Вірусна вакцинна композиція та спосіб її отримання

1. Вакцинна композиція, що містить принаймні два живі мутантні віруси з ідентичної родини, де кожний вірус має мутацію у вірусному геномі, а мутації у вір усах знаходяться в ідентичному геномному сайті, так що мутантні віруси не можуть рекомбінуватися один з одним з видаленням мутації, і де два живі мутантні віруси складаються з мутантних вірусів коров‘ячої вірусної діареї (ВВДК). 2. Вакцинна композиція за п. 1, де два мутантні живі віруси складаються з мутантного вірусу коров‘ячої вірусної діареї типу 1 (ВВДК-1) та мутантного вірусу коров‘ячої вірусної діареї типу 2 (ВВДК2). 3. Вакцинна композиція за п. 2, де два мутантні живі віруси складаються з цитопатичного ВВДК-1 2 (19) 1 3 85845 Заявлений винахід стосується загалом вакцин, придатних для застосування до тварин проти вірусних інфекцій. Більш конкретно, заявлений винахід стосується безпечних вакцин та способів отримання таких вакцин. Вакцини заявленого винаходу містять принаймні два живих мутантних віруси з ідентичної родини, або молекули нуклеїнових кислот, що кодують такі віруси, де у кожному вірусі або кодуючій нуклеїновій кислоті є мутація, що призводить до бажаного фенотипу, а мутації у вірусах залишаються в одному геномному сайті, так що мутантні віруси не можуть рекомбінуватися з будь-яким іншим з видаленням мутації. Родина вірусів Flavi viridae складається з видів Pestivirus, Flavivirus та Hepacivirus. Вид Pestivirus представлено біотипом вірусу вірусної діареї корів 1 (ВВДК-1), ВВДК-2, вірусу класичної свиної лихоманки, та вірусу хвороби Бордера. Віріони членів родини інкапсулюють геноми позитивно-нитьової РНК розміром приблизно 9.5-12.3ко. Геномні РНК містять суміжні довгі відкриті рамки зчитування (ВРЗ), котрі транслюються у поліпротеїни, що оброблюються клітинними та вірусними протеазами, даючи дозрілі вірусні білки. Для членів Pestivirus, ВРЗ кодує поліпротеїн розміром приблизно 3900 амінокислот, котрий ко-трансляційно та посттрансляційно оброблюється до дозрілих вірусних білків (від 5' до 3'): Nero, С, Erns, Е1, Е2, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A, та NS5B. Два біотипи виявлені серед деяких членів Pestivirus на основі їх дії на клітини культури тканин, а саме цитопатогенні (цитопатичні або цп) та нецитопатогенні (нецитопатичні або нцп). Геномні аналізи виявили вставки клітинних послідовностей, що іноді супроводжуються дуплікацією вірусних послідовностей, геномними перебудовами та/або видаленням вірусних послідовностей у геномах цп-пестивірусів, але не у РНК відповідних нцп-пестивірусів. Це свідчить що цп-пестивіруси розвиваються з нцп-пестивіруси рекомбінацією РНК. ВВДК є широко розповсюдженим патогеном великої рогатої худоби. ВВДК-1 звичайно викликає тільки помірну діарею у імунокомпетентних тварин, оскільки ВВДК-2 може викликати тромбоцитопенію, геморагії та гостру фатальну хворобу. ВВДК здатні перетинати плаценту вагітної великої рогатої худоби та може призводити до народження стійко інфікованих (СІ) телят [Malmquist, J. Am. Vet. Med. Assoc. 152:763-768 (1968); Ross, et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 188:618-619 (1986)]. Віремічні телята є імунотолерантними до вірусу та стійко віремічними протягом залишку життя. Вони забезпечують джерело для спалахів хвороб слизової [Liess, et al., Dtsch. Tieraerztl. Wschr. 81:481-487 (1974)] та є високо схильними до інфекції мікроорганізмами, що викликають хвороби, якто пневмонія або кишкова хвороба [Barber, et al., Vet. Rec. 117:459-464 (1985)]. Віруси будь-якого генотипу можуть існувати як один з двох біотипів, цп або нцп. Цп-фенотип корелює з експресією NS3, оскільки клітини, інфіковані як цп-, так і нцпВВДК експресують NS2-3, a NS3 визначають тільки після інфекції цп-ВВДК. NS3 є колінеарним Стермінальній частині NS2-3. Експресія NS3, як ви 4 явлено, є результатом геномних змін, спостережених для цп-ВВДК. Зараз доступні вірусні вакцини містять вбиті або послаблені живі вірусні вакцини, живоспрямовані вакцини, субодиничні вакцини, та ДНКабо РНК-вакцини. Дивись [Roth et al., "New Technology For Improved Vaccine Safety And Efficacy", Veterinary Clinics North America: Food Animal Practice 17(3): 585-597 (2001)]. Послаблення вірусів можна досягти УФ-опроміненням, хімічною обробкою, або високо серійним пасажем in vitro. Число, позиція та природа мутацій, індукованих