Спосіб одержання продукту приєднання діпептидного похідного і амінокіслоти

Соци в л ы стмч оскнх Республик ТЕ К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту — (22)3аявлено 26.01.78(21) 2570052/23-04 (23) ПриоритетСССР (331 С 07 С 103/52 /'А 61 К 37/02 27.01.77 (31) 7279/1У77 Государствекный комитет (32) М. Кл. Япония по делам изобретений Опубликовано28.02.82.Бюллетень № 8 н открытий Дата опубликования описання 23.0^.82 Иностранцы Ьсиказу Изоза, Мунеки Охмори, Каору Мори, ГеЦуя Исикава, іОдзи Нонака. Кеиити Кихара, Кийотака Ояма, Хейидзиро Сато и Сигеаки Нисимура (Япония) Иностранная Фирма "Тойо Сода Мануфакчуринг КО,ЛТД иҐЗайданходзин\Сагами]Кємикал Рисерч Сентер" '(Япония) . (72) Авторы изобретения П\\Ч * ' (53) У Д К 547.96* .4.07(088.8) те к (5і*) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ ПРИСОЕДИНЕНИЯ ДИПЕПТИДНОГО ПРОИЗВОДНОГО И АМИНОКИСЛОТЫ 1 Изобретение относится к способу получения новых продуктов присоединения дипептидного производного и аминокислоты, соединений, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в биохимии и медицине. Известно применение протеаз (таких как папаин, химотрипсин) для образования пептидных связей. Таким способом были осуществлены белковые синтезы из моноаминокарбоновых кислот, таких как лейцин, имеющих N-концевую зацитную бензоильнул группу, и лейцин глицин, оое из которых имеют С-концевую защитную группу [Ї] . При этом продукты реакции осандались в водной среде и как водонераст 0 я О и воримые при потере водорастворимых групп (что необходимо для сдвига обратимой реакции в сторону образования белка)* В случае, когда водорастворимая группа сохраняется в реакционном продукте, например, как в случае использования в качестве исходного соединения дикарбоновых аминокислот, необходимо водорастворимую группу ис" ходного соединения закрыт ь менее гидрофильной защитной группой. Цель изобретения - новый способ получения новых биологически активних соединений. Поставленная цель достигается тем, что в способе получения продуктов присоединения дипептидного производного и аминокислоты общей формулы I m 1 R З 91011 7 4бензилоксикарбонил, пара-меэфира D-аминокарбоновой "кислоты. Потоксибензилоксикарбонил; лученный продукт присоединения может R a — бензил; быть легко разделен на два частичных R ^ — метокси, этокси-группы; компонента, т. е. на LL-дипептидныи П - 1 или 2 s Эфир и сложный эфир D-аминокислоть^. N-замещенную аминодикарбоновую кисТаким образом, предлагаемый способ лоту общей формулы, может одновременно обеспечить получение дипептидного эфира и оптическое разделение сложного Эфира DL-аминокарбоновой кислоты. Отделенную D-форму или обогащенную D-форму сложного эфира аминокис2 лоты можно рацемизовать обычным спосогде значения ТЦ и п указаны выще, бом, и полученный продукт использоподвергают взаимодействию со сложным 15 вать в качестве исходного вещества эфиром аминокарбоновой кислоты общей в описываемом способе. формулы При использовании DL-формы N-заме0 щенной моноаминодикарбоновой кислоты и L-формы сложного эфира аминокислоты D-изомер из DL-формы N-эамецонной 20 