Послаблена популяція ротавірусів людини, ротавірус та вакцинна композиція, що містить живий послаблений ротавірус людини

1. Послаблена популяція ротавірусів людини, яка відрізняється тим, що вона включає єдиний варіант або по суті єдиний варіант, причому варіант характеризується нуклеотидною послідовністю, яка кодує щонайменше один з основних вірусних білків, позначених як VP4 і VP7. UA (21) 2002021196 (22) 15.08.2000 (24) 15.12.2006 (86) PCT/EP00/07965, 15.08.2000 (31) 9919468.0 (32) 17.08.1999 (33) GB (31) 9927336.9 (32) 18.11.1999 (33) GB (46) 15.12.2006, Бюл. №12, 2006р. (72) Колау Бріжіт Дезіре, BE, Денамур Франсуа, BE, Кнотт Ізабелль, BE, Поліщак Аннік, BE, Тірі Джорж, BE, Ванде Велде Вінсент, BE (73) ГЛАКСОСМІТКЛАЙН БАЙОЛОДЖІКАЛЗ С.А., BE (56) US A 4571385, 18.02.1986 US A 4341763, 27.07.1982 MIDTHUN K ET AL: "Single gene substitution rotavirus reassortants containing the major neutralization protein (VP7) of human rotavirus serotype 4" JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 24, no. 5, October 1986, pages 822-826, XP000881407 ISSN: 0095-1137 GARBAG-CHENON A ET AL: "Reactogenicity and immunogenicity of rotavirus WC3 vaccine in 5-12 2 (19) 1 C2 (54) ПОСЛАБЛЕНА ПОПУЛЯЦІЯ РОТАВІРУСІВ ЛЮДИНИ, РОТАВІРУС ТА ВАКЦИННА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО МІСТИТЬ ЖИВИЙ ПОСЛАБЛЕНИЙ РОТАВІРУС ЛЮДИНИ 3 77388 4 2. Популяція ротавірусів за п.1, яка відрізняється тим, що вона є клонованим штамом. 3. Популяція ротавірусів за п.1 або п.2, яка відрізняється тим, що вона походить від ротавірусної інфекції людини. 4. Популяція ротавірусів за будь-яким з пп.1-3, яка відрізняється тим, що вона реплікується у людях та екскретується ними. 5. Популяція ротавірусів за будь-яким з пп.1-4, яка відрізняється тим, що по суті єдиний варіант є варіантом, в якому ген VP4 містить нуклеотидну послідовність, що включає щонайменше одне з наступного: основу аденін (А) у положенні 788, основу аденін (А) у положенні 802 та основу тимін (Т) у положенні 501 від стартового кодону. 6. Популяція ротавірусів за п.5, яка відрізняється тим, що ген VP4 містить нуклеотидну послідовність, яка включає основу аденін (А) у положеннях 788 та 802 та основу тимін (Т) у положенні 501 від стартового кодону. 7. Популяція ротавірусів за будь-яким з пп.1-6, яка відрізняється тим, що по суті єдиний варіант є варіантом, в якому ген VP7 містить нуклеотидну послідовність, що включає щонайменше одне з наступного: тимін (Т) у положенні 605, аденін (А) у положенні 897 та гуанін (G) у положенні 897 від стартового кодону. 8. Популяція ротавірусів за п.7, яка відрізняється тим, що ген VP7 містить нуклеотидну послідовність, що включає тимін (Т) у положенні 605 та аденін (А) або гуанін (G) у положенні 897 від стартового кодону. 9. Популяція ротавірусів за пп.5-8, яка відрізняється тим, що ген VP4 містить нуклеотидну послідовність, яка включає аденін (А) у положеннях 788 і 802 та тимін (Т) у положенні 501 від стартового кодону, а ген VP7 містить нуклеотидну послідовність, що включає тимін (Т) у положенні 605 і аденін (А) у положенні 897 від стартового кодону. 10. Ротавірус, який містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок VP4, причому ця нуклеотидна послідовність є такою, як показано на Фіг.1, та/або нуклеотидну послідовність, що кодує білок VP7, при цьому ця нуклеотидна послідовність є такою, як показано на фіг. 2. 11. Популяція ротавірусів за будь-яким з пп. 1-10, що позначена як Р43 та депонована в Європейській колекції клітин тварин, що культивуються, (ЕСАСС), під реєстраційним номером 99081301. 12. Ротавірусний варіант, що позначено як Р43 та депоновано в Європейській колекції клітин тварин, що культивуються, (ЕСАСС) під реєстраційним номером 99081301, потомство ротавірусу, та його імунологічні активні похідні, та матеріали, що отримані з них. 13. Ротавірусний псевдовіріон, що містить щонайменше один антиген або щонайменше один сегмент ротавірусного варіанту Р43 за п. 11 або п. 12. 14. Вакцинна композиція, що включає живий послаблений вірус за будь-яким з пп. 1-13, що змішано з придатним фармацевтичним носієм або ад'ювантом. 15. Вакцинна композиція за п. 14, яка відрізняється тим, що вона пристосована для перорального введення. 16. Вакцинна композиція за п. 15, яка відрізняється тим, що живий послаблений вірус приготовано з антацидною композицією. 17. Вакцинна композиція за будь-яким з пп. 14-16, яка відрізняється тим, що вірус знаходиться у ліофілізованій формі. 18. Вакцинна композиція, що містить живий послаблений ротавірус людини, яка відрізняється тим, що вірус знаходиться у ліофілізованій формі та належить по суті до єдиного варіанту, причому варіант характеризується нуклеотидною послідовністю, яка кодує щонайменше один з основних вірусних білків, позначених як VP4 та VP7. 19. Вакцинна композиція за п. 18, яка відрізняється тим, що вона виконана у формі швидкорозчинної таблетки для негайного розчинення при поміщенні на язик. 20. Вакцинна композиція за п. 18 або п. 19, яка відрізняється тим, що містить ліофілізований живий послаблений вірус, який змішано з неорганічним антацидним засобом, таким, як карбонат кальцію, та агентом, що регулює в'язкість, таким, як ксантанова камедь. 21. Вакцинна композиція за п. 20, яка відрізняється тим, що послаблений вірус та антацидна композиція знаходяться в окремих контейнерах для приготування препарату у вигляді рідкої вакцинної композиції перед введенням. 