Спосіб одержання похідного авермектіна

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГННТ СССР (51)5 С 12 Р 17/08/У(С 12 Р 17/08, С 12 R ) :465) И ПАТЕНТУ і С2О AO27887V3O-J3 (22) 25.07.86 (31) 8518999; 8520069; 86І0063; 8610862 (32) 27.07.85; 09.08.85; 24.04.86; 02.05.86 (33) G B (46) 23.04.90. Бюл. * 15 (71) Пфайзер Корпорейшн (РА) (72) Стив Пол Гибсон, Келвин Скотт Холдом, Александр Кроссан Гоуди и Джон Десмонд Бу Лок (GB) (53) 6J5.779.93 (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНОГО АВЕРМЕКТИНА ,(57) И з о б р е т е н и е о т н о с и т с я к м и к р о б и о л о г и ч е с к о й промышленности, в частности к производству антибиотиков. Штамм S t r e p t o m y c e s a v e r r a i t i l i s NCI В 1212] культивируют в п и т а т е л ь н о й г р е де в присутствии карбоновой кислоты RACO^H или е е н а т р и е в о й с о л и , или е є м е т и л о в о г о эйшра, г д е R ^ ~ алыЬараэветвленный C^-Cg-алкил}при у с л о в и и , ч т о не изопропиловый или вторич Изобретение относится к микробиологической промьаилениости, в частности производству антибиотиков. Для осуществления способа используют штамм Streptomyces a v e m i t i l i s NC1B 1212І, который характеризуется следующими свойствами. Культурально-морфологические признаки. _ Спиральные цепи спор но среде 1SP4. но-бутиловый, алкенил, алкинил, а л к о к с и а л к и л или а л к и л т и о а л к и л о в а я г р у п п а , или С,-С ,~циклоалкилалкило*в а я г р у п п а * в к о т о р о й а л к и п о в а я группа п р е д с т а в л я е т альба-разветвленную алкильную г р у п п у C ^ - C j , или C 3 ~Cgц и к л о а л к и л , ил и цикло алк и н и л о в а я г р у п п а Cj.-C« , п р и этом любой из них может з а м е щ а т ь с я метиленом или одной или б о л е е а л к и л о в о й г р у п п о й С ( - С ^ , или г а л о а т о м а м и , или т и е н и л г р у п п а , в условиях аэрации и перемешивания. После ф е р м е н т а п и и выделяют ц е л е в о й п р о д у к т , г д е R. - ОН и о т с у т с т в у е т д в о й н а я с в я з ь в положении 2 2 - 2 3 , или есть двойная связь и отсутствует R | , и при необходимости последнее соединение в о с с т а в н а в л и в а ю т д о п о л у ч е н и я р целевого продукта, где , - Н и о т с у т с т в у е і д в о й н а я с в я з ь , R - - II или СН3, R + - 4 ' - ( а л ь ф а - 2 - о л е а н д р о з и л ) а л ь ф а - 2 - о л е а н д р о зилок с и г р у п п а . Полученные с о е д и н е н и я обладают п р о т и в о п а р а з и т а р н о й а к т и в н о с т ь ю широкого с п е к тра д е й с т в и я , 5 з . п . ф . Серая пигментация воздушного мицелия на среде 1 Г Р 4. > Отсутствие четкой пигментации субстрата мицелия на среде 1SP 4, Отсутствие способного диффундировать пигмента на среде 1SP 5. Образование меланина на 1SP 6: пептон -дрожжи-железный агар. ' Биохимические свонс гва. Фе рмент ішна я ак т ив но с т ь : 8 1560059 Восстановление нитрата Образование H^S + Гццролиз гиппурата Продукты деградации: Гуанин Мочевина + -Аллантоиин , + Температура выращивания: 45°С ' • • 10 Рост в присутствии: 7%-ного хлористого натрия + О,1%-ного фенола + 0,0001%-ного теллурита калия + Рост на единичном источнике азота (0,1 мае. / о б . %)•* L-Цистеин • + L-Валин + L-Фенилаланин + 20 L-Гистидин + L-Гидроксипролин Нитрат калия ' Рост на единичном источнике у г л е рода (1 м а с . / о б . % ) : 25 L-Арабиноза + : Сахароза • + • D-Ксилоза + мезо-Инозит + Маннит " + 30 D-Фруктоза + L-Рамноза + • Раффиноза + D-Лактоза + Салицин - . 