Рослина пшениці з підвищеною резистентністю до імідазолінонових гербіцидів

1. Рослина пшениці, яка містить Imi3 нуклеїнову кислоту, де рослина пшениці має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду порівняно з різновидами рослини дикого типу, причому Imi3 нуклеїнова кислота включає полінуклеотид, вибраний з групи, до якої входять: a) полінуклеотид, який включає SEQ ID NO:1, та b) полінуклеотид, що кодує поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, кодовану SEQ ID NO:1. 2. Рослина пшениці за п. 1, у якій Imi3 нуклеїнова кислота являє собою Triticum monococcum Imi3 нуклеїнову кислоту. 3. Рослина пшениці за п. 1, у якій Imi3 нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1. 4. Рослина пшениці за будь-яким з пп. 1-3, де рослина є трансгенною. 5. Рослина пшениці за будь-яким з пп. 1-3, де рослина не є трансгенною. 6. Рослина пшениці за будь-яким з пп. 1-3, де рослина отримана або походить від рослини з номером патентного депонування ATCC PTA-4113. 7. Рослина пшениці за будь-яким з пп. 1-6, де імідазоліноновий гербіцид вибраний із групи, яка складається з 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти, 2-(4ізопропіл)-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3хінолінкарбонової кислоти, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)5-(метоксиметил)-нікотинової кислоти, 2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5метилнікотинової кислоти, та суміші метил 6-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-мтолуату і метил 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-п-толуату. 8. Рослина пшениці за п. 1, де імідазоліноновий гербіцид є 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-нікотиновою кислотою. 9. Рослина пшениці за п. 1, де імідазоліноновий гербіцид є 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2 UA (21) 2004020924 (22) 10.07.2002 (24) 25.12.2009 (86) PCT/CA02/01050, 10.07.2002 (31) 60/311,180 (32) 09.08.2001 (33) US (46) 25.12.2009, Бюл.№ 24, 2009 р. (72) ХАКЛ П'ЄР, CA (73) ЮНІВЕРСІТІ ОФ САСКАЧЕВАН, CA (56) NEWHOUSE K E ET AL: "TOLERANCE TO IMIDAZOLINONE HERBICIDES IN WHEAT" PLANT PHYSIOLOGY, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, ROCKVILLE, MD, US, vol. 100, no. 2, 16 March 1992 (1992-03-16), pages 882-886 SWANSON E B ET AL: "MICROSPORE MUTAGENESIS AND SELECTION CANOLA PLANTS WITH FIELD TOLERANCE TO THE IMIDAZOLINONES" THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, vol. 78, no. 4, 1989, pages 525-530 CHONG CHOM-KYU ET AL: "Amino acid residues conferring herbicide tolerance in tobacco acetolactate synthase." BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 279, no. 2, 20 December 2000 (2000-12-20), pages 462-467 WRIGHT T R ET AL: "Cell selection and inheritance of imidazolinone resistance in sugarbeet (Beta vulgaris)." THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, vol. 96, no. 5, April 1998 (1998-04), pages 612-620 SHANER DALE L ET AL: "Imidazolinone-resistant crops: Selection, characterization, and management." 1996 , HERBICIDE-RESISTANT CROPS: AGRICULTURAL, ENVIRONMENTAL, ECONOMIC,, PAGE(S) 143-157 , 1996 CRC PRESS, INC.;CRC PRESS BOCA RATON, FLORIDA, USA; LONDON, ENGLAND, UK XP001118963 ISBN: 1-56670-045-0 page 147 -page 152 ANDERSON O.: retrieved from EBI Database accession no. BF2004188, DATABASE EMBL [Online] November 2000 (2000-11-08) EP А 0508161. 14.10.1992 EP А 0525384, 03.02.1993 EP А 0360750,28.03.1990 2 (19) 1 3 89016 4 імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотиновою кисотид, що включає SEQ ID NO:1 та полінуклеотид, лотою. що кодує поліпептид, який включає амінокислотну 10. Рослинна частина рослини пшениці за будьпослідовність, кодовану SEQ ID NO:1; і яким з пп. 1-9, де рослинна частина містить Imi3 б) вирощування з рослинної клітини трансгенної нуклеїнову кислоту. рослини з підвищеною резистентністю до імідазо11. Рослинна клітина рослини пшениці за будьлінонового гербіциду порівняно з сортом рослини яким з пп. 1-9, де рослинна клітина містить Imi3 дикого типу. нуклеїнову кислоту. 19. Спосіб за п. 18, у якому Imi3 нуклеїнова кисло12. Насіння, яке продукується рослиною пшениці та являє собою Triticum monococcum Imi3 нуклеїза будь-яким з пп. 1-9, де насіння містить Imi3 нукнову кислоту. леїнову кислоту. 20. Трансгенна рослина, одержана відповідно до 13. Виділена IMI нуклеїнова кислота, де нуклеїноспособу за п. 18 або 19. ва кислота включає полінуклеотид, вибраний з 21. Насіння, що продукується трансгенною рослигрупи, до якої входять: ною за п. 20, де насіння включає Imi3 нуклеїнову a) полінуклеотид, що містить SEQ ID NO:1, та кислоту. b) полінуклеотид, що кодує поліпептид, який вклю22. Спосіб боротьби з бур'янами в оточенні росчає амінокислотну послідовність, кодовану SEQ ID лин, який включає застосування імідазолінонового NO:1. гербіциду до бур'янів та рослини, де рослина має 14. Виділена IMI нуклеїнова кислота за п. 13, у якій підвищену резистентність до імідазолінонового нуклеїнова кислота включає полінуклеотид з посгербіциду порівняно з різновидами рослини дикого лідовністю SEQ ID NO:1. типу, причому рослина являє собою трансгенну 15. Спосіб боротьби з бур'янами в оточенні рослирослину за п. 20. ни пшениці, який включає застосування імідазолі23. Спосіб одержання рослини пшениці, що має нонового гербіциду до бур'янів та рослини пшенипідвищену резистентність до імідазолінонового ці, де рослина пшениці має підвищену гербіциду, який включає: резистентність до імідазолінонового гербіциду a) кросбридинг першої рослини пшениці з другою порівняно з сортом рослини пшениці дикого типу, рослиною пшениці, де перша рослина пшениці причому рослина містить Imi3 нуклеїнову кислоту, має резистентність до імідазолінонового гербіциду та Imi3 нуклеїнова кислота являє собою полінукпорівняно з різновидами рослини дикого типу, та леотид, вибраний з групи, до якої входять: b) вирощування потомства рослин пшениці після a) полінуклеотид, який включає SEQ ID NO:1, та кросбридингу, та b) полінуклеотид, що кодує білок, кодований поліc) обробку потомства рослин пшениці імідазолінонуклеотидом, який включає SEQ ID NO:1. новим гербіцидом; 16. Спосіб за п. 15, у якому Imi3 нуклеїнова кислопричому перша рослина пшениці являє собою рота являє собою Triticum monococcum Imi3 нуклеїслину пшениці за п. 1. нову кислоту. 24. Спосіб за п. 23, у якому Imi3 нуклеїнова кисло17. Спосіб за п. 14 або п. 15, у якому рослина та являє собою Triticum monococcum Imi3 нуклеїотримана або походить від рослини з номером нову кислоту. патентного депонування ATCC PTA-4113. 25. Спосіб за п. 23 або п. 24, у у якому рослина 18. Спосіб одержання трансгенної рослини з підотримана або походить від рослини з номером вищеною резистентністю до імідазолінонового патентного депонування ATCC PTA-4113. гербіциду, який включає: 26. Рослина пшениці, одержана відповідно до споa) трансформацію рослинної клітини вектором собу за будь-яким з пп. 23-25. експресії, який включає Imi3 нуклеїнову кислоту, 27. Насіння, яке продукується рослиною пшениці де Imi3 нуклеїнова кислота включає полінуклеоза п. 26, де насіння має підвищену резистентність тид, вибраний з групи, до якої входять: полінукледо імідазолінонового гербіциду. Ця заявка заявляє пріоритет попередньої заявки США №60/311,180, поданої 9 серпня 2001р. Даний винахід у цілому стосується рослин, які мають підвищену резистентність до імідазолінонових гербіцидів. Тобто даний винахід стосується пшеничних культур, одержаних шляхом мутагенезу та кросбридингу і перетворення, які мають підвищену резистентність до імідазолінонових гербіцидів. Синтаза ацетогідроксіоцтової кислоти (AHAS; EC 4.1.3.18) є першим ферментом, який каталізує біохімічний синтез амінокислот з розгалуженими ланцюгами валіну, лейцину та ізолейцину (Singh В. K., 1999 Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine in: Singh В. K. (Ed) Plant amino acids. Marcel Dekker Inc. New York, New York. Pg 227247). AHAS є місцем дії чотирьох різних за струк турою груп гербіцидів, включаючи сульфонілсечовини (LaRossa RA and Falco SC, 1984 Trends Biotechnol. 2:158-161), імідазолінони (Shaner et al., 1984 Plant Physiol. 76:545-546), триазолопіримідини (Subramanian and Gerwick, 1989 Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines in (ed) Whitaker JR, Sonnet PE Biocatalysis in agricultural biotechnology. ACS Symposium Series, American Chemical Society. Washington, D.C. Pg 277-288) та піримідилоксибензоати (Subramanian et al., 1990 Plant Physiol 94: 239-244.). Імідазолінонові та сульфонілсечовинні гербіциди широко застосовують у сучасному сільському господарстві завдяки їхній ефективності при дуже низьких нормах внесення та відносній нетоксичності для тварин. Шляхом інгібування активності AHAS ці групи гербіцидів перешкоджають ростові та розвиткові чутливих до 5 89016 6 них рослин, включаючи багато видів бур'янів. Приний, частково домінантний ген забезпечував резикладами імідазолінонових гербіцидів серійного стентність. На основі алельних досліджень автори дійшли висновку, що мутації в чотирьох ідентифівиробництва є PURSUIT (імазетапір), SCEPTER кованих лініях містилися в одному місці. Один з (імазахін) та ARSENAL (імазапір). Приклади сугенів резистентності культури Fidel було позначено льфонілсечовинних гербіцидів є хлорсульфурон, як FS-4 (Newhouse et al., 1992 Plant Physiol. метсульфурон-метил, сульфометурон-метил, хло100:882-886). римурон-етил, трифенсульфурон-метил, трибенуКомп'ютерне моделювання тривимірної конрон-метил, бенсульфурон-метил, нікосульфурон, формації комплексу AHAS-інгібітора передбачає етаметсульфурон-метил, римсульфурон, трифлукілька амінокислот у запропонованій кишені зв'ясульфурон-метил, триасульфурон, примісульфузування інгібітора як місця, де викликані мутації рон-метил, циносульфурон, амідосульфурон, флуможуть забезпечувати вибіркову резистентність до засульфурон, імазосульфурон, піразосульфуронімідазолінонів (Ott et al., 1996 J. Mol. ВіоІ. 263:359етил та галосульфурон. 368). Пшеничні культури, одержані за допомогою Завдяки їх високій ефективності та низькій тодеяких із цих раціонально спланованих мутацій у ксичності, імідазоліноновим гербіцидам віддають запропонованих місцях зв'язування ферменту перевагу, коли йдеться про нанесення шляхом AHAS, фактично інгібували специфічну резистентрозпилення над широкими площами рослинних ність до єдиного класу гербіцидів (Ott et al., 1996 J. культур. Можливість розпилення гербіциду над Mol. ВіоІ. 263:359-368). великими площами рослинних культур знижує виПро резистентність рослин до імідазолінонотрати, пов'язані зі створенням плантацій та доглявих гербіцидів також повідомлялося в багатьох дом за ними і зменшує потребу в підготуванні міспатентах. У патентах США №№ 4,761,373, ця до застосування таких хімікатів. Розпилення 5,331,107, 5,304,732, 6,211,438, 6,211,439 та над потрібними толерантними видами в результаті 6,222,100 у загальних рисах описано застосування також забезпечує можливість досягнення максизміненого гена AHAS для викликання резистентномального врожаю потрібних культур завдяки відсусті до гербіцидів у рослинах і докладно описано тності конкуруючих видів. Однак можливість застодеякі резистентні до імідазолінону лінії кукурудзи. сування таких способів розпилення залежить від У патенті США №5,013,659 описано рослини, які наявності резистентних до імідазолінону видів виявляють резистентність до гербіцидів і мають потрібних рослин на площі розпилення. мутації у принаймні одній амінокислоті в одній або Серед основних сільськогосподарських кулькількох збережених ділянках. Описані в ньому мутур деякі види зернобобових, такі як соя, мають тації кодують або перехресну резистентність до природну резистентність до імідазолінонових герімідазолінонів та сульфонілсечовин або специфічбіцидів завдяки їх здатності до швидкого засвоєнну до сульфонілсечовини резистентність, але спеня гербіцидних сполук (Shaner and Robinson, 1985 цифічна до імідазолінону резистентність не описуWeed Sci. 33:469-471). Інші культури, такі як кукується. Крім того, в патенті США №5,731,180 та рудза (Newhouse et al., 1992 Plant Physiol. 