22. Вакцинна композиція за п. 20, яка відрізняється тим, що послаблений вірус та антацидна композиція приготовані в одному контейнері у вигляді ліофілізованої вакцинної композиції, яку потрібно розводити водним розчином перед введенням. Даний винахід належить до нових вакцинних препаратів, способів їх виготовлення та їх застосування при лікуванні. Зокрема, винахід належить до нових ротавірусних вакцинних препаратів. Гостра інфекційна діарея є основною причиною захворювання та смерті в багатьох областях світу. У країнах, що розвиваються, наслідки діарейного захворювання приголомшують. Для Азії, Африки та Латинської Америки встановлено, що щорічно тут трапляється від 3 до 4 мільярдів ви падків діареї та з них приблизно 5-10 мільйонів випадків, що закінчуються смертю [Walsh J.A.et al. // N. Engl. J. Med. – 1979. – 301. – P. 967-974]. Ротавіруси вважаються однією з найбільш важливих причин тяжкої діареї у немовлят та маленьких дітей [Estes M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology / Ed. by Fields et al. 3th Ed. – Philadelphia: Raven Publishers, 1996]. Встановлено, що захворювання, яке викликається ротавірусами, відповідально за більш, ніж один мільйон смертей 5 щорічно. Розлад, що викликається ротавірусами, звичайно уражує дітей віком від 6 до 24 місяців, і максимальне розповсюдження захворювання, як правило, трапляється під час холодніших місяців у зонах з помірним кліматом та цілорічно -в тропічних районах. Ротавіруси, як правило, передаються від людини до людини фекально-оральним шляхом з інкубаційним періодом, що складає від приблизно 1 до приблизно 3 днів. На відміну від інфекції у віковій групі від 6 до 24 місяців, немовлята, як правило, не виявляють симптомів захворювання або мають лише легку форму захворювання. У протилежність тяжкому захворюванню, що характерне для маленьких дітей, більшість дорослих захищена в результаті ротавірусної інфекції, перенесеної раніше, тому більша частина інфекцій у дорослих проходить легко або безсимптомно [Offit P.A. et al. // Соmр. Ther. – 1982. - 8(80). – P. 21-26]. Ротавіруси, як правило, є сферичними, та їх назва походить від їх характерної зовнішньої і внутрішньої частин або двохоболонкової структури капсиду. Як правило, двохоболонкова структура капсиду ротавірусу оточує внутрішню білкову оболонку або серцевину, яка містить геном. Геном ротавірусу складається з 11 сегментів дволанцюгової РНК, які кодують щонайменше 11 характерних вірусних білків. Два з цих білків, що позначені як VP4 та VP7, розміщено на зовнішній частині двохоболонкової структури капсиду. Внутрішній капсид ротавірусу є одним білком, який є ротавірусним білком, позначеним як VP6. Відносна вологість цих трьох конкретних ротавірусних білків для індукування імунної відповіді, що супроводжує ротавірусну інфекцію, досі не ясна. Проте, білок VP6 визначає групу та підгрупу антигену, а білки VP4 та VP7 є детермінантами серотипічної специфічності. Білок VP7 є глі'копротеїном з молекулярною масою 38000 (з молекулярною масою 34000 - для негліколізованого білка), який є продуктом трансляції геномного сегмента 7, 8 або 9 - в залежності від штаму. Цей білок стимулює утворення головного нейтралізуючого антитіла, супутнього ротавірусній інфекції. Білок VP4, що є негліколізованим білком з молекулярною масою приблизно 88000, є продуктом трансляції геномного сегмента 4. Цей білок також стимулює нейтралізуюче антитіло, супутнє ротавірусній інфекції. Оскільки білки VP4 та VP7 є вірусними білками, проти яких спрямовано нейтралізуючі антитіла, припускається, що вони є першими кандидатами для розробки ротавірусних вакцин, що забезпечать захист від ротавірусного розладу. Відомо, що природна ротавірусна інфекція в ранньому дитинстві індукує захисний імунітет. Таким чином, жива послаблена ротавірусна вакцина є вельми бажаною. Краще, щоб вона була пероральною вакциною, тому що пероральний шлях є природним шляхом інфекції вірусу. Розробка вакцини для попередження ротавірусних інфекцій почалася в 1970 роках після відкриття цього вірусу. Спочатку були вивчені послаблені штами, отримані з тварин та людей, що давало змішані або невтішні результати. Більш пізні роботи були сфокусовані на тваринно 77388 6 людських псевдовиріонах, і вони виявилися успішнішими. Штам ротавірусу, відомий як 89-12, було описано Уордом (Ward) [US, 5,474,773; Bernstein D.L. et al. // Vaccine. – 1998. - 16(4). – P.381-387]. Штам 89-12 було виділено в 1988 році зі зразка випорожнення, відібраного в 14-місячної дитини з природним ротавірусним розладом. Згідно з [US, 5,474,773] ротавірус людини HRV 89-12 потім було адаптовано до умов культивування за допомогою 2 пасажів у первинних клітинах нирки африканської зеленої мавпи (НАЗМ) та 4 пасажів у клітинах МА-104 у відповідності до того, як описано [Ward // J. Clin. Microbiol. – 1984. - 19. - P.748-753]. Потім його 3 рази очищали методом бляшок у клітинах МА-104 (до пасажу 9) і після 2 додаткових пасажів вирощували в цих клітинах. Один додатковий пасаж (пасаж 12) зроблено для депонування в Американській колекції типових культур (АТСС) під реєстраційним номером [АТТС VR 2272]. Цей депонований штам відомо як 89-12С2. Далі посилатимуться на [Bernstein et al. // Vaccine. – 1988] як на статтю з Vaccine (1998). Ця стаття описує безпечність та імуногенність кандидата для вакцини, що вводять перорально і який містить живий ротавірус людини. Цю вакцина отримано зі штаму 89-12, послабленого шляхом пасирування без очищення методом бляшок 26 у первинних клітинах НАЗМ та потім ще 7 разів у клітинній лінії НАЗМ, що прижилася (в сумі 33 пасажі). У подальшому посилання на Р26 (пасаж 26) належатимуть до вищезазначеного матеріалу, який послідовно пасирували 26 разів, а посилання на Р33 належатимуть до матеріалу, який пасирували послідовно 33 рази. Взагалі, ротавірус, отриманий шляхом пасирування 89-12 η разів, буде позначено як Рп. У наступних прикладах матеріал Р33 додатково пасирували ще 5 разів у клітинах Vero. На нього посилаються як на Р38. Ізоляти Р26 та Р33, що описані в статті Vaccine (1998), не депонували у колекції культур та не аналізували для встановлення їх генетичної характеристики. У наш час виявили, що популяція Р26, яка описана в літературі, містить суміш варіантів. Це було виявлено шляхом встановлення генетичної характеристики, як описано нижче (див. приклади). Таким чином, Р26 не є придатною надійною популяцією для подальших пасажів, зокрема для виробництва партій вакцин. Аналогічно Р33 містить суміш варіантів і не є надійним та придатним для виробництва партій вакцин. Виявлено, що матеріал Р26 