Спосіб інактивації мікроорганізмів

Винахід відноситься до ветеринарії та біотехнології, а саме до способів інактивації мікроорганізмів та може бути використаний при виготовленні інакти-вованих вакцин для ветеринарного застосування. Використання інактивованих вакцин в ветеринарній практиці має важливе значення у системі протиепізоотичних заходів при інфекційних захворюваннях. Важливою умовою створення ефективних вакцин є вибір інактиватора та оптимальних умов інактивації, які дозволяють повністю інактивувати збудника при максимальному збереженні імуногенності. Удосконалення методів отримання та концентрації антигену, способів інактивації та методів її контролю сприяють отриманню більш безпечних та ефективних вакцинних препаратів. У промисловому виробництві вакцин застосовують фізичні та хімічні методи інактивації, однак застосування інактиваторів емпіричне. Найбільш розповсюдженим методом фізичної інактивації є гамма та ультрафіолетове опромінення. Гамма проміні - вид іонізуючого випромінювання, який має значну проникаючу властивість. В основі ефекту інактивації лежить дія на пуринові та пірімидинові основи та вплив на вільні радикали Н, ОН, НО2. Використання гамма промінів дає змогу інактивувати та стерилізувати вакцинний препарат, але потребує складного обладнання та великих витрат енергії. Вакцини отримані таким методом мають високу імуногенність та тривалий строк збереження, але є необхідність у кожному випадку підбирати оптимальну дозу опромінення (Сюрин В.Н. Ветеринарная вирусология 1984). Інший метод фізичної інактивації - це опромінення ультрафіолетовими проміннями, які викликають глибокі зміни в структурі нуклеїнових кислот шляхом утворення димерів між сполуками пірімідінових основ, але не мають впливу на білкову оболонку, завдяки чому інактивіровані мікроорганизми зберігають антигенну та імуногенну активність. Однак складність підбору та контролю оптимальної дози, яка забезпечує інактивацію збудника зі збереженням його антигенних властивостей, ускладнює практичне отримання безпечних інактивованих препаратів. До фізичних методів також належить термоінактивація. Досліди свідчать про складність цього процесу. Основна причина інактивації під впливом температури належить порушенню структури геному які викликані розривом зв'язків нуклеїнової кислоти. З хімічних інактиваторів найбільш часто використовують формальдегід та бетапропіолактон. Механізм хімічних реакцій інактивації складний та залежить від ряду супутніх факторів таких як рН середовища тривалості інактивацій та концентрація інактиватора. Інактивація формальдегідом має недоліки, такі як тривалість інактивації, неповне обеззараження, недостатня імуногенність формолвакцин проти деяких інфекцій. Крім цих, найбільш поширених інактиваторів застосовують глютаровий альдегід, гідроксил амід, а також етиленімін та його похідні, сернокислу мідь, етанол та сапонін (Сергеев В. А. Вирусные вакцины 1993). Більшість хімічних реагентів, які застосовують для інактивації, являються сильними мутагенами, тому по закінченню інактивації, залишки інактиватора повинні бути видалені або переведені в неактивну форму. До простих методів інактивації належить фотодинамічний вплив деяких барвників таких як метиленова синька, акридиновий оранжевий, толуїдин синій, нейтральний червоний та інші до яких чутливі більшість мікроорганізмів. Механізм цього явища повністю не вивчено. Передбачається, що фотодинаміч-на інактивація пов'язана з ушкодженням нуклеїнової кислоти. Цей метод було використано при виготовленні дослідних зразків інактивованих вакцин проти кліщового енцефаліту, хвороби Ауєскі, класичної чуми свиней та інших хвороб. Обробка вірусу Сендай родаміном-В, бриліантовим зеленим і фіолетовим Гофмана супроводжувалась частковим порушенням РНК без змін капсідних білків. Інактивований препарат мав високу імуногенність. Рибофлавін, також відомий як вітамін В2, є обов'язковим компонентом раціону годівлі тварин. Є декілька характеристик цієї молекули які роблять її ефективним фотосенсибілізатором. Перш за все вона має 3 кільцевих структури кон'югації, це - плоска