Є ще 22 сторінки.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Людське антитіло, що специфічно зв'язується з людським TNFSF13b (hTNFSF13b), яке включає варіабельну ділянку легкого ланцюга Послідовності №2 та варіабельну ділянку важкого ланцюга Послідовності №10.

2. Антитіло за п. 1, яке включає константну ділянку важкого ланцюга імуноглобуліну, вибраного з групи, яку складають: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM та IgD.

3. Антитіло за п. 2, де імуноглобулін являє собою IgG1 або IgG4.

4. Антитіло за п. 3, де імуноглобулін являє собою IgG4.

5. Антитіло за будь-яким із пп. 1-4, яке включає константну ділянку легкого ланцюга каппа або лямбда.

6. Антитіло за п. 5, яке включає константну ділянку легкого ланцюга каппа.

7. Людське антитіло, що специфічно зв'язується з людським TNFSF13b (hTNFSF13b), яке включає Послідовність №2 та Послідовність №17.

8. Антитіло за п. 7, яке включає константну ділянку легкого ланцюга каппа або лямбда.

9. Антитіло за п. 8, яке включає константну ділянку легкого ланцюга каппа.

10. Людське антитіло, що специфічно зв'язується з людським TNFSF13b (hTNFSF13b), яке включає Послідовність №17 та Послідовність №19.

11. Людське антитіло, що специфічно зв'язується з людським TNFSF13b (hTNFSF13b), яке включає Послідовність №18 та Послідовність №19.

Текст

1. Людське антитіло, що специфічно зв'язується з людським TNFSF13b (hTNFSF13b), яке включає варіабельну ділянку легкого ланцюга Послідовності №2 та варіабельну ділянку важкого ланцюга Послідовності №10. C2 2 (19) 1 3 89017 4 vivo. Незважаючи на те, що у міжнародній заявці За іншим варіантом втілення, цей винахід проWO 00/50597 неописово розкриваються антитіла, понує антигенну детермінанту згаданого антигену, спрямовані проти TNFSF13b, у цій заявці немає з якою зв'язуються нові aнти-hTNFSF13b людські конкретного опису структурних або функціональантитіла. Таким чином, цей винахід також пропоних характеристик таких антитіл. нує застосування антитіла, яке зв'язує антигенну Цей винахід пропонує aнти-hTNFSF13b люддетермінанту за цим винаходом, із нейтралізуванські антитіла або їхні антиген-зв'язувальні домени. ням, тим самим, активності TNFSF13b для лікуАнтитіла за цим винаходом відрізняються високовання чи запобігання гострих або хронічних захвоафінним зв'язуванням із TNFSF13b поліпептидарювань чи станів, пов'язаних із В-клітинною та ми, повільною дисоціативною кінетикою та здатнідеякою Т-клітинною активністю, у тому числі (але стю до антагонізування щонайменше однієї in vitro без обмеження) автоімунних захворювань, наприта/або in vivo активності, що пов'язується із клад, системного червоного вовчака, ревматоїдноTNFSF13b поліпептидами. го артриту та/або неоплазії. Цей винахід пропонує також aнти-hTNFSF13b Цей винахід включає також готовий виріб, до людські антитіла, що включають поліпептид, вибскладу якого входять пакувальний матеріал та раний з групи, що включає поліпептид, який відпоантитіло, що міститься у згаданому пакувальному відає Послідовності №2, поліпептид, який відповіматеріалі, де згадане антитіло нейтралізує активдає Послідовності №4, поліпептид, який відповідає ність TNFSF13b для лікування чи запобігання Послідовності №6, поліпептид, який відповідає страждання людини від розладу, при якому активПослідовності №8, поліпептид, який відповідає ність TNFSF13b є шкідливою, і де згаданий пакуПослідовності №10, поліпептид, який відповідає вальний матеріал включає пакувальну вкладку, Послідовності №12, поліпептид, який відповідає яка вказує, що згадане антитіло здійснює нейтраПослідовності №14 та поліпептид, який відповідає лізацію шляхом зв'язування антигенної детермінаПослідовності №16. нти TNFSF13b, де згадана антигенна детермінанта За іншим варіантом втілення, цей винахід промає лізин у положенні 71, треонін у положенні 72, понує ізольоване анти-hTNFSF13b людське антитирозин у положенні 73 та глутамінову кислоту у тіло, яке зв'язується з hTNFSF13b поліпептидом та положенні 105; та пакувальна вкладка, що проповідокремлюється від згаданого hTNFSF13b полінує введення дозованої лікарської форми, наслідпептиду із константою швидкості дисоціації Koff, ком чого є нейтралізація активності TNFSF13b. Фіг.1. Графік, що ілюструє пригнічення яка дорівнює 1 10 4с 1 або менше, за результатаhTNFSF13b- та IL-1 (інтерлейкін-1)-індукованої ми визначення засобами поверхневого плазмонпроліферації клітин Т1165.17 людським антитілом ного резонансу, або яке пригнічує TNFSF13b4А5-3.1.1-В4. індуковану проліферацію у реакції нейтралізації in Фіг.2. Графік, що ілюструє нейтралізацію vitro з ІС50 1 10 8М або менше. hTNFSF13b-індукованої проліферації ембріональЗа варіантом втілення, якому віддається перених людських В-клітин, стимульованих анти-IgM, вага, цей винахід пропонує ізольоване антилюдським антитілом 4А5-3.1.1-В4. hTNFSF13b людське антитіло, що має такі харакДля полегшення розуміння цього винаходу теристики: спочатку наводиться визначення деяких термінів. a) пригнічує TNFSF13b-індуковану проліфераАнтитіло являє собою молекулу імуноглобуліцію у реакції нейтралізації in vitro з ІС50 1 10 8М M ну, що складається з чотирьох поліпептидних ланабо менше; цюгів, двох важких (Н) ланцюгів (приблизно 50b) має CDR3 (гіперваріабельна ділянка 3) важ70кДа) та двох легких (L) ланцюгів (приблизно кого ланцюга, що включає амінокислотну послідо25кДа), взаємозв'язаних дисульфідними зв'язками. вність, яка відповідає Послідовності №16; та Легкі ланцюги класифікуються як каппа та лямбда. с) має CDR3 легкого ланцюга, що включає Важкі ланцюги класифікуються як гамма, мю, альамінокислотну послідовність, яка відповідає Посфа, дельта або іпсилон, і визначають ізотип антилідовності №8. тіла як IgG, IgM, IgA, IgD та IgE, відповідно. До Цей винахід пропонує також способи лікування складу кожного важкого ланцюга входять варіабеабо запобігання гострих або хронічних захворюльна ділянка важкого ланцюга (яка позначається у вань чи станів, пов'язаних із В-клітинною та децьому описіяк HCVR) та константна ділянка важякою Т-клітинною активністю, у тому числі (але без кого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга обмеження) автоімунних захворювань, наприклад, складається із трьох доменів, СН1, СН2 та СНЗ у системного червоного вовчака, ревматоїдного арразі IgG, IgD та IgA і чотирьох доменів, СН1, СН2, триту та/або