є сумішшю щонайменше трьох варіантів гена VP4. Відповідно Р33 і Р38 є сумішшю двох варіантів. При оцінюванні титрів нейтралізуючих антитіл сироватки крові немовлят, вакцинованих Р33, проти цих варіантів представляється те, що ці варіанти антигенно відрізняються в термінах віруснейтралізуючих антигенних детермінантів від штамма 89-12С2, депонованого в АТСС. Це проілюстровано на Фіг.3. Крім того, виявлено, що коли немовлятам вводять матеріал Р33, два ідентифіковані варіанти 7 репліцюються та секритуються. З 100 вакцинованих немовлят лише у двох виявили симптоми гастроентериту, викликаного ротавірусною інфекцією, у той час як 20% групи, що отримали плацебо, були інфіковані. Ці відкриття означають, що зазначені ідентифіковані варіанти зв'язані із захистом від ротавірусного захворювання. Відповідно до даного винаходу запропоновано спосіб виділення ротавірусних варіантів та вдосконалена жива послаблена ротавірусна вакцина, що отримана з клонованого (гомогенного) штаму ротавірусу людини. Відповідно, згідно з першим аспектом даного винаходу, запропоновано послаблену популяцію ротавірусів (ізолят), яка відрізняється тим, що вона включає єдиний варіант або по суті єдиний варіант, причому вказаний варіант характеризується нуклеотидною послідовністю, що кодує щонайменше один з основних вірусних білків, позначених як VP4 та VP7. Краще, коли популяція ротавірусів є клонованим варіантом. Під популяцією, що включає єдиний варіант або по суті єдиний варіант, розуміють популяцію ротавірусів, яка не містить більш за 10%, краще менш за 5% та найкраще - менш за 1% варіанту або варіантів, що відрізняються. Популяції вірусу можуть бути очищені до гомогенного стану або по суті гомогенного стану шляхом пасирування в клітинах придатних типів шляхом здійснення серій, що складаються з однієї або більш за одну стадій клонування. Перевага даного" винаходу полягає в тому, що популяція, яка включає єдиний варіант, є придатнішою для виготовлення партії придатної вакцини. Конкретні варіанти, які характеризуються нуклеотидними послідовностями, що кодуються основним вірусним білком, також можуть бути зв'язані з підвищеною ефективністю запобігання ротавірусній інфекції. В одному кращому аспекті вказаний єдиний чи по суті єдиний варіант у ротавірусній популяції за даним винаходом є варіантом, в якому ген VP4 містить яуклеотидну послідовність, що містить щонайменше одно з наступного: основу аденіну (А) у положенні 788, основу аденіну (А) у положенні 802 та основу тиміну (Т) у положенні 501 від стартового кодону. Згідно ще з одним аспектом, зазначений єдиний або по суті єдиний варіант у популяції є варіантом, в якому ген VP7 містить нуклеотидну послідовність, що включає щонайменше одно з наступного: тимін (Т) в положенні 605, аденін(А) в положенні 897 або гуанін (G) в положенні 897 від стартового кодону. Краще, коли в положенні 897 знаходиться аденін (А). Відповідно до кращого аспекту єдиний варіант у популяції за даним винаходом має аденін (А) у положенні 788 та 802 і тимін (Т) у положенні 501 від стартового кодону в послідовності гена VP4. Відповідно ще до одного кращого аспекту єдиний варіант у популяції за даним винаходом має тимін (Т) у положенні 605 та аденін/гуанін (A/G) у положенні 897 від стартового кодону в послідовності гену VP7. Найкраще, коли в послідовності VP7 у положенні 897 знаходиться аденін (А). 77388 8 Відповідно до особливо кращого аспекту єдиний варіант у популяції за даним винаходом має аденін (А) у положенні 788 та 802 і тимін (Т) у положенні 501 від стартового кодону в послідовності гена VP4, а також тимін (Т) у положенні 605 та аденін/гуанін (A/G) у положенні 897 від стартового кодону в послідовності VP7. Найкраще, коли у послідовності VP7 у положенні 897 знаходиться аденін (А). Відповідно до ще одного аспекту єдиний варіант містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок VP4, причому ця нуклеотидна послідовність є такою, як зображено на Фіг.1, та/або нуклеотидну послідовність, що кодує білок VP7, причому ця нуклеотидна послідовність є такою, як зображено на Фіг.2. Згідно з даним винаходом, також запропоновано спосіб виробництва популяції ротавірусів, що містить по суті єдиний варіант, при якому: пасирують ротавірусний препарат в клітинах придатного типу; можливо виділяють однорідну культуру за допомогою стадій а) кінцевих розведень; або б) ізолювання окремих бляшок; та перевіряють на присутність по суті єдиного варіанту шляхом здійснення визначення послідовності відповідної ділянки послідовності гена VP4 та/або VP7. Визначення послідовності може бути здійснено зручним способом з використанням методики кількісної або напівкількісної гібридизації, такої як слот-блот-гібридизація або гібридизація нуклеїновими кислотами в бляшках. Краще, якщо виділений варіант є варіантом, що реплицує та секретує, коли вихідний ротавірусний препарат вводять людині, зокрема дитині. Вірусна популяція, клонована способом за даним винаходом, може бути ампліфікована шляхом додаткового пасирування в придатній лінії клітин. Типи клітин, придатні для пасирування ротавірусної популяції у вищезазначеному способі, включає клітини нирки африканської зеленої мавпи (НАЗМ), які можуть бути клітинними лініями, що прижилися, наприклад, Vero (ATCC CCL-81), DBSFRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ЕСАСС 85011422) та CV-1 (ATCC CCL-70). Також придатні лінії клітин МА-104 (мавпи резус) та MRC-5 (людини-АТСС CCL-171). Клітини Vero кращі особливо для цілей ампліфікації. Пасирування в клітинах Vero дає високий вихід вірусу. Методики перевірки того, чи дійсно у вірусній популяції, що отримана у результаті здійснення вищезазначеного способу, присутньо єдиний варіант, і методики визначення природи цього єдиного варіанту містить стандартні процедури секвенірування та гібридизації, відомі в даній галузі техніки та описані нижче. У відповідності до кращого аспекту спосіб за даним винаходом здійснюють з використанням придатного ротавірусу, зокрема ротавірусу, що має характеристики