Спосіб оцінки рівня оксидативного стресу у дітей

Винахід, що заявляється, відноситься до медицини, точніше до педіатрії, і призначений для діагностики захворювань дітей. В наш час роль оксидативного стресу (ОС) доведено в генезі більш, ніж 100 захворювань. ОС виявляється гіперпродукцією вільних радикалів кисню та порушенням прооксидантно-антиоксидантного балансу. Зокрема, ОС знижує ендотелій-залежну релаксацію і відіграє велику роль у формуванні артеріальної гіпертензії, атеросклерозу. Зростання продукції супероксидного радикалу-аніону сприяє активації симпатичного відділу вегетативної нервової системи [1], крім того він активує ангіотензин-перетворюючий фермент з тривалою інгібіцією синтази оксиду азоту [2]. Джерелом радикальних форм кисню є різноманітні внутрішньоклітинні процеси: транспорт електронів в ендоплазматичному ретикулумі, мітохондріях, "респіраторний" вибух у фагоцитах. Нижче наведені основні реакції утворення радикальних форм кисню. Перекис водню утворюється в клітинах при ферментативній дисмутації радикал-анонів (3) або в інших окислювальних реакціях, а розпадається з утворенням більш активних гідроксильних радикалів за реакцією Габера-Вейса (5), каталітичну роль в якій відіграють іони металів з перемінною валентністю (залізо, мідь). O 2 +`e ® O 2 · (1) O 2 · +H + ® ·O 2 H (2) O 2 · +O 2 · +2H+ ® H2 O 2 + O 2 (3) O 2 · +Fe3 + ® O 2 + Fe 2+ (4) H2 O 2 + Fe 2+ ® Fe3 + + OH` + OH × (5) Незважаючи на успіхи у вивченні ОС, діагностичні підходи розроблені поки що недостатньо. Так, відомі способи діагностики рівня ОС за рівнем перекисного окислення ліпідів (ПОЛ)[3]. Методом газоворідинної хроматографії вимірюються спектри жирних кислот, біохімічні дослідження дозволяють визначити вміст продуктів ПОЛ в крові. Однак дані дослідження дають орієнтовне уявлення і дозволяють лише оцінити кінцевий результат ОС, крім того, вони інвазивні і внаслідок процедурного стресу негативно впливають на перебіг захворювання. Найближчим аналогом (прототипом) способу, що заявляється, є спосіб біохемілюмінісценції, який дозволяє визначити ступінь вільно радикального окислення. Однак, цей метод чутливий, але мало специфічний, крім того він інвазивний [4]. Задача, яка вирішується у даному винаході полягає у визначенні вмісту маркерів оксидативного пошкодження ДНК в сечі хворих дітей, що забезпечує безпечне, неінвазивне, нешкідливе для хворого дослідження. Може використовуватись з самого раннього віку. Технічний результат дозволяє отримати високочутливу та специфічну діагностику рівня оксидативного стресу у дітей. Поставлена задача вирішується завдяки тому, що у відомому способі оцінки оксидативного стресу, який передбачає визначення ступеня вільно-радикального окислення, згідно винаходу визначають ступінь вільнорадикального окислення по наявності маркерів оксидативного пошкодження ДНК 8-оксогуаніну та 8-гідроксі-2'деоксігуанозину в добовій сечі, розраховують їх кількість і оцінюють рівень оксидативного стресу у дітей. Основною відмінністю способу, що заявляється, є оцінка рівня оксидативного стресу за допомогою визначення в добовій сечі хворих дітей вмісту маркерів 8-оксогуаніну (8-oxoG) та 8-гідроксі-2'-деоксігуанозину (8oxodG) з використанням твердофазної екстракції і наступною спектрофотометрією на СФ-46. Перевагами даного методу оцінки рівня ОС є його неінвазивність, висока чутливість і специфічність. Спосіб здійснюється наступним чином. Хворим, що поступили в стаціонар проводиться збір добової сечі, потім 15мл сечі відбирається для проведення. Швидкість екскреції та вміст 8-oxodG та 8-oxoG екстрагують із сечі на колонці твердофазної екстракції ("Merck", Німеччина). Аліквоту сечі з А280=50о.о. наносять на колонку, яку попередньо промивають 5 мл метанолу, 10 мл дистильованої води і врівноважують 10мл 50мМ КН2РО4 буфером з рН7,5. Колонку промивають цим буфером до того часу, поки A280 не дорівнювало 0,1-0,2. Промивку колонки повторюють 2 рази 2мл метанолу, розведеного 50 мМ KH2PO4 буфером, збираючи кожну фракцію окремо. Елюювання 8-oxodG проводили 15% метанолом на 50мМ КН3РO4 з рН5,5, а 8-oxoG – 100% метанолом з рН5,5. Спектрофотометрію кожної фракції проводили на СФ-46 з реєстрацією значень А при 250, 260, 280, 293нм. При аналізі спектральних характеристик фракцій встановлюють рівень окисленого гуаніну та гуанозину. Проводиться ідентифікація компонентів фракцій елюатів за допомогою тонкошарової хроматографії на пластинках Silufol (Чехія) в системі розчинників ізопропанол+аміак+вода (7:2:1 по об'єму). Швидкість екскреції любої компоненти розраховують в нмоль/добу на 1г маси тіла за формулою: V ´ å( Ci ´ Vi ) R ek = Vappl ´ W де: Rek - швидкість екскреції окисленого гуаніну або гуанозину; V - загальний об'єм сечі за добу; Vi - об'єм фракції елюату; Vappl - об'єм сечі, нанесеної на колонку; W - маса тіла дитини. Спосіб не потребує значних зусиль з боку медичного персоналу. Під спостереженням знаходилось 49 дітей (21 дівчинка та 29 хлопчиків) віком 9-16 років з вегетативними дисфункціями (ВД). Дослідження крім загально клінічного включало визначення добового профілю артеріального тиску та стану вегетативного гомеостазу. У 7 обстежених відмічалась стабільна артеріальна гіпертензія (САГ), у 11 - лабільна артеріальна гіпертензія (ЛАГ), у 32 - нестабільний артеріальний тиск (НестАТ). Згідно даних кардіоінтервалографії у 5 дітей виявлено ваготонію, у 27 - симпатикотонію, у решти - амфотонію. Маркери 8-oxoG і 8-oxodG виділяли з добової сечі з використанням твердофазної екстракції з наступною спектрофотометрією на СФ-46. Встановлено, що у всіх обстежених дітей з сечею виділяються маркери ОС. Рівень 8-oxoG відмічався в межах 0,44-5,38нмоль/добу/г маси тіла, 8-oxodG - в межах 0,67-14,9нмоль/добу/г. В середньому показники 8-oxoG і 8oxodG достовірно відрізнялись у хворих з ВД в порівнянні з контрольними (відповідно 2,78±1,53нмоль/добу/г проти 0,94±0,03 нмоль/сутки г; Р