цими способами є невідомими без аналізів геномної послідовності. Послаблення можна також досягти створенням визначених генетичних змін, наприклад, специфічного видалення вірусних послідовностей, відповідної за надання вірулентності, або вставки послідовності у вірусний геном. Один інтерес стосовно застосування послаблених живих вірусних вакцин полягає в тому, що послаблені мутантні віруси мають можливість рекомбінувати in vi vo для видалення послаблювальних мутацій,тим повертаючи вірулентність. Наприклад, у присутності вірулентного (природний тип) натурального штаму послаблені віруси, що мають делеції у вірусному геномі, мають можливість рекомбінувати з вірулентним штамом з поверненням видаленої послідовності. Дивись, наприклад, [Roth et al., вище]. Цитопатичні пестивіруси, що мають клітинні вставки, як також спостерігали, дають нецитопатичні віруси у культурі клітин видаленням клітинних послідовностей, можливо рекомбінацією РНК. Дивись, наприклад, ["Insertion of cellular NEDD8 coding sequences in a pestivirus", Virology. 278(2): 456-66, (2000), та Becher et al., "RNA recombination between persisting pestivirus and a vaccine strain: generation of cytopathogenic virus and induction of lethal disease", Journal of Virology 75(14): 6256-64 (2001)], де потрібно уводити два послаблені мутантні віруси з одного, виду або родини у вакцинній композиції, це стосується того, що два віруси можуть рекомбінуватися у вакцинованій тварині, тим видаляючи послаблювальні мутації. Дивись, наприклад, [Glazenburg et al., "Genetic recombination of pseudorabies virus: evidence that homologous recombination between insert sequences is less frequent than between autologous sequences", Archi ves of Virology, 140(4): 671-85 (1995)]. Залишається необхідність розробки безпечних та ефективних вакцин, котрі захищають тварини проти вірусних інфекцій. Заявлений винахід стосується безпечних вакцин, котрі містять принаймні два живі мутантні віруси з ідентичної родини або молекули нуклеїнових кислот, що кодують такі віруси, де у кожному вірусі або кодуючій нуклеїновій кислоті є мутація, що призводить до бажаного фенотипу, а мутації у вірусах знаходяться в одному геномному сайті, так що мутантні віруси не можуть рекомбінуватися один з одним з видаленням мутації. Заявлений винахід також стосується способу отримання безпечної вірусної вакцини вибором або створенням двох або більше живих мутантних вірусів з ідентичної родини, вид або біотип, де у 5 85845 6 кожний вірус має мутацію, що призводить до баозначає геномну молекулу нуклеїнової кислоти жаного фенотипу, та мутації у вір усах знаходяться вірусу, у формі РНК або ДНК. в одному геномному сайті, так що мутантні віруси "Мутація" означає видалення, вставку або зане можуть піддаватися гомологічній рекомбінації з міщення одного чи більше нуклеотидів, або їх комвидаленням мутацій. бінації. Згідно з заявленим винаходом, мутація Заявлений винахід крім того стосується спопереважно надає бажаного фенотипу, наприклад собу захисту тварин від вірусних інфекцій застосупослаблення вірулентності, зміни клітинного тропіванням до тварини вакцинної композиції заявленозму або біотипу, зміни тропізму різновиду, або го винаходу. експресію чужинної генної касети. Особливо переФіг. Вивірка вставок та фланкуючих вірусни х важними мутаціями є мутації, що надають послабпослідовностей регіонів NS2-3 штаму ВВДК-1 леної вірулентності. NADL та штаму ВВДК-2 53637. "Послаблення" означає, що вірус втратив часОднозначно визначено згідно з заявленим витково або усю свою здатність до проліферації находом, що живі мутантні віруси з ідентичної рота/або викликання хвороб у інфікованих вірусом дини, котрі містять мутації в одному геномному тварин. Наприклад, послабленим може бути вірус, сайті вірусів, не можуть рекомбінуватися один з що нездатний до реплікації в усі х або одному чи одним з видаленням мутацій. кількох етапах реплікації, або обмежений у клітинВідповідно, в одному втіленні заявлений винаному або тканинному тропізмі, у наявності у твахід стосується безпечних вакцинних композицій, рині, у котрій може реплікувати патогенна версія котрі містять принаймні два, тобто, два або більприродного типу послабленого вірусу. ше, живих мутантних вірусів з ідентичної родини, Послаблений вірус може мати одну чи більше або молекул нуклеїнових кислот, що кодують такі мутацій у гені або