Протимікробний та противірусний препарат з шишок вільхи

Винахід відноситься до ветеринарії та може бути використаний для лікування кишкових інфекцій, гнійних ран та вірусних інфекцій у ветеринарії. Антибіотики, що зараз використовують в лікуванні інфекційних захворювань, діють на специфічні етапи поділу або метаболізму мікробних клітин. Наприклад, фторхінолони є інгібіторами ферменту гірази, що приймає участь в реплікації ДНК у прокаріот [1]. Але в останній час з'явилося багато мутантних штамів мікроорганізмів, які не чутливі до антибіотиків [2]. Лікування тварин, інфікованих такими штамами, є неефективним та призводить до загибелі тварин або втрати продуктивності. Кишкові інфекції є однією з найпоширеніших причин загибелі телят в перші дні після народження. Причиною цих захворювань, як правило, є представники родин Escherichia та Salmonella. Також велика група ентеритів викликається вірусами [3]. Відсутність на ринку ветеринарних препаратів недорогих ефективних рослинних ліків з новими механізмами антимікробної та противірусної дії, висока вартість і невелика ефективність імпортних засобів є причиною необхідності розробки рослинного препарату з вітчизняної сировини. Найпоширенішими в останній час групами препаратів для лікування кишкових інфекцій у тварин є сульфаніламіди (СА) та фторхінолони (ФХ) [4]. Інші препарати, такі як тетрацикліни, або пеніциліни в останній час мало використовують у зв'язку з наявністю плазмід з факторами нечутливості. СА та ФХ мають ряд недоліків: це наявність стійких штамів мікроорганізмів, необхідність використовувати високі дози препарату завдяки механізму дії у випадку СА, токсичний вплив на кровотворення та імунітет, наявність екологічно небезпечних продуктів при виробництві СА та ФХ, ці засоби є дуже коштовними, сировинна база ФХ та СА на Україні відсутня. Прототипом є сухий порошок з листя Вільхи японської як антисептичний препарат для перорального використання [5]. Однак, недоліками цього препарату є те, що використовувався відсутній на Україні вид Вільхи - Вільха японська (Alnus japonica), антисептичні властивості препаратів досліджені тільки при зовнішньому застосуванні, екстракт Вільхи японської погано розчиняється у воді, активність його підтверджена тільки на моделі Ешерихіозів та Сальмонельозів, а при інших інфекціях препарат був малоефективним, окрім того екстракт отримували з листя рослини, не використовували лужний або кислотний гідроліз екстракту для підвищення ефективності і розширення спектру дії препарату. В основу винаходу поставлено задачу розробити протимікробний та противірусний препарат з шишок вільхи шляхом водної екстракції шишок Вільхи клейкої або сірої у співвідношенні 1:20 з наступним випаровуванням екстракту в присутності лугу при рН=9,5 або кислоти при рН=2,5 або без них при рН=7-8, щоб забезпечити широкий спектр дії протимікробного та противірусного препарату з шишок Вільхи клейкої та Вільхи сірої. Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок про те, що "Протимікробний та противірусний препарат з шишок вільхи клейкої та вільхи сірої" відрізняється від існуючого прототипу ефективністю та спектром дії та відповідає критерію "новизна". Препарат отримують таким чином. Шишки вільхи загружають в екстрактор та заливають дистильованою водою, кип'ятять, після чого випаровують, отримують кристали препарату. Приклад 1 1кг шишок вільхи клейкої або сірої загружали в екстрактор та заливали 20л води дистильованої, кип'ятили 20 хвилин, рідину зціджували та випаровували в присутності лугу або хлороводневої кислоти (рН повинна бути 9,5 або 2,5 відповідно чи 7,5-8 без гідролізу) або без них. Утворювалися сіро-брунатні кристали екстракту. 100г отриманих кристалів екстракту розчиняли у 1000мл 50% гліцерину. Утворений 10% розчин досліджували далі. Приклад 2 1кг шишок вільхи клейкої або сірої екстрагували в апараті Сосклета 2 літрами дистильованої води до прозорого та безкольорового забарвлення екстракту. Отриманий екстракт підлужували до рН=9,5 або підкислювали до рН=2,5 або без лугу та кислоти висушували в сушильній шафі або іншим методом до утворення кристалів препарату. Розчинення кристалів проводили як написано в прикладі 1. Приклад 3 Протимікробну дію препарату перевіряли методом лунок в агарі (МПА) та методом гальмування росту в рідкому середовищі (МПБ). Плавили агар, охолоджували його до температури 37-39°С, додавали 105 клітин мікроорганізмів згідно еталону мутності, розливали на дно чашок Петрі, розставляли 6 металевих трубок, розливали ще один шар агару без мікробних клітин. Після охолодження агару, трубки виймали, до лунок додавали водний розчин препарату у відповідній дозі, та фіксували зону затримки росту мікроорганізмів. Як контроль використовували бензилпеніцилін в концентрації 0,5% [6]. Як тест-мікроорганізми використовували Е.