моноаминодикарбоновой кислоты, явля-' ясь инертным, остается в водной срегде значения R^ и R tt указаны выше. де, в результате чего может быть полу- . При молярном соотношении исходных чен продукт присоединения LL-дипептидсоединений формул II. и III 1 : 1 - 1 : ного сложного эфира и сложного эфира :3,7Ь> в водной среде, в присутствии L-аминокарбонэвой кислоты. Соответстметаллопротеазы при рН 5,й-/,2, темвенно, если D-форму N-замещенной монопературе 10-90°С. Продукты, полученаминодикарбонозой кислоты выделяют из ные в процессе реакции, мало раствориводной среды, то это может одновремы в воде и выпадают в осадок. Кроме менно обеспечить получение продукта 30 того, предлагаемый способ позволяет присоединения и оптическое разделение получить оптически активный продукт Ьі-замещеннои DL-моно аминоди карбонов ой присоединения дипептида и сложного кислоты. Если выделенную N-замещенную эфира аминокислоты из рацематов, поD-моноаминодикарбоновую кислоту рацескольку реакция образования пептидной мизировать известным способом, то посвязи при этом происходит только на 3 5 лученный продукт может быть использоL-изомерах. С другой стороны, сложные ван в качестве исходного вещества. При эфиры аминокислот, используемые для использовании DL-формы N-замещенной проведения реакции присоединения с моноаминодикарбоновой кислоты и DLобразованием продуктов присоединения, формы сложного эфира аминокарбоновой 40 кислоты из водной среды может быть могут быть либо в 'L-форме, либо э D-форме, либо их смесью. получена N-замещенная DL-моноаминодикарбоновая кислота, а также продуктПри использовании DL-формы сложноприсоединения LL-дипептидного сложного эфира аминокарбоновой кислоты Lго эфира и сложного Эфира D-аминокаризомер DL-формы сложного эфира амино._ карбоновой кислоты расходуется в про 45 боновой кислоты, причем указанный продукт присоединения разделяют на цессе пептидного синтеза при получекомпоненты, как указано выше. Однонии продукта присоединения, остающийвременно может быть достигнуто обрася сложный Эфир аминокислоты имеет зование дипептидного сложного эфира D-форму. и оптическое разделение N-замеценной Если концентрации исходных веществ 50 > высоки, процесс проходит с количествен- DL-моноаминодикарбоновой кислоты и f сложного эфира DL-аминокарбоновой ным выходом. При использовании двух кислоты. молей DL-формы сложного эфира аминокарбоновой кислоты на 1 моль L-формы. N-замещенной моноаминодикарбоновой 55 Предлагаемый способ позволяет искислоты получают продукт присоединеключить стадии введения и удаления ния, состоящий в основном из LL-дизащитных групп в'боковой цепи, котопептидного сложного эфира и сложного рые считаются неизбежными в известных где R і ¥? Н0С-(СН )гГ СН-СОИ С-Из (Ш) J 5 91 0 1 1 7 способах, что соответственно позволячес кого слоя получают киспотное с о ет предотвратить потерю исходных веединение. При обработке продукта приществ; а также использовать DL-форму соединения указанным образом получают исходных соединении. В ооычных спосокиспотное соединение с характеристиЬах с использованием фермента D-изоками и свойствами, отве