штаму 89-12, або його пасированого похідного. Особливо кращою популяцією єдиного варіанту є Р43, що отримана з Р33 (виділений ротавірус 9 людини 33 рази пасирується у культурі в клітинах придатного типу) за допомогою стадій клонування шляхом кінцевих розведень з наступним пасируванням клонованого матеріалу в клітинах Vero для ампліфікації. Популяцію Р43 було депоновано в Європейській колекції клітин тварин, що культивуються (ЕСАСС). Лабораторія досліджень та виробництва вакцин, Лабораторна служба громадської охорони здоров'я, Науково-виробничий центр мікробіології, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, United Kingdon, 13 серпня 1999 року зареєстрували її під реєстраційним номером 99081301 за умов Будапештського договору. Хоча ця вказана загальнодоступність є самим простим способом отримання ротавірусів Р43 людини, у цілому, цілком можливо або вірогідно, що відповідні та по суті функціонально ідентичні ротавіруси можуть бути одержані цими та іншими способами з урахуванням винаходу. Припускаємо, що такі по суті функціонально ідентичні ротавіруси є біологічним еквівалентом ротавірусу людини Р43 за даним винаходом та, як наслідок, входять в обсяг даного винаходу. Отже, зрозуміло, що даний винахід охоплює ротавірусні популяції, що мають характеристики варіанту Р43 у відповідності з тим, як описано в матеріалах даної заявки. Також треба розуміти, що даний винахід охоплює матеріали, отримані з депонованого Р43 ЕСАСС 99081301, шляхом піддавання їх додатковій обробці, наприклад, розмноженню їх шляхом додаткового пасирування, клонування або інших процедур з використанням живого вірусу або шляхом модифікування Р43 будь-яким методом, в тому нислі методами генної інженерії чи методами псевдовиріонів. Такі стадії та методи добре відомі в даній галузі техніки. Матеріали, що отримані з депонованого Р43, які охоплюються даним винаходом, включають білок та генетичний матеріал. Особливий інтерес становляють ротавірусні псевдовиріони, які містять щонайменше один антиген або щонайменше один сегмент Р43, наприклад, псевдовиріони, що містять вірулентний штам ротавірусу, в якому один чи частина одного з 11 сегментів генома заміщена сегментом генома Р43 або його частиною. Конкретно, корисні властивості може мати ротавірусний псевдовиріон, в якому сегмент або частина сегменту, що кодує NSP4, є сегментом чи частиною сегменту Р43. Ротавірусні псевдовиріони та методики їх одержання добре відомі [Foster R.H., Wagstaff A.J. Tetravalent Rotavirus Vaccine. // A review, ADIS drug evaluation, Biodrugs, Gev. – 1998. - 9(2). P. 155-178]. Матеріалами, що становлять особливий інтерес, є потомство Р43 та імунологічно активні похідні Р43. Під імунологічно активними похідними розуміють матеріали, які отримані з вірусу Р43 або з ним, зокрема антитіла цього вірусу, що здатні викликати імунну відповідь проти ротавірусів при введенні в тварину-хазяїна. При адаптації ротавірусу до придатної клітинної лінії, наприклад, до клітин Vero, може бути необхідно обробити вірус таким чином, щоб звільнитися від будь-якого можливого забруднення, як, 77388 10 наприклад, від будь-яких випадкових агентів, які можуть бути присутні та можуть іншим чином викликати забруднення. При випадкових вірусах, чутливих до ефіру, це можна зробити шляхом обробки ефіром, як описано нижче. Даний винахід також належить до включення такої обробки ефіром як можливої стадії в загальну процедуру отримання послабленого живого ротавірусу або приготованої з ним вакцини. Також до обсягу даного винаходу належать суміші Р43 з іншими ротавірусними варіантами, наприклад, з іншими клонованими варіантами, або з іншими вірусами, зокрема, з іншими послабленими вірусами. Такі суміші корисні у вакцинах за винаходом, що описано нижче. Відповідно до даного винаходу запропонована також жива послаблена ротавірусна вакцина, яка містить популяцію по суті єдиного варіанту, що змішана з придатним ад'ювантом або фармацевтичним носієм. Краще, коли ротавірусна вакцина за винаходом є моновалентною ротавірусною вакциною, що містить єдиний штам ротавірусу. Даний винахід є корисним, тому що пропонує живу ротавірусну вакцину, в якій живий послаблений ротавірус є ротавірусом людини та не викликає інвагінації. Придатні фармацевтичні носії для використання у вакцині за даним винаходом включають відомі у даній галузі носії, про які відомо, що вони придатні для перорального введення, особливо малятам. Такі носії включають вуглеводи, поліспирти, амінокислоти, гідроксид алюмінію, гідроксид магнію, гідроксиапатит, тальк, оксид титану, гідроксид заліза, стеарат магнію. карбоксиметилцелюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу, мікрокристалічну целюлозу, желатин, рослинний пептон, ксантан, карагенан, гуміарабік, -циклодекстран, але не обмежуються ними. Згідно з винаходом також запропоновано спосіб приготування ротавірусної вакцини, наприклад, за допомогою сублімаційного сушіння вірусу в присутності придатних стабілізаторів або шляхом змішування вірусу за даним винаходом з придатним ад'ювантом або фармацевтичним носієм. Також може бути корисно приготувати препарати вірусу за даним винаходом на основі ліпідів, таких як віросоми або ліпосоми, в емульсіях типу "масло у воді" або частками носія. Як альтернатива або на додаток до препарату можуть бути внесені імуностимулятори, такі як відомі в даній галузі імуностимулятори для пероральних вакцин. Такі імуностимулятори містять бактеріальні токсини, зокрема холерний токсин (XT) у формі голотоксину (ціла молекула) або лише як ланцюг В (ХТВ) та термолабільний ентеротоксин Е.соіі (ЛТ). Мутантні ЛТ (мЛТ), що перетворюються в свою активну форму з меншою вірогідністю за нативний ЛТ, також описані в [WO, 96/006627, 1996; WO, 93/13202, 1993; US, 5,182,109]. Додаткові імуностимулятори, які може бути корисно включити, є похідними сапоніну, такі як QS21 та монофосфорилліпід А, зокрема 3-де-Оацильований монофосфорилліпід A (3D-MPL). Очищені сапоніни як пероральні ад'юванти описані 11 в [WO, 98/56415, 1998]. Сапоніни та монофосфорилліпід А можна використовувати окремо або в комбінації [WO, 94/00153, 1994], та можна включати до складу препарату в ад'ювантних системах разом з іншими агентами. 