100:882патенті США №5,767,361 обговорюється виділе886) та рис (Barrette et al., 1989 Crop Safeners for ний ген, який має єдине амінокислотне заміщення Herbicides, Academic Press New York, pp. 195-220), в амінокислотній послідовності AHAS однодольних певною мірою є чутливими до імідазолінонових дикого типу, яка в результаті забезпечує специфігербіцидів. Розбіжності в чутливості до імідазолічну до імідазолінону резистентність. нонових гербіцидів залежать від хімічної природи До цього часу в роботах існуючого рівня техніконкретного гербіциду та характеру метаболізму ки не було описано резистентних до імідазолінону сполуки від токсичної до нетоксичної форми в копшеничних культур, які містять більше одного зміжній рослині (Shaner et al., 1984 Plant Physiol. неного гена AHAS. Так само в роботах існуючого 76:545-546; Brown et al., 1987 Pestic. Biochem. рівня техніки не було описано резистентних до Physiol. 27:24-29). Інші фізіологічні розбіжності роімідазолінону пшеничних культур, які містять муслин, такі як абсорбція та транслокація, також відітації в геномах, крім геному, від якого походить ген грають важливу роль у чутливості (Shaner and FS-4. Таким чином, дана галузь потребує ідентиRobinson, 1985 Weed Sci. 33:469-471). фікації генів резистентності до імідазолінону з доКультурні сорти, резистентні до імідазолінонів, даткових геномів. Дана галузь також потребує сульфонілсечовин та триазолопіримідинів, успішпшеничних культур, які мають підвищену резистено виводилися з застосуванням насіння, мікроснтність до гербіцидів, таких як імідазолінон, і міспор, пилку та мутагенезу калюсу в Zea mays, тять більше одного зміненого гена AHAS. Потрібні Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, також способи контролю над ростом бур'янів побand Nicotiana tabacum (Sebastian et al., 1989 Crop лизу від таких пшеничних культур. Ці композиції та Sci. 29:1403-1408; Swanson et al., 1989 Theor. Appl. способи дозволяють застосовувати технології розGenet. 78:525-530; Newhouse et al., 1991 Theor. пилення при нанесенні гербіцидів на площі з пшеAppl. Genet. 83:65-70; Sathasivan et al., 1991 Plant ничними культурами. Physioi. 97:1044-1050; Mourand et al., 1993 J. Даний винахід забезпечує пшеничні культури, Heredity 84: 91-96). В усіх випадках резистентність які включають ІМІ нуклеїнові кислоти, причому забезпечував єдиний, частково домінантний ядерпшенична культура має підвищену резистентність ний ген. Раніше також були виведені чотири резидо імідазолінонового гербіциду порівняно з різностентні до імідазолінону пшеничні культури після видами рослини дикого типу. Пшеничні культури мутагенезу насіння Triticum aestivum L. cv Fidel можуть містити одну, дві, три або більше ІМІ нук(Newhouse et al., 1992 Plant Physiol. 100:882-886). леїнових кислот. В одному варіанті втілення пшеДослідження успадкування підтвердили, що єди 7 89016 8 нична культура включає кілька ІМІ нуклеїнових ленням. (Modified from Devine, M. D. and Eberlein, кислот, які містяться в різних геномах. В оптимаС. V., 1997 Physiological, biochemical and molecular льному варіанті ІМІ нуклеїнові кислоти кодують aspects of herbicide resistance based on altered білки, які включають мутацію в консервативній target sites in Herbicide Activity: Toxicity, амінокислотній послідовності, вибраній з групи, яка Biochemistry, and Molecular Biology, IOS Press складається з Домену А, Домену В, Домену С, ДоAmersterdam, p. 159-185). мену D та Домену Е. У ще кращому варіанті мутаФігура 4 є таблицею, в якій показано батьківція міститься в консервативному Домені Ε або ські лінії пшениці, які використовують для визнаконсервативному Домені С. Забезпечуються також чення алельного взаємозв'язку між ІМІ генами. частини рослин та насіння рослин, отримані від Фігура 5 є таблицею, в якій показано F2 дані описаних авторами пшеничних культур. В іншому сегрегації, які демонструють розміщення ЕМ2 муваріанті втілення пшенична культура включає ІМІ тації в геномі А. нуклеїнову кислоту, яка не є ІМІ нуклеїновою кисФігура 6 є таблицею, в якій показано різні аглотою. ІМІ нуклеїнова кислота може бути, наприрономічні характеристики, на які може впливати клад, Іmі2 або Іmі3 нуклеїновою кислотою. ураження гербіцидами в контрольній рослині ІМІ нуклеїнові кислоти даного винаходу моEinkorn та ЕМ2. жуть включати нуклеотидну послідовність, вибрану Фігура 7 є таблицею, в якій показано оцінку коз групи, яка складається з: полінуклеотиду SEQ ID нтрольної рослини Einkorn та ЕМ2 на загальне NO:1; полінуклеотиду, який включає принаймні 60 ураження культури при трьох нормах імазамоксу. послідовних нуклеотидів SEQ ID NO:1; та полінукФігура 8 є таблицею, в якій показано підвилеотиду, комплементарного SEQ ID NO:1. щення резистентності до імідазолінонових гербіРослини даного винаходу можуть бути трансцидів у сортів пшениці після міжплощинної взаєгенними або нетрансгенними. Прикладами нетрамодії ІМІ нуклеїнових кислот. нсгенних пшеничних культур з підвищеною резисДаний винахід стосується пшеничних культур, тентністю до імідазолінонових гербіцидів є частин пшеничних культур та клітин пшеничних пшенична культура, яка має Номер патентного культур з підвищеною резистентністю до імідазодепонування АТСС РТА-4113; або мутантна, релінонових гербіцидів. Даний винахід також охопкомбінантна або піддана генній інженерії похідна лює насіння, вироблене описаними авторами рослини з номером патентного депонування АТСС пшеничними культурами, та способи контролю над РТА-4113; або будь-якого потомства рослини з бур'янами в оточенні описаних авторами пшеничномером патентного депонування АТСС РТАних культур. Слід розуміти, що вжита в описі та 4113; або рослина, яка є потомством будь-якої з формулі форма однини може означати як однину, цих рослин. так і множину, залежно від контексту, в якому її Крім композицій даного винаходу, забезпечувжито. Так, наприклад, посилання на "клітину" моється кілька способів. Авторами описано способи же означати використання принаймні однієї клітизміни толерантності рослини до імідазолінонового ни. гербіциду, які включають зміну експресії ІМІ нуклеВжитий авторами термін "пшенична культура" їнової кислоти в рослині. Описано також способи стосується рослини, яка належить до роду одержання трансгенної рослини, яка має підвищеTriticum. Пшеничні культури даного винаходу мону толерантність до імідазолінонового гербіциду, жуть належати до роду Triticum, включаючи, крім які включають перетворення рослинної клітини інших, Т. aestivum, Т. turgidum, Т. timopheevii, Т. вектором експресії, що включає одну або кілька monococcum, Т. zhukovskyi та Т. urartu і їх гібриди. ІМІ нуклеїнових кислот, та вирощування рослини з Прикладами підвиду Т. aestivum, які охоплюються рослинної клітини. Винахід також охоплює спосіб даним винаходом, є aestivum (пшениця звичайна), контролю над бур'янами в оточенні пшеничної compactum (карликова пшениця), macha (пшениця культури, який включає нанесення імідазолінономаха), vavilovi (пшениця Вавілова), spelta та вого гербіциду на бур'яни та пшеничну культуру, sphaecrococcum (пшениця спельта). Прикладами причому пшенична культура має підвищену резиспідвиду Т. turgidum, які охоплюються даним винатентність до імідазолінонового гербіциду порівняходом, є turgidum, carthlicum,. dicoccon, durum, но з сортом пшеничної культури дикого типу, і роpaleocolchicum, polonicum, turanicum та слина містить одну або кілька ІМІ нуклеїнових dicoccoides. Прикладами підвиду Т. monococcums, кислот. У деяких оптимальних варіантах втілення які охоплюються даним винаходом, є monococcum цих способів рослини включають множинні ІМІ (einkorn) та aegilopoides. В одному варіанті втіленнуклеїнові кислоти, які містяться в різних геномах ня даного винаходу пшенична культура належить пшениці. до виду Triticum monococcum, точніше, партії Фігура 1 показує часткову послідовність кДНК Einkorn. Einkorn IMI3 (SEQ ID NO:1). Термін "пшенична культура" охоплює пшеничФігура 2 показує часткову послідовність кДНК ні культури на будь-якій стадії стиглості або розвиEinkorn MB порівняно з послідовністю Einkorn дитку, а також будь-які тканини або органи (частини кого типу (SEQ ID NO:2) та узагальнюючу типову рослин), взяті або одержані від будь-якої подібної послідовність (SEQ ID NO:3). рослини, якщо в контексті прямо не вказано іншоФігура 3 є схематичним зображенням консерго. До частин рослин належать, крім інших, стебла, вативних амінокислотних послідовностей в AHAS коріння, квітки, насінні зачатки, тичинки, листя, генах, пов'язаних з резистентністю до різних інгібізародки, ділянки меристеми, тканина калюсу, куторів AHAS. Конкретну амінокислотну ділянку, яка льтури пиляка, гаметофіти, спорофіти, пилок, міквідповідає за резистентність, позначено підкресроспори, протопласти та ін. Даний винахід також 9 89016 10 охоплює насіння, вироблене пшеничними культупшениці. Отже, кожен Imi клас включає ІМІ нуклеїрами даного винаходу. В одному варіанті втілення нові кислоти, які відрізняються за своєю нуклеотинасіння одержують шляхом розведення гомозигот дною послідовністю, але, незважаючи на це, поздля підвищеної резистентності до імідазоліноновоначаються як такі, що походять або містяться в го гербіциду порівняно з насінням сорту пшеничної одному геномі пшениці, на основі дослідження культури дикого типу. успадкування, яке відоме спеціалістам у даній гаУ даному винаході описано пшеничну культулузі. ру, яка включає одну або кілька ІМІ нуклеїнових Відповідно, даний винахід охоплює пшеничну кислот, причому пшенична культура має підвищекультуру, яка включає одну або кілька ІМІ нуклеїну резистентність до імідазолінонового гербіциду нових кислот, причому пшенична культура має порівняно з різновидами рослини дикого типу. підвищену резистентність до імідазолінонового Вжитий авторами термін "ІМІ нуклеїнова кислота" гербіциду порівняно з різновидами рослини дикого стосується нуклеїнової кислоти, яка є мутованою типу, і одну або кілька ІМІ нуклеїнових кислот вивід нуклеїнової кислоти AHAS у пшеничній культурі бирають із групи, яка складається з нуклеїнової дикого типу, і яка надає підвищеної резистентності кислоти Іmі1, Іmі2 та Imi3. В одному варіанті втідо імідазолінону рослині, в якій вона транскрибулення рослина містить Imi3 нуклеїнову кислоту. В ється. В одному варіанті втілення пшенична кульоптимальному варіанті втілення Imi3 нуклеїнова тура включає множинні ІМІ нуклеїнові кислоти. кислота включає полінуклеотидну послідовність, Вжитий в описі ІМІ нуклеїнових кислот термін показану в SEQ ID NO:1. В іншому варіанті втілен"множинні" стосується ІМІ нуклеїнових кислот, які ня рослина містить Іmi1 або Іmі2 нуклеїнову кисломають різні нуклеотидні послідовності і не стосуту. ється простого збільшення кількості однієї ІМІ нукВжитий авторами по відношенню до нуклеїнолеїнової кислоти. Наприклад, ІМІ нуклеїнові кислових кислот термін "із" стосується нуклеїнової кисти можуть бути різними через те, що вони лоти, яка "міститься у" або "походить із" конкретпоходять із різних геномів або містяться в різних ного геному. Термін "міститься у" стосується геномах пшениці. нуклеїнової кислоти, яка міститься в межах конкПшеничні культури даного винаходу можуть ретного геному. Також вжитий авторами по відномати множинні ІМІ нуклеїнові кислоти з різних гешенню до геному термін "походить із" стосується номів, оскільки ці рослини можуть містити більше нуклеїнової кислоти, видаленої або виділеної з одного геному. Наприклад, пшенична культура цього геному. Термін "виділений" детальніше виTriticum aestivum містить три геноми, які іноді назначено нижче. зивають геномами А, В та D. Оскільки AHAS є потВ іншому варіанті втілення пшенична культура рібним метаболічним ферментом, то вважається, включає ІМІ нуклеїнову кислоту, причому ця нуклещо геном має принаймні один ген, який кодує феїнова кислота не є Imi1 нуклеїновою кислотою. рмент AHAS, який зазвичай спостерігається з інТермін "не Imi1" стосується ІМІ нуклеїнової кислошими метаболічними ферментами в гексаплоїдній ти, яка не належить до Іmi1 класу, як описано випшениці, підданій картуванню. Нуклеїнова кислота ще. Одним прикладом не Imi1 нуклеїнової кислоти AHAS у кожному геномі може відрізнятися і зазвиє полінуклеотидна послідовність, показана в SEQ чай відрізняється своєю нуклеотидною послідовніID NO:1. Відповідно, в оптимальному варіанті втістю від нуклеїнової кислоти AHAS в іншому геномі. лення пшенична культура містить ІМІ нуклеїнову Спеціаліст у даній галузі може визначити геном кислоту, яка включає полінуклеотидну послідовпоходження кожної нуклеїнової кислоти AHAS, ність, показану в SEQ ID NO:1. застосовуючи генетичний кросинг та/або інші