неоплазії, що включають введення СН3, СН4 у разі IgM та IgE. До складу кожного леганти-hTNFSF13b людського антитіла за цим винакого ланцюга входять варіабельна ділянка легкого ходом. ланцюга (яка позначається у цьому описі як LCVR) За іншим варіантом втілення, цей винахід прота константна ділянка легкого ланцюга. Константпонує послідовності, які кодують нові aнтина ділянка легкого ланцюга складається із одного hTNFSF13b людські антитіла, вектори, що вклюдомену, CL. HCVR та LCVR ділянки можуть додатчають полінуклеотидні послідовності, які кодують ково підрозділятись на гіперваріабельні ділянки, aнти-hTNFSF13b людські антитіла, клітини-хазяї, які позначаються як CDR, що чергуються з більш трансформовані векторами, що включають полінуконсервативними ділянками, які називаються карклеотиди, які кодують aнти-hTNFSF13b людські касними ділянками (FR). Кожна HCVR та LCVR антитіла, композиції, що містять анти-hTNFSF13b складається з трьох CDR та чотирьох FR, які розлюдські антитіла і способи їх одержання та застоміщуються у напрямку від аміно-кінця до карбоксування. 5 89017 6 сильного кінця таким чином: FR1, CDR1, RF2, специфічність антигенної детермінанти (наприCDR2, FR3, CDR3, FR4. Приналежність амінокисклад, зв'язування aнти-hTNFSF13b людського анлот до кожного домену відповідає добре відомим титіла з hTNFSF13b), здатність до антагонізування домовленостям. [Кабат (Kabat) та інші, Sequences активності цільового поліпептиду (наприклад, акof Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, тивності TNFSF13b), стабільність антитіла in vivo U.S.Department of Health and Human Services, NIH та імуногенні властивості згаданого антитіла. До Publication N91-3242 (1991); Чотіа (Chothia) та інші, інших біологічних властивостей, що піддаються J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Чотіа (Chothia) та визначенню, або характеристик антитіла, визнаних інші, Nature, 342:878-883 (1989)]. Функціональні у цій галузі, належать, наприклад, перехресна рехарактеристики антитіла відносно зв'язування конактивність (наприклад, із нелюдськими гомологами кретного антигену визначаються гіперваріабельзгаданого цільового поліпептиду або з іншими білними ділянками (CDR). ками чи тканинами, взагалі) та здатність до збереТермін "антитіло" у цьому описі означає моноження високих рівнів експресії білка у клітинах клональне антитіло per se. Моноклональне антитіссавців. Вищезгадані властивості або характерисло може бути людським антитілом, химерним антики можуть спостерігатись або визначатись за титілом, гуманізованим антитілом, Fabдопомогою методів, визнаних у цій галузі, у тому фрагментом, Fab'-фрагментом, F(ab')2 або одночислі (але без обмеження) за допомогою ELISA ланцюговим FV-фрагментом. За варіантом, якому (твердофазний імуноферментний аналіз), конкувіддається перевага, згаданий термін "антитіло" рентного ELISA, аналізу поверхневого плазмонноозначає людське антитіло. го резонансу, реакції нейтралізації in vitro та in vivo Згаданий термін "людське антитіло" включає (наприклад, Приклад 2) та імуногістохімічних досантитіла, які мають варіабельні та константні діляліджень тканинних зрізів із різних джерел, у тому нки, що відповідають послідовностям людського числі від людини, приматів або іншого джерела, у імуноглобуліну ембріонального типу. Людські анзалежності від потреби. Докладний опис конкреттитіла мають деякі переваги над нелюдськими або них активностей та біологічних властивостей aнтихимерними антитілами для застосування у людсьhTNFSF13b людських антитіл наведено нижче у кій терапії. Наприклад, ефекторна ділянка людсьПрикладах. кого антитіла може краще взаємодіяти з іншими Згадане словосполучення "контактне полочастинами людської імунної системи (наприклад, ження" означає положення амінокислоти у межах більш ефективно знищувати клітини-мішені шляCDR1, CDR2 або CDR3 варіабельної ділянки важхом комплемент-залежної цитотоксичності (CDC) кого ланцюга або варіабельної ділянки легкого або антитіло-залежної клітинно-опосередкованої ланцюга антитіла, яке займає амінокислота, що цитотоксичності (ADCC)). Інша перевага полягає у контактує з антигеном. У разі, коли амінокислота тому, що людська імунна система не буде розпіCDR контактує зі згаданим антигеном, ця амінокизнавати людське антитіло як чужорідне і, завдяки слота може розглядатись як така, що займає концьому, гуморальна імунна відповідь проти такого тактне положення. введеного антитіла буде менш інтенсивною, аніж Словосполучення "консервативна заміна" або проти повністю чужорідного нелюдського антитіла "консервативна амінокислотна заміна" означає або частково чужорідного химерного антитіла. амінокислотні заміни унаслідок природних мутацій Окрім того, повідомлялось, що період напіввивеабо людської маніпуляції, де антитіла, які одержудення введених нелюдських антитіл у кров'яному ють шляхом таких замін, мають по суті таку саму руслі є набагато коротшим, аніж період напіввиве(поліпшену або зменшену, у залежності від потредення людських антитіл. Період напіввиведення би) активність (активності), що і антитіла, які розклюдських антитіл буде по суті ідентичним періоду ривають у цьому описі. напіввиведення природних людських антитіл, що Згаданий термін "антигенна детермінанта", надає можливість введення менших за об'ємом який використовують у цьому описі, означає діляндоз із меншою частотою. ку білкової молекули, з якою може зв'язуватись Згаданий термін "hTNFSF13b" означає людсьантитіло. ку форму члена сімейства лігандів некротичного Словосполучення "імуногенна антигенна депухлинного фактора, опис якого наведено у міжтермінанта" означає частину білка, що викликає народних заявках WO 98/18921 та WO 00/50597 гуморальну імунну відповідь у разі, коли весь білок є імуногеном. (який згадується у цьому описі як нейтрокін- ). Згаданий термін "зв'язується", який використоЗгаданий термін "TNFSF13b" означає hTNFSF13b, вують у цьому описі, означає, взагалі, взаємодію a також гомологи hTNFSF13b, одержані від інших антитіла з антигенною детермінантою антигену. видів тварин. Згадані терміни "hTNFSF13b" та, Точніше, згаданий термін "зв'язується" має відно"TNFSF13b" означають його форми, що можуть шення до афінності антитіла до антигенної детербути одержані стандартними методами рекомбінамінанти антигену. Афінність визначається KD. нтної експресії або придбані у