35 D-Мелибиоза + Ацетат натрия (0,1 мас./об.%) + П роп инн атн ат рия (0,1 мас.Уоб.%) + 40 Пируват натрия (0,1 мас./об.%) + (ISP - среды согласно международному проекту по стрептомицину ( I S P ) ) . П р и м е р 1 . Получение 25-цик- 45 лопентил-авермектин А2. Суспензию культуры на скошенном агаре S . a v e r m i t i l i s NC1B 1212] инокулируют в 600 мл среды, содержащей лактозу (12,0 г ) , барду ( 8 , 0 г) и 50 дрожжевой экстракт (3,0 г ) , в трехлитровой колбе, и инкубируют при 28 С в течение 3 дней. Этот инокулюм используют для инокулирования 16 л с р е ды, содержащей растворимый крахмал (640 г ) , сульйат аммония (32 г ) , в т о - 55 ричный кислый ФосФат калия (16 г ) , хлористый натрий (16 r j , сульфат магния 7ІЦ0 (16 г ) , карбонат кальция (32 г ) , растворимый дрожжевой э к с т ракт (6,4 г ) , сульФат железа ( I I ) х *7Н4'О (0,016 г.), сульсЬат пинка 7 Н г 0. (0,016 г ) и хлорид марганиа 4И^0 (0,016 г ) , в двадцатилитровом Фермент е р е . Ферментируемую массу инкубируют при 28°С при перемешивании со скорое* тью 250 об. мин и подшот воздух со скоростью 15 л/мин. Натриевую соль циклопентакарбоновой кислоты (1,6 г) д о бавляют через 24 ч , и снова через 28 ' и 72 ч инкубирования, а Ферментацию продолжают 120 ч, После этого времени мицелий удагсяют фильтрованием и э к с т рагируют смесью ацетон:1н. соляная кислота ( 1 0 0 : 1 , 3*7 л ) . Полученный экстракт концентрируют до приблизительно 2 л при пониженном давлении и экстрагируют метиленхлоридом (2*5 л ) . Метиленхлоридный экстракт концентрируют досуха до получения неочищенного продукта в виде подвижного масла, которое растворяют в диэтиловом эФире и вводят в колонку С' силикагелем (1 к г ) . Колонку элюируют диэтиловым эфиром, собирая Фракции по 100 мл. Фракции 20-40 объединяют, и растворитель выпаривают, получая практически очищенный материал. Продукт растворяют в смеси метанола и воды (4:1) и хроматограФируют на С18 Micro-Bondapack колонке (50 мм*50 см) в высокоэффективном жидкостном хроматографе, используя тот же растворитель со скоростью потока 100 мл/мин, фракции 3550, содержащие иелевой продукт, объединяют и повторно хроматографируют на С18 Zorbax ODS колонке (21 мм * *] 5 см), элюируя смесью метанола и воды (4:1) со скоростью потока 9 мл/мин. Соответствующие фракции объединяют и растворитель выпаривают до получения соединения формул (1) где R1 - ОН, двойной свячи нет; циклопентил; R % - СР *; Ч , - 4-( 5 1560059 2-олеандросил)-аль(Ъа-И-олеандросилокПолученный мицелии экстрагируют смесью ацетон:1н. соляная кислота сн ( 1 0 0 : 1 ) , и ацетоновый экстракт конСН3 центрируют досуха. Зкстрскт анализируют с-помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и показывают, что он содержит продукт, идентичный продукту призера 1 . П р и м е р 3. Получают кчокулюм 10 з виде белого порошка с т . п л , J 5 0 , 5 по примеру 1 и используют его для » 151*0. Строение продукта подтвержден инокулирования 50 мл среды как в прино данным масс-спектрометрии и Я Р М мере 1, заключенной в колбу емкостью 350 мл. После инкубирования в течение Масс-спектрометрия с бомбардиров15 24 _н добавляют 2-амино-циклопентилкой быстрыми атомами проведена на ук су сную кислоту (циклопентилгл',;щ!