соlі шт. "Basic", St.aureus шт. "White", Str.pyogens. шт. "Біо-2", Salmonela tnteritidis (польовий). Результати досліджень представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Назва мікроорганізму та зона Зона затримки росту (мм) при відповідних концентраціях затримки росту препарату (%) Концентрації: 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0 Е.coli 1,4±0,2 1,8±0,2 2,2±0,3 2,6±0,3 2,8±0,3 St.aureus 1,1±0,2 2,0±0,2 2,5±0,3 2,9±0,3 2,9±0,3 Str.pyogenes 0,5±0,1 0,8±0,1 1,8±0,2 2,5±0,3 2,8+0,3 Salm.enteritidis 0,5±0,1 1,5±0,2 2,2±0,3 2,6±0,3 2,9±0,3 0,5% бензилпеніцилін 2,0±0,3 2,5±0,3 2,2±0,3 2,0±0,3 Як видно з таблиці, отриманий екстракт мав протимікробні властивості щодо всіх досліджених мікроорганізмів, та найбільшу активність проявив у випадку Е.coli та St.aureus. Оптимальна концентрація препарату 0,5 та 1,0% в розчині. Приклад 4 Було обстежено 180 телят, з них встановлено 124 з ешеріхіозним ентероколітом, 21 - з сальмонельозним та 15 з вірусним ентеритом, 20 - з герпетичним кератокон'юнктивітом. Препарат, що патентується, для лікування кишкових розладів використовували як стандартизований 10% розчин на гліцерині для подальшого розведення на воді, 0,9% розчині натрію хлориду або іншому розчиннику. Препарат залишали розведеним у розчиннику протягом всього періоду лікування. 110-и тваринам з ешеріхіозом, 15 - з сальмонельозом та 13 з вірусним ентеритом давали розчин препарату, що патентується, в дозі 30мг/кг (виходячи з дози 0,5-1% в розчині при дослідженнях in vitro) щодобово протягом 3 діб. Іншим контрольним тваринам давали воду. Ознаки ентериту після використання препарату зникали за добу, телята, яких лікували, залишилися жити. Одне теля з вірусним ентеритом загинуло. Тоді як не ліковані тварини (12 з ешерихіозом, 5 з сальмонельозом та всі з вірусним ентеритом) загинули. Бактеріологічні дослідження підтвердили мікробну причину ентеритів (окрім невстановлених). У всіх випадках спостерігали мікробне обсіменіння ентеритних ран 4 ступеня. Посів у контролі виявив Е.coli у нетоксичній концентрації у всіх тварин, сальмонел виявлено не було. Для лікування герпетичного кератокон'юнктивіту використовували розведення препарату 1:10 на дистильованій воді, при цьому 10 телятам вводили препарат в обидва ока 2 рази протягом 3 діб, 10 тварин в контролі залишали не лікованими. Всі тварини в контролі осліпли, тоді як 9 лікованих тварини одужали і тільки одне теля осліпло на одне око. Таблиця 2 Результати порівняння препарату із прототипом Назва хвороби Препарат, що патентується (кількість загиблих тварин проти контролю, який не лікували) Форма використання Перорально доза 30мг/кг в розчині Ешерихіозні ентероколіти Сальмонельозні ентероколіти Вірусні ентероколіти Герпетичні кератокон'юнктивіти 110/0 15/0 13/1 10/1 Прототип (кількість загиблих тварин) Перорально доза 450мг/кг порошку 100/52 52/27 Не досліджували Не досліджували Як видно з таблиці, ефективність препарату, що патентується, при 10 - кратно меншій дозі перевищує за активністю (в три рази) та спектром дії препарат прототипу. Таким чином антимікробний та противірусний екстракт з шишок Вільхи клейкої та Вільхи сірої має значні переваги над прототипом та може бути використаний для виготовлення препаратів для лікування мікробних та вірусних ентеритів, герпетичних кератокон'юнктивітів та кератитів. Джерела інформації: 1. Красильников А.П. Химиотерапия и антисептика // Антибиотики и химиотерапия. -1990. -№10. -С.24-25. 2. Исаев С.Г., Волкова Н.А., Евдокимова О.С. Направленный поиск антибактериальных средств на основе 2этокси-6,9-диаминоакридина и некоторых замещенных бензойной кислоты. // Химия физиол. активн. соед. -1989. -С.112-114. 3. Mebus С.А., Stair E.Z., Rhodes M.B. et al. Pathology of neinatal calf diarrhea induced by a coronavirus like // Vet.Pathology. -1973. -№10. -P.45-64. 4. Gantz N.M. Quinolones: a new class of antymicrobial agents with wide potential uses // Medical Clinics of North America. -1988. V.72, №3. -P.623-633. 5. A01N65/00 A61L9/01. // Нансеї Грін, Гушікен Тсутому, Хіга Хіротоаке. Спосіб отримання нового антисептику з листя Вільхи японської, що нетоксичний для тварин. Патент Японії №08239307 А за заявкою №07350371 від 22.12.95, яка опублікована 17.09.96. 6. Исаев С.Г., Волкова Н.А., Евдокимова О.С. Направленный поиск антибактериальных средств на основе 2этокси-6,9-диаминоакридина и некоторых замещенных бензойной кислоты. // Химия физиол, активи, соед., 1989. C.112.