3D-MPL є добре відомим ад'ювантом, що виробляється Ribi immunochem, Montana, та його виробництво описано в [GB, 2122204]. Загальне обговорення носіїв та ад'ювантів для пероральної імунізації можна знайти в [Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach / Ed. by Powell and Newman. - New York: , Plenum Press, 1995]. Відповідно до даного винаходу запропоновано також спосіб вакцинації людей, особливо немовлят, при якому суб'єкту, що потребує цього, вводять ефективну кількість вакцинної композиції за винаходом. Краще, коли вводять живу послаблену вакцину пероральним шляхом. Відповідно до кращого аспекту композицію вакцини за даним винаходом готують з антацидним засобом, щоб мінімізувати інактивацію вакцини кислотою у шлунку. Придатні антацидні компоненти включають неорганічні антацидні засоби, наприклад, гідроксид алюмінію Аl(ОН)3 та гідроксид магнію Mg(OH)2. Антацидні засоби, що є у продажу і що придатні для застосування за даним винаходом, включають Mylanta , який містить гідроксид алюмінію та гідроксид магнію. Вони не розчинні у воді та постачаються в суспензії. Гідроксид алюмінію є особливо кращим компонентом композиції вакцини за даним винаходом, оскільки він може забезпечити не лише антацидну дію, а також і ад'ювантну дію. Також для застосування як антацидні засоби за даним винаходом придатні органічні антацидні засоби, такі як солі органічних кислот за карбоксильною групою. Кращий антацидний засіб для вакцинної композиції за даним винаходом містить сіль органічної кислоти за карбоксильною групою, краще сіль лимонної кислоти, такої як цитрат натрію або цитрат калію. Особливо кращим засобом, що може бути використано у вакцинній композиції за даним винаходом, є нерозчинна неорганічна сіль карбонат кальцію СаСО3. Карбонат кальцію здатен утворювати асоціати з ротавірусом, і активність ротавірусу зберігається під час асоціації з карбонатом кальцію. Для запобігання осадженню карбонат кальцію під час заповнення в препараті переважно присутні агенти, що регулюють в'язкість. Можливі агенти, що регулюють в'язкість, містять псевдопластичні ексципієнти. Псевдопластичний розчин визначають як розчин, що має більш високу в'язкість при стоянні порівняно з його в'язкістю при перемішуванні. Ексципієнти цього типу є природними полімерами, такими як гуміарабік, трагакантова камедь, агар-агар, альгінати, пектини або напівсинтетичні полімери, наприклад, карбокси-метилцелюлоза (Tyloses С , метилцелюлоза (Methocels A , Viscotrans МС , Tylose ΜΗ та MB ), гідроксипропілцелюлоза (Klucels ) та гідроксипропілметилцелюлоза (Methocels Ε , Viscotrans MPHC ). Як правило, ці псевдопластичні ексципіє 77388 12 нти використовують разом з токсотропнимй агентами. Альтернативними агентами, які регулюють в'язкість і які можна застосовувати, є псевдопластичні ексципієнти, що мають низьку текучість. Ці полімери, що взяті в достатній концентрації, приводять до структурного перегрупування в рідині, яке спричиняє в результаті розчин з високою в'язкістю, що має низьку текучість при стоянні. До системи потрібно підвести деяку кількість енергії для того, щоб дати їй можливість текти та забезпечити переміщення. Потребується енергія зовні (перемішування) для тимчасового руйнування структурного перегрупування в рідині, щоб отримати рідкий розчин. Прикладами таких полімерів є Carbopols та ксантанова камедь. Тиксотропні ексципієнти набувають структуру гелю при стоянні, тоді як при перемішуванні вони утворюють рідкий розчин. Прикладами тиксотропних ексципієнтів є: Veegum (магнієво-алюмінієвий силікат) та Avicel RC (приблизно 89% мікрокристалічної целюлози та 11% Naкарбоксиметилцелюлози). Краще, коли вакцинна композиція за даним винаходом включає агент, який регулює в'язкість та який вибрано з ксантанової камеді або крохмалю. Таким чином, краще, коли вакцинну композицію за даним винаходом готують у вигляді препарату з комбінацією карбонату кальцію та ксантанової камеді. Інші компоненти композиції, що використовуються у даному винаході, відповідно включають сахари, наприклад, цукрозу та/або лактозу. Вакцинна композиція за даним винаходом може містити додаткові компоненти, включаючи, наприклад, смакові додатки (особливо для пероральної вакцини) та бактеріостатичні агенти. Передбачено різне відтворення вакцинної композиції за даним винаходом. В одному кращому відтворенні вакцину вводять у вигляді рідкого препарату. Краще, коли рідкий препарат перед введенням отримують розведенням щонайменше двох компонентів: 1) вірусного компоненту; 2) рідкого компоненту. У цьому відтворенні вірусний компонент та рідкий компонент, як правило, містяться в окремих контейнерах, які можуть зручним чином бути окремими відсіками ємності або окремими ємностями, що можуть бути з'єднані таким чином, що кінцеву вакцинну композицію отримують розведенням без відкриття доступу повітря. Перед розбавленням вірус може знаходитися в сухій формі або рідкій формі. Краще, коли вірусний компонент є ліофілізованим. Ліофілізований вірус є стабільнішим за вірус у рідкому розчині. Ліофілізований вірус може бути відповідним чином розведено з використанням рідкої антацидної композиції для отримання рідкого вакцинного препарату. Або ж ліофілізований вірус може бути розведено у воді або водному розчині, причому в цьому випадку краще, коли ліофілізована вірусна композиція містить антацидний компонент. Краще, коли вакцинний препарат включає вірусний компонент, приготований у вигляді препа 13 рату з карбонатом кальцію та ксантановою камеддю в одному відсіку ємності, який розводять водою або водним розчином, що знаходиться у другому відсіку ємності. У ще одному кращому втіленні вакцинна композиція є твердим препаратом, краще ліофілізованим брикетом, який придатний для розчинення безпосередньо при вміщенні його у ротову порожнину. Ліофілізовані препарати