н) масс-спектрометре V модель 7070Е с G (5 мг) и ферментацію продолжают еще использованием матрицы образца три- , 5 дней. Полученный продукт выделяют, этиленгликоля с твердым хлористым экстрагируя мицелий ацетоном и мети+ натрием, (M+Na) наблюдается при й/е 20 ленхлоридом. Экстрлкт анализируют с 939 (теоретически 939). Масс-спйктпомощью высокоэффективной жидкостной рометрий электронного удара проводят хроматографии, данные которой указына масс-спектрометре V Модель 7O7OF, G вают на то, что продукт содержит с о е ДИНЄНИЄ5 идентичное продукту примеЗначение тп/е для основных Лрагментов следующие: 335, 317, 275, 25J, 205, 25 ра 1 . J-o о сщо Ш , J 7 9 , J 4 5 , 127, J J 3 , 111, 96 и 87, П р и м е р 4 . Воспроизводят у с ловия примера 3, за исключением того, Данные Я Р М С получены на спектчто в качестве субстрата используют рометре Брукер Модель N-250 для о б циклопентилметанол с аналогичными р е разца концентрации 20 мг/м в дейтерозультатами. хлоросЬорме. Химические сдвиги в м.д. 30 по отношению к тетраметилсилану: П р и м е р 5„ Воспроизводят у с 14,1; 15,3; J 7,8; J 8 , 5 ; 19,9; 20,3; ловия примера 3, за исключением того, 24,6^ 2 5 , 9 ; 2 6 , 2 ; 2 9 , 3 ; 34,4 (2С), что в качестве субстрата используют 34,7, 36,7; 37,8; 39,8; 40,5; 41,0; сложный метиловый эфир циклопентакар4 1 , 3 ; 4 5 , 8 ; 56,4;' 5 6 , 6 ; 5 7 , 8 ; 6 7 , 4 ; боновой кислоты с аналогичными резуль35 татами. 6 8 , 0 ; 6 8 , 7 ; 69,9; 7 0 , 5 ; 7 6 , 0 ; 77,6 (2С), 7 8 , 3 ; 7 9 , 5 ; 80,7 (2С); 8 1 , 8 ; П р и м е р 6. Воспроизводят ус9 4 , 9 ; 9 8 , 7 ; 9 9 , 8 ; 117,7; 118,5; 119,8; ловия примера 3 , за исключением того, 125,0; 135,8; 136,3; 137,8; 160,1 что в качестве субстрата используют 173,8. циклопентанкарбоновую кислоту, растворенную в метаноле, с аналогичными П р и м е р 2. Суспензию культуры результатами. на скошенном агаре S . a v e r m i t i l l s П р и м е р 7, Получение 25-(тиАТСС 31271 инокулируют в 50 мл среды, ен-3-ил)-авермектин. содержащей лактозу (1,0 г ) , барду (0,75 г) и дрожжевой экстракт Суспензию культуры на скошенном 45 (0,25 г ) , в колбе объемом 350 мл и агаре S . a v e r m i t i l i s NCIB 12121 инокуинкубируют при 28 С в течение 3 дней. лируют в 600 мл среды, содержащей Этот инокулюм (4 мл) используют для лактозу (32,0 г ) , барду ( 8 , 0 г) и инкубирования каждой из 50 колб, с о дрожжевой экстракт ( 3 , 0 г ) , в трехдержащих кукурузный крахмал ( 2 , 0 г ) , • литровой колбе и инкубируют при 28°С соевую муку (0,35 г) и дрожжевой э к с в течение 3 дней. Этот инокулюм истракт (0,25 г ) , объемом 350 мл, к о т о пользуют для инокулированкя 16 л с р е рые инкубируют при 28 С. ды, содержащей растворимый крахмал (640 г ) , сулъйат аммония (32 r j s втоЧерез 24 ч в каждую колбу добавляричный кислый фосфат калия (16 г ) , ют натриевую соль циклопентакарбоно55 натрийхлорид (16 г ) , гульфат магния вок кислоты (5 мг) и инкубирование 7HjO (16 г ) , карбонат кальция (32 г ) , продолжают в течение следующих 5 дней. растворимый дрожжевой экстракт (6,4 г ) , После этого содержимое колб извлекасульфат железа (ТІ) 7Н г 0 ( 0 , 0 ! 