тющимм соедимер OL-формы исходных веществ не нуненна Фприулы жен в реакции, и хотя он не влияет на ход реакции, но вызывает потерю исходных веществ. Однако D-форму исHOC-(CHj и (IV) ходных веществ можно с успехом и с to -СПС пользовать в качестве агента для осамдения пептида с последующим их вос1 становлением. в JL-форме, где R,j, R ? ) R^ и л і имеют те же значения, что и в продукте приТаким ооразом, при осуществлении предлагаемого способа может быть од- IS соединения. Кислотное соединение, полученной новременно достигнуто оптическое разиз продукта присоединения при к а т а деление N-замещенной 1)1 -иминодикарболитическом восстановлении даег и з новои кислоты и сложного эфира 01 вестное соединение • метиловый эФир аминокарбоновой кислоты. 1 ^Ь-атіартмл-ізенилаланина. Продукты присоединения имеют хаРезультаты анализа соединений, рактеристики, которые можно ожидать полученные на основании инфр^ю \с\ ых на основании формулы I . Например, спектров, спектр ЯМР и элементарного типичный продукт присоединения, поан-ализа подтверждают структуру соедилученный реакцией Ы-бензилоксикарбонпнил формулы 1 . Полностью «-овпэдага — нил L-аспарагиновои кислоты и метиЦИЄ результаты ПОЛУЧеНЫ ІЗЮКе И В ( І!У лового эфира 1-фенилаланина, дает чае, когда выбраны соединения с друїи поглощение в инфракрасном диапазоне ми значениями Ч^ , R^, R ^ и и» и спектр ЯМР, указанные ниже. Прслеазы, используемые в нредпагаИнфракрасный с п е к т р : 3260 см"* 7 емом способе, являются металлопротеа(колебание растяжения связи N - i l ) , зо зами, имеющими металлическим ион в 3000-J200 см~* (колебание растяжения 1 активном центре. Пригодными мепаплосвязи С—Н); 1/40 см" ^сложный Эфир протеазами являются ферменты, полуС=О); 1 /20 с м м (С=0 у р е т а н ) ; 1660см ченные из микроорганизмов, такие как (1-ое амидное поглощение); Т630 см нейтральные г.ротетзы из -жтиномицета, (карооксилатj см * (1-е амид* 4 пролизин, термолизин 3 коплагеназа, ное поглощение); 1^30 и 1ч50 см" прогезза C r o t u l u s а г ю х и т . д . Могут (С=Н деформационное колебание); 1 быТЬ ИСПОЛЬ iOfidHb! ТДКЖЄ Н ^ О Ч И Ц Є Н ! 1Ые 1390 см" ^ к а р б о к с и л а т } ; 1200 и ферменты, такие как термоаз, тйцина1290 с м " (О-О-С колебание растяжения за-N, проиазт и т . д , Ч т б ч подіпи-ь связи и 3-е амидное поглощении), Д Є Ч С Б И Є ОСТерсіЗЬ', Г ОДЄР) -.ЩЄ 1СГ '' 1050 см (колебание фенила а плоснпоыищемных ферментах, предпочтителькости) ; и 740 и 69Ь см™'г(колг1бание но использовать ферментный иніиОигор, монозамещенного бензольного кольца картофельный ингибитор имеете с невне п л о с к о с т и ) . , очищенными ферментами. Используют ЯМР-спектр, 6. (1) 2,75 ррп UHJ тнопьные протеазы, папайи или сери(2) 3,02 р р т f4H), (3) 3,61 № n C3H). новые протеазы, трипсин, однако они 3,7 р р п ( З Н ) , ( М 4 , 4 - ч , 8 р р п ( З Н ) ; обладают эстеразнои активностью. По(5) Ь,ОЬ № i (2ri), ( 6 ) 5 , 8 2 ppm ( 5 H ) ; этому,, но время проведения реакции < ( 7 ) / , 3 ppm { J b H j . использованием таких ферментов н^ої)™ Результаты элементарного анализа 50 ходимо принять м^ры для предотвращепродукта присоединения оказались т а ния гидролиза сложных эФиров. кими же, что и рассчитанные значения для формулы I , где значения R*, Rtj П р и м е р (S ммоль) И35 Ы-бензилоксикарбоиил L™аспаратиповой R^ и п указаны выше. кислоти и 1078 мг (5 ммоль) ХПОРГИДКогда продукт присоединения обраба рата метилового эфиоа L- 6 мт1 продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь 910117 сикарбонил-L-аспаргил-L-фєнилалани-аспартил-і.