комерційних джереТермін "пригнічення" або "пригнічувати" має лах (Research Diagnostics Inc., каталожний № RDIзагальноприйняте значення, яке включає нейтра3113, rhuBAFF, Flanders, штат Нью-Джерсі), а талізацію, перешкоджання, запобігання, стримуванкож одержані синтетичним шляхом. ня, уповільнення, припинення або реверсування Словосполучення "біологічна властивість", "бірозвитку або тяжкості захворювання або стану. ологічна характеристика" та згаданий термін "акЗгаданий термін "нейтралізуюче" або "антаготивність" відносно антитіла за цим винаходом занізуюче" по відношенню до aнти-TNFSF13b антистосовуються у цьому описі взаємозамінно і тіла або словосполучення "антитіло, яке антагоніозначають (але не обмежуються) афінність та 7 89017 8 зує активність TNFSF13b" означає антитіло або Згадане словосполучення "молекула нуклеїфрагмент антитіла, наслідком зв'язування якого з нової кислоти" означає молекули ДНК та молекули TNFSF13b є пригнічення біологічної активності, РНК. Молекула нуклеїнової кислоти може бути індукованої TNFSF13b поліпептидами. Пригніченодноланцюговою або дволанцюговою, але, за ваня біологічної активності TNFSF13b може оцінюваріантом, якому віддається перевага, це дволанцютись шляхом визначення одного або декількох in гова ДНК. vitro або in vivo показників біологічної активності Згадане словосполучення "ізольована молеTNFSF13b, у тому числі (але без обмеження) кула нуклеїнової кислоти", яке використовують у TNFSF13b-індукованої проліферації, TNFSF13bцьому описі по відношенню до нуклеїнових кислот, індукованої секреції імуноглобулінів, TNFSF13bякі кодують антитіла або фрагменти антитіл (наіндукованого запобігання апоптозу В-клітин або приклад, HCVR, LCVR, CDR3), що зв'язують пригнічення зв'язування рецептора у аналізі зв'яhTNFSF13b поліпептид, означає молекулу нуклеїзування рецептора TNFSF13b. Показники біологічнової кислоти, нуклеотидні послідовності якої, що ної активності TNFSF13b можуть оцінюватись за кодують антитіло або частину антитіла, є вільними допомогою одного або декількох з цілого ряду in від інших нуклеотидних послідовностей, що кодуvitro та in vivo аналізів, відомих у цій галузі (диють антитіла або фрагменти антитіл, які зв'язують вись, наприклад, Мур П.А. (Moore P.A.) та інші, інші антигени, окрім hTNFSF13b поліпептиду, де Science, 285:260-263 (199); Шнейдер П. (Schneider інші послідовності можуть, природно, фланкувати P.) та інші, /. Ехр. Med., 189:1747-1756 (1999); Шу згадану нуклеїнову кислоту у людській геномній Г. (Shu Н.) та інші, J. Leuko. Biol., 65:680-683 ДНК. Так, наприклад, ізольована нуклеїнова кис(1999); Махопадья A. (Mukhopadhyay А.) та інші, J. лота за цим винаходом, що кодує ділянку HCVR Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999); Макей Ф. анти-hTNFSF13b людського антитіла, не включає (Mackay F.) та інші, J. Ехр. Med., 190:1697-1710 інших послідовностей, що кодують ділянки HCVR, (1999); Гросс Дж.А. (Gross J.A.) та інші, Nature, які зв'язують інші антигени, окрім hTNFSF13b полі404:995-999 (2000); та Приклад 2). За варіантом, пептиду. якому віддається перевага, здатність антитіла до Згаданий термін "вектор" означає молекулу нейтралізації або антагонізування активності нуклеїнової кислоти, здатну до транспортування TNFSF13b оцінюється шляхом пригнічення пролііншої нуклеїнової кислоти, з якою вона зв'язана. ферації В-клітин, як показано у Прикладі 2. Вектором одного із типів є "плазміда", яка являє Згаданий термін "Koff", який використовують у собою петльовий фрагмент кільцевої дволанцюгоцьому описі, означає константу дисоціації антитіла вої ДНК, до якого можуть лігуватись додаткові севід комплексу антитіло/антиген. гменти ДНК. Вектором іншого типу є вектор на Згаданий термін "KD", який використовують у основі вірусної ДНК, де додаткові сегменти ДНК цьому описі, означає константу дисоціації або можуть лігуватись до вірусного геному. Деякі векшвидкість "відокремлення", поділену на швидкість тори є здатними до автономної реплікації у клітині"зв'язування" у разі конкретної взаємодії антитілохазяїні, до якої вони були введені (наприклад, векантиген. Для цілей цього винаходу, KD визначали тори на основі бактеріальної ДНК, що мають бакяк показано у Прикладі 4. теріальну точку ініціювання реплікації, та вектори "Ізольованим" антитілом є антитіло, яке іденна основі епісомної ДНК ссавців). Інші вектори тифікували і відокремили та/або виділили зі скла(наприклад, вектори на основі неепісомної ДНК дової його природного оточення. Контамінуючими ссавців) можуть інтегруватись до геному клітинискладовими природного оточення антитіла є матехазяїна після введення до цієї клітини, і, таким ріали, які можуть перешкоджати діагностичному чином, реплікуються разом із геномом хазяїна. або терапевтичному застосуванню згаданого анБільше того, деякі вектори є здатними до спрямутитіла; до їх числа можуть належати ферменти, вання експресії генів, з якими вони є функціональгормони та інші білкові або небілкові розчинені но зв'язаними. На такі вектори у цьому описі посиречовини. Ізольоване антитіло одержують, як пралаються як на "рекомбінантні вектори експресії" вило, за допомогою щонайменше однієї стадії (або просто "вектори експресії"). Взагалі, вектори очищення. За варіантами втілення, яким віддають експресії, придатні для застосування у методах перевагу, антитіло буде очищатись (1) до рівня, рекомбінантних ДНК, часто мають форму плазмід. що перевищує 95%(мас.) антитіла, який визначаУ цьому описі терміни "плазміда" та "вектор" моється за методом Лоурі, а за варіантом, якому віджуть застосовуватись взаємозамінно, оскільки дається найбільша перевага, до рівня, що переплазміда є найпоширенішою формою вектора. Цей вищує 99%(мас), та (2) до гомогенного стану за винахід, однак, включає інші форми векторів ексдопомогою електрофорезу у поліакриламідному пресії, наприклад, вектори на основі вірусного гегелі у присутності додецилсульфату натрію (SDSному (наприклад, реплікаційно дефективних ретPAGE) за відновних або невідновних умов із заровірусів, аденовірусів та адено-асоційованих стосуванням кумассі синього або срібла. За варіавірусів), які застосовуються для здійснення еквівантом, якому віддається перевага, "ізольованим лентних функцій. антитілом" є антитіло, по суті вільне від інших анНуклеїнова кислота є "функціонально зв'язатитіл, що мають різні антигенні специфічності (наною" у тому разі, коли вона знаходиться у функціприклад, ізольоване антитіло, яке специфічно зв'яональному зв'язку з іншою послідовністю нуклеїзує hTNFSF13b по суті вільне від антитіл, які нових кислот. Наприклад, ДНК для специфічно зв'язують інші антигени, окрім передсеквенувальної або секреторної лідерної hTNFSF13b поліпептиду). послідовності є функціонально зв'язаною з ДНК для одержання поліпептиду, якщо вона експресу 9 89017 10 ється як передбілок, що бере участь у секретувантипу до таких зародкових мишей-мутантів буде ні згаданого поліпептиду; промотор або енхансер є продукування людських антитіл у разі введення функціонально зв'язаним із кодувальною послідоантигену (дивись, наприклад, Якобовіц (Jakobovits) вністю, якщо він впливає на транскрипцію згаданої та інші, Ргос. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, послідовності; або місце зв'язування рибосоми є (1993); Якобовіц (Jakobovits) та інші, Nature, функціонально зв'язаним із кодувальною послідо362:255-258, (1993); Брюггеманн (Bruggemann) та вністю, якщо воно є позиціоноване таким чином, інші, Year in Immun., 7:33 (1993); Nature, 148:1547що полегшує трансляцію. Взагалі, словосполучен1553 (1994); Nature Biotecnology, 14:826 (1996); ня "функціонально зв'язаний" означає, що посліГросс Дж.А. (Gross J.A.) та інші, Nature, 404:995довності ДНК, які зв'язуються, є суміжними, а у 999 (2000); та патенти США №5,877,397, разі секреторної лідерної послідовності, є суміж5,874,299, №5,814,318, №5,789,650, №5,770,429, ними і знаходяться у межах рамки зчитування. №5,661,016, №5,633,425, № 5,625,126, № Енхансери, однак, не повинні бути суміжними. 5,569,825 та № 5,545,806 (кожен з яких включено Зв'язування здійснюється шляхом лігування на до цього опису у повному обсязі як посилання для зручних сайтах рестрикції. У разі, якщо такі сайти будь-яких цілей)). Людські антитіла можуть також не існують, застосовують синтетичні олігонуклеопродукуватись у бібліотеках фагів (Хугенбум тидні адаптори або лінкери у відповідності до ста(Hoogenboom) та Вінтер (Winter), J. Моl. Biol, ндартної практики. 227:381 (1992); Маркс (Marks) та інші, J. Моl. Biol, Згаданий термін "рекомбінантне" у відношенні 222:581 (1991)). Для одержання людських монокдо антитіла означає антитіла, які одержують, екслональних антитіл доступними є методи Коул пресують, створюють або ізолюють рекомбінант(Cole) та інших і Бернер (Boerner) та інших (Коул ними методами. Репрезентативними прикладами є (Cole) та інші, Monoclonal Antibodies and Cancer антитіла, що експресуються із застосуванням реTherap., Ален P. Лісc (Alan R. Liss), стор. 77 (1985) комбінантного вектора експресії, трансфікованого та Бернер (Boerner) та інші, J. Immunol, 147(1):86до клітини-хазяїна, антитіла, ізольовані з бібліоте95 (1991)). ки рекомбінантних, комбінаторних людських антиТермін "контейнер" означає будь-яку посудину тіл, антитіла, ізольовані з тварини (наприклад, та пакунок, придатні для збереження, транспортумиші), яка є трансгенною за генами людського вання, розподілення та/або маніпулювання з фарімуноглобуліну, або антитіла, одержані, експресомацевтичним продуктом. вані, створені або ізольовані за допомогою будьСловосполучення "пакувальний матеріал" яких методів, що залучають сплайсингування посозначає зручний для покупця пристрій, що забезлідовностей гена людського імуноглобуліну до печує можливість зручного введення та/або допоінших послідовностей ДНК. Такі рекомбінантні міжні пристрої, які допомагають під час доставки, людські антитіла мають варіабельні та константні роз'яснювальної роботи та/або введення. Пакуваділянки, одержані із послідовностей людського льний матеріал може поліпшувати введення антиімуноглобуліну ембріонального типу. тіла пацієнту, зменшувати або підвищувати ефекЗгадане словосполучення "рекомбінантна клітивність роз'яснювального інструктування тина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") означає пацієнта, надавати основу для підвищення ефекклітину, до якої було введено рекомбінантний вективності досліджень витрат на охорону здоров'я тор експресії. Слід розуміти, що такі терміни мата/або обмежувати навантаження на канали розють відношення не тільки до конкретної цільової поділу. Крім того, пакувальний матеріал може клітини, але і до нащадків такої клітини. Оскільки включати (але без обмеження) пакунок на паперопевні модифікації можуть відбуватись у подальших вій основі, обгортковий матеріал із термоусадочної генераціях унаслідок мутації або впливів навколиплівки, пакунок із прозорою верхньою частиною, шнього середовища, такі нащадки можуть фактичкупони для замовлення після випробування, роз'яно не бути ідентичними до батьківської клітини, снювальний матеріал, додаткові матеріали та/або однак вони, незважаючи на це, включаються до засоби для доставки. обсягу згаданого терміну "клітина-хазяїн", який Словосполучення "пакувальна вкладка" ознавикористовується у цьому описі. чає інформацію, що супроводжує продукт, у якій Рекомбінантні людські антитіла можуть також наведено опис того, яким чином вводити "згаданий піддаватись мутагенезу in vitro (або, у разі викорипродукт; а також "дані щодо безпечності та ефекстання тварин, трансгенних за послідовностями тивності, необхідні для того, щоб лікар, фармаколюдського Ig, соматичному мутагенезу in vivo), і, лог та пацієнт могли прийняти базоване на інфортаким чином, амінокислотні послідовності ділянок мації рішення щодо застосування згаданого HCVR та LCVR рекомбінантних антитіл є послідопродукту та/або для надання пацієнту роз'яснювавностями, які, незважаючи на те, що були одержальної інформації. Згадана пакувальна вкладка ні від послідовностей, пов'язаних із послідовносзвичайно розглядається як "етикетка" фармацевтями людських зародкових HCVR та LCVR, тичного продукту. можуть, природно, не існувати у межах зародковоТермін "суб'єкт" означає ссавця; за варіантом, го набору людських антитіл in vivo. якому віддається перевага, це людина, що потреМожуть використовуватись трансгенні тварини бує лікування. Відносно цього винаходу, суб'єкта(наприклад, миші), які є здатними, після імунізації, ми, що потребують лікування, є ссавці, які страждо продукування повного набору людських антитіл дають на або є схильними до страждання від за відсутності продукування ендогенних імуноглорозладу, під час якого