобактерий, проводят гель-электрофорез амплифицированно-го фрагмента ДНК микобактерий, расщепляют его рестрикционными эндонук-леазами с последующим гельэлектрофорезом и выявляют микобактерий с помощью праймеров по наличию амплифицированно-го фрагмента ДНК микобактерий, а по количеству образовавшихся полос в результате расщепления рестрикционными эндонукле-азами идентифицируют микобактерий. Способ осуществляется следующим образом. Из клинического материала (мокрота, кровь) больного выделяют суммарную ДНК (человеческую, бактериальную) по общепринятой методике (см. Mizugas Y. Metod for deoziribonucleik asld from mycobacteria. 1970, v. 104, pp. 1-1020). Затем проводят амплификацию фрагмента микобактериальной ДНК. Для проведения амплификации необходима реакционная смесь в объеме 100 мл, содержащая 1 мкгсуммарной ДНК(выделенной из клинического материала), 1-кратный солевой %фер, 2 праймера: 1 мМ каждого. 4 dNTPO,2 мМ каждого и 2,5 ед Tag полимера-зы. Приготовление реакционной смеси ведется по общепринятой методике (cM.lnis MA PCR protocoI-1990, London, Acad Pres. p,3~12). В качестве маркеров в реакционной смеси использовали праймеры: 1-й 5 -ag ate gag ctg gag g; 2-й 5 - де tgc age cca aag д. Для амплификации использовали фрагмент последовательности микобактерий ДНК, кодирующий микобактериальный антиген. Затем проводили гельэлектрофорез амплифицированного фрагмента микобактериальной ДНК. Амплифицированный фрагмент исследовали в 4% агарозном или 8% полиакрила-мидном геле с окрашиванием бромидом этидия. О наличии в геле амплифицированного фрагмента микобактериальной ДНК судили по наблюдаемой флюоресценции бромида этидия под ультрафиолетовым светом, ин-теркалированного в молекулу ДНК. Размер амплифицированного фрагмента микобактериальной ДНК оценивали по ДНК известного размера, которая вносилась в соседнюю ячейку геля одновременно с анализируемой пробой. Наличие в геле полосы размером 381 пара нуклеотидных остатков (п.н.о) позволяло судить об амплификации фрагмента микобактериальной ДНК, что свидетельствовало о наличии в клиническом материале микобактерий. Для идентификации микобактерий, присутствующих в клиническом материале, амплифицированный фрагмент микобактериальной ДНК расщепляли рестрикционными эндонуклеазами: Hru1, Nco1; после чего расщепленный амплифицированный фрагмент микобактериальной ДНК наносили на гелевую пластинку и проводили гель-электрофорез. При расщеплении амплифицированного фрагмента микобактериальной ДНК ре-стрикционной эндонуклеазой Nru1 наблюдали в геле две полосы размером 253 и 128 п.н,о., что свидетельствовало о наличии в клиническом материале M.tuberculosis. При расщеплении амплифицированного фрагмента микобактериальной ДНК ре-стрикционной эндонуклеазой Nco1 наблюдали в геле полосы размером 317 и 64 п.н.о., что свидетельствовало о наличии в клиническом материала M.fortuitum. В качестве контроля использовали расщепленную рестрикционными эндонуклеазами ДНК микобактерий, выделенную из чистых микобактериальных культур. Для определения чувствительности способа использовали различные титры культур микобактерий, содержащие 7 χ 106, 7 χ 10 , 700, 70,7 клеток микобактерий, что позволило сделать вывод о возможности выявления даже единичных клеток микобактерий. Примеры конкретного выполнения. Пример 1. Больной К. Диагноз: ин-фильтративный туберкулез верхней доли левого легкого в фазе обсеменения и распада. Для уточнения диагноза использовали способ выявления и идентификации микобактерий. 9.02.93 г. из 1 мл мокроты выделили суммарную дозу ДНК. Затем проводили амплификацию фрагмента микобактериальной ДНК. Для проведения амплификации использовали праймеры; 1-й 5' -ag ate gag ctg gag g; 2-й 5' -де tgc age cca aag g. О наличии амплифицированного фрагмента микобактериальной ДНК судили по наблюдаемой в геле, после проведения электрофореза, флюоресценции бромида этидия под ультрафиолетовым светом, интеркалированного в молекулу ДНК. Наличие в геле полосы размером 381 п.н.о. позволило судить об амплификации фрагмента микобактериальной ДНК, что свидетельствовало о присутствии в мокроте микобактерий. Для идентификации микобактерий, присутствующих в мокроте, амплифицированный фрагмент микобактериальной ДНК расщепляли рестрикционной эндонуклеазой Nru t, после чего амплифицированный фрагмент микобактериальной ДНК вносили в ячейку геля и проводили гель-электрофорез Наличие в геле полос размером 253 и 128 п.н.о., полученных в результате расщепления амплифицированного фрагмента ми-кобактериальной ДНК рестрикционной эндонуклеазой Nru 1, свидетельствовало о присутствии в мокроте больного К. микобак-терий туберкулеза. Результат был получен 11.02.93 г. В качестве контроля использовали посев исследуемой мокроты на питательную среду. Мокрота была посеяна 9.02.93 г. 1.02.93 г. производили учет результатов; Наличие М. tuberculosis было подтверждено бактериологическим способом. Пример 2. Больная С. Диагноз: ретикулярный саркоидоз легких, саркоидоз лимфатической системы, туберкулез легких под вопросом. Для уточнения диагноза использовали способ выявления и идентификации микобактерий. 13.07.93 г. из 1 мл мокроты выделили суммарную ДНК. Затем проводили амплификацию предполагаемого фрагмента микобактериальной ДНК. Для проведения амплификации использовали праймеры: 1-й 5' -ag ate gag ctg gag g; 2-й 5-gc tgc agecca aag g. Затем проводили гель-электрофорез ам-плифицируемой пробы в 4% агарозном геле с окрашиванием бромидом этидия. Отсутствие в геле полосы свидетельствовало о том, что фрагмент микобактериаль-ной ДНК размером 381 п.