генах, що залучені у патогенвіруси, де мутації у вір усах знаходяться в одному ність вірусу. Такі мутації також позначені тут як геномному сайті, так що мутантні віруси не можуть "послаблювальні мутації". Послаблений вірус морекомбінуватися один з одним з видаленням мужна отримувати з природного типу, патогенного тації. вірусу УФ-опроміненням, хімічною обробкою, або У ще одному втіленні заявлений винахід стовисоко-серійним пасажем природного типу, патосується способу отримання безпечної вірусної генного вірусу in vitro. Альтернативно, послаблевакцини, як описано тут ви ще. Конкретно, безпечний вірус можна отримувати з природного типу, ну вакцину отримують вибором або створенням патогенного вірусу специфічним видаленням вірудвох або більше живих мутантних вір усів з одних сних послідовностей, відповідних за надання віруродини, виду або біотипу, де кожний вірус має лентності, вставкою послідовностей у вірусний мутацію, що призводить до бажаного фенотипу геном, або створенням одної чи більше точкової (наприклад послаблення вірулентності, зміни клімутації у вір усному геномі. Послаблений вірус мотинного тропізму або біотипу, зміни тропізму різже бути вірусним ізолятом, отриманим від твариновиду, або експресію чужинної генної касети), а ни, цей ізолят походить з природного типу, патомутації у віруса х знаходяться в одному геномному генного вірусу не через штучні засоби, наприклад, сайті, так, що мутантні віруси не можуть піддаварекомбінацією, що відбулася у тварині-хазяїні. тися гомологічній рекомбінації один з одним з виДва або більше живих мутантних вірусів, котрі даленням мутацій. наявні у вакцинних композиціях заявленого винаТермін "вакцина" або "вакцинна композиція" ходу містять мутації, що знаходяться в одному стосується композиції, що містить живі мутантні геномному сайті. "Тій же геномний сайт" означає, віруси, котрі при інокуляції у тварину індук ують що коли вивіряють послідовності геномних нуклеоповну або часткову імунність до патогенної версії тидів вірусів, мутації у вір усних геномах перекривірусів або послаблюють симптоми хвороб, викливаються одна з одною так, що це є несприятливим каних патогенними версіями вірусів. Захисної дії для гомологічної рекомбінації між вірусними геновакцинної композиції проти вірусу звичайно досямами з видаленням мутацій. Іншою мовою, при гають індукуванням у суб'єкті імунної реакції, оповивірці послідовностей геномних нуклеотидів вірусередкованої клітинами або гуморальної імунної сів, є принаймні одна суміжна частина вивірених реакції, або комбінацією обох. Загалом кажучи, послідовностей, де послідовності у вивірених вірузнищена або зменшена інцидентність вірусної інсних геномах є мутантними послідовностями. Є фекції, поліпшення симптомів, або прискорене ряд комп'ютерних програм, що порівнюють та вивидалення вірусів з інфікованих суб'єктів є індикавіряють послідовності нуклеїнових кислот, котрі тивними стосовно захисної дії вакцинної композиможе застосовувати фа хівець. Послідовності вивіції. ряють для оптимального порівняння (наприклад, "Тварина" означає птиць, наприклад, курок, інгепи можуть бути уведені у послідовності нуклеїдиків, домашню водоплавну птицю, та будь-якого нових кислот для оптимальної вивірки з другою ссавця, наприклад, велику рогату худобу, овець, послідовністю нуклеїнової кислоти). Наприклад, свиней, кіз, собак, котів та коней. програми NBLAST та XBL AST, описані у [Altschul, Термін "віруси", "вірусні ізоляти" або "вірусні et al., 1990, J. Mol. ВіоІ. 215:403-410], програма штами", застосовувані тут, стосуються вірусних Gapped BLAST, що описано у [Altschul et al., 1997, частинок або віріонів, що містять вірусну геномну Nucleic Acids Res. 25:3389-3402], та програма PSIДНК або РНК, асоційовані білки, та інші хімічні Blast, що описано у [Altschul et al., 1997], вище. складові (так як ліпіди). При застосуванні програм BLAST, Gapped BLAST, "Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує віта PSI-Blast, параметри за умовчанням відповідрус" або "молекула нуклеїнової кислоти вірусу" них програм (наприклад, XBLAST та NBLAST) мо 7 85845 8 жна застосовувати (дивись хворобу [Corapi et al., J. Virol. 