Спосіб прижиттєвої діагностики синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові у собак

Спосіб прижиттєвої діагностики синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання (ДВЗ) крові у собак, що включає дослідження стабілізованої крові, її плазми та сироватки, який відрізняється тим, що у камері Горяєва в стабілізованій крові собак підраховують кількість тромбоцитів, визначають їх агрегаційну здатність, при кількості тромбоцитів понад 200Г/Л і збільшен ня їх агрегаційної здатності понад 18% роблять висновок про розвиток тромбоцитопатії, утворення агрегатів клітин та тромбоцитопенії споживання, після цього у плазмі крові визначають протромбінований, тромбіновий і активований частковий тромбопластиновий час плазми, при відхиленні більше ніж на 10% від контрольних показників пулплазми встановлюють наявність коагулопатії споживання (складова частина синдрому), далі визначають концентрацію розчинних фібринмономерних комплексів (РФМК) та продуктів деградації фібриногена/фібрина (ПДФ) у плазмі та сироватці крові, і при збільшенні їх рівня понад 1,0бал для РФМК та 0,09г/л для ПДФ встановлюють наявність синдрому ДВЗ. Корисна модель відноситься до ветеринарної медицини, зокрема, до ветеринарної паразитології. Для діагностики використовуються методи визначення кількості тромбоцитів у крові [Лабораторные методы исследования системы гемостаза / Балуда В П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. Томск. - 1980. - 306с], їх агрегаційної здатності, дослідження рівню розчинних фібрин-мономерних комплексів (РФМК), продуктів деградації фібриногена/фібрина, а також визначення коагуляційних параметрів: протромбінового часу, тромбінового часу, активованого часткового тромбопластинового часу згортання плазми. Способи діагностики синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові у ветеринарній медицині не розроблені. Корисною моделлю ставиться завдання створення способу прижиттєвої діагностики синдрому дисемінованого внутрішньо судинного згортання крові (ДВЗ), який виступає як основне ускладнення при бабезіозі тварин. Поставлене корисною моделлю завдання досягається тим, що у способі прижиттєвої діагностики синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання (ДВЗ) крові у собак, що включає дослідження стабілізованої крові, її плазми та сироватки, згідно корисній моделі у камері Горяєва в стабілізованій крові собак підраховують кількість тромбоцитів, визначають їх агрегаційну здатність, при кількості тромбоцитів за 200Г/л і збільшення їх агрегаційної здатності понад 18% судять про розвиток тромбоцитопатії, утворення агрегатів клітин та тромбоцитопенії споживання, після цього у плазмі крові визначають протромбінований, тромбіновий і активований частковий тромбопластиновий час плазми, по відхиленню більш ніж на 10% від контрольних показників пул-плазми встановлюють наявність коагулопатії споживання (складова частина синдрому) далі визначають концентрацію розчинних фібрин-мономерних комплексів (РФМК) та продуктів деградації фібриногена/фібрина (ПДФ) у плазмі та сироватці крові і по збільшенню їх рівня понад 1,0бал для РФМК та 0,09г/л для ПДФ остаточно встановлюють наявність синдрому ДВЗ. Приклад. Визначення кількості тромбоцитів проводиться шляхом їх підрахунку у камері Горяєва. Як розбавник використовується 1% розчин амонія оксалату. У пробірку наливають 3,98мл розбавника та 0,02мл стабілізованої свіжо відібраної крові, ретельно струшують протягом 3 хвилин, заправляють у камеру Горяєва і витримують в ній 20 хвилин до створення повного гемолізу еритроцитів. Підрахунок ведеться в 10 великих квадратах з використанням фазово-контрасної насадки до мікроскопу. Отримана кількість у 10 великих квадратах поділя 9427 ється на 2 та помножується на 10 тис. Результат виражається у одиницях СІ (Г/л). Норма для собак - 200-350Г/Л. При синдромі дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові кількість тромбоцитів знижується. Агрегаційну здатність тромбоцитів визначають шляхом струшування проби протягом 3 хвилин зі швидкістю 100 струшувань за хвилину. Від відомого методу Тарасової відрізняється відсутністю додавання до проби формаліну. Підраховуючи кількість тромбоцитів до і після струшування, визначають агрегаційну здатність у відсотках Норма для собак - 9-18%. При синдромі ДВЗ агрегаційна здатність тромбоцитів зростає. Рівень розчинних фібрин-мономерних комплексів (РФМК) визначається шляхом взаємодії плазми з 50% етиловим спиртом (етаноловий тест). До 1мл безтромбоцитної плазми додають 0,03мл 50% етилового спирту. За виглядом утвореного осаду оцінюють