Спосіб отримання специфічного імуноглобуліну противірусних інфекцій “поліімуноглобулін людський донорський”

Винахід відноситься до медицини, зокрема до імунології і може застосовуватись для виробництва імуноглобулінів направленої дії з метою використання їх як для імунотерапії, так і імунопрофілактики широкого кола захворювань вірусної етіології. Відомий спосіб отримання специфічного імуноглобуліну направленої дії [1] шляхом виділення його з крові людини, заснований на попередній імунізації донорів-добровольців відповідними специфічними антигенними препаратами з наступним забором крові і її фракціонуванні. Імуноглобулін виділяють спиртовим методом із осаду ІІ+ІІІ донорської плазми з отриманням 10%-16% розчину імуноглобуліну людського донорського. Головним недоліком відомого способу є необхідність проведення спеціальної активної імунізації донорів, а у деяких випадках - гіперімунізації. Такий активний вплив на імунокомпетентні системи донорів високоактивним антигенним препаратом може надалі вплинути на імунний статус їхнього організму. Відомий спосіб отримання специфічного імуноглобуліну з специфічною активністю до вірусу гепатиту А [2] шляхом виділення його з крові людини, при цьому цільовий продукт отримують з сироватки донорів, які перехворіли гепатитом А, що не містить HBs-антиген (HBsAg), а забір крові здійснюють через 4-5 міс. після одужання. Недоліком відомого способу є те, що використовують тільки відібраних донорів, які перехворіли гепатитом А, що різко звужує коло специфічних вірусни х інфекційних, відносно яких може застосовуватись імуноглобулін. Найближчим до заявленого технічного рішення є спосіб отримання специфічного імуноглобуліну проти вірусних ін фекцій [3] шляхом етанолового фракціонування на холоді донорської плазми крові, причому цільовий продукт виділяють з плазми фенотипу АВО гр уп крові навмисно не імунізованих донорів, з титрами специфічних (антидифтерійних) антитіл від 1:80 і вище, які фільтрують, освітлюють і стерилізують через глибинні фільтри. Однак, препарат розроблений як специфічний антидифтерійний імуноглобулін з обмеженою сферою використання та низькою чуттєвістю до широкого кола вірусних інфекцій іншої етіології. В основу винаходу поставлено задачу розробити новий високоспецифічний поліімуноглобулін направленої дії з специфічною активністю до широкого переліку вірусних інфекцій, а саме, вірусу герпесу простого 1 та 2 типу, цитомегаловірусу (ЦМВ), Епштейн-Барр вірусу (ЕБВ), вір усу краснухи (ВК) та вірусів гепатиту А (ВГА) і вірусу гепатиту В (ВГВ). Технічний результат - підвищення імунотерапевтичної та імунопрофілактичної ефективності імуноглобуліну за рахунок розширення його противірусної дії шляхом збільшення противірусної активності до 1:25600-1:80000 і включенням набору природних антитіл проти герпесу простого 1 та 2 типу, ЦМВ, ЕБВ, ВК, ВГА та ВГВ. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб отримання специфічного імуноглобуліну проти вірусних інфекцій "Поліімуноглобуліну людського донорського" включає виділення його з донорської крові людини шляхом етанолового фракціонування на холоді донорської плазми крові, причому цільовий продукт виділяють з плазми фенотипу АВО гр уп крові навмисно не імунізованих донорів, з титрами специфічних антитіл, що фільтрують, освітлюють і стерилізують. Згідно винаходу, отримують кінцевий продукт у вигляді 10% розчину за протеїном, який виділяють із застосуванням фільтрів різної величини шляхом сольової екстракції спиртового осаду сироватки фракції ІІ+ІІІ або плазми крові фенотипу АВО спеціально відібраних зразків з титрами природних антитіл від 1:640 та більше до вірусу герпесу простого 1 та 2 типу, цитомегаловірусу, Епштейн-Барр вірусу, вір усу краснухи та вір усу гепатиту А і В. Спосіб здійснюється таким чином. Перед отриманням специфічного імуноглобуліну ви хідну сировину, а саме, сироватку фракції ІІ+ІІІ або донорської плазми крові фенотипу АВО, вільну від ВІЛ 1 та 2 типу, гепатиту В та С, ЦМВ, сифілісу, витримують у холодильнику при температурі -65°С на протязі 3 місяців, після чого з кожного пулу 10-15 л або 1 кг та більше відбирають пробу 2-3 мл (1-2 г), проводять тестування на антитіла до вірусів (герпес 1 та 2 типу, ЦМВ, ВК, ВГВ, ВГА) і при наявності природних антитіл 1:640 та вище приступають до виробництва препарату "ПОЛІІМУНОГЛОБУЛІН". Антитіла до вірусів визначалися методом імуноферментного аналізу (ІФА) з комерційними тест-системами фірми BioRad (Франція), Orgenics (Ізраїль), а антиген - за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), Росія. Приклад 1. 