63: 3934-3943; Bolin http://www.ncbi.nlm.nih.gov). et al., Am. J. Vet. Res. 53: 2157-2163; Pellerin et al., Загалом кажучи, концепцію заявленого винаVirology 203: 260-268, 1994; Ridpath et al., Virology ходу, тобто, вміщення в одній вакцинній композиції 205: 66-74, 1994; Carman et al., J. Vet. Diagn. Invest. двох або більше живих мутантни х вірусів з іденти10: 27-35, 1998]. Два типи вір усів мають відмінну чної родини, що мають мутації в одному геномноантигенність, визначену за допомогою панелі му сайті, застосовують до мутантних вірусів від MAbs та перехресною нейтралізацією, застосовубудь-якої родини, де вірусні геноми мають достатючи вірус-специфічну антисироватку, створену у ню ідентичність послідовностей для дозволяння тварині [Corapi et al., Am. J. Vet. Res. 51: 1388гомологічної рекомбінації. Показано, що нуклеоти1394, 1990]. Віруси будь-якого генотипу можуть дна ідентичність така коротка, як 15 нуклеотидів, існувати як один з двох біотипів, цитопатогенного може призводити до ефективної гомологічної ре(цитопатичного або цп) або нецитопатогенного комбінації [Nagy та Bujarski, J. Virol. 69:131-140, (нецитопатичного або нцп). Цп-віруси індукують 1995]. цитопатичну дію (наприклад, лізис клітин) на кульЗаявлений винахід особливо стосується вірутивовані клітини, а нецитопатичні віруси не індусів родини Flaviviridae. Родина Flaviviridae складакують цитопатичної дії. ється з видів Pestivirus, Flavivirus та Hepacivirus. Бажано отримувати вакцини, що забезпечують Віріони членів родини Flaviviridae інкапсулюють захист проти ВВДК-1 та ВВДК-2. Однак, внаслідок геноми позитивно-нитьової РНК приблизно 9.5високого ступеню ідентичності послідовностей між 12.3ко. Геномні РНК, що містять суміжні довгі віддвома вірусами, є можливість, що живий цитопакриті рамки зчитування, котрі транслюються у потичний ВВДК-1 та живий цитопатичний ВВДК-2, ліпротеїни, оброблюються клітинними та віруснивміщені в одну вакцинну композицію, могли б реми протеазами, даючи дозрілі вірусні білки. комбінуватися один з одним у вакцинованій твариПереважно, мутантні віруси з вакцинної комні з утворенням нецитопатичних вірусів. Рекомбіпозиції заявленого винаходу належать до одного нація між ВВДК-1 та ВВДК-2 документовано. виду, однакового чи відмінного біотипу. Дивись, наприклад, [Ridpath et al., Virology 212: У кращому втіленні вакцинна композиція заяв259-262 (1995)]. Інфекція плода вагітної великої леного винаходу містить два або більше живі мурогатої худоби нцп-вірусами перед розвиненням тантні віруси виду Pestivirus. Вид Pestivirus предімунокомпетентності може призводити до плода, ставлено біотипом вірусу вірусної діареї корів типу що залишається віремічним протягом вагітності та 1 (ВВДК-1), вірусу вірусної діареї корів типу 2 наступного народження теляти, що залишається (ВВДК-2), вірусу класичної свиної лихоманки, та стійко віремічним. Таке теля може загинути від вірусу хвороби Бордера. ВРЗ кодує поліпротеїн хвороби слизової при суперинфекції цп-ВВДК. Відприблизно у 3900 амінокислот, котрий коповідно, вакцинні композиції заявленого винаходу, трансляційно та пост-трансляційно оброблюється котрі містять живий цп-ВВДК-1 та живий цп-ВВДКдо дозрілих вірусних білків (від 5' до 3'): Nero, С, 2, що мають мутації в одному геномному сайті, є Ems, Е1, Е2, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5 A, та NS5B. особливо бажаними для захисту тварини проти Звичайно, ВВДК має геном у формі РНК. РНК обох ВВДК-1 та ВВДК-2. може бути зворотно-транскрибованою у ДНК для В одному втіленні ВВДК цп-ізоляти, отримані застосовування у клонуванні. Отже, посилання на від тварини, можна застосовувати у вакцинній нуклеїнові кислоти та ВДК-вірусні послідовності композиції заявленого винаходу. Цп-ізоляти обох охоплюють послідовності вірусної РНК та послідоВВДК-1 та ВВДК-2 описані та є доступними фахіввності ДНК, похідні від вірусних послідовностей цям, наприклад, ВВДК-1 NADL (ATCC# VR1422 РНК. Для зручності геномні послідовності ВВДК, або VR-534), ВВДК-2 53637 штам (депоновано в представлені у переліку послідовностей тут нижче, АТСС як РТА-4859), та природні ізоляти типу 2, якстосуються тільки послідовностей ДНК. Відповідна то описані [Ridpath та Neill, J. Virol 74:8771-8774, послідовність РНК для кожної ясна фахівцям. (2000)]. Описані до сучасного часу цп-ізоляти звиУ ще кращому втіленні вакцинна композиція чайно містять вставку гетерологічної послідовносзаявленого винаходу містить цитопатичний ВВДКті, наприклад, кодуючої убіквітин послідовності 1 та цитопатичний ВВДК-2, де у мутації в обох ві[Genbank accession number M96687 або De русах, асоційовані з цитопатичним біотипом, знаMoerlooze et al., J. Gen. Virol. 