6 г ) , ют и мииелий выделяют центриАугирова 7 1560059 сульфат цинка 7!!2О ( 0 , 0 ! 6 г) и хлорид марганца АН^О (0,0J6 г ) , находящейся в двадцатилитровом Ферментере, Ферментируемую массу инкубируют при ft 28» С при перемешивании со скоростью 250 об/мин и подают воздух со с к о р о с тью 15 л/мин. Спустя 24 ч добавляют натриевую соль тиофен-3-карбоновой : кислоты ( 1 , 6 г ) , такое добавление по- 10 вторяют через 48 и 72 ч , а Ферментацию продолжают в течение 120 ч . Далее мицелий удаляют фильтрованием и экстрагируют смесью ацетон:1н, с о л я ная кислота (100:1,3x7 л ) . Полученный экстракт концентрируют до приблизительно 2 л при пониженном давлении и' экстрагируют метиленхлоридом (2 * *5 л ) . Метиленхлоридиый экстракт концентрируют досуха до получения неочи20 щенного продукта в виде подвижного масла, которое растворяют в диэтиловом эфире и вводят в колонну с силикагелем (1 к г ) . Эту колонну элюируют диэтиловым эфиром, собирая Фракции 25 по 200 мл. Фракции 32-45 объединяют и растворитель выпаривают До получения частично очищенного материала. Полученный продукт растворяют в смеси метанола и воды ( 3 : 1 ) и хроматографируют на колонне С18 Micro Bonda- 30 pack (50 мм*50 см) в высокоэффективном жидкостном хроматографе, используя тот же растворитель со скоростью потока 100 мл/мин. Фракции 27-36, с о держащие целевой продукт, объединяют, 35 и повторно хроматографируют на С18 Zorbax ODS колонне (21 мм*25 с м ) , элюируя смесью метанола и воды ( 3 : О со скоростью потока 9 млУмин. Соответствующие фракции объединяют и р а - 40 створитель выпаривают до получения соединения формулы ( 1 ) , где Чf - ОН, двойной связи нет, R^ - тиенил-3-ил, R і - СН j , a R 4 ~ 4 -(anbiba-Z-олеандросил)-альФа-2-олеондросилокси (2) в 45 виде белого порошка с т . п л . 167 С. Строение продукта подтверждено данными масс-спектрометрии следующим о б разом. 50 Масс-спектрометрию с бомбардировкой быстрыми электронами проводят на масс-спектрометре VG модель 7070F, используя матрицу образца триэтиленгликоля с твердьм найтринхлоридом. 55 (M+Na)"*" наблюдается при т / е - 9 5 3 (теор. 953). Масс-спектрометрию электронного удара проводят на масс-спектрометре 8 VG модель 7O7OF. Значение т / е для о с новных Фрагментов следующие: 349, 331, 275, 265, 257, 247, 237, 219, 195,145, 127, 133, 95 и 87. П р и м е р 8. Вегетативную к л е точную суспензию S - a v e r r a i t i l i s NCIB 12121, хранив игу me я при -60°С в 10% объем/объем водном (2 мл) глицерине, инокулируют в 50 мл среды, содержащей лактозу ( 1 , 0 г ) , барду (0,75 г) и дрожжевой экстракт (0,25 г ) , находящуюся в конической колбе объемом 30.0 мл, и инкубируют при 28°С и т е ч е ние 24 ч при встряхивании. Затем инокулюм добавляют к 600 мл указанной среды, содержащейся в трехлитровой колбе, и полученную смесь инкубируют при 28 С в течение 24 ч прч встряхивании. Полученный продукт используют для инокулирования 10 л указанной среды, находящейся в 1 6-литровом Лерментере, и инкубируют в течение 24 ч при 28 С и скорости перемршивания 350 об/мин при аэрации со скоростью 