можуть бути зручним чином запропоновані у формі таблеток у фармацевтичній блістерній упаковці. Згідно із ще одним аспектом даного винаходу запропоновано ротавірусну вакцину у формі швидкорозчинної таблетки для перорального введення. У відповідності з ще одним аспектом даного винаходу запропоновано композицію, що містить живий послаблений ротавірусний штам, зокрема ротавірус людини, яка є ліофілізованою твердою речовиною, що здатна розчинятися безпосередньо при вміщенні в ротову порожнину. Краще, коли швидкорозчинна таблетка за даним винаходом розчиняється у ротовій порожнині суб'єкта досить швидко для того, щоб попереджалося проковтування таблетки, яка не розчинилася. Цей підхід є особливо кращим для педіатричних ротавірусних вакцин. Краще,, коли вірус є живим послабленим ротавірусом людини, який приготовано у вигляді препарату з неорганічним антацидним засобом, таким як карбонат кальцію, і агентом, що регулює в'язкість, таким як ксантанова камедь. У відповідності із ще одним аспектом даного винаходу запропоновано ліофілізований препарат, в якому вірусний компонент є будь-яким штамом ротавірусу, що готують у складі препарату з карбонатом кальцію та ксантановою камеддю. Вакцини за даним винаходом можуть бути приготовані та введені відомими способами з використанням придатної кількості живого вірусу для забезпечення ефективного захисту від ротавірусної інфекції без значних несприятливих побічних ефектів типових вакцин. Придатна кількість живого вірусу, як правило, складає від 104 до 107 бляшкоутворюючих одиниць (БУО) на дозу. Типова доза вакцини може включати 105-106 БУО на дозу та може бути введена у вигляді декількох доз на протязі періоду часу, наприклад, у вигляді двох доз, що вводяться з двомісячним інтервалом. Користь, проте, може бути отримано при використанні схеми прийому, що включає більше за 2 дози, наприклад, 3 або 4 дози, особливо у країнах, що розвиваються. Тривалість інтервалу між дозами може лишатися більш або менш двох місяців. Оптимальна кількість живого вірусу для схеми прийому у вигляді одноразової дози або множинних доз та оптимальний час для цих доз можуть бути встановлені шляхом стандартних досліджень, що включають нагляд за титром антитіл та іншими реакціями у суб'єктів. 77388 14 Вакцина за даним винаходом може також включати інші придатні живі віруси для захисту від захворювань, наприклад, полівірус. Або ж можна давати інші придатні живі вірусні вакцини для перорального введення у вигляді окремої дози, проте, у тому ж самому випадку, що і ротавірусну вакцинну композицію за даним винаходом. Титр нейтралізації ротавірусних клонів, що мають походження від Р33, у зразках сироватки крові, отриманих від немовлят, вакцинованих Р33 (експлікація Фіг.3). Зразки сироватки крові, що отримані від дванадцяти 4-6 місячних немовлят, вакцинованих матеріалом Р33 у відповідності з тим, як описано у статті Vaccine (1998), тестували щодо нейтралізації Р33, Р38, Р43та 89-12С2. Діапазон титрів нейтралізації для всіх протестованих зразків сироватки крові є одним і тим же для Р33, Р38 та Р43. Статистичний аналіз не продемонстрував значущої різниці в загальних титрах нейтралізації щодо всіх трьох вірусів. Це свідчить про те, що конформаційні та неконформаційні віруснейтралізуючі антигенні детермінанти Р33, Р38 та Р43 у рівному ступені добре розпізнаються антитілами проти P33 у зразках сироватки немовлят, вакцинованих Р33. Ці спостереження безпосередньо свідчить про те, що віруснейтралізуючі антигенні детермінанти, які виявлені в цьому аналізі in vito, не розрізняються у Р33, Р38 та Р43. Діапазон титрів нейтралізації Р89-12С2 проте значно відрізняється від Р33, Р38 та Р43. Це спостереження свідчить про те, що конформаційні та неконформаційні віруснейтралізуючі антигенні детермінанти Р33, Р38 та Р43 не розпізнаються у рівному ступені добре антитілами проти Р33 у зразках сироватки крові немовлят, вакцинованих Р33. Ці спостереження безпосередньо свідчить про те, що віруснейтралізуючі антигенні детермінанти, які виявлені в цьому аналізі in vito, розрізнялися у Р33, Р38 та Р43. Наступні приклади ілюструють винахід. Приклади Приклад 1. Демонстрація того, що штам 89-12 у пасажі 26 (Р26) є сумішшю варіантів Секвенірування генів VP4 та VP7 з партій різних пасажів Було здійснено секвенірування генів VP4 та VP7 з пасажів Р26 (первинні клітини НАЗМ), пасажу Р33 (що прижилася (як протилежність) первинній) лінія клітин (НАЗМ), пасажу Р41 та Р43. Екстракт тотальної РНК було піддано зворотній транскрипції та ампліфіковано шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в одній пробірці/в одній стадії. Праймери Rota 5bis та Rota 29bis забезпечили ампліфікацію повного гена VP4, та праймери Rota 1 та Rota 2bis забезпечили ампліфікацію повного гена VP7. Матеріал після ПЛР секвенірували з використанням різних праймерів, наведених у Таблиці 1. 15 77388 16 Таблиця 1 Олегонуклеотиди, що використовуються для полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою (ПЛР-ЗТ) та секвенірування Білок VP7 VP4 Позначення Rota 1 Rota 1bis Rota 2bis Rota 7 Rota 12 Rota 46 Rota 18 Rota 5 Rota 6 Rota 5bis Rota 6bis Rota 25 Rota 26 Rota 27bis Rota 28 Rota 31 Rota 32 Rota 45 Rota 53 Rota 54 Rota 55 Rota 40 Rota 39 Rota 33 Rota 34 Rota 29bis Послідовність GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC CGT CTG G GGT TAG CTC CTT TTA ATG TAT GGT A GGT CAC ATC GAA CAA TTC TAA TCT AAG CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G TGT TGA TTT TTC TGT CGA TCC AC GGT TGC TGA GAA TGA GAA ATT AGC TAT AGT GG CCA CTA TAG CTA ATT TCT CAT TCT CAG CAA CC TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC TGG CTT CAC TCA TTT ATA GAC A ATT TCA GAC CAT TTA TAA CCT AG GGA GTA GTA TAT GAA AGT ACA AAT AAT AG CTA TTA TTT GTA CTT TCA TAT ACT ACT CC TCG ATA CAG TAT AAG AGA GCA CAA G TTC ATT AAC TTG TGC TCT CTT ATA CTG GTA TAT GTA GAC TAT TGG GAT G CAT CCC AAT AGT CTA CAT ATA C TGT AAC TCC GGC AAA ATG CAA CG CGT TGC ATT TTG CCG GAG TTA CA GTA AGA CAA GAT TTA GAG CGC CA TGG CGC TCT AAA TCT TGT CTT AC CTT GAT GCT GAT GAA GCA GCA TCT G CAG ATG CTG CTT CAT CAG CAT CAA G CGA TCA TAT CGA ATA TTA AAG GAT G CAT CCT TTA ATA TTC GAT ATG ATC G AGC GTT CAC ACA ATT TAC ATT GTA G Послідовність пасажу Р26 відрізнялася від послідовності пасажу Р33 на 3 основи (в положенні 501, 788 та 802 п.