74:1433-1438, (1993)], ходяться в одному геномному сайті так, що два кодуючої NEDD8 корів послідовності [Baroth et al., мутантні віруси не можуть рекомбінуватися з вивище], або кодуючої Bos taurus DnaJ1 послідовнодаленням мутацій. сті (як описано у прикладах тут нижче), серед інВВДК-1 та ВВДК-2 представляють два тісно ших. споріднені генотипи ВВДК. Нуклеоти-дні послідовУ ще одному втіленні цп-ВВДК отримують ності двох вірусів мають приблизно 70% ідентичстворенням визначеної зміни у геномі ВВДК, наності суцільного геному, та трохи вищий процент приклад, видаленням специфічної вірусної посліідентичності у регіоні NS2-3. Вважають, що продовності, вставкою послідовності у конкретний цент ідентичності між вірусними геномами ВВДК-1 вірусний геномний сайт, або створенням одного чи та ВВДК-2, принаймні у регіоні NS2-3, є достатніми більше заміщень, або їх комбінаціями. для дозволяння гомологічної рекомбінації. Коли цп-ВВДК створюють вставкою гетеролоВВДК-1 звичайно викликають тільки помірну гічної (тобто, чужинної до вірусу) послідовності діарею у тварини, оскільки ВВДК-2 є вірусами з конкретний вірусний геномний сайт, природа встависокою вірулентністю, котрі можуть викликати влюваної послідовності загалом не є критичною тромбоцитопенію, геморагії та гостру фатальну згідно з заявленим винаходом. На додаток, встав 9 85845 10 ка не є обмеженою будь-яким конкретним сайтом, ної рекомбінації. Додаткові приклади комбінацій оскільки вставка призводить до послабленого февірусів, прийнятних для застосовування у вакциннотипу. Як гетерологічні, послідовності у цпній композиції заявленого винаходу охоплюють, ізолятах часто виявляють у регіоні NS2-3, регіоні але без обмеження, комбінації відмінних типів поNS2-3, особливо частині оточуючій передбачуваліовірусів, комбінації багатьох живих мутантних ний сайт розщеплення NS2-3, котрий відповідає, штамів вірусу інфекційного бронхіту, комбінації наприклад, амінокислотним залишкам №1679 багатьох живих мутантних штамів вірусу хвороби №1680 штаму ВВДК-1 NADL (нумерація на основі Ньюкасла, комбінації аденовірусу-1 собак та адеопублікованої геномної послідовності Genbank новірусу-2 собак, комбінації вірусу герпесу-1 коней accession № М31182, SEQ ID NO: 4), є переважта вірусу герпесу-4 коней, комбінації багатьох жиним розташуванням для вставки. вих мутантних штамів вірусу грипу, комбінації жиЦп-ВВДК-1 можна створити визначеною генових послаблених мутантних штамів кальціовірусу мною зміною, що імітує м утацію, ідентифіковану в кішок, комбінації багатьох серотипів ротавірусу, ізоляті цп-ВВДК-2, отриманому від тварини, так що комбінації багатьох серотипів риновірусу, комбінаці віруси мають мутації, асоційовані з цп-біотипом, ції багатьох серотипів вірусу хвороби лап та рота, в одному геномному сайті. Подібним чином, цпкомбінації європейських та північно-американських ВВДК-2 можна створити визначеною геномною генотипів вірусу репродуктивного та респіраторнозміною, що імітує м утацію, ідентифіковану в ізоляті го синдрому свиней, комбінації стандартних та цп-ВВДК-1, отриманому від тварини. варіантних штамів вірусу інфекційної хвороби сиУ кращому втіленні вакцинна композиція заявновіальної сумки. леного винаходу містить NADL (ізолят цп-ВВДК-1), Згідно з заявленим винаходом, хоча переважта ВВДК-2 53637 (ізолят цп-ВВДК-2), де кожний цпно для застосовування у вакцинах призначені віізолят має мутацію в одному геномному сайті, котрусні частинки, у вакцинах також можна застосорий призводить до цитопатичного біотипу. Геномвувати безпосередньо молекули нуклеїнових ну послідовність штаму ВВДК-1 N ADL показано у кислот, що кодують мутантні віруси з одних родиSEQ ID NO: 4, а штам ВВДК-2 53637 депоновано в ни, виду або біотипу,. ДНК- або РНК-молекули моАТСС як РТА-4859. Обидва ізоляти містять вставжуть бути у "незахищеній" формі або їх можна ку у регіоні NS2-3. Послаблений цп-ВВДК-1 містить комбінувати із засобом, котрий полегшує клітинне вставку кодуючої послідовності Bos taurus DnaJ1 3' поглинання (наприклад, ліпосомами або катіоннитимідину у н уклеотидній позиції №4993 (послідовми ліпідами). Вакцини та способи вакцинації, що ності нумерації NADL), що є третім нуклеотидом застосовують нуклеїнові кислоти (ДНК або мРНК) кодону, що кодує залишок гліцину у н уклеотидній добре описані у рівні те хніки, наприклад, [Патент позиції 1536. Послаблений цп-ВВДК-2 містить США №5703055, Патент США №5580859, Патент вставку кодуючої послідовності Bos taurus DnaJ1 в США №5589466, Міжнародна патентна публікація одному геномному сайті. WO 98/35562, та Immunol. Cell Biol. 75:360-363; Згідно з заявленим винаходом, цп-ВВДК ізоляDavis, 1997, Cur. Opinion Biotech. 