реакцію у хрестах: випадіння осаду у вигляді дрібних пластівців - 1 хрест, збільшення розміру пластівців - 2 хреста, збільшення в'язкості плазми та утворення пластівців - 3 хреста, утворення желеподібного згустку - 4 хреста. Норма для собак - до 1 хреста. Збільшення рівня РФМК свідчить про тромбінемію - обов'язковий компонент синдрому ДВЗ. Концентрація продуктів деградації фібриногена/фібрина (ПДФ) визначається колориметричне за рівнем тирозину, який встановлюють шляхом взаємодії відповідно обробленої плазми з реактивом Фоліна (метод Nanniga Guest). До плазми будь-якого об'єму додають 8 мл насиченого розчину сульфату амонію для осадження білків. Центрифугують при 3 тис. обертах за хвилину протягом ЗО хвилин Надосадову рідину зливають і поміщають у термостат на ЗО хвилин при температурі 56°С. Проводять центрифугування при 15 тис. обертах за хвилину протягом ЗО хвилин. Надосадову рідину зливають, а осад відмивають тричі фізіологічним розчином: до осаду додають Змл фізіологічного розчину і центрифугують при 3 тис. обертах за хвилину протягом 15 хвилин. Після останнього промивання до осаду додають 1мл фізіологічного розчину та Змл реактиву Фоліна. Дослідження проводять на фотоел є ктрокол ори метрі, використовуючи кювети товщиною оптичного шару 1см. Для контролю використовують розчин, що включає 1мл фізіологічного розчину та Змл реактиву Фоліна. Визначення ПДФ проводять при використанні калібрувальної кривої різних концентрацій тирозину. Виготовляють різні концентрації тирозину, використовуючи D(L)-i30Mep та фізіологічний розчин натрію хлориду. До 1 мл розчину певної концентрації додають 3 мл реактиву Фоліна. Для перерахунку використовують формулу: ПДФ, г/л - Е*2,5*10/А*Ф, де Е - екстинція, А - об'єм розчину після осадження, Ф - середня величина коефіцієнту переводу екстинції. Норма - до 0,09г/л. Комп'ютерна верстка А. Рябко Зростання показника є беззаперечним ствердженням наявності синдрому ДВЗ. Визначення коагуляційних параметрів проводиться з метою оцінки всіх панок процесу згортання крові. Протромбіновий час визначається за тестом Квіка шляхом взаємодії плазми з тромбопластином Даний тест характеризує згортання крові за зовнішнім механізмом. До 0,1мл 0,277% розчину кальцію хлориду додають 0,1мл 1-2% суспензії тром бо пласти ну та 0,1 мл безтромбоцитної' плазми крові. В момент додавання плазми вмикають секундомір. Через кожну секунду пробірку перехиляють до утворення згустку. Час утворення згустку і виражає протромбіновий час плазми. За норму приймається показник, отриманий на пул-плазмі здорових тварин (100%). Скорочення часу згортання більш, ніж на 10%, свідчить про гіперкоагуляцію, подовження - про гіпокоагуляцію. Тромбіновий час визначається шляхом взаємодії плазми крові з тромбіном і характеризує 3-ю ланку згортання крові - перетворення фібриногену у фібрин під впливом тромбіну. До 0,1мл безтромбоцитної плазми додають 0,1 мл розчину тромбіна з активністю 100 ІО на 1мл. Вмикають секундомір Час утворення згустку вважають тромбі новим часом плазми. За норматив приймається показник, отриманий на пул-плазмі здорових тварин (100%). Скорочення часу згортання більш, ніж на 10%, свідчить про гіперкоагуляцію у 3-й фазі згортання крові, подовження - про гіпокоагуляцію. Активований частковий тромбопластиновий час плазми визначається шляхом її взаємодії з кефаліном - аналогом еритроцитарного тромбопластину і карактеризує процес згортання крові за внутрішнім механізмом. В пробірку наливають 0,1 мл 1% суспензії каоліну та 0,1 мл 1% суспензії кефаліну. Перемішують ретельно та додають 0,1мл безтромбоцитної плазми. Вмикають секундомір. Час утворення згустку вважають активованим частковим тромбопластиновим часом плазми. За норматив приймається показник, отриманий на пул-плазмі здорових тварин (100%). Скорочення часу - п пер коагуляція у внутрішньому механізмі згортання крові, подовження часу- гіпокоагуляція. Критеріями синдрому ДВЗ виступають: на стадії гі перша гул я ції - скорочення часу згортання в усіх 3-х тестах, на стадії коагулопатії споживання різноспрямованість зрушень, на стадії гіпокоагуляціі - подовження часу згортання плазми в усіх 3-х тестах Методи прижиттєвої діагностики синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові будуть використані у ветеринарній паразитології для діагностики процесу як ускладнення при різних паразитарних хворобах тварин. Дослідження необхідно проводити за умов температури в лабораторії не нижче 15°С. Кров відбирають у тварин у будь-який час, стабілізують 3,8% розчином натрію цитрату. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601