н. від стартового кодону) у VP4 та на три основи у VP7 (108, 605 та 897 п.н. від стартового кодону). Розгорнення послідовності пасажу Р26 для VP4 і VP7 демонструють у мутованих положеннях Положення (-49)-(-22) (-16)-10 1014-988 266-287 372-394 651-682 682-651 2-23 878-859 2-23 878-856 268-296 296-268 721-745 753-727 1048-1070 1070-1048 1205-1227 1227-1205 1465-1487 1487-1465 1703-1727 1727-1703 2008-2032 2032-2008 2335-2311 наявність послідовності пасажу як фону. Таким чином, можна бачити, що пасаж Р26 є сумішшю щонайменше двох варіантів. Розгорнення послідовностей пасажу Р33 виглядають однорідними для VP4 та різнорідними для VP7 (Таблиця 2). Таблиця 2 Олегонуклеотиди, що використовуються у гібридизації Білок VP7 VP4 Позначення Rota 41 Rota 42 Rota 15 Rota 16 Rota 35 Rota 36 Послідовність AGT ATT TTA TAC TAT AGT AGA TTA TAT TAA AGT ATT TTA TAC TAT GGT AGA TTA TAT TAA TC ATC CCC ATT ATA CTG CAT TCC TTT C ATC CCT ATT ATA CTG CAT TTC TTT C ATC CCC ATT ATA CTG CAT TTC TTT C ATC CCT ATT ATA CTG CAT TCC TTT C Пасаж Р38 (отриманий з пасажу 33) пасировано 5 разів у клітинах Vero, та він демонструє той же самий набір послідовностей VP4 та VP7, що і пасаж P33 (лінія клітин НАЗМ). Таким чином, у популяції Р38 не було значної зміни у порівнянні з Р33. Основи, що виділені в табл. 2 жирним шрифтом, є місцями специфічної зміни послідовностей VP4 і VP7. NB: У другому клоні з 3-х клонів, які були розвинуті до рівня партії, що продукує, нуклеотид VP7 Положення 882-913 882-913 807-783 807-783 807-783 807-783 у положенні 897 є скоріше G, ніж А, як у вибраному клоні Р43. У результаті це дає метіонін замість ізолейцину в амінокислотній послідовності. Варіанти, що відповідні як до вибраного клону Р43, так і до клону, в якого в VP у положенні 897 п.н. від стартового кодону знаходиться G, екстретирувалися у випорожненні немовлят, які були вакциновані матеріалом Р33. У Таблиці 3.1, де у визначеному положенні вказані дві альтернативні основи, перша з цих двох є основою, що виявляється у значній популя 17 77388 ції, і друга є основою, що виявляється у незначній популяції. Значні та незначні популяції варіантів 18 розцінюються за силою сигналу при секвеніруванні. Таблиця 3.1 Заміна послідовностей генів VP4 і VP7 Білок VP4 Пасаж Р26 (НАЗМ) P33 (НАЗМ) Р38 (VERO) Р43 (VERO) 501 п.н. 167а/к (амінокислота) A T T T VP7 788 п.н. 263 а/к 802 п.н. 268 a/к 108 n.н. 36 а/к 605 п.н. 202 а/к 897 п.н. 299 а/к G/A A A A G/A A A A A G/A A/G A C/T T/C T T A A/G G/A A Таблиця 3.2 демонструє амінокислотні заміни, які є результатом відмінностей в нуклеотидах між варіантами. Таблиця 3.2 Амінокислотні заміни, які є результатом відмінностей в нуклеотидах між варіантами Білок Пасаж Р26 (НАЗМ) P33 (НАЗМ) Р38 (VERO) Р43 (VERO) 501 п.н. 167а/к Leu Phe Phe Phe VP4 768 п.н. 263 а/к Gly/Glu Glu Glu Glu 802 п.н. 268 a/к Gly/Arg Arg Arg Arg Слот-блот-гібридизація Зміни в популяції від пасажу Р26 до пасажу Р33 у клітинах НАЗМ у подальшому були підтвердженні слот-блот-гібридизацією. Фрагменти генів VP4 і VP7, що вироблені полімеразною ланцюговою реакцією зі зворотною транскриптазою (ПЛРЗТ), гібридизували з олігонуклеотидними зонами, специфічними для кожного варіанту (табл. 3.1, 108 п.н. 36 а/к Arg Arg/Arg Arg/Arg Arg VP7 605 п.н. 202 а/к Thr/Met Met/Thr Met Met 897 п.н. 299 а/к IIe IIe/Met Met/IIe IIe 3.2). На відміну від Р26, який гібридизували з Rota 16, Rota 35 і Rota 36, але не з Rota 15, ПЛЦфрагмент VP4 матеріалу Р33 в положенні 788 і 802 гібридизували тільки з Rota 16, але не з Rota 15, чи Rota 35, чи Rota 36. Ці результати встановили наявність щонайменше 3 варіантів в Р26 (Таблиця 4). Таблиця 4 Слот-блот-гібридизація фрагментів генів VP4 і VP7 Білок Зонди Пасажі Р26 P33 Р38 Р43 G-G Rota 15 VP4 (положення 788-902) A-A A-G Rota 16 Rota 3 + + + + Для ПЛЦ-фрагменту VP7 матеріалу Р33 у положенні 897 проходила гібридизація з Rota 41 і Rota 42. Ці результати встановили наявність щонайменше двох варіантів у матеріалі Р33. Приклад 2. Виділення та характеристика клону Р43 Для виділення компонентів Р33 у вигляді однорідної вірусної популяції здійснили три кінцеві + G-A Rota 36 + VP (положення 897) A G Rota 41 Rota 42 но ++ + + но + ++ розведення Р33/НАЗМ у клітинах Vero та отриманий у результаті вірус використовували для інфікування клітин Vero. Лунки з позитивним результатом було відібрано з використанням двох критеріїв: ріст, що демонструється найбільшим числом осередків, які виявлені у лунках, та лунки, що найбільш ізольовані, з позитивним результатом на планшетах у 19 відповідності з тим, як це робиться класично. Після 3 пасажів кінцевими розведеннями у 96-луночних титрацийних мікропланшетах 10 лунок з позитивним результатом були послідовно ампліфіковані в клітинах щодо їх виходу. Засновуючись на виході, три клони розвили до рівня пасирування продуктивної партії. Було показано, що імунологічне розпізнання поліклональними антитілами близько як між трьома клонами, так і між цими клонами та P33. Однорідність клонів оцінювали слот-блот-гібридизацією. Кінцеве виділення єдиного клону було засновано на виході та послідовності. Виділений клон ампліфікували шляхом послідовних пасажів у клітинах Vero для отримання контрольного посівного матеріалу, робочого посівного матеріалу та кінцевих продуктивних партій, що виробляють. Виділений клон генетично характеризували на різних рівнях пасирування шляхом секвенірування VP4 і VP7 (ідентичність) та шляхом специфічної слот-блот-гібридизації VP4 і VP7 (гомогенність) матеріалів, ампліфікованих ГОЩ. Послідовності генів VP4 і VP7 матеріалів Р43 подано відповідно на Фіг.1, 2, і вони ідентичні Р41. Однорідність виділеного клону оцінювали шляхом вибірної гібридизації з використанням олігонуклеотидних зондів, здатних розрізняти нуклеотидні заміни на ділянках VP4 або VP7 для кожного варіанту, ідентифікованого при секвеніруванні Р26/первинні НАЗМ (табл. 4). Фрагмент VP4 гібридизувався з Rota 16, але не з Rota 15, Rota 35 чи Rota 36. Фрагмент VP7 гібридизувався з Rota 41, але не з Rota 42. Ці результати підтвердили, що Р43 є однорідною популяцією. Приклад 3. Видалення потенційного випадкового вірусу Ефір додавали до P33 (ріст в НАЗМ) до кінцевої концентрації 20% протягом 1год. Потім ефір видували N2 протягом 35хв. Не спостерігали ніякого впливу на титр посівного матеріалу P33. Приклад 4. Приготування препарату живої послабленої вакцини Продуктивні партії, як описано вище, готували у вигляді препарату для перорального введення немовлятам наступним чином. 