шкідливою є активність булінів. Наслідком перенесення згаданого набору TNFSF13b, наприклад, імунні захворювання, у толюдських імуноглобулінових генів зародкового му числі автоімунні захворювання та запальні за 11 89017 12 хворювання. До розладів, яким віддають перевагу, вності №6; CDR3 поліпептид LCVR, який відповіналежать (але ними не обмежуються) системний дає Послідовності №8; CDR1 поліпептид HCVR, червоний вовчак, ревматоїдний артрит, ювенільякий відповідає Послідовності №12; CDR2 поліпений хронічний поліартрит, артрит Ліма, хвороба птид HCVR, який відповідає Послідовності №14; та Крона, неспецифічний виразковий коліт, запальна CDR3 поліпептид HCVR, який відповідає Послідохвороба кишечнику, астма, алергійні захворюванвності №16. За іншим варіантом втілення, згадане ня, псоріаз, реакція "трансплантат проти хазяїна", aнти-hTNFSF13b людське антитіло включає щовідторгнення трансплантата органа, гостре або найменше чотири поліпептиди, вибрані з групи, що хронічне імунопатологічне захворювання, пов'язавключає: CDR1 поліпептид LCVR, який відповідає не із трансплантацією органів, саркоїдоз, інфекПослідовності №4; CDR2 поліпептид LCVR, який ційні захворювання, паразитарні захворювання, відповідає Послідовності №6; CDR3 поліпептид жіноче безпліддя, автоімунна тромбоцитопенія, LCVR, який відповідає Послідовності №8; CDR1 автоімунна хвороба щитовидної залози, хронічний поліпептид HCVR, який відповідає Послідовності лімфоматозний тиреоїдит, сухий кератокон'юнкти№12; CDR2 поліпептид HCVR, який відповідає віт та різні форми раку, зокрема, лімфоми або мієПослідовності №14; та CDR3 поліпептид HCVR, ломи В- чи Т-клітин. який відповідає Послідовності №16. За іншим ваУ наведених далі підрозділах наданий докларіантом втілення, згадане aнти-hTNFSF13b людсьдний опис різних аспектів цього винаходу. ке антитіло включає щонайменше п'ять поліпептиЦей винахід має відношення до людських модів, вибраних із групи, що включає: CDR1 ноклональних антитіл, що є специфічними до та поліпептид LCVR, який відповідає Послідовності нейтралізують біоактивні hTNFSF13b поліпептиди. №4; CDR2 поліпептид LCVR, який відповідає ПосРозкриваються також амінокислотні послідовності лідовності №6; CDR3 поліпептид LCVR, який відважких та легких ланцюгів антитіл, що є високосповідає Послідовності №8; CDR1 поліпептид пецифічними до та нейтралізують TNFSF13b поліHCVR, який відповідає Послідовності №12; CDR2 пептиди, з якими вони зв'язуються. Ця висока спеполіпептид HCVR, який відповідає Послідовності цифічність надає можливість застосування №14; та CDR3 поліпептид HCVR, який відповідає людських aHra-hTNFSF13b антитіл та людських Послідовності №16. За іншим варіантом втілення, моноклональних антитіл із подібною специфічнісзгадане aнти-hTNFSF13b людське антитіло вклютю, як імунотерапевтичних засобів для лікування чає поліпептиди: CDR1 поліпептид LCVR, який захворювань, пов'язаних із TNFSF13b. відповідає Послідовності № 4; CDR2 поліпептид За одним зі своїх аспектів, цей винахід пропоLCVR, який відповідає Послідовності №6; CDR3 нує ізольоване людське антитіло, що включає щополіпептид LCVR, який відповідає Послідовності найменше одну з амінокислотних послідовностей, №8; CDR1 поліпептид HCVR, який відповідає Посякі відповідають Послідовностям №2, №4, №6, лідовності №12; CDR2 поліпептид HCVR, який №8, №10, №12, №14 або №16, і яке зв'язує антивідповідає Послідовності №14; та CDR3 поліпепгенну детермінанту TNFSF13b поліпептиду з висотид HCVR, який відповідає Послідовності №16. кою афінністю, відокремлюється від зв'язаного За варіантом, якому віддається більша переTNFSF13b поліпептиду з низькою константою дивага, згадане aнти-hTNFSF13b людське антитіло включає поліпептид варіабельної ділянки легкого соціації Koff на рівні 1 10 4c 1 або менше, та має ланцюга (LCVR), який відповідає Послідовності здатність до антагонізування активності TNFSF13b №2 або поліпептид варіабельної ділянки важкого поліпептиду. За одним із варіантів втілення, згадаланцюга (HCVR), який відповідає Послідовності не aнти-hTNFSF13b людське антитіло включає №10. За варіантом, якому віддається ще більша поліпептид, вибраний з групи, що включає: CDR1 перевага, згадане aнти-hTNFSF13b людське антиполіпептид LCVR, який відповідає Послідовності тіло включає LCVR поліпептид, який відповідає №4; CDR2 поліпептид LCVR, який відповідає ПосПослідовності №2 та HCVR поліпептид, який відлідовності №6; CDR3 поліпептид LCVR, який відповідає Послідовності №10. повідає Послідовності №8; CDR1 поліпептид За варіантами, яким віддається перевага, ізоHCVR, який відповідає Послідовності №12; CDR2 льоване людське антитіло відокремлюється від поліпептид HCVR, який відповідає Послідовності зв'язаного TNFSF13b поліпептиду з константою №14; та CDR3 поліпептид HCVR, який відповідає дисоціації Koff на рівні 5 10 5с 1 або менше і пригПослідовності №16. За іншим варіантом втілення, згадане анти-hTNFSF13b людське антитіло вклюнічує TNFSF13b-індуковану проліферацію у реакції чає щонайменше два поліпептиди, вибрані з групи, нейтралізації in vitro з ІС50 1 10 7М або менше. За що включає: CDR1 поліпептид LCVR, який відповіваріантами, яким віддається більша перевага, ізодає Послідовності №4; CDR2 поліпептид LCVR, льоване людське антитіло відокремлюється від який відповідає Послідовності №6; CDR3 поліпепзв'язаної антигенної детермінанти TNFSF13b політид LCVR, який відповідає Послідовності №8; пептиду з константою дисоціації Koff на рівні 5 10 5 1 CDR1 поліпептид HCVR, який відповідає Послідос або менше і пригнічує TNFSF13b-індуковану вності №12; CDR2 поліпептид HCVR, який відповіпроліферацію у реакції нейтралізації in vitro з ІС50 дає Послідовності №14; та CDR3 поліпептид 1 10 8М або менше. За варіантами, яким віддаHCVR, який відповідає Послідовності №16. За інється ще більша перевага, ізольоване людське шим варіантом втілення, згадане aнти-hTNFSF13b антитіло відокремлюється від зв'язаного людське антитіло включає щонайменше три поліTNFSF13b поліпептиду з константою кінетичної 6 1 пептиди, вибрані з групи, що включає: CDR1 полідисоціації Koff на рівні 5 10 с або менше і пригпептид LCVR, який відповідає Послідовності №4; нічує TNFSF13b-індуковану проліферацію у реакції 9 CDR2 поліпептид LCVR, який відповідає Послідонейтралізації in vitro з ІС50 1 10 М або менше. 