Протимікробний засіб

Винахід належить до галузі медицини і фармації, а саме до фармацевтичної хімії і може бути використаний для лікування урогенітального хламідіозу й туберкульозу. Відомі ефективні протимікробні засоби антихламідійної дії (антибіотики тетрациклінового ряду, антибіотики-макроліди, сульфаніламідні препарати), а також протитуберкульозної дії (Ізоніазид і рифампіцин). Сполука N-(9-флуореніліден)-N'-Ізонікотиногідразид формули відома [Патент Великобританії №722679 від 26.01.55], але ніде не застосовувалась, бо не була вивчена з точки зору її утилітарних властивостей, зокрема протимікробних. Найближчого структурного аналога щодо антихламідійної активності заявлений об'єкт не має ні у вітчизняній, ні у світовій медичній літературі. Для лікування хламідійної інфекції застосовують антибіотики тетрациклінового ряду (тетрациклін, окситетрациклін, метациклін), антибіотики макроліди (еритроміцин, рифампіцин), сульфаніламідні препарати (етазолнатрій). Недоліком використання згаданих препаратів є їх здатність викликати кандидамікоз, септицемію, фотосенсибілізацію, алергічні реакції, зміну крові [1]. Найближчим структурним аналогом заявленого об'єкта з точки зору протитуберкульозної дії є найефективніший у даний час туберкулостатик Ізоніазид (синоніми: ГІНК, тубазид тощо). Ізоніазид у хімічному відношенні представляє собою гідразид Ізонікотинової кислоти формули Ізоніазид має високу туберкулостатичну дію. Його застосовують у комбінації з Іншими, хоч і менш активними, протитуберкульозними засобами, а також у поєднанні з вітаміном В6 і глютамінатною кислотою. Недоліком використання Ізоніазиду і відомих туберкулостатиків є стійкість до них мікобактерій туберкульозу (МБТ). Відносне збільшення Ізоніазидостійких форм бактерій (особливо, у вперше виявлених хворих). При лікуванні ізоніазидом у хворих виникають побічні реакції, зокрема, ураження печінки, що перешкоджає проведенню ефективної хеміотерапії. Ізоніазид протипоказаний хворим на епілепсію, психічні та нервові хвороби, атеросклероз, хворим з розладами печінки та нирок. Формування лікарської стійкості бактерій, виявлення токсичних властивостей препаратів і їх Індивідуальної непереносимості спонукають до пошуку і впровадження нових активніших засобів, які мають низьку токсичність. За основу винаходу поставлено задачу розширити спектр промікробних засобів. Поставлену задачу вирішують таким чином, що як протимікробний засіб використовують N-(9флуореніліден)-N'-Ізонікотиногідразид (флуренізид). Винахідницький рівень полягає в неочевидності створення вказаного засобу. Протимікробну активність N-(9-флуореніліден)-N'-Ізонікотиногідразиду вивчено щодо мікобактерій Chlamidia trachomatis, а також туберкульозу (на прикладі Мус. tuberculosis hominis H 37RV). Анти хламідійну активність N-(9-флуореніліден)-N'-ІзонІкотиногІдразиду вивчено при експериментальній хламідійній Інфекції (штам L2, венерична лімфогранульома) в досліді на курячих ембріонах, які розвиваються. Приклад 1. Визначення антихламідійної активності N-(9-флуоренІлІден)-N'-Ізонікотиногідразиду на курячих ембріонах, які розвиваються. Зараження здійснюють у жовтковий мішок 7-денних курячих ембріонів у дозі 10 ЛД50/ембріон. Загибель контрольних ембріонів при цьому становила 90%. Препарат вводять одномоментно зі збудником в об'ємі 0,5 мл/ембріон. У кожному експерименті використовують не менше 20 ембріонів. Термін спостереження за ембріонами становить 12 днів. Ефективність N-(9-флуореніліден)-N’-нікотиногідразиду оцінюють