10 лУмин. Эту Ферментируемую массу (600 мл) испотьзуют для инокулирования 16 л среды, содержащей частично гидролизованный крахмал (640 г ) , сульфат аммония (32 г ) , вторичный кислый фосфат калия (16 г ) , натрийхлорид (16 г ) , сульфат магния 7Н г 0 (16 г ) , карбонат кальция (16 г ) , растворимый дрожжевой экстракт (6,4 г ) , сульфат железа ( I I ) 7Н г 0 (0,016 г ) , сульбат цинка 7Н^0 (0,016 г) и хлорид марганца 411^0 (0,OJ6 г ) , находящейся в 20литровом ферментере. Ферментируемую массу инкубируют при 28°С при перемешивании со скоростью 350 об/мин и аэрируют со скоростью 15 л/мин. Через 24 ч добавляют натриевую соль циклобутанкарбоновой кислоты (1,6 г) и такое добавление повторяют через 48 и 72 ч инкубирования, и Ферментацию продолжают в течение J20 ч . После этого промежутка времени мицелий уда-^ ляют фильтрованием и экстрагируют ацетоном (3*7 л ) . Этот экстракт концентрируют до приблизительно 2 л при пониженном давлении и экстрагируют метиленхлоридом (2*5 л ) . Метиленхлорид конденсируют досуха до получения н е очищенного продукта в виде подвижного масла. Его помещают в изооктан (150 мл), и раствор экстрагируют смесью метанола (95 мл) и воды (5 мл). После выпаривания метанольного э к с т ракта получают частично очищенный ма J560059 JO хрзм&тогравируют дважды на колонке CIS Zorbax ODS (21 ммх°.5 сь) , этойруя смесью метанола и воды (?7:23^ со скоростью потока 9 мл/ним. Соответствующие' іЬракцни объединяют и лыпаркза1от до пол>'чения соединения формулы (1) , где R.,- ОН,двойной связи не-г, R 2 ииклобутил, К э - СП** г ІЦ - ^ ' - ( а л ь 'фа^-олерндросип; -аль6а'2—олеандроси—• локси (2) в вице белого порошкя с т . п л . 135-140°С. Строение продукта подтверіцдено масс-спектрометрически следующим о б разам. Масс-спектрометрщо с бомбардировкой быстрыг^и электоомами осуществляют на масс-спектрометре VG модель 7О7ОЕ, используя матрицу образна триэтиленгликоля с твердьм натримхлоридом (М+ +Na)+ наблюдают npiJ m/e 925 (теоретически 925) . Масс-спектрометрию электронного удара осуществляют на мэсс-спектромртре VG модель 7O7OF. Значения m/e для основных фрагментов следующие; 5 % , 454, 3 2 1 , 303, 275, 237, 219, 191,179, ! 6 7 , 145, 127, 133, П і , 95 и 87. П р и м е р П . Получение 25-ииклобутил-аъермектмн ВІ (имеется 22,23 двойная с в я з ь , R 3 = Н). Объединенные фракции 10-19 из примера 8 выпаривают досуха, а остаток ра ство ряіот в ме тано ле и хром а то графируют на колонке С18 Zorbax ODS, элтируя смесыз четанола и воды ( 4 : 1 ) со скоростью потока 9 мл/мин.Соо гветствующие фракции объединяют, а растворитель Строение полученного продукта под~лп выпаривают до получения продукта, к о торый повторно хроматографируют на тверждено масс-спектрометрически с л е колонке S i l i c a Zorbax SXK (21 мм * дующим образом. Й 25 сп) „ элюируя смесью дихлррметана Масс-спєктрометркю с бомбардирови метанола ( 9 8 , 5 : 1 , 5 ) со скоростью кой быстрыми электронами проводят на потока 9 мл/мин. Соответствующие масс-спектрометре V модель 7070Е, G 45 фракции объединяют и растворитель выиспользуя матрицу образца триэтиленпаривают до получения соединения форгликоля с твердьм иатрийхлоридом (М+ + мулы О), где R' отсутствует, двой+Na) наблюдают при т / в 9JJ (теореткная связь имеется, R г - циклобутил, чески 9 Ї І ) . R 3 - ll s a R t - 4'-(альЛа-2-олеандроМасс-слектрометрию с электронным 50 сип^-альфа-олеандросилокси, в Риде ударом осуществляют на масс-спектробелого пороспса с т . п л . 