8: 635-640; ти, застосовувані у заявленій вакцинній композиції Manickan et al., 1997, Critical Rev. Immunol. 17: 139є послабленими, а відтак непатогенними. Способи 154; Robinson, 1997, Vaccine 15(8): 785-787; послаблення відомі фахівцям, а також описані тут Robinson et al., 1996, AIDS Res. Hum. Retr. 12(5): нижче. 455-457; Lai and Bennett, 1998, Critical Rev. У ще одному втіленні вакцинна композиція заImmunol. 18:449-484; and Vogel and Sarver, 1995, явленого винаходу містить послаблений ВВДК-1 Clin. Microbiol. Rev. 8(3): 406-410, усі які уведені тут та послаблений ВВДК-2, де послаблювальні мутаяк посилання]. ції в обох вір усах знаходяться в одному геномному На додаток до двох або більше живих мутантсайті так, що два мутантні віруси не можуть реконих вірусів з одних родини, виду або біотипу вакмбінуватися з видаленням послаблювальних муцинні композиції можуть містити інший антигенний тацій. компонент. Інші антигенні компоненти, прийнятні Послаблений ВВДК створюють УФдля застосовування згідно з заявленим винахоопроміненням, хімічною обробкою або високо седом, охоплюють, але без обмеження, антигени, рійним пасажем патогенної версії вірусу in vitro. отримані від патогенних бактерій, як-то Аналіз послідовності можна провести для визнаMycoplasma hyopneumonia, Haemophilus somnus, чення природи та геномного розташування мутаHaemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, цій, створених цими способами. Мутації можуть Bacillus anthracis, Actinobacillus pleuropneumonie, бути у формі видалення, вставки або заміщення Pasteurella multocida, Mannhemia haemolytica, одного чи більше нуклеотидів, або їх комбінацією. Mycoplasma bovis, Mycoplasma galanacieum, Альтернативно, послаблений ВВДК створюють Mycoplasma gallisepticum, Mycobacterium bovis, визначеною зміною у геномі ВВДК, наприклад, Mycobacterium paratuberculosis, Clostridial spp., видаленням конкретної вірусної послідовності, Streptococcus uberis, Streptococcus suis, вставкою послідовності у конкретний вірусний геStaphylococcus aureus, Erysipelothrix rhusopathiae, номний сайт, або створенням одного чи більше Campylobacter spp., Fusobacterium necrophorum, заміщень, або їх комбінацією. Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Listeria Як описано вище, живі мутантні віруси для заmonocytogenes, Rickettsia rickettsii, Borrelia spp., стосовування у вакцинній композиції заявленого Ehrlichia spp., Chlamydia spp., Brucella spp., Vibrio винаходу можуть бути з одних родини, виду або spp., Salmonella enterica serovars, Leptospira spp.; біотипу, де вірусні геноми мають достатню ідентипатогенних грибків, як-то Candida; protozoa, як-то чність послідовностей для дозволяння гомологічCryptosporidium parvum, Neospora canium, 11 85845 12 Toxoplasma gondii, Eimeria spp., Babesia spp., Ад'юванти, придатні для застосовування у ваGiardia spp.; гельмінтів, як-то Ostertagia, Cooperia, кцинних композиціях, охоплюють, але без обмеHaemonchus, Fasciola; у формі інактивованого ження, ад'ювантну систему RIBI (Ribi inc.), галуни, препарату цілих або часткових клітин, або у формі гель алюміній гідроксиду, емульсії масло-у-воді, антигенних молекул, отриманих способами генної емульсії вода-у-маслі, як-то, наприклад, повний та інженери або хімічним синтезом. Додаткові антинеповний ад'юванти Фрейнда, блок-кополімер гени охоплюють патогенні віруси, як-то вірус хво(CytR x, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), роби Марека, вірус інфекційної хвороби синовіаAMPHIGEN Ò ад'ювант, сапонін, Quil А, холестельної сумки, вірус хвороби Ньюкасла, вірус анемії рин, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge курок, вірус курячої віспи, вірус лейкозу птиць, віMA), або інші фракції сапоніну, монофосфориллірус ларинготрахеїту, ретикулоендотеліальний віпід А, ад'ювант авридин-ліпід-аміну, теплонастабірус, парвовірус собак, вірус собачої чумки, вірус льний ентеротоксин від Е. coli (рекомбінантний або герпесу собак, коронавірус собак, парагрипу-5 соінакше), токсин