н.о не амплифицировался, что свидетельствовало об отсутствии в исследуемой мокроте микобактерий. Результат был получен 15.07.93. В качестве контроля использовали посев исследуемой мокроты на питательную среду. Мокрота была посеяна 13.07.93 г. 10.08.93 г. проводили учет результатов. Отсутствие М.tuberculosis было подтверждено бактериологическим способом. Пример 3. Больной Т. Диагноз: хронический обструктивний бронхит, эмфизема легких, туберкулез легких под вопросом. Для уточнения диагноза* использовали способ выявления и идентификации микобактерий. 27.07.92 г. из 1 мл мокроты выделяли суммарную ДНК. Затем проводили амплификацию предполагаемого фрагмента мико-бактериальной ДНК. Для проведения амплификации использовали праймеры: 1-й 5' -ag ate gag ctg gag g; и 2-й 5' -де tgc age cca aag g. Затем проводили гель-электрофорез амплифицируемой пробы в 4% агарозном геле с окрашиванием бромидом этидия. О наличии в геле амплифицированного фрагмента микобактериальной ДНК судили по наблюдаемой флюоресценции бромида этидия под ультрафиолетовым светом, интеркали-роваиного в молекулу ДНК. Наличие в геле полосы размером 381 п.н.о. позволило судить об амплификации фрагмента микобактериальной ДНК, что свидетельствовало о присутствии в мокроте микобактерий. Для идентификации микобактерий, при?-сутствующих в мокроте, амплифицированный фрагмент микобактериальной ДНК расщепляли рестрикционной эндонуклеазой Nru 1, после чего амплифицированную пробу вносили в ячейку геля и проводили гель-электрофорез. Наличие в геле полос размером 253 и 129 п.н.о., полученных в результате расщепления амплифицированного фрагмента микобактериальной ДНК рестрикционной эндонуклеазой Nru 1, свидетельствовало о присутствии в мокроте больного К. микобактерий туберкулеза. Результат был получен 30.07.92 г. В качестве контроля использовали посев исследуемой мокроты на питательную среду. Мокрота была посеяна 27.07.92 г. 27.08.92 г. производили учет результатов, Нянчив Μ.tuberculosis было подтверждено бактериальным способом. Для проверки эффективности лечения 17.08.93 г. из 1 мл мокроты вышеописанным способом была выделена и идентифицирована M.tuberculosis. В то время как при бактериальном посеве на питательную среду результаты были отрицательными. На основании полученных результатов лечение было продолжено. При последующем исследовании бактериологическим и предложенным способом микобактерий выявлены не были. Пример 4. Больной Б. Диагноз: диссеменированный туберкулез легких в фазе распада. Для уточнения диагноза использовали способ выявления и идентификации микобактерий. 17.02.93 г. из 1 мл крови выделяли суммарную ДНК. Затем проводили амплификацию предполагаемого фрагмента микобактериальной ДНК. Для проведения амплификации использовали праймеры: 1-й 5' -ag ate gag ctg gag g; 2-й 5' -де tgc age cca aag g. Затем проводили гель-электрофорез ам-плифицируемой пробы в 4% агарозном геле с окрашиванием бромидом этидия. О наличии в геле амплифицированного фрагмента микобактериальной ДНК судили по наблюдаемой флюоресценции бромида этидия под ультрафиолетовым светом, интеркали-рованного в молекулу ДНК. Наличие в геле полосы размером 381 п.н.о. позволило судить об амплификации фрагмента микобактериальной ДНК, что свидетельствовало о присутствии в крови микобаггерий. Для идентификации микобактерий, присутствующих в крови, амплифицированный фрагмент микобактериальной ДНК расщепляли оестрикционными эндонуклеазами Nru1 щ Eagi, после чего амплифицирован-ную пробу вносили в ячейку геля и проводили гель-электрофорез. Наличие в геле полос размером 164 и 129 п.н.о., полученных в результате расщепления амплифицированного фрагмента микобактериальной ДНК рестрикционной эндонуклеазой Nru 1, свидетельствовало о присутствии в крови больного К. микобактерий туберкулеза. Результат был получен 20.02.93 г. В качестве контроля использовали посев исследуемой крови на питательную среду. Кровь была посеяна 17.02.93 г. 22.03.93 г, производили учет результатов. Присутствие в крови M,tuberculosis было подтверждено бактериологическим способом. Наличие в геле полос размером 196 и 178 п.н.о., полученных в результате расщепления рестрикционной эндонуклеазой Eag 1, свидетельствовало о присутствии в крови M.fortultum. После проведенного лечения проводили исследования крови с помощью бактериологического и предложенного способов. Результаты были отрицательными. Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с прототипом: во-первых, менее трудоемкий так как для его осуществления не применяется дополнительно бактериологический способ исследования; во-вторых, он безопасный, так как для его выполнения не используются радиоактивные вещества; в-третьих, он позволяет достоверно идентифицировать один вид микобактерий от другого и прочих классов микроорганизмов; в-четвертых, он высокочувствительный, благодаря тому, что позволяет выявить и идентифицировать в клиническом материале даже единичные клетки микобактерий; кроме того, он значительно сокращает время выявления и идентификации микобактерий (с четырех недель в прототипе - до трех дней по предлагаемому способу), что позволяет рекомендовать его в качестве экспресс-способа, а следовательно назначить адекватное лечение в минимальные сроки.