споДаний винахід включає пшеничні культури, які соби секвенування або гідролізу екзонуклеази, які містять одну, дві, три або більше ІМІ нуклеїнових відомі спеціалістам. З точки зору цього винаходу, кислот, причому пшенична культура має підвищеІМІ нуклеїнові кислоти, які походять із одного з ну резистентність до імідазолінонового гербіциду геномів А, В або D, розпізнають і позначають як порівняно з різновидами рослини дикого типу. ІМІ нуклеїнові кислоти Іmi1, Іmі2 або Іmі3. Автори не нуклеїнові кислоти можуть включати нуклеотидну стверджують, що будь-який конкретний клас ІМІ послідовність вибрану з групи, яка складається з нуклеїнової кислоти співвідноситься з будь-яким полінуклеотиду SEQ ID NO:1; полінуклеотиду, який конкретним геномом А, В або D. Наприклад, автовключає принаймні 60 послідовних нуклеотидів ри не стверджують, що Іmі1 нуклеїнові кислоти SEQ ID NO:1; та полінуклеотиду, комплементарноспіввідносяться з нуклеїновими кислотами геному го SEQ ID NO:1. А, що Іті2 нуклеїнові кислоти співвідносяться з Імідазоліноновий гербіцид може бути вибрануклеїновими кислотами геному В і т. д. Позначенний, крім інших, з-поміж, PURSUIT (імазетапіру), ня Іmi1, Іmі2 та Іmі3 лише вказують, що ІМІ нуклеїCADRE (імазапіку), RAPTOR (імазамоксу), нові кислоти в межах кожного такого класу не виSCEPTER (імазахіну), ASSERT (імазетабензу), діляються незалежно, тоді як дві ІМІ нуклеїнові ARSENAL (імазапір), похідної будь-якого з вищекислоти різних класів виділяються незалежно і, згаданих гербіцидів або суміші двох або більшої таким чином, можуть походити з різних геномів кількості вищезгаданих гербіцидів, наприклад, імапшениці. запіру/імазамоксу (ODYSSEY ). Точніше, імідазоКлас Іmі1 нуклеїнових кислот включає FS-4 ліноновий гербіцид може бути вибраний, крім інген, як описано в роботі Newhouse et al. (1992 ших, з-поміж, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2Plant Physiol. 100:882-886). Клас нуклеїнових кисімідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти, 2-(4лот Imi3 включає описаний нижче IMI3 ген Einkorn. ізопропіл)-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3Кожен Іmі клас може включати члени інших видів хінолінкарбонової кислоти, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4 11 89016 12 метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоNO: 8). Оптимальним заміщенням є аспарагін зати, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)мість серину в Домені Ε (SEQ ID NO:8). 5-(метоксиметил)-нікотинової кислоти, 2-(4Описані авторами пшеничні культури можуть ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5бути або трансгенними пшеничними культурами, метилнікотинової кислоти, та суміші метил 6-(4або нетрансгенними пшеничними культурами. ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-mВжитий авторами термін "трансгенний" стосується толуату і метил 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2будь-якої рослини, рослинної клітини, калюсу, роімідазолін-2-іл)-р-толуату. Перевагу віддають заслинної тканини або частини рослини, що містить, стосуванню 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксоповністю або частково, принаймні один рекомбіна2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти та 2-(4нтний полінуклеотид. У багатьох випадках рекомізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5бінантний полінуклеотид, частково або повністю, є (метоксиметил)-нікотинової кислоти. Особливу стабільно включеним у хромосому або стійкий перевагу віддають застосуванню 2-(4-ізопропіл-4позахромосомний елемент таким чином, що він метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)передається наступним поколінням. З точки зору нікотинової кислоти. винаходу термін "рекомбінантний полінуклеотид" В одному варіанті втілення пшенична культура стосується полінуклеотиду, який було змінено, містить дві ІМІ нуклеїнові кислоти, причому нуклеїперебудовано або модифіковано шляхом генної нові кислоти походять із або містяться в різних інженерії. Прикладами є будь-який клонований геномах пшениці. В оптимальному варіанті однією полінуклеотид або полінуклеотиди, які є зв'язаниз двох нуклеїнових кислот є Imi3 нуклеїнова кисломи або приєднаними до гетерологічних послідовта. У ще кращому варіанті Imi3 нуклеїнова кислота ностей. Термін "рекомбінантний" не стосується включає полінуклеотидну послідовність SEQ ID змін полінуклеотидів, які є результатом природних NO:1. В іншому варіанті втілення пшенична кульподій, таких як спонтанні мутації, або неспонтаннотура містить одну ІМІ нуклеїнову кислоту, причому го мутагенезу з наступною селекцією. Рослини, які нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну посмістять мутації, що виникають внаслідок неспонлідовність SEQ ID NO:1 У ще одному варіанті втітанного мутагенезу та селекції, вказуються автоленняпшенична культура містить три або більше рами як нетрансгзнні рослини і охоплюються даІМІ нуклеїнових кислот, причому кожна нуклеїнова ним винаходом. У варіантах втілення, в яких кислота походить із свого геному. В оптимальному пшенична культура є трансгенною і містить мноваріанті принаймні одна з трьох ІМІ нуклеїнових жинні ІМІ нуклеїнові кислоти, нуклеїнові кислоти кислот включає полінуклеотидну послідовність, можуть походити з різних геномів або з одного показану в SEQ ID NO:1. геному. Або ж у варіантах втілення, в яких пшениВ оптимальному варіанті втілення даного вична культура є нетрансгенною і містить множинні находу одна або кілька ІМІ нуклеїнових кислот, які ІМІ нуклеїнові кислоти, нуклеїнові кислоти містятьмістяться в рослині, кодують амінокислотну посліся в різних геномах або в одному геномі. довність, яка включає мутацію в домені, збережеПрикладом нетрансгенного сорту пшеничної ному серед кількох білків AHAS. Ці консервативні культури, що містить одну ІМІ нуклеїнову кислоту, домени вказуються авторами як Домен А, Домен є сорт рослини, депонований в АТСС під номером В, Домен С, Домен D та Домен Е. Фігура 2 показує патентного депонування РТА-4113 і вказаний авзагальне розташування кожного домену в білку торами як сорт пшениці Einkorn ІМІ. Сорт пшениці AHAS. Домен А містить амінокислотну послідовEinkorn ІМІ містить Imi3 нуклеїнову кислоту. Частність AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO:4). Домен В кову нуклеотидну послідовність, що відповідає містить амінокислотну послідовність QWED (SEQ генові Einkorn ІМІ, показано в SEQ ID NO:1. ID NO:5). Домен С містить амінокислотну послідоДепонування 2500 зразків насіння сорту пшевність VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO:6). ниці Einkorn ІМІ було здійснено в Американському Домен D містить амінокислотну послідовність зібранні типових культур, Манассас, Вірджинія, 4 AFQETP (SEQ ID NO:7). Домен Ε містить амінокиберезня 2002р. Депонування було здійснено згідно слотну послідовність IPSGG (SEQ ID NO:8). Даний з умовами Будапештської угоди стосовно депонувинахід також передбачає можливість незначних вання мікроорганізмів. Депонування було здійсневідхилень у консервативних доменах, наприклад, у но на термін не менше тридцяти років і не менше куколі сериновий залишок у Домені Ε заміщено п'яти років після отримання АТСС останнього зааланіновим залишком. питу про надання депонованого зразка. ДепоноваВідповідно, даний винахід охоплює пшеничну не насіння отримало номер патентного депонукультуру, яка включає ІМІ нуклеїнову кислоту, яка вання РТА-4113. кодує амінокислотну послідовність, яка має мутаДаний охоплює пшеничну культуру, яка має цію в консервативному Домені, вибраному з групи, номер патентного депонування РТА-4113; мутантяка складається з Домену А, Домену В, Домену С, ну, рекомбінантну або піддану генній інженерії Домену D та Домену Е. В одному варіанті втілення похідну рослини з номером патентного депонупшенична культура містить ІМІ нуклеїнову кислоту, вання РТА-4113; будь-яке потомство з номером яка кодує амінокислотну послідовність, яка має патентного депонування РТА-4113; та рослину, мутацію в Домені Е. В інших оптимальних варіаняке є потомством будь-якої з цих рослин. В оптитах втілення мутації в консервативних доменах мальному варіанті втілення пшенична культура трапляються в місцях, позначених таким підкресданого винаходу додатково має характеристики ленням: ATTGQVPRRMIGT (SEQ ID NO:4); OWED резистентності до гербіцидів, яку рослини з номе(SEQ ID NO:5); VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID ром патентного депонування РТА-4113. NO:6); AFQETP (SEQ ID NO:7) та IPSGG (SEQ ID 13 89016 14 Даний винахід також охоплює описані автораАнтисмислові полінуклеотиди та рибозими можуть ми гібриди сорту пшениці Einkorn IMI та іншого складатися повністю з рибонуклеотидів, або мосорту пшениці. До інших сортів пшениці належать, жуть містити змішані рибонуклеотиди та деоксикрім інших, Т. aestivum L. cv Fidel та будь-який сорт рибонуклеотиди. Полінуклеотиди винаходу одерпшениці, який містить мутантний ген FS-1, FS-2, жують будь-якими способами, включаючи FS-3 або FS-4, та інший сорт пшениці, включаючи, одержання геномних препаратів, кДНК-препаратів, крім інших, Т. aestivum L. cv Fidel, точніше, сорти in vitro синтез, RT-ПЛР та in vitro або in vivo трансFidel, які містять мутантні гени FS1, FS2, FS3 або крипцію. FS4. (див. патент США №6,339,184 та патентну "Виділеною" молекулою нуклеїнової кислоти є заявку США №08/474,832). молекула, яка є практично відокремленою від інТерміни "сорт" та "різновид" стосуються групи ших молекул нуклеїнових кислот, присутніх у прирослин у межах виду, які мають певну кількість родному джерелі нуклеїнової кислоти (тобто посспільних характеристик або особливостей, які спелідовностей, які кодують інші поліпептиди). В ціалістами вважаються достатніми для відрізнення оптимальному варіанті "виділена" нуклеїнова кисодного сорту або різновиду від іншого сорту або лота є вільною від деяких із послідовностей, які у різновиду. Жоден з термінів не передбачає, що всі природі є фланкуючими на нуклеїновій кислоті рослини будь-якого даного сорту або різновиду є (тобто послідовностей, розміщених на 5' та 3' кінгенетично ідентичними на рівні повного гена або цях нуклеїнової кислоти) в її природному репліконі. на молекулярному рівні, або що будь-яка дана Наприклад, клоновану нуклеїнову кислоту вважарослина є гомозиготною в усіх локусах. А сорт або ють виділеною. У різних варіантах втілення видірізновид вважається "розведенням гомозигот" для лена молекула ІМІ нуклеїнової кислоти може місконкретної особливості, якщо в разі, коли гомозитити менше, ніж приблизно 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, готний сорт або різновид є самозапилюваним, усе 0,5kb або 0,1kb нуклеотидних послідовностей, які у потомство має цю особливість. У даному винаході природі є фланкуючими на молекулі нуклеїнової особливість виникає внаслідок мутації в гені AHAS кислоти в геномній ДНК клітини, з якої походить пшеничної культури або насіння. нуклеїнова кислота (наприклад, клітини Triticum Крім пшеничних культур, даний винахід охопmonococcum). Нуклеїнову кислоту також вважають лює виділені ІМІ білки та нуклеїнові кислоти. Нуквиділеною, якщо її було змінено через втручання леїнові кислоти включають полінуклеотид, вибралюдини або поміщено в локус або місце, яке не є її ний з групи, яка складається з полінуклеотиду SEQ природним місцем, або якщо її було введено у ID NO:1; полінуклеотиду, який включає принаймні клітину шляхом агроінфекції або біолістики. Крім 60 послідовних нуклеотидів SEQ ID NO:1; та політого, "виділена" молекула нуклеїнової кислоти, нуклеотиду, комплементарного SEQ ID NO:1. В така як молекула кДНК, може бути вільною від оптимальному варіанті втілення ІМІ нуклеїнова деякого іншого клітинного матеріалу, з яким вона кислота включає полінуклеотидну послідовність пов'язана у природі, або культурального середоSEQ ID NO:1. вища, якщо її одержують рекомбінантними спосоТермін "білок AHAS" стосується білка синтази бами, або хімічних попередників або інших хімічацетогідроксіоцтової кислоти, а термін "ІМІ білок" них речовин, якщо її синтезують хімічним шляхом. стосується будь-якого білка AHAS, який є мутоваПрямо виключаються з визначення "виділені ним від білка AHAS дикого типу і який надає більнуклеїнові кислоти": природні хромосоми (такі як шої резистентності до імідазолінону рослині, росрозтягнуті хромосоми), бібліотеки штучних хромолинній клітині, частині