1 Ліофілізований вірус Для приготування доз вірусу використовуються стандартні способи. Заморожений очищений сипучий матеріал вірусу розморожують та розводять придатною композицією, в даному випадку середою Ігла, модифікованою за Дульбекко, до бажаної стандартної концентрації вірусу, в даному випадку складовою 106,2 БУО/мл. Розведений вірус потім додатково розводять до позначеного титру вірусу, що в даному випадку складає 105,6 БУО/мл, ліофілізаційним стабілізатором, %: цукроза 4; декстран 8; сорбіт 6; амінокислота 4. Аліквоти по 0,5мл стабілізованої вірусної композиції асептично переносять у флакони на 3мл. Кожний флакон потім частково закривають гумо 77388 20 вою пробкою, зразок сушать виморожуванням у вакуумі, потім флакон закривають повністю та обтискають алюмінієву кришку, щоб підтримувати пробку на місці. Для використання вірус розводять з наступними антацидними розріджувачами: а) Цитратний розріджувач Цитрат натрію розчиняють у воді, стерилізують шляхом фільтрації та асептично переносять в ємності для розведення в кількості по 1,5мл при концентрації 544мг [Na3Цитрат]x2Н2О на дозу 1,5мл. Ємностями для розведення можуть бути, наприклад, флакони на 4мл, або шприці на 2 мл, або м'які пластикові капсули, що стискаються, для перорального введення. Як варіант підтримування стерильних компонентів у стерильних умовах кінцеву ємність можна автоклавувати. б) Розріджувач Аl(OH)3 Стерильну суспензію гідроксиду алюмінію (Mylanta ) асептично розводять стерильною водою, асептично переносять в ємності для розведення (наприклад, шприці на 2мл або м'які пластикові капсули, що стискаються) в кількості по 2мл, що містять по 48мл Аl(ОН)3. Альтернативою використання стерильних компонентів у стерильних умовах є -опромінювання суспензії гідроксид натрію (краще розведеному стані). Для запобігання осадженню суспензії включають стандартні інгредієнти. Такі стандартні інгредієнти включають, наприклад, стеарат магнію, карбоксиметилцелюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу, мікрокристалічну целюлозу та сіліконові полімери. Також можна включати бактеріостатичні агенти, наприклад, бутилпарабен, пропілпарабен або інші стандартні бактеріостатичні агенти, що використовуються в продуктах харчування, а також смакові додатки. 2.Ліофілізований вірус з Аl(OH)3 рідкому препараті Для приготування доз вірусу використовуються стандартні способи. Заморожений очищений сипучий матеріал вірусу розморожують та розводять придатною композицією, в даному випадку середою Ігла, модифікованою за Дульбекко, до бажаної стандартної концентрації вірусу, що в даному випадку складає 106,2БУО/мл. Суспензію гідроксиду алюмінію додають для досягнення кінцевої кількості 48мг/дозу та вірусну композицію розводять до позначеного титру вірусу, що в даному випадку складає 105,6БУО/мл, ліофілізаційним стабілізатором, %: цукроза 4; декстран 8; сорбіт 6; амінокислота 4. Аліквоти по 0,5мл стабілізованої вірусної композиції асептично переносять у флакони на 3мл. Потім здійснюють ліофілізацію та закупорку флаконів, як описано у частині 1. 3. Ліофілізований вірус з Аl(OH)3 для подання ν блістерній формі Для приготування доз вірусу використовуються стандартні способи. Заморожений очищений сипкий матеріал вірусу розморожують та розводять придатною композицією, в даному випадку 21 77388 середою Ігла, модифікованою за Дульбекко, до бажаної стандартної концентрації вірусу, що в даному випадку складає 106,2БУО/мл. Суспензію гідроксиду алюмінію додають для досягнення кінцевої кількості 48мг/дозу та вірусну композицію розводять ліофілізаційним стабілізатором, який може бути цукрозою, декстраном або 4% амінокислотою, або желатином, або рослинним пептоном, або ксантаном до позначеного титру вірусу, що в даному випадку складає 105,6БУО/мл. Здійснюють операцію асептичного заповнення, щоб перенести дози по 0,5мл або краще - менші дози в поглиблення блістерних упаковок. Композицію піддають ліофідізації та поглиблення блістерних упаковок термічно запаюють. 22 Для запобігання осадженню суспензії гідроксид алюмінію можуть бути включені стандартні інгредієнти. Такі стандартні інгредієнти включають, наприклад, стеарат магнію, карбоксиметилцелюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу, мікрокристалічну целюлозу та силіконові полімери. Можна також включати смакові додатки. Приклад 5. Вірусне титрування ротавірусів для різних препаратів 5.1. Порівняння препаратів на основі лактози та цукрози Ротавірус Р43 було приготовано у вигляді препарату, або із цукрозою, або з лактозою у відповідності з тим, що показано у Таблиці 5.1. Таблиця 5.1 Результати порівняльного титрування рота вірусів препаратами на основі лактози та цукрози Партія № 98G06/01 98G06/03 Композиція препарату інгредієнт вміст, % Лактоза 2 Декстран 4 Сорбіт 3 Амінокислоти 2 Цукроза 2 Декстран 4 Сорбіт 3 Амінокислоти 2 Титр вірусу, БУО/мл до ліофілізації після ліофілізації та ще 1 тиждень при 37°С 105,22 104,67 105,28 Вірусне титрування до ліофілізації є титром вірусу у рідині, повністю приготованій у вигляді препарату (що міститьцукрозу, декстран, сорбіт, амінокислоти) без здійснення стадії ліофілізації. Добрі результати є такими, коли досягається зменшення на стадії ліофілізації