холери, або мураміл дипептид, бак, вірус панлейкопенії кішок, вірус герпесу кішок, серед багатьох інших. кальциовірус кішок, імунодефіциту кішок, вірус Заявлений винахід далі ілюстровано, але без інфекційного перитоніту кішок, вірус герпесу коней, обмеження, наступними прикладами. вірус артериту коней, вірус інфекційної анемії коПриклад І ней, вірус східного енцефаліту коней, вірус західВизначення позиції клітинної вставки у штамі ного енцефаліту коней, вірус енцефаліту коней, 53637 ВВДК2 вірус західного Нілу, вір ус інфекційного гастроенЧастину регіону послідовності NS2-3 від териту, коронавірус корів, вірус герпесу-1,3,6 корів, ВВДК2-53637 визначали, для ідентифікації та карпарагрипу корів, респіраторний синцитіальниий тування розташування будь-якої клітинної вставки вірус корів, вірус лейкозу корів, вірус чуми великої у регіоні. Продукт 3T-ПЛР з 670 основ ампліфікурогатої худоби, вірус хвороби лап та рота, вірус вали з вірусної РНК, застосовуючи передній прайсказу, вірус африканської свиної лихоманки, пармер 53637U1 (5'-CGTCCACAGATGGTTTGGT-3'; вовірус свиней, вірус PRRS, цирковірус свиней, SEQ ID NO: 1) та зворотний праймер 53637L (5'вірусу грипу, вірус п узирчатки свиней, вірус лихоGGCTATGTATTGGACGTAACCC-3'; SEQ ID NO: 2). манки Техена, вірус псевдосказу, у формі препаПродукт 3T-ПЛР очищали та аналізували послідорату модифікованих живих (послаблених) вірусів, вність (SEQ ID NO: 3). При вивірці з ВВДК1-NADL препарату інактивованих цілих або часткових віру(Genbank accession № М31182, SEQ ID NO: 4), сів, або у формі антигенних молекул, отриманих спостерігали разючі подібності (Фіг.). Обидва віруспособами генної інженерії або хімічним синтезом. си містять у рамці вставку, похідну від гена Bos При застосуванні додаткових послаблених живих taurus DnaJ1. У випадку NADL, вставка має 90 амівірусів такі додаткові віруси повинні переважно нокислот (270 нуклеотидів) у довжину та розташобути з родини відмінної від родини двох головних вана між гліцином-1536 та проліном-1627 у поліпослаблених вірусів, що описано вище. протеїні NADL. Ці координати відповідають У кращому втіленні заявлений винахід стосугліцину-1536 та проліну-1537 у нецитопатичних ється вакцинної композиції, котра містить послабштамах ВВДК1, як-то SD-1 (Genbank accession № лений цп-ВВДК-1, похідний від штаму ВВДК-1 ААА42860, SEQ ID NO: 6), вказуючи, що зміна геNADL, послаблений цп-ВВДК-2, похідний від штаному у NADL є простою вставкою без супровому 53637ВВДК-2, де кожний з двох цп-ізолятів місдження видаленням або дуплікацією фланкуючих тить мутацію, асоційовану з цп-біотипом, в одному вірусних послідовностей. Аналогічно ВВДК1-NADL, геномному сайті, та принаймні один (тобто, один є вставка частини гена Bos taurus DnaJ1 у ВВДК2чи більше) наступний антигенний компонент, у 53637. Клітинна вставка є довшою (131 амінокисінактивованій або модифікованій живій формі: вілот, 393 нуклеотидів), і простягається у обох нарус герпесу-1 корів, респіраторний синцитіальниий прямках відносно вставки у ВВДК1-NADL. Розтавірус корів, вірус парагрипу-3, Campylobacter fetus, шування клітинної вставки у регіоні NS2-3 є Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, ідентичним в обох вірусах. На відміну від ВВДК1Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, NADL, вставка ВВДК2-53637 супроводжується виLeptospira pomona, або Mannhemia haemolytica. даленням 5 амінокислот (15 нуклеотидів) фланкуНа додаток, вакцинні композиції заявленого ючих вір усних послідовностей. Три амінокислотні винаходу можуть містити один чи більше ветеризалишки відсутні, фланкуючи 5' закінчення вставнарно прийнятних носіїв. Як застосовувано тут, ки, а два амінокислотні залишки відсутні, фланку"ветеринарно прийнятний носій" охоплює усі розючи 3' закінчення вставки. Оскільки клітинні вставчинники, дисперсійні середовища, покриття, ад'юки є у тій ж самій геномній позиції у двох ванти, стабілізатори, розріджувачі, консерванти, вакцинних вірусах, вони не можуть піддаватися антибактеріальні та антигрибкові засоби, ізотонічні гомологічній рекомбінації з видаленням вставки засоби, засоби затримки поглинання, тощо. Розрідля створення нецитопатичного химерного вірусу. джувачі можуть містити воду, фізіологічний розПриклад II чин, декстрозу, етанол, гліцерин, тощо. Ізотонічні Спроби виявити нецитопатичні віруси ВВДК у засоби можуть містити натрій