13 89017 14 Прикладами aнти-TNFSF13b людських антитіл, що тись. Для одержання генів важких та легких ланзадовольняють вищезгаданим кінетичним та нейтцюгів антитіла, включення цих генів до рекомбінаралізаційним критеріям, є 4А5-3.1.1-В4 антитіла. нтних векторів експресії та введення згаданих векАнти-hTNFSF13b людським антитілом за цим торів до клітин-хазяїв вдаються до стандартних винаходом, якому віддається найбільша перевага, методів рекомбінантних ДНК. є 4А5-3.1.1-В4. 4А5-3.1.1-В4 має послідовності Ізольована ДНК, що кодує HCVR ділянку, може LCVR та HCVR поліпептидів, які відповідають Поперетворюватись на непроцесований ген важкого слідовностям №2 та №10, відповідно. Полінуклеоланцюга шляхом функціонального зчеплення ДНК, тидна послідовність, що кодує LCVR та HCVR 4А5що кодує HCVR, з іншою молекулою ДНК, що ко3.1.1-В4 антитіла відповідає Послідовностям №1 дує константні ділянки важкого ланцюга (СН1, СН2 та №9, відповідно. Властивості aнти-hTNFSF13b та СНЗ). Послідовності ДНК людських генів конслюдських антитіл за цим винаходом конкретно тантних ділянок важких ланцюгів є відомими у цій розкриваються у Прикладах. Особливої уваги загалузі і фрагменти ДНК, що включають ці ділянки, слуговує висока афінність до TNFSF13b поліпепможна одержати шляхом стандартної ПЛРтиду, повільна кінетика дисоціації та висока здатампліфікації. Константною ділянкою важкого ланність до антагонізування активності TNFSF13b цюга може бути константна ділянка IgG1, IgG2, поліпептиду, що демонструється 4А5-3.1.1-В4. IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM або IgD та будь-який алоKoff aнти-hTNFSF13b людського антитіла може типовий варіант, як описано у роботі Кабат (Кабат визначатись за поверхневим плазмонним резона(Kabat) та інші, Sequences of Proteins of нсом, як у загальному вигляді описано у Прикладі Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department 4. Взагалі, під час аналізу поверхневого плазмонof Healh and Human Services, NIH Publication 91ного резонансу у масштабі реального часу визна3242 (1991), однак за варіантом, якому віддається чають зв'язувальні взаємодії між лігандом (рекомнайбільша перевага, це константна ділянка IgG1 бінантний TNFSF13b поліпептид, іммобілізований або IgG4. За альтернативним варіантом частиною на біосенсорній матриці) та досліджуваною речоантитіла може бути Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, виною (антитіла у розчині). Інтенсивність цих взаF(ab')2 або одноланцюговий FV-фрагмент. Для ємодій визначають за поверхневим плазмонним одержання Fab-фрагмента гена важкого ланцюга, резонансом (SPR) із застосуванням системи ДНК, що кодує HCVR, може функціонально зчепBIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, штат люватись з іншою молекулою ДНК, що кодує лише Нью-Джерсі). SPR аналіз може здійснюватись таконстантну ділянку СН1 важкого ланцюга. кож шляхом іммобілізації досліджуваної речовини Ізольована ДНК, що кодує LCVR ділянку; може (антитіла на біосенсорній матриці) і презентації перетворюватись на непроцесований ген легкого ліганду (рекомбінантного TNFSF13b у розчині). ланцюга (а також на ген Fab-фрагмента легкого За одним із своїх аспектів, цей винахід спряланцюга) шляхом функціонального зчеплення мований також на лінії клітин, що продукують aнтиДНК, що кодує LCVR, з іншою молекулою ДНК, що hTNFSF13b людські антитіла за цим винаходом. кодує константну ділянку легкого ланцюга, CL. Виділення ліній клітин, що продукують моноклонаПослідовності ДНК людських генів константних льні антитіла за цим винаходом, може здійснюваділянок легких ланцюгів є відомими у цій галузі і тись за допомогою стандартних методів пошуку, фрагменти ДНК, що включають ці ділянки, можна відомих у цій галузі. Гібридома, що продукує aнтиодержати шляхом стандартної ПЛР-ампліфікації. hTNFSF13b людське антитіло за цим винаходом, Константною ділянкою легкого ланцюга може бути була депонована до АТСС (Американська колекція константна ділянка каппа або лямбда. типових культур) (АТСС РТА-3674), як розкриваДля одержання гена scFV, фрагменти ДНК, що ється у цьому описі. кодують HCVR та LCVR, функціонально зчіплюють Для експресії антитіл за цим винаходом моз іншим фрагментом, що кодує гнучкий лінкер, жуть застосовуватись найрізноманітніші хазяйські наприклад, фрагментом, що кодує амінокислотну системи експресії, у тому числі бактеріальні, дріжпослідовність Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Glyджові, бакуловірусні, рослинні та ссавцеві системи Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (Gly4-Ser)3, таким чином, експресії (а також системи експресії фагів). Прикщо HCVR та LCVR послідовності можуть експреладом придатного вектора експресії на основі баксуватись як суміжний одноланцюговий білок з теріального геному є pUC119 (Sfi). У цій галузі віLCVR та HCVR ділянками, які з'єднуються гнучким домі також інші системи експресії антитіл, які лінкером (дивись, наприклад, Берд (Bird) та інші, розглядаються у цьому описі. Science, 242:423-426 (1988); Хьюстон (Huston) та Антитіло за цим винаходом можна одержати інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 шляхом рекомбінантної експресії генів легких та (1988); Маккафферті (McCafterty) та інші, Nature, важких імуноглобулінових ланцюгів у клітині348:552-554 (1990)). хазяїні. Для рекомбінантної експресії антитіла, Для експресії антитіл за цим винаходом, ДНК, клітина-хазяїн трансфікується одним або декільщо кодують неповні або повномірні легкі та важкі кома рекомбінантними векторами експресії, що ланцюги, які одержали, як було описано вище, несуть фрагменти ДНК, які кодують легкі та важкі вставляють до векторів експресії таким чином, що імуноглобулінові ланцюги антитіла таким чином, згадані гени функціонально зчіплюються з транскщо згадані легкі та важкі ланцюги експресуються у рипційними та трансляційними регуляторними клітині-хазяїні. За варіантом, якому віддають перепослідовностями. Згаданий антитіло-кодуючий ген вагу, рекомбінантні антитіла секретуються до селігується до вектора таким чином, що транскрипредовища, у якому культивуються клітини-хазяї, і з ційні та трансляційні регуляторні послідовності у цього середовища згадані антитіла можуть виділямежах згаданого вектора здійснюють свою визна 15 89017 16 чену функцію регулювання транскрипції та трансу dhfr-клітинах-хазяях із селекцією/ампліфікацією ляції згаданого антитіло-кодуючого