135-138 С, метре VG модель 7O7OF. Значения ; т / е Строение полученного продукта поддля основных фрагментов: 321, 3 0 3 , тверждено масс-спектрометрически сле26J, 2 5 7 , 2 3 7 ; 219, 209, 191 , J 7 9 , дующим образом* 167,1US, 127, J J 3 , Ш , 95 и 8 7 . 55 Масс-спектрометрно с ЗомбардкроБП р и м е р 10'. Йолучекие 25-циккой быстрыми электронами осутэствлялобутип-авермектин А2 (R fOH, R^CUj) ют на масс-спектрометре VG модель Объединенные фракции 5-9 из приме7О7ОЕ, используя матрицу образца трира 8 выпаривают досуха, а остаток териэл, который разделяют на і дуальные компоненты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии следующим образом, Полученный остаток растворяют в небольшом КОЛІЇЧЄСТВЄ метанола и хроматографируют на колонке С]8 H i c r o Bondapack (50 нм*50 см) на высокоэффективном жидкостном хромзтограбе, ,„ используя смесь метанол/вода (4:1) со скоростью потока 100 мл/мин, фракции 1-4 объединяют п используют в примере 9 Г Фракции 5-9 объединяют и используют в примере 10, фракции '.С- « < 19 объединяют и используют в примере I I , а фракции 20-35 объединяют и и с пользуют в примере 12* П р и м е р 9. Получение 25-ииклобутил-авермектин В2 (R.,= ОН, ^ 3 - H ) . , n Объединенные фракции 1-4 из примера 8 выпаривают досуха и остаток п о вторно хроматографируют на колонке CJ8 Zorbax CDS (21 мм*25 с м ) , элюируя смесью метанола и воды (3:1) со 25 скоростью потока 9 мл/мин. Соответствующие фракиии объединяют, растворитель выпаривают и полученный продукт подвергают окончательной очистке на колонке (10,5 мл*25 см), элюируя сме-30 сью метиленхлорида и метанола (98:2) со скоростью потока 4 мл/мин. Соответствующие фракции объединяют и р а створитель выпаривают До получения соединения формулы ( I ) , где R f - ОН, 35 двойной связи нет, R2 - циклобутил, Rj - И, a R 4 - 4 -(альфа-2-олеандросил)-альфа-2~олеандросшгокси (2) в виде белого порошка с т . п л , JJO-1I2°C, и 12 1560059 андросилокси, в виде белого порошка зтиленгликоля и твердьм натрийхлори+ с т . п л . 131-5°С. дом (M+Na) наблюдается при щ/е 898 Строение полученного продукта под(теоретически 893.)^ тверждено масс-спектрометрически с л е Масс-спектрометрию электронного удара осуществляют на масс-спектромет _5 дующим образом. Масс-спектрпметрию с бомбардировре VG модель 7070Е. Значении т / е для кой быстрыми электронами осуществляосновных фрагментов следующие: 303, ют на масс-спектрометре V модель G 261 , 257, 219, 3 9 1 , 1$7, 127, 113, 7О7ОЕ, использ-уя .матрицу образца три111, 95 и 8 7 . to этиленгликодя с т-вердым найтрихлориП р и м е р 12. Получение 25-цикдом( (M+Na)+ наблюдают при т / е 951 лобутил-авермектин А1 (имеется д в о й (теоретически 9 5 0 • 'ная связь 22,23 R_ = CHj). Объединенные фракции 20-35 из п р и , Масс-спектрометрию электронного 'мера 8 выпаривают досуха и остаток удара осуществляют, используя массЇ5 хроматограФируют на колонке С18 Z o r спектрометр VG модель 7O7OF. Значения bax ODS (21 мм*25 см) со