рослини, насінню рослини сом, геномні бібліотеки та бібліотеки кДНК, які ісабо рослинній тканині, якщо він у них експресуєтьнують або як in vitro препарат нуклеїнової кислоти, ся. В оптимальному варіанті втілення ІМІ білок або як препарат трансфікованої/трансформованої включає поліпептид, який кодується полінуклеотиклітини-хазяїна, причому клітини-хазяї є або in vitro дом SEQ ID NO:1. також вжиті авторами терміни гетерогенним препаратом, або вирощеними на "нуклеїнова кислота" та "полінуклеотид" стосуютьпластині як гетерогенна популяція окремих колося РНК або ДНК, яка є лінійною або розгалуженою, ній. Також прямо виключаються вищезгадані бібліодно- або дволанцюговою, або їх гібриду. Термін отеки, в яких зазначена нуклеїнова кислота склатакож охоплює гібриди РНК/ДНК. Ці терміни також дає менше 5% від кількості нуклеїновокислотних охоплюють нетрансльовану послідовність, розмівставок у векторних молекулах. Також прямо вищену на 3' та 5' кінцях кодуючої ділянки гена: приключаються геномні ДНК цілих клітин або препанаймні близько 1000 нуклеотидів послідовності рати РНК цілих клітин (включаючи препарати цілих перед 5' кінцем кодуючої ділянки, і принаймні бликлітин, які є механічно зрізаними або підданими зько 200 нуклеотидів послідовності після 3' кінця ферментативному гідролізові). Крім того, прямо кодуючої ділянки гена. Менш поширені основи, такі виключаються препарати цілих клітин, які існують як інозин, 5-метилцитозин, 6-метиладенін, гіпоксаабо як in vitro препарат, або як гетерогенна суміш, нтин та інші, також можуть бути використані для відокремлена шляхом електрофорезу, в якій нукантисмислового, dsPHK- та рибозимного спарюлеїнову кислоту згідно з винаходом не було піддавання. Наприклад, було виявлено, що полінуклеоно подальшому відокремленню від гетерологічних тиди, які містять С-5 пропінові аналоги уридину та нуклеїнових кислот у середовищі електрофорезу цитидину, зв'язуються з РНК з високою споріднені(наприклад, подальшому відокремленню шляхом стю і є сильними антисмисловими інгібіторами вирізання однієї смуги з гетерогенної сукупності експресії генів. Також здійснюють інші модифікації, смуг в агарозному гелі або шляхом блотування на наприклад, модифікацію фосфодіестерного оснонейлон). вного ланцюга або 2'-гідрокси у групі рибози РНК. 15 89016 16 Молекулу нуклеїнової кислоти даного винахослини дикого типу. Способи кількісного визначення ду, наприклад, молекулу нуклеїнової кислоти, яка підвищеної резистентності до імідазолінонових містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1 гербіцидів представлено нижче у Прикладах. Біоабо її частину, виділяють, застосовуючи стандартлогічно активні частини ІМІ білка включають пепні способи молекулярної біології та представлену тиди, кодовані полінуклеотидними послідовностяавторами інформацію про послідовність. Наприми, які включають SEQ ID NO:1, які включають клад, ІМІ кДНК Т. monococcum виділяють з бібліоменше амінокислот, ніж ІМІ білок повної довжини і теки Т. monococcum, застосовуючи, повністю або надають підвищеної резистентності до імідазолічастково, послідовність SEQ ID NO:1. Крім того, нонового гербіциду після експресії в рослині. Як молекула нуклеїнової кислоти, яка включає, повніправило, біологічно активні частини (наприклад, стю або частково, SEQ ID NO:1 може бути виділепептиди, які мають у довжину, наприклад, 5, 10, на шляхом полімеразної ланцюгової реакції з за15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 або більше стосуванням олігонуклеотидних праймерів, амінокислот) включають домен або мотив з припобудованих на основі цієї послідовності. Напринаймні однією активністю ІМІ білка. Крім того, інші клад, мРНК виділяють із рослинних клітин (наприбіологічно активні частини, в яких делетовано інші клад, шляхом процедури виділення гуанідин тіоціділянки поліпептиду, одержують рекомбінантними анату, описаної в роботі Chirgwin et al., 1979 способами і оцінюють на наявність описаних автоBiochemistry 18:5294-5299), а кДНК одержують, рами однієї або кількох активностей. В оптимальзастосовуючи зворотну транскриптазу (наприклад, ному варіанті біологічно активні частини ІМІ білка Moioney MLV зворотну транскриптазу, яку отримувключають один або кілька консервативних домеють від Gibco/BRL, Bethesda, MD; або AMV зворонів, вибраних з групи, яка складається з Домену А, тну транскриптазу, яку отримують від Seikagaku Домену В, Домену С, Домену D та Домену Е, приAmerica, Inc., St. Petersburg, FL). Синтетичні олігочому консервативний домен містить мутацію. нуклеотидні праймери для ампліфікації полімеразВинахід також забезпечує химерні або злиті ної ланцюгової реакції можуть бути побудовані на ІМІ поліпептиди. Вжитий авторами термін ІМІ "хиоснові нуклеотидної послідовності, показаної в мерний поліпептид" або "злитий поліпептид" охопSEQ ID NO:1. Молекула нуклеїнової кислоти виналює IMI поліпептид, функціонально зв'язаний з неходу може бути ампліфікована з застосуванням ІМІ поліпептидом. Термін "не-ІМІ поліпептид" стокДНК або, в альтернативному варіанті, геномної сується поліпептиду, який має амінокислотну посДНК як матриці та відповідних олігонуклеотидних лідовність, яка не має значної ідентичності ІМІ праймерів згідно зі стандартними способами ампполіпептидові, наприклад, поліпептиду, який не є ліфікації ПЛР. Ампліфіковану таким чином молеІМІ ізоферментом, причому цей пептид виконує кулу нуклеїнової кислоти клонують у відповідний відмінну від ІМІ поліпептиду функцію. По відновектор і характеризують шляхом аналізу послідовшенню до злитого поліпептиду термін "функціонаності ДНК. Крім того, олігонуклеотиди, які відповільно зв'язаний" означає, що ІМІ поліпептид та недають нуклеотидній послідовності ІМІ, можуть бути ІМІ поліпептид є злитими один з одним таким чиодержані стандартними способами синтезу, наном, що обидві послідовності виконують передбаприклад, із застосуванням автоматизованого синчену функцію, характерну для даної послідовності. тезатора ДНК. Не-ІМІ поліпептид може бути злитий з N-кінцем ІМІ нуклеїнові кислоти даного винаходу моабо С-кінцем ІМІ поліпептиду. Наприклад, в одножуть включати послідовності, які кодують ІМІ білок му варіанті втілення злитий поліпептид є GST-IMI (тобто "кодуючі ділянки"), а також 5' нетрансльозлитим поліпептидом, у якому ІМІ послідовність є вані послідовності та 3' нетрансльовані послідовзлитою з С-кінцем GST послідовності. Такі злиті ності. В альтернативному варіанті молекули нуклеполіпептиди можуть сприяти очищенню рекомбіїнових кислот даного винаходу можуть включати нантних ІМІ поліпептидів. В іншому варіанті втілише кодуючі ділянки ІМІ гена, або можуть містити лення злитий поліпептид є ІМІ поліпептидом, який повні геномні фрагменти, виділені з геномної ДНК. містить гетерологічну сигнальну послідовність на Кодуючу ділянку цих послідовностей позначають своєму N-кінці. У деяких клітинах-хазяях (наприяк "ORF-позицію". Крім того, молекула нуклеїнової клад, клітинах-хазяях ссавців) експресія та/або кислоти винаходу може включати частину кодуюсекреція ІМІ поліпептиду може бути посилена зачої ділянки ІМІ гена, наприклад, фрагмент, який вдяки застосуванню гетерологічної сигнальної може бути використаний як зонд або праймер. послідовності. Нуклеотидні послідовності, визначені за клонуванВиділена молекула нуклеїнової кислоти, яка ням ІМІ гена з Т. Мопососсит, дозволяють утворюкодує ІМІ поліпептид, що має послідовність, іденвати зонди та праймери, призначені для застосутичну поліпептидові, який кодується полінуклеотивання в розпізнанні та/або клонуванні ІМІ дною послідовністю SEQ ID NO:1, може бути ствогомологів в інших типах клітин та організмів, а тарена шляхом введення одного або кількох кож ІМІ гомологів з інших пшеничних культур та нуклеотидних заміщень, додавань або делецій у споріднених видів. Частина кодуючої ділянки тануклеотидну послідовність SEQ ID NO:1 таким кож може кодувати біологічно активний фрагмент чином, щоб одне або кілька амінокислотних заміІМІ білка. щень, додавань або делецій були введені в кодоВжитий авторами термін "біологічно активна ваний поліпептид. Мутації вводять у послідовність частина" ІМІ білка охоплює частину, наприклад, SEQ ID NO:1 стандартними способами, такими як домен/мотив ІМІ білка, який у разі вироблення в сайт-специфічний мутагенез та ПЛРрослині підвищує резистентність рослини імідазоопосередкований мутагенез. В оптимальному валінонового гербіциду порівняно з різновидами роріанті консервативні амінокислотні заміщення 17 89016 18 здійснюють в одному або кількох прогнозованих казник "gap extension penalty" 0,1. Усі інші парамезамінних амінокислотних залишках. три встановлено за умовчанням. "Консервативне амінокислотне заміщення" є Слід розуміти, що для визначення ідентичності таким, при якому амінокислотний залишок заміщупослідовності, якщо порівнюють послідовність ДНК ється амінокислотним залишком, який має подібз послідовністю РНК, тимідиновий нуклеотид є ний боковий ланцюг. Спеціалістами було визначееквівалентом урацилового нуклеотиду. В оптимано групи амінокислотних залишків, які мають льному варіанті виділені ІМІ поліпептиди, які охопподібні бокові ланцюги. До цих груп належать амілюються даним винаходом, є принаймні приблизнокислоти з основними боковими ланцюгами (нано на 50-60%, краще - принаймні приблизно на 60приклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бо70%, ще краще - принаймні приблизно на 70-75%, ковими ланцюгами (наприклад, аспарагінова 75-80%, 80-85%, 85-90% або 90-95%, найкраще кислота, глутамінова кислота), незарядженими принаймні приблизно на 96%, 97%, 98%, 99% або полярними боковими ланцюгами (наприклад, глібільше ідентичними повній амінокислотній посліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, довності, кодованій нуклеїновою кислотою, яка цистеїн), неполярними боковими ланцюгами (навключає полінуклеотидну послідовність, показану приклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, в SEQ ID NO:1. В іншому варіанті втілення виділені фенілаланін, метіонін, триптофан), бетаІМІ поліпептиди, які охоплюються даним винахорозгалуженими боковими ланцюгами (наприклад, дом, є принаймні приблизно на 50-60%, краще треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бокопринаймні приблизно на 60-70%, ще краще - привими ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланаймні приблизно на 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85нін, триптофан, гістидин). Таким чином, прогнозо90% або 90-95%, найкраще - принаймні приблизно ваний замінний амінокислотний залишок в ІМІ на 96%, 97%, 98%, 99% або більше ідентичними поліпептиді оптимально заміщується іншим аміноповній амінокислотній послідовності, кодованій кислотним залишком з тієї самої групи бокових нуклеїновою кислотою, яка включає поліпептид, ланцюгів. В альтернативному варіанті втілення показаний у SEQ ID NO:1. мутації вводять випадково по всій ІМІ кодуючій Крім того, можуть бути створені оптимізовані послідовності або її частині, наприклад, шляхом ІМІ нуклеїнові кислоти. В оптимальному варіанті насиченого мутагенезу, і одержані в результаті оптимізована ІМІ нуклеїнова кислота кодує ІМІ мутанти відбирають на наявність описаної автополіпептид, який модулює толерантність рослини рами ІМІ активності для розпізнання мутантів, які до імідазолінонових гербіцидів, ще краще - якщо зберігають ІМІ активність. Після мутагенезу посліпідвищує толерантність рослини до імідазолінонодовності SEQ ID NO:1 кодований поліпептид може вого гербіциду після його переекспресії в рослині. бути експресований рекомбінантно, й активність Вжитий авторами термін "оптимізований" стосуполіпептиду може бути визначена шляхом аналізу ється нуклеїнової кислоти, підданої генній інженерезистентності до імідазолінону в рослини, яка рії для посилення її експресії в даній рослині або експресує поліпептид, як описано нижче у Приклатварині. Для забезпечення оптимізованих для родах. слини ІМІ нуклеїнових кислот послідовність ДНК Для визначення відсотка ідентичності послідогена модифікують, щоб вона 1) включала кодони, вності двох амінокислотних послідовностей посліоптимальні для високоекспресованих рослинних довності суміщують для оптимального порівняння генів; 2) включала А+Т, який практично відповідає (наприклад, у послідовність одного поліпептиду за складом нуклеотидної основи тому, що міститьвставляють розриви для оптимального суміщення ся в рослинах; 3) утворювала ініціюючу послідовз іншим поліпептидом). Після цього порівнюють ність рослини, 4) не містила послідовностей, які амінокислотні залишки у відповідних позиціях амівикликають дестабілізацію, неналежне поліаденінокислот. Якщо позиція в одній послідовності залювання, деградацію та термінацію РНК, або які ймається тим самим амінокислотним залишком, утворюють шпильки вторинної структури або місця що й відповідна позиція в іншій послідовності, то сплайсингу РНК. Посилення експресії ІМІ нуклеїмолекули в цій позиції є ідентичними. Таке саме нових кислот у рослинах досягають шляхом застопорівняння здійснюють між двома послідовностясування частоти розподілу використання кодонів у ми нуклеїнових кислот. Відсоток ідентичності посрослинах взагалі або в конкретній рослині. Спосолідовності між двома послідовностями залежить би оптимізації експресії нуклеїнових кислот у росвід кількості ідентичних позицій, спільних для цих линах описано в ЕРА 0359472; ЕРА 0385962; заяпослідовностей (тобто відсоток ідентичності послівці РСТ № WO 91/16432; патенті США довностей=кількість ідентичних позицій/загальна №5,380,831; патенті США №5,436,391; роботах Perlack et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA кількість позицій 100). З точки зору винаходу від88:3324-3328; і Murray et al., 1989 Nucleic Acids соток ідентичності послідовностей між двома нукRes. 