-фенилалаиина и метиловона. Выход 98,8^. После растворения в1 го эфира В-фенилаланинэ (1*. 1). Выход в этилацетате продукт осаждают н-гек62, 3% расчете на N-бензилоксикарбонип-1.-аспарагиновую кислоту, саном, т. пл. 121 — 12^° С, [АЛ $ = г. пл. 1 0 5 - Ш ° С . • -15»^ (С - 1, менол). 5 Продукт перекристаллизовывают из Найдено, %: С 61,58; Н 5,6 і *; смеси эчияацетата и н-гексана, т.пл. N 6,56. 1/.Ь-13ч L. 1, добавляют 2 мл воды и 2,0 мл 1 и.НС^р смесь перемешивают 10 при 6О°С в течение 3 мин, затем обрабатывают способом, описанным аналогичным в примеру 19, получают 0,35 г кристаллов метилового эфира Ы-иензилоксикарбонил-Ь-аспартия-L15 -фенилаланин. Чистота 100%; выход 100%. Пример 26. 0,59і* г (2 ммоль) №-Р-метоксиоензилоксикарбонил-Ь~аспарагиновой кислоты и 0,860 г {h ммоль);20 хлоргидрата метилового эфира L-фе1* нилаланина растворяют в 1 H.NaOH, значение рН доводят до 6 , 0 . Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина, встряхивают в течение ночи 25 38-^0°С. Осадок отфильтровывают, промывают 10 мл воды, сушат, получают 0,928 г кристаллов, имеющих 68 20 М ррт (1Н)і (8) 5.0ppm(f2H); (9) 5,65 ррт (ЗН); (10) 5,65 ррт (1Н); (11) Ь,2Ч1Н); и (12) 6,8 до 7,3 ррт (1^Н) Полученные результаты показывают, что продукт является продуктом присоединения формулы I, где R-i, Яг, Яъ, и п означают п-метоксибензилоксикарбонил, бензил, метокси и 1 соответственно. Смесь 0,500 г (0,78 ммоль) продукта присоединения метилового эфира N-Р-метоксибензилоксикарбонил-Ъ-аспар-" тил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина, полученного таким образом, с 2 мл воды и 0,9^ мл (0,9і* ммоль) 1 н.НСЕ перемешивают при 6О°С в течение 3 мин. Полученную суспензию отфильтровывают и промывают 6 мл воды, сушат, получают 0,32 г кристаллов. Нижеследующие результаты подверждают, что продукт является сложным эфиром Ы-Р-метокси-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-L-фенилаланина. Чистота 100%, выход 89,\%. Кристаллы растворяют в этилацетате и продукт осаждают н-гексаном получают соединение с т. пл. 128-130°С, зо Ы о = - Ь,1 (С = 1 метанбл) Найдено, %: С 60,30; Н 5,7^; N5,99 Результаты подтверждают получение продукта присоединения метилового эфира N-P-метоксибензйЛОксикарбонил••Ь-аспартил-Ь-фенилалаиина и метилового эфира L- фенилаланина ( 1 : 1 ) . После перекристаллизации продукта 3 5 из смеси этилацетата и н-гексана. Т.