за ступенем захисту (визначають як різницю у виживанні між дослідною і контрольною групами), середніми термінами загибелі і повному попередженні загибелі курячих ембріонів, які розвиваються. Статистично достовірність одержаним результатів оцінюють за методом ФІшера Стьюдента. Як еталон порівняння антихламідійної дії застосовують етазол-натрій - один з активних хеміотерапевтичних препаратів, які застосовують у медичній практиці для лікування хламідіозів. Етазол-натрій використовують у вигляді водного розчину, а N-(9-флуоренІлІден)-N’-Ізонікотиногідразид розчиняють у твіні-80. Порівняльна оцінка антихламідійної активності досліджуваних препаратів на моделі експериментальної інфекції у курячих ембріонів, які розвиваються, подана у табл.1. Дані, подані у табл.1, свідчать проте, що заявлений N-(9-флуореніліден)- N'-ізонікотиногідразид виявляє антихламідійну дію, ступінь якої залежить від дози препарату. Так, одномоментне введення препарату зі збудником у дозах 10,0 15,0 мг/ембріон повністю попереджує загибель курячих ембріонів, які розвиваються. Процент їх захисту становить 90. Введення нового препарату у дозі 2,5 мг/ембріон підвищує резистентність до хламідійної інфекції у 60% ембріонів, а в дозі 1,25 - у 23% ембріонів. У тих самих умовах досліду етазол-натрій у дозі 2,5 мг/ембріон забезпечує тільки 40% захисту ембріонів, а в дозі 1,25 мг/ембріон і нижче взагалі не викликає антихламідійної дії. Таким чином, одержані дані свідчать про виражену антихламідійну активність заявленого об'єкта. Приклад 2. Вивчення терапевтичного ефекту N-(9-флуоренiлiден)-N'-Ізонікотиногідразиду (флуренізиду) при хламідійному уретриті і ендоцервіциті. Хвора Н., 25 років, скарги на свербіння у ділянці зовнішніх геніталій, збільшене виділення після менструації, тягнучі болі в низу живота, періодично - болі при випусканні сечі. Тривалість захворювання 8 місяців. При комплексному клініко-лабораторному обстеженні діагностовано хламідійний уретрит і ендоцервіцит. Дослідженням вискрібу слизової уретри і цервікального каналу на культурі клітин L 929 та за допомогою прямого імунофлюоресцентного методу Із використанням моноклональних антитіл виявлено антиген хламідій. Серологічне дослідження сироватки крові в реакції непрямої Імунофлюоресценції виявили анти-хламідійні антитіла в титрі 1:64. У загальному аналізі сечі - сліди білка, слизу, лейкоцитів 5-6 у полі зору. Візуально і кольпоскопічно встановлено ендоцервіцит. У загальному аналізі крові змін не виявлено. Проведено курс лікування піхвовими свічками з флуренізидом (N-(9-флуореніліден)-N’ізонікотиногідразидом) по 0,1 г. Через тиждень від початку лікування хворою відзначено відчутне зменшення болів внизу живота і при випусканні сечі, зникнення виділень з піхви. Нормалізація аналізу сечі наступила на 10-й день лікування. Клінічно і кольпоскопічно зникнення симптомів ендоцервіциту спостерігається на 14 день від початку лікування. Контроль за елімінацією збудника проводять під час лікування (на 14 і 21 дні), через 10 днів після завершення курсу і після наступної місячки. У культурі клітин L 929 хламідії не виявляють з 14 дня від початку лікування. Методом прямої Імунофлюоресценції антиген хламідій у вискрібах зі слизових уретри 1 цервікального каналу не ідентифікують після завершення курсу лікування, а також через 10 і 30 днів опісля. Для уникнення реінфекції паралельно лікують статевого партнера хворої таблетками флуренізиду по 0,15 г двічі на добу (добова доза 0,3 г) протягом 21 дня. Таким чином, в