17:477-498. леїновими кислотами або поліпептидними посліВжитий авторами термін "частота переважного довностями визначають, застосовуючи пакет використання кодонів" стосується переваги, яку програм Vector NTI 6.0 (PC) (lnforMax,-7600 віддає конкретна клітина-хазяїн при використанні Wisconsin Ave., Bethesda, MD 20814). Для визнануклеотидних кодонів для визначення даної аміночення відсотка ідентичності двох нуклеїнових кискислоти. Для визначення частоти використання лот виставляють показник "gap opening penalty" 15 конкретного кодону в гені кількість випадків цього і показник "gap extension penalty" 6,66. Для визнакодону в гені ділять на загальну кількість випадків чення відсотка ідентичності двох поліпептидів виусіх кодонів, які вказують на ту саму амінокислоту ставляють показник "gap opening penalty" 10 і пов гені. Так само частота переважного використан 19 89016 20 ня кодонів, яку виявляє клітина-хазяїн, може бути повністю або частково, генові, первинному транскрозрахована через середнє значення частоти периптові або процесованій мРНК, щоб впливати на реважного використання кодонів у великій кількосекспресію ендогенного гена. "Комплементарними" ті генів, експресованих клітиною-хазяїном. В оптиполінуклеотидами є ті, які здатні до спарювання мальному варіанті цей аналіз обмежують генами, основ згідно зі стандартними правилами комплеякі сильно експресуються клітиною-хазяїном. Відментарності Вотсона-Кріка. Зокрема, пурини ствосоток відхилення частоти переважного викорисрюють пари основ з піримідинами для утворення тання кодонів для синтетичного гена від частоти комбінації гуаніну, спареного з цитозином (G:C) та використання клітиною-хазяїном розраховують аденіну, спареного або з тиміном (А:Т) у разі ДНК, спочатку шляхом визначення відсотка відхилення або аденіну, спареного з урацилом (A:U) у разі частоти використання одного кодону від частоти РНК. Слід розуміти, що два полінуклеотиди мовикористання клітиною-хазяїном з наступним одежуть гібридизуватися один з одним, навіть якщо ржанням середнього показника відхилення по всіх вони не є повністю комплементарними один однокодонах. Як визначено авторами, цей розрахунок му, якщо кожен має принаймні одну ділянку, праквключає унікальні кодони (тобто ATG і TGG). Тобтично комплементарну іншій. Термін "антисмислото загальне середнє відхилення використання кова нуклеїнова кислота" охоплює експресійні касети донів оптимізованого гена від показника клітинаодноланцюгової РНК, а також дволанцюгової ДНК, хазяїна розраховують, користуючись рівнянням які можуть бути транскрибовані для утворення 1А=n=1ΖΧn-ΥnΧn разів 100 Ζ, де Хn=частота викоантисмислової РНК. "Активними" антисмисловими ристання для кодону n у клітині-хазяїні; Υn=частота нуклеїновими кислотами є молекули антисмисловикористання для кодону n у синтетичному гені, n вої РНК, здатні селективно гібридизуватися з перпредставляє окремий кодон, який визначає аміновинним транскриптом або мРНК, що кодує поліпекислоту, і загальна кількість кодонів дорівнює Ζ. птид, який має принаймні 80% ідентичність Загальне відхилення частоти використання кодопослідовності з поліпептидом, кодованим нуклеїнів, А, для всіх амінокислот в оптимальному варіановою кислотою, яка включає полінуклеотидну нті становить менше, ніж приблизно 25%, краще послідовність SEQ ID NO:1. менше, ніж приблизно 10%. Крім вищеописаних ІМІ нуклеїнових кислот та Таким чином, ІМІ нуклеїнова кислота може буполіпептидів, даний винахід охоплює ці нуклеїнові ти оптимізована таким чином, щоб її частота розкислоти та поліпептиди, приєднані до компонента. поділу використання кодонів відхилялася в оптиДо цих компонентів, крім інших, належать компомальному варіанті не більше, ніж на 25% від ненти виявлення, компоненти гібридизації, компочастоти високоекспресованих рослинних генів, у ненти очищення, компоненти доставления, компоще кращому варіанті - не більше, ніж приблизно на ненти реакції, компоненти зв'язування та ін. 10%. Крім того, враховують відсотковий вміст G+C Типовою групою нуклеїнових кислот, які мають виродженої третьої основи (однодольні підтримуприєднані компоненти, є зонди та праймери. Зонють G+C у цій позиції, на відміну від дводольних). ди та праймери, як правило; включають практично Визнано також, що XCG (де X є А, Т, С, або G) ізольований олігонуклеотид. Олігонуклеотид, як нуклеотид є найменшим оптимальним кодоном у правило, включає ділянку нуклеотидної послідовдводольних, тоді як ХТА кодону уникають як одноності, яка гібридизується за жорстких умов з придольні, так і дводольні. Оптимізовані ІМІ нуклеїнові наймні приблизно 12, краще - приблизно 25, ще кислоти цього винаходу також бажано мати індеккраще - приблизно 40, 50 або 75 послідовними си уникнення дублетів CG і ТА, наближені до інденуклеотидами смислового ланцюга послідовності, ксів вибраної рослини-хазяїна (тобто Triticum вказаної в SEQ ID NO:1, антисмисловою послідовmonoccocum). Краще, якщо ці індекси відхиляютьністю послідовності, вказаної в SEQ ID NO:1, або ся від індексу хазяїна не більше, ніж приблизно 10їх природними мутантами. Праймери на основі 15%. нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:1 застосоКрім молекул нуклеїнових кислот, які кодують вують у ПЛР для клонування IMI гомологів. Зонди описані вище ІМІ поліпептиди, інший аспект винана основі ІМІ нуклеотидних послідовностей застоходу стосується виділених молекул нуклеїнових совують для виявлення транскриптів або геномних кислот, які є антисмисловими до них. Вважається, послідовностей, які кодують ті ж самі або гомологіщо антисмислові полінуклеотиди інгібують генну чні поліпептиди. В оптимальних варіантах втілення експресію полінуклеотиду-мішені шляхом специзонд також включає приєднану до нього мітку, нафічного зв'язування з полінуклеотидом-мішенню і приклад, мітку, яка може бути радіоізотопом, флувпливу на транскрипцію, сплайсинг, перенесення, оресцентною сполукою, ферментом або кофактотрансляцію та/або стійкість полінуклеотиду-мішені. ром ферменту. Такі зонди застосовують як В існуючому рівні техніки описано способи спрячастину випробувального комплекту геномного мування антисмислового полінуклеотиду на хромаркера для розпізнання клітин, які експресують мосомну ДНК, на первинний транскрипт РНК або ІМІ поліпептид, наприклад, шляхом вимірювання на процесовану мРНК. В оптимальному варіанті рівня ІМІ-кодуючої нуклеїнової кислоти, у зразку ділянки-мішені включають місця сплайсингу, кодоклітин, наприклад, виявлення рівня ІМІ мРНК або ни ініціації трансляції, кодони термінації трансляції визначення, чи був геномний ІМІ ген мутованим чи та інші послідовності в межах відкритої рамки зчивидаленим. тування. Винахід також забезпечує виділений рекомбіТермін "антисмислова" з точки зору винаходу нантний вектор експресії, який включає ІМІ нуклеїстосується нуклеїнової кислоти, яка включає полінову кислоту, як описано вище, причому вектор нуклеотид, який є достатньо комплементарним, експресії у клітині-хазяїні в результаті забезпечує 21 89016 22 підвищену резистентність до імідазолінонового вибір клітини-хазяїна, яка підлягає трансформації, гербіциду порівняно з різновидом клітини-хазяїна рівень експресії потрібного поліпептиду і т. д. Векдикого типу. Вжитий авторами термін "вектор" стотори експресії згідно з винаходом вводять у клітисується молекули нуклеїнової кислоти, здатної ни-хазяї для утворення поліпептидів або пептидів, транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою її включаючи злиті поліпептиди або пептиди, кодобуло з'єднано. Одним типом вектора є "плазміда", вані нуклеїновими кислотами, як описано автораяка означає кільцеву дволанцюгову петлю ДНК, у ми (наприклад, ІМІ поліпептиди, злиті поліпептиди яку можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. і т. д.). Іншим типом вектора є вірусний вектор, у якому В оптимальному варіанті втілення даного видодаткові сегменти ДНК можуть бути ліговані у находу ІМІ поліпептиди експресуються в рослинах вірусний геном. Деякі вектори здатні до самостійта рослинних клітинах, таких як клітини однокліної реплікації у клітині-хазяїні, в яку вони є введетинних рослин (наприклад, водоростей) (див. ними (наприклад, бактеріальні вектори, які мають Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3):239бактеріальне походження реплікації, та епісомні 251, та посилання, що містяться в цій роботі) та вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепіклітини вищих рослин (наприклад, сперматофітів, сомні вектори ссавців) вводять у геном клітинитаких як хлібні злаки). ІМІ полінуклеотид може бути хазяїна після введення у клітину-хазяїн, а отже, "введений" у рослинну клітину будь-яким спосореплікують разом з геномом хазяїна. Крім того, бом, включаючи трансфекцію, трансформацію або деякі вектори здатні спрямовувати експресію генів, трансдукцію, електропорацію, бомбардування часз якими вони є функціонально зв'язаними. Такі тинками, агроінфекцію, біолістику i т. ін. вектори названо авторами "векторами експресії". Відомості про придатні способи трансформації Взагалі, вектори експресії, які застосовують у техабо трансфекції клітин-хазяїв, включаючи рослинні нологіях рекомбінантних ДНК, часто мають форму клітини, можна знайти у Sambrook, et al. (Molecular плазмід. У даному описі терміни "плазміда" та "веCloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring ктор" можуть вживатися поперемінно, оскільки Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory плазміда є найпоширенішою формою вектора. Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) та інших лаОднак винахід охоплює й інші форми векторів ексбораторних посібниках, таких як Methods in пресії, такі як вірусні вектори (наприклад, ретровіMolecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium руси з недостатньою реплікацією, аденовіруси та protocols, ed: Gartland and Davey, Humana Press, аденоасоційовані віруси), які виконують рівноцінні Totowa, New Jersey. Оскільки підвищена резистенфункції. тність до імщазолінонових гербіцидів є загальною Рекомбінантні вектори експресії згідно з винаособливістю, успадкування якої є бажаним для ходом включають нуклеїнову кислоту винаходу у багатьох видів рослин, таких як кукурудза, пшениформі придатної для експресії нуклеїнової кислоти ця, жито, овес, тритикале, рис, ячмінь, соя, арахіс, у клітині-хазяїні, що означає, що рекомбінантні бавовна, рапс та канола, маніхот, перець, соняшвектори експресії включають одну або кілька регуник та чорнобривці, пасльонові рослини, такі як ляторних послідовностей, вибраних на основі клікартопля, тютюн, баклажан та томати, види віки, тин-хазяїв, які мають бути застосовані для експрегорох, люцерна, чагарникові рослини (кава, какао, сії, які є функціонально зв'язаними з чай), види верби, дерева (олійна пальма, кокос), нуклеїновокислотною послідовністю, яка підлягає багаторічні трави та фуражні культури, ці хлібні експресії. По відношенню до рекомбінантного векзлаки також є оптимальними рослинами, які мотора експресії "функціонально зв'язаний" означає, жуть бути об'єктами генної інженерії як ще один що дана нуклеотидна послідовність є зв'язаною з варіант втілення даного винаходу. В оптимальнорегуляторною(ими) послідовністю (послідовностяму варіанті втілення рослиною є пшенична культуми) таким чином, що це дозволяє експресію нукра. До фуражних культур належать, крім інших, леотидної послідовності (наприклад, в in vitro трапирій, Phalaris arundinacea, Bromopsis inermis, дике нскрипційній/трансляційній системі або у клітиніжито, Bluegrass, Dactillis glomerata L., люцерна, хазяїні, коли вектор є введеним у клітину-хазяїн). Salfoin, Lotus corniculatus L., шведська конюшина, Термін "регуляторна послідовність" охоплює прочервона конюшина та буркун. мотори, енхансери та інші елементи контролю В одному варіанті втілення даного винаходу експресії (наприклад, сигнали поліаденілювання). трансфекції ІМІ полінуклеотиду в рослину досягаТакі регуляторні послідовності описано, наприють шляхом Agrobacterium-опосередкованого пеклад, у роботі Goeddel, Gene Expression ренесення гена. Одним з відомих спеціалістам Technology: Methods in Enzymology 185, Academic способів трансформації є занурення рослини під Press, San Diego, CA (1990), або в роботі Gruber час цвітіння в розчин Agrobacteria, в якому and Crosby, Methods in Plant Molecular Biology and Agrobacteria містить ІМІ нуклеїнову кислоту, з наBiotechnology, eds. Glick and Thompson, Chapter 7, ступним розведенням трансформованих гамет. 