скоростью т / е для основных Фрагментов: 624,480, потока 9 мл/мин. Соответствующие 347, 329, 375, 263, 245, 235, 217, фракции объединяют, растворитель вы205,193, 179, 145, 127, 113, 111, 95 паривают и полученный продукт повтори 87. но хроматографирутот на колонке S i l i c a П р и м е р 14. Получение 25-цикS p e r i s o r b 5 мкм (10,5 мм*25 с м ) , логексил авєрмектин А2. элюируя смесью дихлорметана" и метаноВоспроизводят среду и условия прила ( 9 8 , 5 : 1 , 5 ) со скоростью потока мера 1 за исключением того, что в к а 4 мл/мин. 25 честве субстрата используют натБиевуго соль циклогексанкарбоновои кислоты до В результате объединения с о о т в е т получения соединения формулы ( 1 ) , г д е ствующих фракций с последующим выпаR 1 - ОН, R-j - циклогексил, R^ - СН,, риранием получают соединение формуa R,. - 4'-(алъфа-олеандроксил)-альАалы ( 1 ) , где R^ отсутствует, двойная Z-олеандросилокси, в виде белого п о связь имеется, R І - оиклобутил, R., . рошка с т . п л . Н ? - П 7 ° С . СН3 , a R , • 4 ' -(альФа^-олеандросил) » • альфа-г-олеандросилокси, в виде б е л о Строение полученного продукта, подго порошка с т . п л . 120-124 С. Строетверждено масс-спектрометрически с л е ние полученного продукта подтверждедующим образом. но масс-спектрометрически следующим Масс-спектрометрию с бомбардиров35 образом. кой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре VG модель Масс-спектрометрию с бомбардиров7О7ОЕ, используя матрицу образца трикой быстрыми электронами осуществляэтиленгликоля с твердым натрийхлориют на масс-спектрометре VG модель 7О7ОЕ, используя матрицу образца три- 40 дом. (M-Na)* наблюдают при тп/е 953 (теоретически 953). этиленгликоля с твердым натрийхлори+ дом. (M+Na) наблюдают при т / е 907 Масс-спектрометрию электронного (теоретически 907). удара осуществляют на масс-спектроМасс-спектрометрию электронного метре VG модель 7O7OF. Значения т / е удара осуществляют на м*асс-спектродля основных фрагментов: 624,48 2, метре VG модель 7070F. Значение т / е 349, 3 3 1 , 275, 265, 247, 237, 219, . для основных фрагментов: 578, 303, 207,195, 179, 145, 327, 113, 111, 96 275, 257, 219, 191 , 167, 145, 127, и 87. 113,111, 95 и 8 7 . П р и м е р 15. Получение 25 — (1 — метилтиоэтил)авєрмектин А2. П р и м е р 13. ДІопучение 2 5 50 Воспроизводят среду и условия при(циклогєкс-З-енил)авермектнн А2, мера 1 за исключением того, что в к а Воспроизводят среду и условия причестве субстрата используют натриевую мера 1 за исключением т о г о , что в к а соль 2-метилтиопропионовоЙ кислоты до честве субстрата используют натоиеполучения соединения формулы ( 1 ) , г д е вуют соль 3-циклогексановой кислоты до получения соединения формулы ( 1 ) , 55 R,, - ОН, R 2 - 1 -метилтиоэтилом, R ? СИ,., a R 4 - 4 ' -(альфа-2-олеандроксил)где R ( - ОН, двойной связи н е т , Rл ~ альфа-г-олеанцроксилокси в виде белоциклогекс-3-енип, R J - C H J , a R ^ го порошк-а с т е п л . 