Спосіб адаптації та культивування штаму вірусу герпесу курей sbg на перещеплюваній культурі нирки зеленої мавпи (vero)

Винахід, що передбачається, відноситься до ветеринарної вірусології та біотехнології, зокрема до виробництва вакцин і репродукції вакцинних штамів вірусу хвороби Марека (ВХМ). Для профілактики хвороби Марека (ХМ) використовують живі вірусвакцини, до складу яких входять збудники І, II і III серотипів ВХМ. Бівалентні та тривалентні вакцини містять штам FC126, вірус герпесу індиків, як основний протективний компонент (ефективність моновакцинації 76-85%), та штами, що підсилюють його імуногеність. Одним із таких і є штам-компонент бівалентної вакцини SBG ВХМ, що відноситься до підродини a-Herpesvirinae, виду Gallid Herpesvirus type 2. За результатами серологічних експертиз його віднесено до II серотипу ВХМ. Є посилання на проведені лабораторні дослідження по адаптації ВХМ до культури лімфоцитів шляхом тривалого сліпого пасажування та генетичної модифікації (Majerciak V., Valkova A., Szabova D., Geerligs H., Zeinik V. Increased virulence of Marek's disease virus type 1 vaccine strain CV1988 after adaptation to qt35 cells// Acta Virol, 2001, - 45(2), - P:101-108). Доведена можливість використання перещеплюваних культур для культивування вакцинних штамів ВХМ шляхом дії на означені культури Tannock G.A. Adaptation of Marek's disease virus to continuous cell lines// Vet. Microbiol, - 2001, - 79(1), - P:75-82). Прототипом може бути спосіб накопичення біомаси вірусу при виробництві вакцин шляхом пасажування на первинне трипсинізованих фібробластах SPF-ембріонів курей. При цьому титр вірусу зростає від 1х103 до 1х105ФУО/см3 (фокусоутворюючих одиниць) (Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. М. - 1998). Недоліком прототипу є те. що одержання маси вірусу за цим способом супроводжується значними матеріальними витратами, що складаються з вартості SPF-ембріонів та трудомісткого процесу їх трипсинізації. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб адаптації та культивування штаму вірусу герпесу курей SBG шляхом тривалого пасажування та додавання гідрокортизону в дозі 0,06-0,08см3/100см3 живильного середовища. що використовується для культивування перещеплюваної культури нирки зеленої мавпи (Vero), щоб забезпечити адаптацію та репродукцію штаму SBG вірусу герпесу курей в перещеплюваних клітинах нирки зеленої мавпи. ВХМ є епітеліотропним вірусом, тому можлива його адаптація до перещеплюваної культури нирки зеленої мавпи, що складається переважно з епітеліальних клітин ниркових канальців. Культура Vero має високі проліферативні показники, що дозволяє швидко накопичувати клітинну біомасу. та володіє низьким темпом старіння, що сприяє більш якісній репродукції вірусу. Використана культура Vero взята з кріобанку перещеплюваних культур клітин лабораторії біотехнології ІЕКВМ УААН. Як оптимальне середовище для культивування визначили суміш із сироватки крові ВРХ нативної. середовища 199 та ІГЛА в співвідношенні 20:20:60. Клітини при культивуванні мали сталу багатогранну форму, моношар яких виповнювався за 2-2.5 доби (при посівній концентрації 90-110тис.клітин/см3 живильного середовища). Старіння наступало на 8-10 добу з моменту пересіву. Активність проліферативних процесів дозволила збирати 4-5-кратну кількість клітин в порівнянні з вихідною біомасою. Приклад 1. Штамом SBG в вигляді суспензії інфікованих первинних культур SPF-ембріонів курей в дозі 10000 ФУО/ флакон об'ємом 250см3 заражали 2-добову культуру Vero. Після 30-хвилинного контакту вірусної суспензії з моношаром клітин обережно видаляли залишки культуральної рідини та внесли підтримуюче середовище, яке включало: - середовище 199-30%; - середовище ІГЛА-70%; - сироватка крові ВРХ нативна - 2%. Пасажування проводили з розрахунку 1:1 (1 флакон вірус інфікованої культури на 1 флакон чистої культури Vero) до появи перших ознак цитопатичної дії вірусу. Ознаки цитопатичної дії вірусу з'явились на сьомому пасажі в культурі клітин Vero. Фокуси ЦПД були розміром 0,25-0,4мм, переважали округлі форми, але зустрічались видовжені, гантелеподібні, комоподібні та іншої будови. Вони складались з полікаріоцитів, круглих клітин та невластивих веретеноподібних дегенеративних клітин. Ділянка подвійного світлозаломлення в центрі часто була відсутня (~84%). Тигр зібраного вірусу склав 1х103ФУО/см3 суспензії вірусовмісної клітинної біомаси. Приклад 2. Пасажування штаму SBG герпесвірусу курей здійснювали в культурі перещеплюваних клітин Vero за аналогічним способом, описаному в прикладі 1, на середовищі, що складалось із: - середовище 199-50%; - середовище ІГЛА-50%; - сироватка крові ВРХ нативна - 2%. Ознаки вірусної дії з'явились на шостому пасажі. Морфологія фокусів була схожою з такою в прикладі 1. Критерієм адаптації вірусу до Vero вважали утворення специфічної цитопатичної дії (ЦПД) в вигляді бляшок. Приклад 3. Після адаптації штаму SBG до репродукції в клітинах перещеплюваної культури Vero вірусною біомасою при титрі 1х103ФУО/см3 було заражено 6 флаконів з моношаром югітин 2-добової Vero по 2000ФУО на флакон (по 2см3). Після 15-хвилинного контакту і видалення залишків вірусвміщуючої суспензії, що використовувалась для інфікування, вносили підтримуюче середовище наступного складу: - середовище 199-50%; - середовище ІГЛА-50%; - нативна сироватка крові ВРХ-2%. Після культивування інфікованих клітин протягом 5 діб титр інфекційної активності вірусу склав 2600ФУО/см3. Приклад 4. Зараження культури клітин і визначення інфекційної активності здійснювали за прикладом 3, на відміну від якого випробовували слідуючий склад середовища: - середовище 199-50%; - середовище ІГЛА-50%; - нативна сироватка крові ВРХ-2%; - гідрокортизон - 300мкл/ один флакон підтримуючої суміші. Встановили, що активність вірусу склала 4300ФУО/см3. З наведених прикладів видно, що Vero може бути використана для культивування штаму SBG ВХМ. Адаптація відбувається на 6-7 пасажі при використанні суміші 50% середовища ІГЛА (DMEM), 50% середовища 199 та 2% нативної сироватки крові ВРХ від загального об'єму, як підтримуючої при пасажуванні вірусу в розрахунку 1:3. Додавання до живильного середовища суспензію гідрокортизону в дозі 0,06-0,08см3/100см3 у 2 рази підвищує репродукцію штаму, SBG ВХМ.