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, включаючи Agrobacterium-опосередкована трансформацію посилання, які в них містяться. До регуляторних рослин здійснюють, застосовуючи, наприклад, послідовностей належать ті, які спрямовують конGV3101(pMP90) (Koncz and Schell, 1986 Mol. Gen. ститутивну експресію нуклеотидної послідовності в Genet. 204:383-396) або LBA4404 (Clontech) штам багатьох типах клітин-хазяїв, та ті, які спрямовуAgrobacterium tumefaciens. Трансформацію здійсють експресію нуклеотидної послідовності лише в нюють стандартними способами трансформації та деяких клітинах-хазяях або за певних умов. Спецірегенерації (Deblaere et al., 1994 Nucl. Acids. Res. алістам стане зрозуміло, що побудова вектора 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. and Schilperoort, експресії може залежати від таких чинників, як Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2nd Ed. 23 89016 24 Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., гомологічної рекомбінації ендогенним геном. Як Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923правило, вектор включає від кількох сотень пар 2731-4; Glick, Bernard R. and Thompson, John E., основ до тисяч основ фланкуючих ДНК (як на 5', Methods in Plant Molecular Biology and так і на 3' кінцях) (див., наприклад, Thomas, К. R., Biotechnology, Boca Raton : CRC Press, 1993 360 and Capecchi, Μ. R., 1987 Cell 51:503, де описано S., ISBN 0-8493-5164-2). Наприклад, рапс трансвектори гомологічної рекомбінації, або Strepp et формують шляхом трансформації сім'ядолі або al., 1998 PNAS, 95(8):4368-4373, де описано рекогіпокотиля (Moloney et al., 1989 Plant cell Report мбінацію на основі кДНК у Physcomitrella patens). 8:238-242; De Block et al., 1989 Plant Physiol. Однак, оскільки ІМІ ген зазвичай відрізняється від 91:694-701). Застосування антибіотиків для вибору гена AHAS у дуже небагатьох амінокислотах, у Agrobacterium та рослини залежить від бінарного фланкуючій послідовності не завжди є необхідвектора та штаму Agrobacterium, який застосовуність. Вектор гомологічної рекомбінації вводять у ють для трансформації. Вибір рапсу зазвичай мікроорганізм або рослинну клітину (наприклад, здійснюють, застосовуючи канаміцин як маркер через поліетиленгліколь-опосередковану ДНК) і для селекції рослин. Agrobacteriumвідбирають клітини, в яких введений ІМІ ген було опосередковане перенесення генів у льон здійсгомологічно рекомбіновано ендогенним геном нюють, застосовуючи, наприклад, спосіб, описаний AHAS, застосовуючи відомі спеціалістам способи. у роботі Mlynarova et al., 1994 Plant Cell Report В іншому варіанті втілення одержують реком13:282-285. Крім того, трансформацію сої здійсбінантні мікроорганізми, які містять вибрані систенюють, застосовуючи, наприклад, спосіб, описаний ми, що дозволяють здійснювати регульовану ексу європейському патенті №0424047, патенті США пресію введеного гена. Наприклад, включення ІМІ №5,322,783, європейському патенті №0397 687, гена у вектор з поміщенням його під контроль Іаспатенті США №5,376,543 або патенті США оперона дозволяє експресію ІМІ гена лише у при№5,169,770. Трансформації кукурудзи досягають сутності IPTG. Такі регуляторні системи добре шляхом бомбардування частинками, опосередковідомі спеціалістам. ваного поліетиленгліколем поглинання ДНК або за Чи є він присутнім у позахромосомному невіддопомогою волокон карбіду кремнію. (Див., напритворюваному векторі, чи у векторі, введеному у клад, Freeling and Walbot "The maize handbook" хромосому, ІМІ полінуклеотид в оптимальному Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826варіанті містяться в експресійній касеті рослини. 7). Конкретний приклад трансформації кукурудзи Експресійна касета рослини в оптимальному варіміститься в патенті США №5,990,387, а конкретний анті містить регуляторні послідовності, здатні виприклад трансформації пшениці міститься в заявці кликати експресію гена в рослинних клітинах, які є РСТ № WO 93/07256. функціонально зв'язаними таким чином, що кожна Згідно з даним винаходом, введений ІМІ поліпослідовність може виконувати свою функцію, нануклеотид може стійко утримуватись у рослинній приклад, термінацію транскрипції сигналами поліклітині, якщо його введено в нехромосомний автоаденілювання. Оптимальними сигналами поліаденомний реплікон або введено у хромосоми рослин. нілювання є ті, що походять із т-ДНК Agrobacterium В альтернативному варіанті введений ІМІ полінукtumefaciens, такі як ген 3, відомий як октопін синлеотид може бути присутній на позахромосомному таза Ті-плазміди pTiACHS (Gielen et al., 1984 невідтворюваному векторі і може бути короткочасEMBO J. 3:835) або їх функціональні еквіваленти, но експресованим або короткочасно активним. В але придатними є також усі інші термінатори, фунодному варіанті втілення може бути створений кціонально активні в рослинах. Оскільки експресія гомологічний рекомбінантний мікроорганізм, у рослинних генів дуже часто не обмежується на якому ІМІ полінуклеотид є введеним у хромосому, транскрипційних рівнях, експресійна касета рослистворюється вектор, який містить принаймні часни в оптимальному варіанті містить інші функціотину гена AHAS, у який введено делецію, доданально зв'язані послідовності, такі як перехідні вання або заміщення для того, щоб змінити, наенхансери, наприклад, надлишкова послідовність приклад, функціонально розірвати, ендогенний ген (overdrive-sequence), яка містить 5'AHAS і створити ІМІ ген. Для створення точкової нетрансльовану лідерну послідовність вірусу тюмутації через гомологічну рекомбінацію, використюнової мозаїки, що збільшує пропорцію поліпептовують ДНК-РНК гібриди, застосовуючи спосіб, тиду в РНК (Gallie et al., 1987 Nucl. Acids Research відомий як химерапластія (Cole-Strauss et al., 1999 15:8693-8711). Прикладами рослинних векторів Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 and Kmiec, експресії можуть бути ті, які детально описано в 1999 Gene Therapy American Scientist 87(3):240роботах Becker, D. et al., 1992 New plant binary 247). Спеціалістам також добре відомі інші процеvectors with selectable markers located proximal to дури гомологічної рекомбінації у виді Triticum, моthe left border, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; Bevan, жливість застосування яких авторами передбачаM.W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant ється. transformation, Nucl. Acid Res. 12:8711-8721; and У векторі гомологічної рекомбінації до ІМІ гена Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: на його 5' та 3' кінцях може приєднуватися додатTransgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, кова молекула нуклеїнової кислоти гена AHAS, що eds.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15дозволяє здійснення гомологічної рекомбінації між 38. екзогенним ІМІ геном, що міститься у векторі, та Експресія рослинного гена має бути функціоендогенним геном AHAS у мікроорганізмі або роснально пов'язана з відповідним промотором, який лині. Додаткова молекула фланкуючої нуклеїнової забезпечує вчасну, клітино- або тканиноспецифічкислоти AHAS має достатню довжину для успішної ну експресію гена. До промоторів, застосовуваних 25 89016 26 у експресійних касетах згідно з винаходом, може тори в оптимальному варіанті експресуються під належати будь-який промотор, здатний ініціювати час розвитку насіння або проростання. Наприклад, транскрипцію в рослинній клітині. До таких промоспецифічні до насіння промотори можуть бути торів належать, крім інших, ті, які можуть бути специфічними до ембріонів, специфічними до енодержані з рослин, рослинних вірусів та бактерій, досперму та специфічними до оболонки насіння. які містять гени, що експресуються в рослинах, Див. Thompson et al., 1989 BioEssays 10:108. Притаких як Agrobacterium та Rhizobium. кладами специфічних до насіння промоторів є, Промотор може бути конститутивним, індуцикрім інших, целюлоза-синтаза (сеІА), Cim1, гаммабельним, специфічним до стадії розвитку, специзеїн, глобулін-1, зеїн кукурудзи 19kD (cZ19BI)Ta фічним до типу клітин, тканиноспецифічним або інші. органоспецифічним. Конститутивні промотори є До інших придатних тканиноспецифічних або активними за більшості умов. Прикладами констиорганоспецифічних промоторів належать промотутивних промоторів є CaMV 19S та 35S промототор напін-гена з рапсу (Патент США №5,608,152), ри (Odell et al. 1985 Nature 313:810-812), sX CaMV USP-промотор із Vicia faba (Baeumlein et al., 1991 35S промотор (Kay et al. 1987 Science 236:1299Mol. Gen Genet. 225(3):459-67), олеозин-промотор 1302), Sep1 промотор, промотор актину рису із Arabidopsis (Заявка РСТ № WO 98/45461), фа(МсElroy et al. 1990 Plant Cell 2:163-171), промотор зеолін-промотор із Phaseolus vulgaris (Патент США актину Arabidopsis, промотор убіхітану (Christensen №5,504,200), Все4-промотор із Brassica (Заявка et al. 1989 Plant Molec. Biol. 18:675-689); pEmu РСТ № WO 91/13980) або легумін В4 промотор (Last et al. 1991 Theor. Appl. Genet. 81:581-588), (LeB4; Baeumlein et al., 1992 Plant Journal, 2(2):23335S промотор вірусу мозаїки ранника, Smas про9), а також промотори, які забезпечують специфічмотор (Velten et al. 1984 EMBO J. 3:2723-2730), ну до насіння експресію в однодольних рослинах, GRP1-8 промотор, промотор дегідрогенази цинатаких як кукурудза, ячмінь, пшениця, жито, рис і т. мілового спирту (Патент США №5,683,439), прод. Придатними промоторами є промотор 1pt2 або мотори з Т-ДНК Agrobacterium, такі як манопін синIpt1-гена з ячменю (Заявка PCX № WO 95/15389 та таза, нопалін синтаза та октопін синтаза, промотор Заявка PCX № WO 95/23230) або описані в заявці малої субодиниці рибулоза біфосфат карбоксилаPCX № WO 99/16890 (промотори з гордеїн-гена зи (ssuRUBISCO) промотор та ін. ячменю, глютелін-гена рису, оризин-гена рису, Індуцибельні промотори є активними за певпроламін-гена рису, гліадин-гена пшениці, глютених навколишніх умов, таких як наявність або віднін-гена пшениці, глютенін-гена вівса, касиринсутність поживної речовини або метаболіту, тепло гена сорго та секалін-гена жита). або холод, світло, напад патогенів, анаеробні умоДо інших промоторів, які застосовують у ексви та ін. Наприклад, hsp80 промотор із Brassica пресійних касетах винаходу, належать, крім інших, індукується термічним ударом, PPDK промотор головний промотор a/b-зв'язувального білка хлоіндукується світлом, PR-1 промотор з тютюну, рофілу, промотори гістону, Ар3 промотор, промоArabidopsis та кукурудзи індукуються інфекцією тор -конгліцину, промотор напіну, промотор соєвопатогену, a Adh1 промотор індукується гіпоксією та го лектину, промотор зеїну кукурудзи 15kD, впливом холоду. Експресії рослинного гена також промотор зеїну 22kD, промотор зеїну 27kD, промоможе сприяти індуцибельний промотор (див. Gatz, тор g-зеїну, промотори waxy, shrunken 1, shrunken 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:892 та bronze, Zml3 промотор (Патент США 108). Хімічно