Спосіб оцінки наявності генотоксичних ефектів техногенного забруднення у великих та дрібних ссавців

Спосіб відноситься до генотоксикології. Може бути використаний для оцінки ступеня забрудненості радіонуклідами, важкими металами і іншими генотоксичними агентами у дрібних ссавців з подальшою екстраполяцією отриманих результатів на людину. Відомий спосіб базується на підрахунку одноядерних лейкоцитів з мікроядрами, двоядерних лейкоцитів, апоптозних клітин, клітин, що поділяються, та метафазних клітин з хромосомними абераціями, в культурі кісткового мозку тварин. Для цього потрібний забій тварин, з подальшим вимиванням кісткового мозку, культивуванням клітин в гипотоничних умовах, та їхнім фіксуванням, для цього потрібні лабораторні умови (термостат, холодильник, центрифуга) [Гилева, 1997]. Задачею винаходу є розробка зручного та швидкого способу оцінки генотоксичності навколишнього середовища у великих та дрібних ссавців. Технічним результатом запропонованого способу є оцінка генотоксичного впливу оточуючого середовища (екотоксикологічний моніторинг) на ссавців, прогнозування і попередження негативних наслідків цього впливу при екологічній оцінці екобезпеки внаслідок різноманітних факторів антропогенної діяльності. Поставлена задача вирішується наступним чином: для цитогенетичного аналізу необхідно взяти 2-3 краплини периферичної крові у тварини (це можна проводити навіть у польових умовах), помістити їх на підготовлені предметні скельця, розбавити фізиологічним розчином в пропорції 1:2-1:3 та приготувати мазки. Мазки фіксуються метиловим спиртом. Після висихання препарати забарвлюються барвником Гімза та висушуються. За допомогою бінокулярного мікроскопу при збільшенні в 1000 разів підраховується частота: - еритроцитів з мікроядрами на 1000 еритроцитів (у %о) - одноядерних лейкоцитів з мікроядрами у непошкодженій цитоплазмі, - двоядерних лейкоцитів, - апоптозних клітин та - клітин, що поділяються на 1000 лейкоцитів (у %о). Всього у кожної тварини аналізують не менше 3000 еритроцитів та 500 лейкоцитів. Потім визнають середнє значення на 1000 клітин (в %о) для дослідженої тварини та для дослідженої групи тварин та порівнюють його з контролем. Статистичне достовірне підвищення цих показників по критерію Стьюдента (tS) говорить про наявність в оточуючому середовищі генотоксичних факторів. Контрольне значення розглянутих показників для кожного виду (лінії) тварин індивідуальне, тобто для цитогенетичного аналізу окремої тварини потрібен підбір даних про спонтанний рівень аномалій (для мишовидних гризунів [Гилева, 1997], для лінійних мишей [Корогодина, Лильп, 1978; Sato, 1993]). Приклад. У мишей ліній C57BL/6 в мазках периферичної крові виконаний порівняльний аналіз частот еритроцитів з мікроядрами (ЕМЯ), одноядерних лейкоцитів з мікроядрами (ЛМЯ), двоядерних лейкоцитів (ДЯ), апоптозних клітин (А) та клітин на стадії метафази (МІ) та цих же характеристик, а ще і хромосомних аберацій в клітинах кісткового мозку. Внаслідок отримані дані, які представлені в табл. 1. З даних таблиці видно, що частота зустрічальності ЕМЯ відображає значення ХА, оскільки виникнення мікроядер може бути наслідком хромосомних аберацій у останньому клітинному поділі. Виявлення двоядерних лейкоцитів у периферичній крові може бути обумовлено затримкою процесу клітинного поділу, також пов'язаного з пошкодженням генетичного матеріалу. Далі, були розглянуті частоти зустрічальності ЕМЯ, ЛМЯ, ДЛ, А та MІ у мазках периферичної крові у мишей та у великої рогатої худоби червоної польської породи, для перевірки правомірності перенесення отриманих результатів на людину. При порівнянні результатів мікроядерного тесту у ліній мишей та груп великої рогатої худоби видно (табл.2), що внутрішньовидові відмінності за частотами зустрічальності розглянутих цитогенетичних аномалій перекривають міжвидові відмінності. Як правило, в усіх розглянутих випадках частоти зустрічальності ЕМЯ вище, ніж ЛМЯ, це пов'язано з процесом дозрівання еритроцитів і виштовхуванням ядра. Розбіжності співвідношень частот зустрічальності ДЯ та МІ в клітинах кісткового мозку та периферичної крові у обох видів дозволяє вважати, що ДЯ в периферичній крові також можуть використовуватися у якості показника дестабілізації генетичного апарату, як і ЛМЯ. Взагалі, отримані дані дозволяють зробити слідуюче заключення. Відсутні виражені відмінності по частотам зустрічаємості розглянутих цитогенетичних аномалій у клітинах периферичної крові у двох видів ссавців, які на порядок відрізняються за тривалістю життя. Результати підрахунку еритроцитів з мікроядрами, одноядерних лейкоцитів з мікроядрами у мазках периферичної крові співпадають з оцінкою розбіжностей по стабільності генетичного матеріалу, виконаної по частотам зустрічальності серед клітин кісткового мозку метафазних пластинок з хромосомними абераціями. Таким чином, спосіб, що з'являється дозволяє замінити трудомісткий аналіз генотоксичних ефектів в клітинах кісткового мозку, які діляться після забою тварин, більш простим, прижиттєвим дослідженням клітин, які не діляться, з мікроядрами у мазках периферичної крові. Таблиця 1 Частоти зустрічальності різних цитогенетичних характеристик (на 1000 клітин) в периферичній крові мишей лінії C57BL/6 та в клітинах кісткового мозку (ΧΑ - метафазні пластинки з хромосомними абераціями). Периферична кров Кістковий мозок Кіл-сть тварин ЕМЯ ЛМЯ ДЛ А МІ ХА ЛМЯ ДЛ МІ C57BL/6 10 4,2±1,3 2,0±0,7 7,2±2,3 2,0±1,2 0 3±1 5±1 3±1 8+1 Таблиця 2 Частоти зустрічальності еритроцитів з мікроядрами, одноядерних лейкоцитів з мікро ядрами та двоядерних лейкоцитів у периферичній крові мишей та корів. Кіл-сть тварин миші ВРХ 10 11 ЕМЯ 4,2±1,3 3,3±1,1 ЛМЯ 2,0±0,7 2,1±0,8 Периферична кров ДЛ 7,2±2,3 6,6±1,4 А 2,0±1,2 2,0±0,7 МІ 0 1,3±0,6