експерименті і в клініці встановлено високу активність N-(9-флуореніліден)-N’ізонікотиногідразиду (флуренізиду) до Ін фекції, яку викликає Chlamydia trachomatis. З хворобою, спричиненою Chlamydia trachomatis пов'язують понад 20 клінічних синдромів, у тому числі ураження сечостатетвих органів, органів дихання, очей, суглобів, неплідність, патологію вагітності і плода, зниження народжуваності, захворювання новонароджених і дітей раннього віку. Новим препаратом можна лікувати хвори х з різними формами урогенітального хламідіозу; хворих з перепетуючою формою хламідійного інфікування; хворих які були ліковані офіцинальними протихламідійними засобами без терапевтичного ефекту; хворих з протипоказами до традиційної антибіотикотерапії. Протитуберкульозну дію N-(9-флуореніліден)-N’-ізонікотиногідразиду щодо кислотостійких мікроорганізмів встановлено при проведенні експерименту у пробірках Із зависсю Мус.tuberculosis hominis H 37RV, яку розводять рідиною (казеїново-сольовою, середовищем P.A. Школьникової). Концентрація бактерій становила 1×107 м.кл/мл поживного середовища. Приклад 3. Визначення бактеріостатичної активності N-(9-флуоренІліден)-N’-ізонікотиногідразиду In vitro. Препарат різної концентрації від 40,0 до 0,078 мкг/мл сполучають з мікобактеріями і витримують у стерильних термостатуючи х умовах протягом 10 днів при температурі 37°С. Відстояну рідину зливають, а з осаду готують фіксовані мазки, зафарбовують методом Ціль-НІльсена і в 100 полях зору рахують кількість утворених джгутів-"кіс". Результати обробляють статистично, порівнюючи контрольні зразки (0,85%. розчин натрію хлориду з бактеріями, середовище з бактеріями) з дослідними і дослідні між собою (розведення препарату). Результати подані в табл.2. З табл.2 видно, що досліджуваний засіб має сильнішу бактеріостатичну дію на Мус. tuberculosis hominis H37RV порівняно з Ізоніазидом. Причому в низьких концентраціях при дії ізоніазидом у двох полях зору вже з'являються довгі "коси" та джгути, в той час, як досліджуваний засіб діє бактеріостатично. Крім того, у випадку досліджуваного засобу в полі зору спостерігались скупчення не типових мікробних клітин збудника туберкульозу розміром 1-3 на 4-5 мікрон. У той же час при Ізоніазиді в полі зору спостерігались короткі "коси" розміром від 5 до 7-10 мікрон. Це явище нове, цінне і цікаве з точки зору механізму дії N-(9-флуореніліден)-N’Ізонікотиногідразиду. Приклад 4. Визначення бактеріостатичної дії N-(9-флуоренІлІден)-N’-Ізонікотиногідразиду in vitro щодо штаму Мус. tuberculosis hominis, стійкого до протитуберкульозних препаратів ряду ГІНК. Препарат у різній концентрації (від 40,0 до 0,078 мкг/мл) сполучають зі стійким штамом Мус. tuberculosis hominis і поводяться дал), так, як описано в прикладі 3. Результати досліджень, подані в табл. 3. свідчать про те, що досліджуваний засіб має велику перевагу над протитуберкульозними препаратами і ряду ГІНК, бо повністю затримує ріст стійкого штаму мікобактерій туберкульозу людського типу. Визначення гострої токсичності N-(9-флуореніліден)-N’-ізонікотиногідразиду. Гостру токсичність засобу визначають за відсотком виживання білих мишей масою до 20,0 г. Піддослідних тварин поділяють на дві групи, в кожній з яких по 6 самок і 6 самців. Речовину вводять внутрішньочеревно в дозах від 4 до 120 мг/мишу 4 рази протягом доби з інтервалом у 6 годин. Загальна тривалість спостережень за тваринами становила 14 діб. Під час першої доби після введення препарату за тваринами наглядають безперервно. При