хлорид, декстрозу, копасажованій культурі ВВДК1-NADL/BBДК2-53637 манітол, сорбітол, та лактозу, серед іншого. СтабіДля визначення, чи здатні рекомбінувати два лізатори охоплюють альбумін, серед іншого. Ваквакцинні віруси для створення визначуваних рівнів цинні композиції можуть містити один чи більше нецитопатичних ВВДК, віруси співкультивували на інших імуномодулювальних засобів, як-то, наприсприйнятливих клітинах та застосовували чутливе клад, інтерлейкіни, інтерферони, або інші цитокіни напівгніздове 3T-ПЛР-дослідження для виявлення 13 85845 14 можливості нецитопатичних вірусів з числа з надДля збільшення чутливості виявлення нецитолишком довших цитопатичних продуктів, що все патичного ВВДК у присутності великого надлишку ще містять клітинну вставку. Для збільшення ймоцитопатичного ВВДК, обмеження фермент етап вірності внутрішньотипової рекомбінації in vitro, гідролітичного розщеплення здійснювали перед кожний вірус інокулювали одночасно на конфлюєгніздовою ПЛР для руйнування великих темплатів нтні клітини ВК-6 у 6-коміркових планшетах при NS2-3, похідних від цитопатичних вірусів. Комбінарозмаїтості інфекції 2-4 (12 реплікатів на експерицію Mspl та Dral вибирали на основі спостереженмент). Після 2-3 діб співкультивації клітини замоня, що вони розрізають вставку Bos taurus DnaJ1, рожували та розморожували двічі, та обривки кліале не розрізають фланкуючі вірусні послідовностин видаляли центрифугуванням з низькою ті. У другому циклі (напівгніздової) ПЛР, застосошвидкістю. Утворену надосадкову рідину тоді завували передні праймери 53637U2 (5'стосовували як інокулят для наступного пасажу. TGCACGATCTGTGAAGGGAAAGAA-3', SEQ ID NO: Загалом були проведені 7 серійних пасажей у кіль9) або NADL4844 (5'кох дослідженнях. При пасажах ВВДК1-NADL ріс TGCACTGTATGTGAGGGCCGAGAG -3', SEQ ID більш швидко, ніж ВВДК2-53637, але вірус типу II NO: 10) у сполученні з тими ж самими двома звовизначали після ще 7 пасажей, застосовуючи гнізротними праймерами 53637L або NADL5305. Придову 3T-ПЛР. Чутливе дослідження напівгніздової йнятні комбінації праймерів застосовували для 3T-ПЛР застосовували у спробі виявлення будьспроби виявлення внутрішньотипових рекомбінанякого нецитопатичного вірусу. тів, а також ВВДК1 та ВВДК2. Очікуваний розмір У першому циклі 3T-ПЛР, передні праймери продукту 3T-ПЛР - 462 по для цитопатичного 53637U1 (SEQ ID NO: 1) або NADL4744 (5'ВВДК1-NADL та 570 по для цитопатичного ВВДК2CGTGGCTTCTTGGTACGGG-3', SEQ ID NO: 7) 53637 (наявні у низьких рівнях внаслідок неповнозастосовували у сполученні зі зворотними прайго гідролітичного розщеплення продуктів 3T-ПЛР мерами 53637L (SEQ ID NO: 2) або NADL5305 (5'цитопатичних ВВДК). Нецитопатичні віруси при AGCGGTATATTGTACAAAGCCA-3', SEQ IDNO: 8). наявності у визначуваних рівнях, як можна було б Усі 4 комбінації передніх та зворотних праймерів очікувати, даватимуть продукти другого циклу 192 застосовували для визначення ВВДК1, ВВДК2, та по (ВВДК1-NADL) або 177 по (ВВДК2-53637). Внувнутрішньотипових рекомбінантів. Очікуваний трішньотипові рекомбінанти повинні бути подібнирозмір продукту 3T-ПЛР був 562 по для цитопатими за розміром до одного з вихідних, або проміжчного ВВДК1-NADL та 670 по дляцитопатичного ної довжини, залежно від розташування ВВДК2-53637. Нецитопатичні віруси, при наявності рекомбінаційного сайту. Нецитопатичні ВВДК нікопри виявлюваних рівнях, як можна було б очікували не виявлялися після другого циклу ПЛР. У кільти, даватимуть продукти першого циклу 292 по кох окремих реакціях спостерігали аберантні смуги (ВВДК1-NADL) або 277 по (ВВДК2-53637). Внутрірізних розміри. Усі смуги між 100 та 300 по вважашньотипові рекомбінанти повинні бути подібними ли можливими нецитопатичними продуктами та за розміром до одного з вихідних, або проміжної піддавали аналізу послідовності ДНК. У кожному довжини, залежно від розташування рекомбінаційвипадку аберантна смуга була результатом невірного сайту. Нецитопатичні ВВДК ніколи не виявляного праймування при ПЛР. Не було свідоцтва лися після першого циклу 3T-ПЛР. нецитопатичного вірусу у будь-якому з досліджень. 15 85845 16 17 85845 18 19 85845 20 21 85845 22 23 85845 24 25 85845 26 27 85845 28 29 85845 30 31 85845 32 33 85845 34 35 85845 36 37 85845 38 39 85845 40 41 Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко 85845 Підписне 42 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601