індуцибельні промотори є особливо №5,086,169), промотори полігалактуронази кукупридатними, якщо потрібна специфічна до часу рудзи (PG) (Патенти США №№ 5,412,085 та експресія гена. Прикладами таких промоторів є 5,545,546) і SGB6 промотор (Патент США індукований саліциловою кислотою промотор (За№5,470,359), а також синтетичні або інші природні явка РСТ № WO 95/19443), індукований тетрацикпромотори. ліном промотор (Gatz et al., 1992 Plant J. 2:397Додаткової гнучкості в контролюванні експресії 404) та індукований етанолом промотор (Заявка гетерологічного гена в рослинах досягають шляРСТ № WO 93/21334). хом застосування доменів зв'язування ДНК та Специфічні до стадії розвитку промотори в опелементів відповіді з гетерологічних джерел (тобто тимальному варіанті експресуються на певних доменів зв'язування ДНК з нерослинних джерел). стадіях розвитку. До тканино- та органоспецифічПрикладом такого гетерологічного домену зв'язуних промоторів належать ті, які в оптимальному вання є домен зв'язування ДНК LexA (Brent and варіанті експресуються в певних тканинах або орPtashne, 1985 Cell 43:729-736). ганах, таких як листя, коріння, насіння або ксилеІнший аспект винаходу стосується клітинма. Прикладами тканиноспецифічних та органосхазяїв, у які було введено рекомбінантний вектор пецифічних промоторів є, крім інших, специфічні експресії згідно з винаходом. Терміни "клітинадо плодів, специфічні до насінних зачатків, специхазяїн" та "рекомбінантна клітина-хазяїн" вживафічні до чоловічих тканин, специфічні до насіння, ються авторами поперемінно. Слід розуміти, що специфічні до шкірки, специфічні до бульб, спетакі терміни стосуються не лише конкретної клітицифічні до· стебел, специфічні до оплодня та спени, але вони також стосуються потомства або моцифічні до листя, специфічні до приймочок, спежливого потомства такої клітини. Оскільки в нацифічні до пилку, специфічні до пиляка, ступних поколіннях можуть траплятися певні зміни специфічні до пелюсток, специфічні до чашолистчерез мутації або вплив навколишнього середока, специфічні до квітконіжки, специфічні до стручвища, таке потомство фактично не може бути ідека, специфічні до суплідь, специфічні до коріння нтичним батьківській клітині, але все одно охоппромотори та інші. Специфічні до насіння промолюється вжитим авторами терміном. Клітина 27 89016 28 хазяїн може бути будь-якою прокаріотною або еуше, ніж приблизно 10% хімічних попередників або каріотною клітиною. Наприклад, ІМІ полінуклеотид відмінних від ІМІ хімічних речовин, найкраще - меможе бути експресований у бактеріальних клітинше, ніж приблизно 5% хімічних попередників або нах, таких як С glutamicum, клітини комах, грибкові відмінних від ІМІ хімічних речовин. В оптимальних клітини або· клітини ссавців (такі як клітини яєчниваріантах втілення виділені поліпептиди або їх ка китайського хом'яка (СНО) або клітини COS), біологічно активні частини не містять забруднююводорості, війчасті, рослинні клітини, грибки або чих поліпептидів з того організму, з якого походить інші мікроорганізми, такі як С glutamicum. Інші приІМІ поліпептид. Як правило, такі поліпептиди одедатні клітини-хазяї є відомими спеціалістам. ржують шляхом рекомбінантної експресії, наприКлітину-хазяїн згідно з винаходом, таку як проклад, ІМІ поліпептиду Triticum monococcum у роскаріотна або еукаріотна клітина-хазяїн у культурі, линах, які не є Triticum monococcum, або використовують для вироблення (тобто експресії) мікроорганізмах, таких як С glutamicum, війчасті, ІМІ полінуклеотиду. Відповідно, винахід також заводорості або грибки. безпечує способи вироблення ІМІ поліпептидів з Послідовності ІМІ полінуклеотиду та поліпепвикористанням клітин-хазяїв згідно з винаходом. В тиду згідно з винаходом мають різне застосування. одному варіанті втілення спосіб включає культивуНуклеїновокислотні та амінокислотні послідовності вання клітини-хазяїна згідно з винаходом (у яку даного винаходу застосовують для трансформації було введено рекомбінантний вектор експресії, рослин, таким чином, модулюючи резистентність який кодує ІМІ поліпептид, або в геном якої було рослин до імідазолінонових гербіцидів. Відповідно, введено ген, який кодує поліпептид дикого типу винахід забезпечує спосіб одержання трансгенної або ІМІ поліпептид) у придатному середовищі до рослини, яка має підвищену толерантність до імівироблення ІМІ поліпептиду. В іншому варіанті дазолінонового гербіциду, включаючи (а) трансвтілення спосіб також включає виділення ІМІ поліформацію рослинної клітини одним або кількома пептидів із середовища або клітини-хазяїна. Інший векторами експресії, які включають одну або кільаспект винаходу стосується виділених ІМІ поліпепка ІМІ нуклеїнових кислот, і (б) вирощування з ротидів та їх біологічно активних частин. "Виділений" слинної клітини трансгенної рослини з підвищеною або "очищений" поліпептид або його біологічно резистентністю до імідазолінонового гербіциду активна частина є вільними від деякого клітинного порівняно з сортом рослини дикого типу. В одному матеріалу, якщо одержуються способами рекомбіваріанті втілення множинні ІМІ нуклеїнові кислоти нантних ДНК, або хімічних попередників або інших походять із різних геномів. Даний винахід також хімічних речовин, якщо хімічно синтезуються. Виохоплює способи одержання трансгенної рослини, раз "практично вільний від клітинного матеріалу" яка має підвищену толерантність до імідазоліноохоплює препарати ІМІ поліпептиду, в яких полінового гербіциду, включаючи (а) трансформацію пептид є відокремленим від деяких із клітинних рослинної клітини вектором експресії, який вклюкомпонентів клітин, у яких він природним або речає ІМІ нуклеїнову кислоту, причому нуклеїнова комбінантним шляхом виробляється. В одному кислота не є Imi1 нуклеїновою кислотою, і (б) виваріанті втілення вираз "практично вільний від рощування з рослинної клітини трансгенної росликлітинного матеріалу" охоплює препарати ІМІ пони з підвищеною резистентністю до імідазоліноноліпептиду, що мають менше, ніж приблизно 30% вого гербіциду порівняно з сортом рослини дикого (сухої маси) відмінного від ІМІ матеріалу (який татипу. кож вказується авторами як "забруднюючий поліДаний винахід включає способи зміни толерапептид"), краще - менше, ніж приблизно 20% віднтності рослини до імідазолінонового гербіциду, мінного від ІМІ матеріалу, ще краще - менше, ніж які включають зміну експресії однієї або кількох ІМІ приблизно 10% відмінного від ІМІ матеріалу, найнуклеїнових кислот. В оптимальному варіанті нуккраще - менше, ніж приблизно 5% відмінного від леїнові кислоти містяться в різних геномах або ІМІ матеріалу. походять із різних геномів. Резистентність рослини Якщо ІМІ поліпептид або його біологічно актидо імідазолінонового гербіциду може бути підвивна частина виробляється рекомбінантно, вони щена або знижена, що досягається посиленням також в оптимальному варіанті є практично вільабо послабленням експресії ІМІ полінуклеотиду, ними від культурального середовища, тобто кульвідповідно. В оптимальному варіанті резистенттуральне середовище складає менше, ніж приблиність рослини до імідазолінонового гербіциду підзно 20%, краще - менше, ніж приблизно 10%, вищують шляхом посилення експресії ІМІ полінукнайкраще - менше, ніж приблизно 5% об'єму прелеотиду. Експресія ІМІ полінуклеотиду може парату поліпептиду. Вираз "практично вільний від змінюватися будь-якими відомими спеціалістам хімічних попередників або інших хімічних речовин" способами. Застосовують способи посилення ексохоплює препарати ІМІ поліпептиду, в яких поліпресії ІМІ полінуклеотидів, у яких рослина є або пептид є відокремленим від хімічних попередників трансгенною, або нетрансгенною. У випадках, коабо інших хімічних речовин, які беруть участь у ли рослина є трансгенною, рослина може бути синтезі поліпептиду. В одному варіанті втілення трансформована вектором, який містить будь-яку вираз "практично вільний від хімічних попередниз вищеописаних ІМІ кодуючих нуклеїнових кислот, ків або інших хімічних речовин" охоплює препараабо ж, рослина може бути трансформована проти ІМІ поліпептиду, що мають менше, ніж приблизмотором, який спрямовує експресію ендогенних но 30% (сухої маси) хімічних попередників або ІМІ полінуклеотидів у рослині. Винахід передбавідмінних від ІМІ хімічних речовин, краще - менше, чає, що такий промотор може бути тканиноспециніж приблизно 20% хімічних попередників або відфічним або регульованим розвитком. В альтернамінних від ІМІ хімічних речовин, ще краще - ментивному варіанті нетрансгенні рослини можуть 29 89016 30 мати експресію ендогенного ІМІ полінуклеотиду, ти" нанесення імідазолінонового гербіциду ознаяка змінюється включенням природного промоточає, що рослина не знищується або не зазнає ра. Експресія полінуклеотидів, які включають SEQ ураження від такого нанесення. ID NO:1 у заданих рослинах може здійснюватися, Крім того, авторами пропонується спосіб конткрім іншого, за допомогою: (а) конститутивного ролю над бур'янами в оточенні пшеничної культупромотора, (б) хімічно індукованого промотора та ри, який включає нанесення імідазолінонового (в) переекспресії підданого інженерії промотора, гербіциду на бур'яни та пшеничну культуру, принаприклад, похідними від цинкових пальців факточому пшенична культура має підвищену резистенрами транскрипції (Greisman and Pabo, 1997 тність до імідазолінонового гербіциду порівняно з Science 275:657). сортом пшеничної культури дикого типу, і рослина В оптимальному варіанті втілення транскрипмістить одну або кілька ІМІ нуклеїнових кислот. В цію ІМІ полінуклеотиду модулюють, застосовуючи одному варіанті втілення рослина містить множинпохідні від цинкових пальців фактори транскрипції ні ІМІ нуклеїнові кислоти, які містяться в різних (ZFP), які описано у Greisman and Pabo, 1997 геномах або походять із різних геномів. В іншому Science 275:657, і які виробляються Sangamo варіанті втілення рослина містить відмінну від Іmi1 Biosciences, inc. Ці ZFP включають як домен розпінуклеїнову кислоту. Завдяки забезпеченню пшезнання ДНК, так і функціональний домен, який ничних культур з підвищеною резистентністю до викликає активацію або пригнічення заданої нуклеімідазолінону, існує широкий вибір придатних до їнової кислоти, такої як ІМІ нуклеїнова кислота. застосування композицій для захисту пшеничних Отже, створюють активуючі і пригнічувальні ZFP, культур від бур'янів з метою активізації росту росякі специфічно розпізнають промотори ІМІ полінулин та зниження конкурентної боротьби за поживні клеотиду, які було описано вище і які застосовують речовини. Імідазоліноновий гербіцид застосовують для посилення або послаблення експресії ІМІ поокремо для досходового, післясходового, передлінуклеотиду в рослині, таким чином, модулюючи посівного та посівного контролю над бур'янами на резистентність рослини до гербіцидів. площах, які оточують описані авторами пшеничні Як було детальніше описано вище, рослини, культури, або ж застосовують композицію імідазоякі одержують способами даного винаходу, молінонового гербіциду, яка містить інші додатки. жуть бути однодольними або дводольними. РосІмідазоліноновий гербіцид також застосовують для лини вибирають, наприклад, з-поміж кукурудзи, обробки насіння. До додатків, які містяться в компшениці, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сої, позиції імідазолінонового гербіциду, належать інші арахісу, бавовни, рапсу, каноли, маніхоту, перцю, гербіциди, детергенти, ад'юванти, засоби розсіюсоняшника, чорнобривців, пасльонових рослин, вання, засоби прилипання, стабілізатори або інші картоплі, тютюну, баклажану, томатів, видів віки, подібні агенти. Композиція імідазолінонового герлюцерни, кави, какао, чаю, видів верби, олійної біциду може бути рідкою або сухою композицією і пальми, кокоса, багаторічних трав та фуражних може включати, крім іншого, сипкі порошки, емулькультур, В оптимальному варіанті втілення рослиговані концентрати та рідкі концентрати. Імідазоліною є пшенична культура До фуражних культур ноновий гербіцид та гербіцидні композиції наноналежать, крім інших, пирій, Phalaris arunclinacea, сять традиційними способами, наприклад, шляхом Bromopsis inermis, дике жито, Bluegrass, Dactillis розпилення, поливання, зрошування або іншими glomerata L., люцерна, Salfoin, Lotus comiculatus L., подібними способами. шведська конюшина, червона конюшина та буркун. У заявці містяться посилання на різні