введенні тваринам досліджуваного засобу в дозі від 68 мг/мишу (3,4 г/кг) до 120 мг/мишу (16 г/кг) спостерігалась транквілізуюча дія. Випадків гострого отруєння мишей N-(9-флуореніліден)-N’Ізонікотиногідразидом не було. Встановлено, до ЛД50 для білих мишей при внутрішньочеревному введенні препарату становить 116,1 мг/мишу (тобто 5,8 г/кг маси тварини), а ЛД50 - 12 г/кг маси тварини. Результати досліджень, подані в таблиці 3, і їх порівняння з літературними даними, показують, що досліджуваний засіб майже у 40 разів менш токсичний порівняно з ізоніазидом. Приклад 5. Встановлення терапевтичного ефекту N-(9-флуореніліден)-N'-ізонікотиногідразиду (флуренізиду) в досліді на класичній моделі туберкульозу у морських свинок. Дослід проводять на морських свинках масою 350 г. Внутрішньолегенево тваринам вводять 107 мікробних тіл H37RV . На 30 добу з моменту зараження загинуло 4 тварини. При розтині встановлено дисемінований туберкульоз. Тварин поділяють на 4 групи і проводять курс лікування.. Перша група тварин одержує N-(9-флуореніліден)-N’-ізонікотиногідразид (флуренізид) протягом 12 діб двічі на добу в дозі 40 мкг внутрішньочеревно. Загальна доза становить 960 мкг. Друга група морських свинок одержує N-(9-флуореніліден)-N’-ізонікотиногідразид (флуренізид) протягом 18 діб двічі на добу в дозі 40 мкг внутрішньочеревно. Загальна доза становить 1440 мкг. Третя група тварин одержує ізоніазид протягом 6 діб двічі на добу в дозі 40 мкг внутрішньочеревно. Загальна доза становить 480 мкг. Четверта група - контрольна, тобто тварини заражені і не одержують хеміотерапевтичних засобів. Всі тварини третьої і четвертої гр уп загинули протягом досліду, а першої і др угої - вижили. Після закінчення курсу лікування тварин першої і другої груп розтинають. Легені, печінку, селезінку і тимус досліджують макроскопічно і гістологічно. Результати гістологічного вивчення специфічних змін у тканинах легень, печінки і селезінки досліджуваних тварин показують, що специфічні зміни на 5 добу одноразового введення значно менші, ніж у контролі; носять продуктивний характер з чітким обмеженням вогнищ. У селезінці є велика проліферація мегакаріоцитів і скупчення епітеліоїдних та гігантських клітин. Результатом (на моделі важкого дисемінованого туберкульозного процесу) є виражений терапевтичний ефект при введенні його внутрішньочеревно в дозі 80 мкг/морську свинку (або 0,228 мг/кг маси тварини) згідно з вказаними схемами лікування. Виражений терапевтичний ефект підтверджується і у білих мишей (на моделі дисемінованого туберкульозного процесу). Приклад 6. Встановлення терапевтичного ефекту у хворих на деструктивний туберкульоз легень з бактеріовиділенням. Хворий О-к, 30 років, зоотехнік, поступив 10.11.1992 р. в протитуберкульозний стаціонар зі скаргами на кашель з виділенням переважно вранці харкотиння слизово-гнійного характеру в невеликій кількості незначну охриплість голосу, нездужання, підвищену температур у тіла. Дані обстеження при поступленні. Загальний аналіз крові від 11.11.1992 p.: еритроцити - 4,5 Т/л, Нb - 142 г/л, кольоровий показник - 1,0, лейкоцити - 10 Г/л, є. - 3%, п. - 9%, с - 60%, лімф. -11%, ШОЕ - 18мм/год. Загальний аналіз сечі: без особливих змін, Аналіз харкотиння від 11.11.1992 p.: бактеріоскопічно і методом посіву виявлені МБТ, які були чутливі до протитуберкульозних препаратів. Біохемічний аналіз крові: загальний білок - 75,0 г/л, загальний білірубін - 11,8 мкмоль/л, АЛТ - 0.5 ммоль/л. ACT - 0,05 ммоль/л. Рентгенографія органів грудної