кільцева структура і дозволяє молекулі реагувати з ДНК або РНК в інфекційному агенті. Вона має вуглеводний ланцюг, що обумовлює розчинність у воді, а також ця молекула виявляється електрично-нейтральною, що дозволяє їй перетинати мембрани клітин. (F. Corbin 2002) Ще у 1965 році доктор Цугидой в Японії, вивчав дію рибофлавіну на вірус Тютюнової Мозаїки, та доказав можливість інактивації вірусу з рибофлавіном у присутності світла (F. Corbin) Інактивація збудника за пропонованим методом заснована на властивості рибофлавіну під дією опромінення світлом реагувати з ДНК або РНК, проходе фотолізіс, який стимулює окислення гуаніну і формує окремі ковалентні зв'язки з білком чим блокує геном інфекційного агента. (McBumey LL, Goodrich ТВ, Hansen ET. The use of riboflavin for the viral inactivation of platelets. Transfusion. 2000; 40 Suppl: 37S. Abstract S136-0401. Перевагою методу є безпечність як самого рибофлавіну так і продуктів його фотохімічних реакції люмінохрому та люмінофлавіну. Результати всіх досліджень токсичності, мутагенності і онкогенності рибофлавіну та продуктів його розпаду були негативні. Спосіб випробувано для інактивації як ДНК- так і РНК-вміщуючих вірусів належних до різних родин, а також проти Грам позитивних та Грам негативних бактерій. Використання пропонуємого способу інактивації забезпечує наступні переваги: 1. Підвищення безпечності інактивованих вакцин проти хвороб домашніх тварин. 2. Зниження собівартості та спрощення виготовлення інактивованих препаратів. 3. Підвищення імуногенність вакцин. 4. Уникнення застосування при інактивації потенційно мутагенних і онкогенних препаратів. Спосіб експериментально обґрунтований на референтних штамах мікроорганізмів викликаючих захворювання у сільськогосподарських тварин. Найбільш близьким до пропонуємого методу є спосіб інактивації мікроорганізмів метиленовим синім. (Corash L. Inactivation of viruses, bacteria, protozoa, and leukocytes in platelet concentrates: Current research perspectives. Transfus Med Rev. 1999; 13:18-30.) Недоліками цього способу є темне забарвлення препарату, яке ускладнює опромінення завдяки, чому не дає повної та незворотної інактивації, це рішення може бути прототипом. В основу винаходу поставлена задача розробити спосіб інактивації мікроорганізмів фотосінсібілізацією шляхом використання як синсібілізатора рибофлавіну та опромінення видимим світлом у синій частині спектру, щоб забезпечити ефективність способу інактивації мікроорганизмів. Сутність винаходу пояснюється прикладами його використання, які не обмежують його обсягу. Приклад 1 Інактивація РНК вміщуючого вірусу діареї великої рогатої худоби шляхом фотодинамічної дії рибофлавіну. Для чого до вірусутримуючої рідини з інфекційним титром 6,3 lg додавали рибофлавін в концентрації 50 мікромоль та опромінювали світлом у синій частині видимого спектру. Приклад 2 Інактивація ДНК вміщуючого вірусу інфекційного ринотрахеіту шляхом фотодинамічної дії рибофлавіну. Для чого до вірусутримуючої рідини з інфекційним титром 7,0 lg додавали рибофлавін в концентрації 50 мікромоль та опромінювали світлом у синій частині видимого. Приклад 3 Інактивація Грам позитивних бактерій St. aureus. Бактеріальну масу в концентрації 4 мільйони мікробних тіл у мілілітрі обробляли рибофлавіном - див. приклад 1. Приклад 4 Інактивація Грам негативних бактерій Е Соli. Бактеріальну масу в концентрації 4,2 мільйони мікробних тіл у мілілітрі обробляли рибофлавіном - див. приклад 1. Ефективність способу підтверджено результатами дослідів, дані про які наведені в таблиці. Таким чином, використання способу дало можливість одержати інактивовані антигени різних вірусів та бактерії. Спосіб інактивації мікроорганізмів призначений для отримання антигену з метою виготовлення інактивованих вакцин проти інфекційних хвороб тварин є більш безпечним, дешевим, простим в виконанні та достатньо ефективною в порівнянні з іншими методами. Таблиця Інфекційна активність Після фотодінамічної До Назва інактивації інактивації мікроорганізму рибофлавином Вірус ВД 6,3 0 Вірус ІРТ 7,0 0 Е. Соli 4,2 0 St. aureus 4 0