пл. 72-7б°С. j > ] £ 5 = + 6,5 (С = 1, метанол). Н а й д е н о , %\ С 6 1 , 8 5 ; Н 6 , 0 ^ ; N 6 , 4 6 Рассчитано, %\ С 62,15; Н 6,16; N 6,59. Инфракрасный спектр: 3280 см""1 (колебание растяжения связи N-H); 302G и 2930 см" 1 (колебание растяже- 4 5 ния С~П); 1735 с м н (сложный эфир С - 0 ) ; 1700 с м 4 (С = О уретан); (2-ое амидное поглощение); 1^35 см (С-Н деформационное колебание); 1 1330 см" (карбоксилат) ; 1210 до 12^0 см~* (колебание растяжения связи С-О-С и j - e амидное поглощение); 1030 см~* (колебание фенила в плоскости) и Ь90, /40 и 810 см~ колебание фенила вче плоскости). Спектр ЯМР, & : (1) 2,7 ppm (2H); 5 5 (2) 3 J ррт ^ Н ) ; (3) 3,6 ppn (3H); 3,7 ррт (ЗН); (*О 3,8 ррт (ЗН); (5) М ррт (1Н); (6) 4,3 ррт (1Н); (7) Рассчитано, %: С 60,25; Н 5,72; N 6,11. Инфракрасный спектр: 3280 см" (растяжение N-H); 2930 и 3020 см"л , (колебание растяжения С-Н); 1735 см~ (С - 0 сложный эфир); 1700 см""1 (С^О уретан); 1650 см"+(1-ое амидное погн лощение); 1510 до ( см (2-е f амидное поглощение); 1^й0 см " f (дефор1 мация С-Н); 122U до 1270 см"" (колебание растяжения С-О-С, 3-е амидное поглощение); 1030 и 1050 см" 1 (колебание фенила в плоскости); 690 и 810см (колебание фенила вне плоскости). ЯМР спектр, 8 : (1) 2,8 ppm (2H); (2) 3,0 ррт (2rQ ( j ) 3,6 ррт (ЗН); W 3,8 ррт (ЗН) (5) 4,5 ррт (1Н); (6) М р р т ОЮ ( 7 ) 6 , 6 р р т (2Н); (8) 6,0 ррт (1Н) (9) 6 , 6 р р т (1Н); (10) 6,6 ррт (1Н) (11) 6,8 до 7,3 ррт (9Н). ЭТИ результаты показывают, что конечным продуктом является соединение формулы IV, в котором R^, R^, R^ и п означает n-метоксибензилоксикарбонил, бензил, метокси и 1 соответственно. ^Ь^МЙИЯІЛІї—t * і 21 9101 17 22 0,2 весовых частей полученного ме5 , 8 ppra ( 3 H ) ; ( 1 0 ) 5 , 8 p p m ( 1 H ] ; ( 1 1 ) тилового эфира N-P-метоксибензилокси7,2 ppm ( 1 H ) ; ( 1 2 ) 7 , 2 ppm ( Ю Н ) ; -карбонил-1.,-аспаргил-Ь-фенилаланика 0 3 ) 7 , 3 ppm ( 5 H ) . растворяют в 2 в е с . ч . ацетона и к Зти результаты показывают, что полученному раствору добавляют * продукт является присоединением форs 1 в е с . ч , 4 н.НС£, смесь нагревают на мулы І , где Яи R^, Чъ и п означают водяной бане со слабым противотоком бензилоксикарбонил, бензил, метокси в течение 1,5 ч , до полного разложеи 2 соответственно. ния для образования раствора, содер0,100 г продукта присоединения межащего в качестве основных компонен- to тилового эфира М-бензилоксикарбонилтов метиловый сложный эфир L-аспартил-Ь-глутамил-Ь-фенилаланина и метилово-L-фенилan анина, метиловый эфир L-фего эфира L-фенилаланина добавляют при нилаланина и анисовый с п и р т , причем перемешивании 2,3 мл ( 0 , 3 2 ммоль) из указанного раствора получают мети0,Ї 4 и НС £ ^ и смесь затем перемешиваловый эфир L-аспартил-Ь-фенилаланина ч з ют при комнатной температуре в течение 15 мин. Полученный белый осадок П р и м е р 2 7 . 0,562 г (2 ммоль) отфильтровывают и промывают 3 мл в о N-бензилоксикарбонил-Ь-глутаминовой ды, сушат, получают 0,0683 г кристалкислоты и 0,860 г (4 ммоль) хлоргидралов. та метилового эфира L-фенилаланина растворяют в 1 H.NaUII, и рН доводят зо Следующие результаты подверждают, до 6 , 0 . что продукт представляет метиловый эфир Н-бензилоксикарбонил-Ь-глутамилПолученный раствор смешивают с -L-фенилаланина .