клітки і томографія правої легені від 10.11.1992 p.: справа в S1, S 2 і S3 вогнища низької інтенсивності, місцями зливного характеру, в S 6 порожнина розпаду до 1,5см в діаметрі. Клінічний діагноз: інфільтративний туберкульоз S1 і S2 верхньої долі і S6 нижньої долі правої легені в фазі розпаду і засіву. БК+, ускладнений туберкульозом гортані (активна фаза). Через один місяць щоденного вживання флуренізиду по одній капсулі (0,3 г) двічі на день після їди констатовані такі дані. Загальний аналіз крові від 15.12.1992 p.: еритроцити - 4,5 Т/л, Нb - 144 г/л, кольоровий показник - 1,0, лейкоцити - 6,4 Г/л, e. - 6%, п. - 2%. с. - 56%. лімф. - 36%, м. - 0%, ШОЕ - 9 мм/год. Загальний аналіз сечі: без особливих змін. Аналіз харкотиння від 15.12.1992 p.: РБТ не виявлені ні бактеріоскопічним, ні бактеріологічним методами. Біохімічний аналіз крові від 15.12.1992 p.: загальний білок - 77,0 г/л, загальний білірубін - 11,9 мкмоль/л, АЛТ - 0,6 ммоль/л, ACT - 0,04 ммоль/л. Рентгенографія органів грудної клітки від 15.12.1992 p.: справа в S1, S2 i S6 вогнища середньої інтенсивності, інфільтрація частково розсмокталася в S1 I S2, порожнина розпаду в S6 зберігається. Отже, позитивна динаміка за рахунок часткового розсмоктування інфільтрації. З початку 2-го місяця перебування хворого у відділенні до флуренізиду були приєднанні рифампіцин 0,6 г, а також стрептоміцин 1,0 внутрішньом'язево щодня. Дані спостереження через 4 тижні монотерапії флуренізиду і 2 місяці комбінованого Із трьох препаратів (флуренізид + рифампіцин + стрептоміцин) лікування. Загальний аналіз крові від 14.02.1993 p.: еритроцити - 4,5 Т/л, Нb - 144 г/л, кольоровий показник - 1,0, лейкоцити - 9,5 Г/л, є. - 2%, с - 48%. лімф. - 46%, м. - 2%, ШОЕ - 5 мм/год. Загальний аналіз сечі: без особливих змін. Аналіз харкотиння від 13.02.1993 p.: МБТ не виявлені ні бактеріоскопічно, ні бактеріологічно. БІохемІчний аналіз крові від 14.02.1993 p.: загальний білок - 80,0 г/л, загальний білірубін - 11,9 мкмоль/л, АЛТ - 0,4 ммоль/л, ACT - 0,05 ммоль/л. Рентгенографія органів грудної клітки від 15.02.1993 р.: в S1 , S 2 і S 6 справа вогнища середньої Інтенсивності і підвищеної Інтенсивності, місцями розсмоктались. В S6 порожнина розпаду до 1.0см в діаметрі. Контрольні щомісячні аналізи харкотиння на МБТ в березні-червні 1993 р. дали від'ємні результати. Порожнина розпаду в S6 правої легені загоїлась через 6 місяців, що підтверджено її рентгенографічним обстеженням. Хворий виписаний 25.06.1993 р. з повним клінічним ефектом. Діагноз при виписуванні: інфільтративний туберкульоз S1, S2 і S6 правої легені в фазі розсмоктування і ущільнення, БК-. Туберкульоз гортані, фаза розсмоктування. Клінічні дослідження підтверджують, що новий фармакологічний засіб протитуберкульозної дії "флуренізид" добре переноситься хворими (навіть у ти х осіб, у яких були побічні реакції в минулому при прийомі антибактеріальних і Інших лікувальних засобів). Застосування монотерапії протягом місяця чи поєднане лікування флуренізидом та Іншими протитуберкульозними препаратами не призводить до зрушень, лейкоформули, що свідчило б про появу побічних реакцій (зростання ШОЕ, зсув лейкоформули, еозинофілія). Порівнювались дані досліджень, одержані під час лікування, з даними, які встановлені у хворих при поступленні в лікарню. Частота нормалізації швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ) і лейкоформули до і після досліджуваних хворих наведена в табл. 5. Із табл.5 видно, що нормалізацію ШОЕ відзначено достовірно (Р