публікаВ оптимальному варіанті втілення рослиною є ції. Описи всіх цих публікацій та посилання, навепшенична культура. У кожному з вищеописаних дені в цих публікаціях у їх повному обсязі, включеспособів рослинна клітина включає, крім іншого, но авторами шляхом посилання в цю заявку для протопласт, гаметопродукуючу клітину та клітину, більш повного опису рівня техніки, якого стосуєтьяка регенерується в цілу рослину. Вжитий авторася цей винахід. ми термін "трансгенний" стосується будь-якої росСлід також розуміти, що вищенаведене стосулини, рослинної клітини, калюсу, рослинної тканиється оптимальних варіантів втілення даного вини або частини рослини, що містить, повністю або находу, і що існує можливість внесення численних частково, принаймні один рекомбінантний полінукзмін без відхилення від обсягу винаходу. Винахід леотид. У багатьох випадках рекомбінантний полідалі пояснюється на представлених нижче прикнуклеотид, частково або повністю, є стабільно ладах, які не повинні розглядатись як такі, що якивключеним у хромосому або стійкий позахромосомось чином обмежують його обсяг. Навпаки, слід мний елемент таким чином, що він передається чітко розуміти, що існує можливість звернення до наступним поколінням. різних інших варіантів його втілення, модифікацій Як описано вище, даний винахід пропонує та еквівалентів, які, по ознайомленню з представкомпозиції та способи підвищення резистентності леним описом, стануть зрозумілими спеціалістам до імідазолінону у пшеничної культури або насіння без відхилення від сутності даного винаходу порівняно з різновидами рослини або насінням та/або обсягу формули винаходу, що додається. дикого типу. В оптимальному варіанті втілення Приклади резистентність до імідазолінону у пшеничної кульПриклад 1 тури або насіння підвищується таким чином, що Мутагенез та відбір резистентних ліній пшенирослина або насіння може витримувати нанесення ці імідазолінонового гербіциду в кількості приблизно Приблизно 15000 зерен ярової пшениці -1 -1 10-400г аі/га , краще - 20-160г аі/га , найкраще Triticum monococcum з партії "ТМ23" обробляли 40-80г аі/га-1. Вжитий авторами термін "витримуваEMS. Застосовували такі способи: (1) попереднє 31 89016 32 вимочування у воді протягом чотирьох годин, (2) monococcum до Т. turgidum. У кожному поколінні обробка 0,3% EMS протягом 16 годин, (3) промирослини обробляли імазамоксом при нормі привання у воді протягом 8 годин, (4) висушування на наймні 20г/га перед відбором рослин як батьківсьповітрі протягом чотирьох годин і (5) висівання ких. Проміжне перетворення Т. aestivum з родовонасіння. Певну частину зібраного насіння розмнодом "Crocus*2/EM2//CDC Teal/3/2*АС Superb", жували далі без відбору на толерантність до імідатолерантне до імазамоксу, схрещували з твердою золінонових гербіцидів. Зібране насіння висівали і лінією AC Avonlea. Одержані в результаті рослини обробляли 40г/га імазамоксу. Загалом висівали F1 змішували для одержання популяції F2, з якої 120кг насіння, в результаті чого обробляли 2,4 52/390 рослин були визнані резистентними (без мільйона рослин, припускаючи, що маса зернини уражень від нанесення гербіциду). Деякі з них вистановила 35мг, і схожість складала 70%. Відбикористовували як жіночі рослини i схрещували з рали насіння поколінь від М2 до М5, причому 72% AC Avonlea. Одержані в результаті рослини BC1F1 насіння належало до покоління не нижче М3. П'ять знову схрещували з AC Avonlea. Для наступних рослин визнавали толерантними, позначаючи їх двох поколінь AC Avonlea використовували як жівід ЕМ1 до ЕМ5, і переносили до оранжереї для ночу рослину. Одержану в результаті лінію познавироблення насіння. ЕМ2 розмножували з відбочали OODIMI#17, i вона мала такий родовід: АС ром на толерантність до імідазолінонового гербіAvonlea*2/3/Crocus*2/EM2//CDC Teal/3/2*AC циду перед початковими польовими випробуванSuperb //3*AC Avonlea. Цю лінію змішували з F2 і нями (Приклад 4). рослини F2 обробляли 40г/га імазамоксу. З резисПриклад 2 тентних рослин F2 одержували покоління F4. Усі Перенесення ЕМ2 із диплоїдної Triticum випробувані рослини 53 F4 витримали нанесення monococcum до гексаплоїдної м'якої Т. aestivum, а 80г/га імазамоксу. По лініях F4:5 чутливих рослин потім до тетраплоїдної твердої Т. turgidum не виявляли зі 124 рослин, оброблених 80г/га імаЕМІМІ є позначенням для вихідної рослини Т. замоксу, що вказувало на стійке включення ЕМ2 monococcum EM2. Crocus є позначенням для вихігена у тверду основу. дної рослини м'якого сорту Т. aestivum. 605 квіток Приклад 3 crocus запилювали пилком ЕМІМІ, в результаті Результати стосовно успадкування IМІ генів та чого одержували насіння 84 F1. 38 409 квіток росалельного взаємозв'язку між ІМІ генами лин F1 запилювали, використовуючи пилок Crocus, Далі в обговоренні норма внесення імідазоліу результаті чого одержували 2 зародки, які забинонового гербіциду імазамокс, яку застосовували рали з рослини. Одержані в результаті рослини при дослідженні успадкування, становила 20 граBC1F1 змішували з BC1F2 і обробляли 20г/га імазамів на гектар. Ця норма була достатньою для моксу. З оброблених таким чином 24 рослин 11 знищення чутливих пшеничних культур. Включебули повністю резистентними, 7 мали певні ураний батьківський матеріал показано на Фігурі 4. ження, і 6 були уразливими. Резистентні рослини Під час процесу інтрогресії ЕМ2 ген виділяли схрещували з хлібним сортом пшениці Teal, який як можливий єдиний частково домінантний ген. являв собою 3-ю порцію хлібної пшениці. Рослини Рослина Triticum monococcum, від якої походила одержаної в результаті лінії з родоводом мутація ЕМ2, є диплоїдною пшеницею, що містить Crocus*2/EMIMI//CDC Teal/3/ схрещували з AC Elsa лише А геном. Гексаплоїдна пшениця має А геном, або AC Superb і присвоювали їм коди, відповідно, а також В та D геном. Якщо припустити, що під час 98РН8 (гібрид Elsa) та 98РН9 (гібрид Superb). інтрогресії ЕМ2 ген включався гомологічно в А 98PH8 схрещували ще шість разів з AC Elsa, і геном гексаплоїдної пшениці, як слід було очікува98РН8 схрещували ще шість разів з AC Superb. Дві ти, то мутація ЕМ2 у вищеописаних батьківських популяції кодували таким чином: матеріалах "EΜ2" та "EM2FS4" має відбуватися в А геномі. Нижче в таблиці представлено дані сегР00.35=98PH8/6*Elsa=Crocus*2/EM2//CDC регації F2, які допомагають пояснити алельний Teal/3/7*AC Elsa взаємозв'язок між різними мутантами. Жоден баР00.45=98PH9/6*Superb=Crocus*2/EM2//CDC тьківський матеріал, за винятком чутливої лінії Teal/3/7*AC Superb Teal, не мав чутливих рослин при обробці імазамоксом; отже, ці дані не показано. Сегрегація одержаних шляхом зворотного Відсутність сегрегації в поколінні F2 вказує, що схрещування рослин в обох популяціях відповідабатьківські лінії мають принаймні одну спільну ла очікуваній 1:1 толерантній:чутливій моногенній алель у певному локусі. Показники сегрегації F2 моделі при обробці з застосуванням 20г/га імаза3:1, 15:1 та 63:1 вказують, відповідно, на один, два моксу. Як і очікувалося при цій нормі та єдиному та три незалежні локуси. Сегрегація 15А при гетерозиготному гені толерантності на основі хлібсхрещуванні з чутливою лінією Teal вказувала на ної пшениці, рослини, визначені як толерантні, участь двох незалежних локусів у толерантності витримали певне ураження. Від кожного запилендо імазамоксу (Фігура 5, Рядок 2). ЕМ2 міститься ня одержували здвоєні гаплоїди, застосовуючи не в тому локусі, що FS4 (Фігура 5, Рядок 7). ЕМ2 спосіб запилення кукурудзи. Сім резистентних DHмає спільний локус із 15А (Фігура 5, Рядок 3). FS4 ліній одержували від Р00.35 і 78 резистентних DHмає спільний локус із 15А (Фігура 5, Рядок 4). Баліній одержували від Р00.45. У тих, які використотьківський EM2+FS4, схрещений з 15А, також не вували в подальшій роботі, виявляли розвиток сегрегувався у F2 (Фігура 5, Рядок 5). FS4, очевидзигот, толерантних до гербіциду. но, міститься в D геномі (Jim Anderson, особисте Т. aestivum використовували як проміжного хаповідомлення). ЕМ2 має бути в А геномі. Отже, зяїна для перенесення ЕМ2 гена від Т. два локуси, пов'язані з толерантністю до імазамок 33 89016 34 су в 15А, мають бути в А та D геномах. Батьківсьнювали на толерантність до 80г/га імазамоксу, усі кий 11А при схрещуванні з чутливою лінією Teal рослини були толерантними, тоді як усі рослини сегрегувався як єдиний локус (Фігура 5, Рядок 1). чутливої твердої лінії, яку брали за контроль, гиВін був незалежним від локусу толерантності в нули, що вказувало на те, що ЕМ2 надає толеранЕМ2 (Фігура 5, Рядок 6) та FS4 (Фігура 5, Рядок 9). тності до Imi класу гербіцидів для твердої пшениці. Як слід було очікувати від відсутності сегрегації Похідна від здвоєного гаплоїда лінія Р00.45, яка ЕМ2 та FS4 з 15А, 11А був також незалежним від складалася з ЕМ2 на гексаплоїдній основі, була локусів у 15А (Фігура 5, Рядок 10) та батьківському толерантною до 20г/га імазамоксу як батьківський EM2+FS4 (Фігура 5, Рядок 8). Якщо припустити, що контроль у дослідженні алелізму, описаному у гени AHAS перебувають у гомологічному наборі в Прикладі 3; усі рослини чутливого гексаплоїдного гексаплоїдній пшениці, існує лише три експресоконтролю при цій нормі загинули. вані гени AHAS, і кожен з експресованих генів пеБуло продемонстровано, що комбінація більш, ребуває у своєму геномі, то 11А має перебувати в ніж одного генів Imi-толерантності підвищує толеВ геномі. рантність пшениці до імідазолінонових гербіцидів. Приклад 4 Чотири генотипи було випробувано на толерантТолерантність до ІМІ гербіцидів, яка забезпеність до двох різних норм імазамоксу. До генотипів чується ЕМ2 в Einkorn, твердій та гексаплоїдній належали лише FS4 лінія, BW755; Teal 15A, опипшениці, та підвищена толерантність при комбінусана вище як така, що має два незалежні локуси ванні з іншими неалельними генами толерантності толерантності до Imi-гербіцидів; похідна від здвоєЛінію ЕМ2, толерантну до імазамоксу (Прикного гаплоїда лінія EM2+FS4 та лінія, що походить лад 1), оцінювали, вирощуючи на одному полі, на від схрещування 15А та 11А, одержання через різні агрономічні характеристики, на які може традиційний масовий відбір найбільш толерантних впливати ураження гербіцидами. Дані за три роки рослин через послідовні покоління при зростаючих оцінки показано на Фігурі 6. Дані за 1998р. є серенормах імазамоксу. Норми імазамоксу становили дніми для двох реплікацій. Дані по зрожаях 1999 200 та 600 грамів на гектар. Ураження проростків та 2000pp. Є середніми для чотирьох реплікацій. від 18 до 25 рослин за одну обробку на генотип Інші дані за 1999p. є середніми для двох реплікаоцінювали на порослинній основі, застосовуючи цій. Контроль Einkorn був чутливим до 40 грамів категорії від загибелі до відсутності ураження. Дані імазамоксу, усі рослини загинули. Мутація ЕМ2 на зведено на Фігурі 8. основі Einkorn забезпечила відмінну толерантність При будь-якій нормі жодна рослина не загинупри нормі 40г/га. ла. Моногенна лінія, BW755, яка містила FS4, заЛінію ЕМ2 оцінювали на загальне ураження знавала ураження при обох нормах. Попереднє культури при трьох нормах імазамоксу, який нанодослідження показало, що 11А та FS4 забезпечусили тричі за сезон. Ці дані представлено на Фігурі ють однакову толерантність для хлібної пшениці. 7. У 1999р. спочатку спостерігали лише легкі ураДві двогенні лінії, Teal 15A та EM2/FS4, реагували ження, і симптоми поступово зникли протягом сеоднаково. Ураження не спостерігали при нижчій зону. У 2000р. ураження не спостерігали в лінії нормі, що вказувало на підвищення толерантності ЕМ2, тоді як нетолерантний до гербіцидів контпорівняно з моногенною рослиною, але всі зазнароль був фактично знищений. вали ураження при вищій нормі. Тригенна норма Також було продемонстровано толерантність, продовжувала сегрегуватися, про що свідчили яка забезпечувалася ЕМ2 на основі твердої (тетдеякі рослини, які зазнавали ураження при обох раплоїд) та хлібної пшениці (гексаплоїд). Історію нормах, але приблизно половина рослин не мала селекції досліджених ліній було попередньо опиуражень за найвищої норми, демонструючи підсано (Приклад 2). Як показано у Прикладі 2, коли вищену толерантність порівняно з будь-якою з лінії F4:5 твердої регенерації ЕМ2 00DIMI#17 оцідвогенних ліній. 35 89016 36 37 89016 38 39 89016 40 41 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 89016 Підписне 42 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601