10-15 л (або 1 кг) сироватки фракції ІІ+ІІІ донорської плазми крові фенотипу АВО в десятикратному об'ємі 0,9%-ного охолодженого хлориду натрію при постійному змішуванні. Потім суміш доводять до десятикратного об'єму, добре знову перемішують та залишають на ніч (18-19 годин) при температурі 4-6°С, рН суміші 5,5-5,8. Наступного дня суміш центрифугують на протязі 60 хв. При 2500-3000 об/хв. на холоді. Отриманий осад видаляють, а в отриманому елюаті (екстракції) визначають кількість протеїну, яка складає 2±0,1%. Об'єм отриманого елюату, в залежності від сировини, складає в межах 10000 мл. Отриманий розчин розливають у 500 мл стерильні флакони по 200 мл, заморожують та кладуть у бункер для закалювання на протязі 48 год. Після закалювання флакони закладають у касети сушильної машини де проводиться ліофілізація препарату на протязі 24-36 год. Ліофілізований препарат, у вигляді білого порошку, закривають резиновими корками та завальцьовують металевими ковпачками. Із отриманого порошку готують рідку лікарську форму імуноглобулін у 10% концентрації за протеїном з активністю природних антитіл проти всіх перерахованих вірусів не менше як 1:25600 або 200 МО/мл до якого добавляють стабілізатор (глікокол або 2%-глюкозу) освітляють у темному місці на протязі 5-6 діб при температурі +10 - +15°С, фільтрують та розливають у ампули 1, 2 та 3 мл. Титри специфічних природних антитіл кожної серії виробленого імуноглобуліну визначають методом імуноферментного аналізу (ІФА), які складають 1:25600 - 1:80000, що в 10 - 15 разів більше ніж у нормальному імуноглобуліні. Порівняльні показники отриманого імуноглобуліну та нормального імуноглобуліну, отриманого згідно з Типовим регламентом виробництва 10%-16% розчину імуноглобуліну людського донорського, затвердженим заст. міністра МОЗ СРСР А.Д. Царегородцевим від 27.04.1990, наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Характеристика препарату імуноглобулін проти вірусних інфекцій людський "ПОЛІІМУНОГЛОБУЛІН" (5 серій) № Назва показників 1 2 3 Прозорість, од.oп.щільності Колір, од.oп. щільності Водневий показник, рН 4 Електрофоретична чистота 5 Норма за НТД /контроль/ нормальний імуноглобулін* 0,03-0,05 0,1-1,15 7,0±0,4 не менше 97% фракції гамаглобуліну 9-11% Результати досліджень отриманого поліімуноглобуліну 0,04 0,1 7,3 97,3% Кількість протеїну % 10,0% Молекулярні параметри %: 85,3% мономери, димери не менше 85,0% 6 4,7% полімери не більше 5,0% фрагменти 7 Стабільність Стабільний Стабільний 8 Стерильність Стерильний Стерильний 9 Безпечність Безпечний Безпечний 10 Токсичність Не токсичний Не токсичний 11 Пірогенність Апірогенний Апірогенний 12 Тест на антитіла до ВІЛ 1/2, вірус Негативний Негативний гепатиту С та HBsAg Титри антитіл до: вірусу герпесу 1 типу 1:80000 вірусу герпесу 2 типу 1:40000 Дані відсутні 1:25600 (95-100) МО/мл 13 ЦМВ Дані відсутні ЕБВ 1:25600-1:5120 ВК 210-250 МО/мл ВГА 100 МО/мл ВГВ 250 МО/мл * - нормальний імуноглобулін, отриманий згідно з Типовим регламентом виробництва 10%-16% розчину імуноглобуліну людського донорського, затверджений заст. міністра МОЗ СРСР А.Д. Царегородцевим від 27.04.1990. Таким чином, отриманий специфічний імуноглобулін проти вірусних інфекцій відповідає необхідним вимогам на препарати крові і може бути використаний, як лікувально-профілактичний препарат серед широких верств населення. Інформаційні джерела 1. Папко Г.П. Получение и клиническое применение человеческих иммуноглобулинов // Дис. д-ра мед. наук М., 1974 - 372 с. 2. Патент України № 2045. Спосіб одержання гамма-глобуліну, А61В10/00, 1994, Бюл.№ 4. 3. Патент України № 22426А. Спосіб одержання антидифтерійного імуноглобуліну. М. кл. C07N33/531, А61К35/395, 1998, Бюл.№ 3.