134-138°С. 4 -(альфа-Е-олеандросил)-альфа-Z-оле 1 3 1560059 Строение полученного продукта подтверждено масс-спектр^метрически с л е дующим образом. Масс-спектрометрию с бомбардировкой быстрыми электронами осуществляют на масс-спектрометре V модель G 7О7ОЕ, используя матрицу образца триэтиленгликоля с твердый натрийхлоридом. (М+Ыа) наблюдают' при т / е 945 J0 (теоретически 94 5) . Facc-спектрометрик» электронного удара осуществляют на масс-спектрометре V модель 7O7OF. Значение т / е G для основных фрагментов: 34J, 323, 275, 257, 239^ 2И , J 7 9 , 187, 145, 1 2 7 , Л З , )П , 95 и 87. П р и м е р 56. Получение 26-(2метилциклопропил)авермектин А2, Воспроизводят среду и условия при20 мера 1 за .исключением того^ что в к а честве субстрата используют натриевую соль 2-метилциклопропанкарбоновой кислоты до получения соединения Формулы ( 1 ) , где Я1 - ОН, R^ - 2-метил- 25 циклопропил, R- - С'Ч* R 4 ~ ^ ' * - ( а л ь ~ фа-^-олеандросил) -альйа^-олеандроксилокси, в виде белого порошка с т . п л . !47-150°С. вал, р 2-метилпентаиов ция. Продукт, полученный по способу любого из предшествующих примеров, растворяют в полиэтиленгликоле (средний молекулярный вес 300) до получения раствора, содержащего 400 мкг/мл, для применения в качестве жидкой композиции. П р и м е р 2 1 . Протирогельминтную активность оценивают против Саеin Строение полученного продукта под- зо norhab d i t i s e l e g a n s , используя v i t r o тест скрянирования. Продукты т«ерждено масс-спектрометрически с л е примеров 1, 7, 9-16 убивают 100% чердующим об ра з ом. вей в концентрации 0,1 мгклУмл. Масс-спектрометрию с бомбардировП р и м е р 22. Инсектицидная аккой быстрыми электронами осуществлятив нос т ь . ют на масс-спектрометре V модель G 7070Е, ИСПОЛЬЗУЯ матрицу образца три- 35 Активность против взрослой домашэтиленгликоля с твердым натрийхлориней мухи Musea domestica демонстрирудом, (M+Na) наблюдают при т / е 925 ют, испопьзуя стандартную тестовую (теоретически 925) . методику, в которой мух анестезируют двуокисью углерода и 0,1 мкл ацетоМасс-спектрометрию электронного 40 на, содержащего тестовое соединение, удара осуществляют на масс-спектропомещают на торакс самок мух. Продукметре V модель 7O7OF. Значение т / е G ты примеров 1,7 и 9-16 .все убивают для основных фрагментов: 596, 454, 1 00% обработанных мух в дозах 303, 275, 237^ 219, 209, 191, 179, 0,01 мкг на муху. 167,145, 127, 1 13, 111 , 96 и 87. 45 Использование способа позволяет П р и м е р 17. Воспроизводят поттучать препараты, обладающие прптиспособ по примеру I за исключением вопаразитическим действием широкого того, что в качестве субстрата вместе спектра. циклопентакарбонпвой кислоты испольФ о р м у л а и з о б р е т е'н и я зуют натриевые соли следующих карбоиовых кислот, до получения соответст- 50 1. Способ получения производного вующих 25-замещенных авермектинов авермектина общей формулы I формулы ( 1 ) , где R f - ОН, двойной связи нет, или где имеется двойная связь, а К , отсутствует, R 3 - Н или ОН, a R - 4'-(альфа-г-олеандросил)- 55 4 альфа-й-олеандросилокси: 2-метилвалериановая, 2,3-диметилмасляная, 2- • метилгексановак, 2-метилпент-4-ено^ 16 1560059 где пунктирная линия в положении 22заключающийся в- том-, что штамм Strep23 представляет возможную двойную tomyces a v e r m i t i l i s NCIB 12121 кульсвязь; тивируют в питательной среде в приR+ - Н или О и отсутствует двойН сутствии карбоновой кислоты общей ная связь в положении 22-23 *° • или двойная связь присутствует и отсутствует R