Чистота 100%; выход 50 мг термолизина и смесь встряхива95,8%. ют при 38~40°С в течение ночи. Оса- док отфильтровывают, промывают 10 мл 25 Кристаллы растворяют в этилацетаводы, сушат, получают 0,510 г к р и с т е , и продукт осакдлют н-гексаном, таллов, т . п л . 3 0 - 8 5 ° С т . п л . 97-У9°С, t)-L-фенилаланина, но 35 С п е к т р ЯМР, 8 : ( 1 ) 1,1 р р т ( 6 Н ) ; большая часть соединения остается (2) 2,7 р р т (2Н); ( 3 ) 3,0 р р т ( 4 Н ) ; в фильтрате и в промывочной воде. (4) 4 , 0 р р т (4Н); ( 5 ) 4 , 1 р р т ( 1 Н ) ; (6) 4 , 5 р р т О Н ) ; (7) 4 , 7 р р т ( 1 Н ) ; Полученный продукт присоединения (8) 5,0 р р т (2Н); ( 9 ) 6 , 2 р р т ( 1 Н ) ; метилового эфира К-бензилоксикарбонил-Ь--аспартил-(С П р и м е р 43. 1,189 г {Ц ммоль) М-р-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспа- і о рагиновой кислоты и 1,725 г (8 ммоль) хлоргидрата метилового эфира DL-фенилаланина загружают в 30 мл колбу и растворяют при добавлении 1 н. водного раствора NaOH; pH 6,0. Раствор раз-is бавляют водой до 15 мл. Полученный раствор смешивают с 0,1 г термолизина, и смесь перемешивают при 33-^0 С в течение 50 мин. Осадок отфильтровывают, промывают 30 мл воды и сушат, 20 получают 2,109 г кристаллов, имеющих й т. пл, 119-123 С, затем перекристаллизовывают продукт из смеси этилацетата и н-гексана, высушивают при 80 С' в течение 7 ч при пониженном давле- 25 нии. Подтверждено, что соединение продукт присоединения метилового эфира N-p-метоксибензилоксикарбонил-Ьаспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира П-фенилаланина (1:1.) полугидра-зо та. Т. пл. 131-138° Д ^ $ = - Ц,2 (С = 1, метанол). 30 ! Найдено, %*. С 62,07; Н 6,17; N6,69 . Рассчитано, С 62,\Ь± Н 6,16; N 6,69.' Спектры инфракрасного поглощения и ЯМР облученного образца дали те же характерные особенности, что и в продукте присоединения формулы 1, полученном в примере 26, Навеску 1,0 г облученного образца смешивают с k мл воды и 2 мл 1 н. НС# затем полученную смесь перемешивают при 6О*С в течение 3 мин. Фильтруют, вводят метиловый эфир N-p-метоксикарбонил-Ь-фенилаланина и метиловый эфир 1>фенилаланина в молярном отношении 1:1 из твердой фазы и из жидкой фазы, соответственно. Повторяют способ аналогичный прии меру 3^» о используют 0,3 г полученного продукта присоединения [полугидрат вместо продукта присоединения, полученного в примере 30). Выход метилового эфира k -Ь-аспартия-Ь-фенилаланина и метилового эфира П-фенилзланина 95,9%. П р и м е р *й. 0,3 продукта присоединения метилового эфира N-p-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового Эфира L-фенилаланина (1:1), полученного в примере 30, растворяют в 10 мл раствора 0,3* н. НС £ в хлороформе, Найдено, %: С 61.50; Н 6,12; N6,*»9 реакцию проводят при 60° С в течение СзъНьз l ^ O f o 1/2 Нг.0 2 ч. Реакционную смесь упаривают Р а с с ч и т а н о , %: С 6 1 , 2 9 ; Н 6 , 2 3 ; 35 при пониженном давлении, к остатку N 6,50. добавляют воду, триэтиламин и цикСпектры инфракрасного поглощения логексанон в качестве внутреннего и ЯМР дали те же характеристические стандарта, образец анализируют высоособенности, что и в продукте присокоскоростной жидкостной хроматограединения формулы I, полученном в прифией. Выход метилового эфира