гена. Згаданий метотрексатом) та neo ген (для селекції G418). вектор експресії та регуляторні послідовності ексДля експресії легких та важких ланцюгів, векпресії вибирають таким чином, щоб вони були сутор(-и) експресії, що кодує важкі та легкі ланцюги, місними з тими експресуючими клітинами-хазяями, трансфікується до клітини-хазяїна за стандартниякі використовуються. Ген легкого ланцюга антитіми методами. Різні форми згаданого терміну "трала та ген важкого ланцюга антитіла може вставлянсфекція" призначені для охоплення найрізноманітись до окремого вектора або, що є більш типотніших методів, які широко застосовуються для вим, обидва гени вставляють до одного і того введення екзогенної ДНК до прокаріотичної або самого вектора експресії. Антитіло-кодуючі гени еукаріотичної клітини-хазяїна, наприклад, електвставляють до вектора експресії стандартними ропорації, осадження фосфатом кальцію, трансметодами (наприклад, шляхом лігування комплефекції DEAE (діетиламіноетил)-декстраном тощо. ментарних сайтів рестрикції на фрагменті антитіНезважаючи на існування теоретичної можливості ло-кодуючого гена та вектора або шляхом лігуванекспресії антитіл за цим винаходом у прокаріотичня тупих кінців у разі відсутності сайтів рестрикції). них або еукаріотичних клітинах-хазяях, найбільша На додаток до цього або альтернативно, рекомбіперевага віддається експресії антитіл у еукаріотинантний вектор експресії може кодувати сигнальчних клітинах, із віданням найбільшої переваги ний пептид, що полегшує секрецію ланцюга aнтиклітинам-хазяям ссавців, оскільки такі еукаріотичні hTNFSF13b людського антитіла з клітини-хазяїна. клітини, і, зокрема, клітини ссавців, є більш ймовіГен ланцюга aнти-hTNFSF13b людського антитіла рно, аніж прокаріотичні клітини, здатними до скламоже клонуватись до вектора таким чином, що дання та секретування відповідним чином укладесигнальний пептид зчіплюється у межах рамки ного та імунологічно активного антитіла. До клітинзчитування з аміно-кінцем гена ланцюга антитіла. хазяїв ссавців, яким віддається перевага для ексЗгаданий сигнальний пептид може бути імуноглопресії рекомбінантних антитіл за цим винаходом, буліновим сигнальним пептидом або гетерологічналежать клітини яєчника китайського хом'ячка ним сигнальним пептидом (тобто сигнальним пеп(СНО клітини) (у тому числі dhfr-CHO клітини, опис тидом від неімуноглобулінового білка). яких наведено у Урлауб (Urlaub) та Чезін (Chasin), Окрім генів ланцюгів антитіла, рекомбінантні Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220 (1980), які вектори експресії за цим винаходом несуть регузастосовуються з DHFR селектованим маркером, ляторні послідовності, які контролюють експресію як описано, наприклад, у Р.Дж. Кауфман (R.J. генів ланцюгів антитіла у клітині-хазяїні. РегулятоKaufman) та П.А. Шарп (PA. Sharp), Моl. Biol, рні послідовності включають промотори, енхансе159:601-621 (1982)), клітини мієломи NS0, клітини ри та інші елементи контролю експресії (наприCOS (клітини яєчника мавп) та клітини SP2. Коли клад, сигнали поліаденілювання), які контролюють рекомбінантні вектори експресії, що кодують антитранскрипцію або трансляцію згаданих генів лантіло-кодуючі гени, вводяться до клітин-хазяїв ссацюгів антитіла. Фахівцям у цій галузі техніки буде вців, згадані антитіла продукуються шляхом кульзрозуміло, що конструювання вектора експресії, з тивування згаданих клітин-хазяїв впродовж включенням вибору регуляторних послідовностей, періоду часу, достатнього для надання можливості може залежати від таких факторів, як вибір клітиекспресії антитіла у клітинах-хазяях або, за варіани-хазяїна до трансформування, рівня експресії нтом, якому віддається більша перевага, секретупотрібного білка тощо. Регуляторні послідовності, вання антитіла до культурального середовища, у яким віддається перевага, для експресії у клітиніякому вирощуються клітини-хазяї. Антитіла можуть хазяїні ссавця включають вірусні елементи, які виділятись зі згаданого культурального середовиспрямовують високі рівні експресії білка у клітинах ща за допомогою стандартних методів очищення ссавця, наприклад, промотори та/або енхансери, білка. одержані від цитомегаловірусу (CMV) (наприклад, Клітини-хазяї можуть також застосовуватись CMV промотор/енхансер), вірусу мавп 40 (SV40) для продукування частин інтактних антитіл, напри(наприклад, SV40 промотор/енхансер), аденовіруклад, Fab-фрагментів молекул scFV. Слід розумісу (наприклад, головний пізній промотор аденовіти, що варіації вищезгаданої процедури входять русу (AdMLP)) та поліоми. до обсягу цього винаходу. Окрім генів ланцюгів антитіла та регуляторних Наприклад, може виникнути потреба трансфіпослідовностей, рекомбінантні вектори експресії кування клітини-хазяїна ДНК, що кодує легкий лаза цим винаходом можуть нести додаткові послінцюг або важкий ланцюг (але не обидва) антитіла довності, наприклад, послідовності, що регулюють за цим винаходом. Методи рекомбінантних ДНК реплікацію згаданого вектора у клітинах-хазяях можуть також застосовуватись для видалення де(наприклад, точки ініціювання реплікації) та гени якої частини або усієї ДНК, що кодує будь-який селектованих маркерів. Ген селектованих маркеабо обидва ланцюги (легкий та важкий), яка не є рів полегшує відбір клітин-хазяїв, до яких було необхідною для зв'язування з hTNFSF13b. Молевведено згаданий вектор. Наприклад, ген селектокули, що експресуються такими "скороченими" ваного маркера, як правило, наділяє стійкістю до молекулами ДНК також входять до числа антитіл лікарських засобів, наприклад, G418, гігроміцину за цим винаходом. У одній із систем рекомбінантабо метотрексату, клітину-хазяїна, до якої було ної експресії антитіла за цим винаходом, рекомбівведено згаданий вектор. До генів селектованих нантний вектор експресії, що кодує як важкий ланмаркерів, яким віддається перевага, належить ген цюг антитіла, так і легкий ланцюг антитіла, вводять дигідрофолатредуктази (DHFR) (для застосування, до dhfr-CHO клітин шляхом трансфекції, що опосередковується фосфатом кальцію. Кожен із генів 17 89017 18 важкого та легкого ланцюгів антитіла у межах реЗа іншими варіантами втілення відмітною комбінантного вектора експресії функціонально ознакою цього винаходу є ізольована нуклеїнова зчіплюється з енхансерними/промоторними регукислота, що кодує варіабельну ділянку легкого ляторними елементами (наприклад, одержаними з ланцюга антитіла, яка кодує гіперваріабельну діSV40, CMV, аденовірусу тощо, наприклад, CMV лянку 3 (CDR3) легкого ланцюга 4А5-3.1.1-В4, яка енхансерний/AdMLP промоторний регуляторний включає амінокислотну послідовність, яка відповіелемент або SV40 енхансерний/AdMLP промотордає Послідовності №8. За варіантом, якому відданий регуляторний елемент) для стимулювання ється перевага, нуклеїнова кислота, яка кодує вависоких рівнів транскрипції цих генів. Згаданий ріабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, рекомбінантний вектор експресії також несе DHFR додатково кодує гіперваріабельну ділянку 1 ген, який надає можливість селекції СНО клітин, (CDR1) легкого ланцюга 4А5-3.1.1-В4, яка включає які були трансфіковані згаданим вектором із заамінокислотну послідовність, яка відповідає Посстосуванням селекції/ампліфікації метотрексатом. лідовності №4. За варіантом, якому віддається ще Відібрані трансформовані клітини-хазяї культивубільша перевага, ізольована нуклеїнова кислота ються для забезпечення можливості експресії вакодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіжких та легких ланцюгів антитіла і інтактне антитіла, яка включає амінокислотну послідовність, яка ло виділяють із культурального середовища. Для відповідає Послідовності №2 (повна LCVR ділянка одержання рекомбінантного вектора експресії, 4А5-3.1.1-В4). трансфікування клітин-хазяїв, відбирання трансЗа іншими варіантами втілення відмітною формованих клітин-хазяїв, культивування клітинознакою цього винаходу є ізольована нуклеїнова хазяїв та виділення антитіла з культурального секислота, що кодує варіабельну ділянку легкого редовища застосовують стандартні молекулярноланцюга антитіла, яка кодує гіперваріабельну дібіологічні методи. Антитіла або їх антигенлянку 3 (CDR3) легкого ланцюга 4А5-3.1.1-В4, яка зв'язувальні домени за цим винаходом можуть включає амінокислотну послідовність, яка відповібути експресовані у тварині (наприклад, миші), яка дає Послідовності №8. За варіантом, якому віддає трансгенною за людськими генами імуноглобуліється перевага, нуклеїнова кислота, яка кодує вану (дивись, наприклад, Тейлор Л.Д. (Taylor L.D.) та ріабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, інші, Nucl. Acids Res., 20:6287-6295 (1992)). Росдодатково кодує гіперваріабельну ділянку 1 линні клітини також можуть бути модифіковані для (CDR1) легкого ланцюга 4А5-3.1.1-В4, яка включає одержання трансгенних рослин, які експресують амінокислотну послідовність, яка відповідає Посантитіло або його антиген-зв'язувальний домен за лідовності №4. За варіантом, якому віддається ще цим винаходом. більша перевага, ізольована нуклеїнова кислота Приймаючи до уваги вищенаведене, інший аскодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіпект цього винаходу має відношення до нуклеїнола, яка включає амінокислотну послідовність, яка вих кислот, векторів та композицій, що містять відповідає Послідовності №2 (повна LCVR ділянка клітини-хазяї, які можуть застосовуватись для ре4А5-3.1.1-В4). комбінантної експресії антитіл та фрагментів антиЗа іншим варіантом втілення цей винахід протіл за цим винаходом. За варіантом, якому віддапонує ізольовану нуклеїнову кислоту, що кодує ється перевага, відмітною ознакою цього винаходу гіперваріабельну ділянку 3 (CDR3) важкого ланцює ізольовані нуклеїнові кислоти, які кодують гіперга, яка включає амінокислотну послідовність, яка варіабельні ділянки 4А5-3.1.1-В4 або повні варіавідповідає Послідовності №16 (тобто CDR3 HCVR бельні ділянки важких та/або легких ланцюгів 4А54A5-3.1.1-B4). Ця нуклеїнова кислота може коду3.1.1-В4. Відповідно, за одним із варіантів втіленвати лише ділянку CDR3 або, за варіантом, якому ня, відмітною ознакою цього винаходу є ізольовавіддається більша перевага, кодує повну варіабена нуклеїнова кислота, що кодує варіабельну дільну ділянку важкого ланцюга антитіла (HCVR). лянку важкого ланцюга антитіла, яка кодує Наприклад, згадана нуклеїнова кислота може когіперваріабельну ділянку 3 (CDR3) важкого ланцюдувати HCVR, що має ділянку CDR2, яка включає га 4А5-3.1.1-В4, яка включає амінокислотну посліамінокислотну послідовність, яка відповідає Посдовність, яка відповідає Послідовності №16. За лідовності №14 (тобто CDR2 HCVR 4A5-3.1.1-B4) варіантом, якому віддається перевага, нуклеїнова та ділянку CDR1, яка включає амінокислотну поскислота, яка кодує варіабельну ділянку важкого лідовність, яка відповідає Послідовності №12 (тобланцюга антитіла, додатково кодує гіперваріабето CDR1 HCVR4A5-3.1.1-B4). льну ділянку 2 (CDR2) важкого ланцюга 4А5-3.1.1За ще іншим варіантом втілення цей винахід В4, яка включає амінокислотну послідовність, яка пропонує ізольовану нуклеїнову кислоту, що кодує відповідає Послідовності №14. За варіантом, яковаріабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, яка му віддається більша перевага, нуклеїнова кисловключає амінокислотну послідовність, яка відповіта, яка кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга дає Послідовності №2 (тобто LCVR 4A5-3.1.1-B4). антитіла, додатково кодує гіперваріабельну ділянЗа варіантом, якому віддається перевага, ця нукку 1 (CDR1) важкого ланцюга 4А5-3.1.1-В4, яка леїнова кислота включає нуклеотидну послідоввключає амінокислотну послідовність, яка відповіність, яка відповідає Послідовності №1, хоча досдає Послідовності №12. За варіантом, якому відвідченому фахівцю буде зрозуміло, що завдяки дається ще більша перевага, ізольована нуклеїновиродженню генетичного коду амінокислотну посва кислота кодує варіабельну ділянку важкого лідовність, яка відповідає Послідовності №2, моланцюга антитіла, яка включає амінокислотну посжуть кодувати інші нуклеотидні послідовності. Згалідовність, яка відповідає Послідовності №10 (подана нуклеїнова кислота може кодувати лише вна HCVR ділянка 4А5-3.1.1-В4). LCVR або може також кодувати константну ділянку 19 89017 20 легкого ланцюга антитіла, функціонально зчеплевключати одну або декілька амінокислотних встану з LCVR. За одним із варіантів втілення, цією вок, делецій, замін, укорочень, злить тощо унаслінуклеїновою кислотою є рекомбінантний вектор док природних мутацій або людської маніпуляції. експресії. Цей винахід охоплює антитіла, які розкриваються у За ще іншим варіантом втілення цей винахід цьому описі, а також додатково включає одну або пропонує ізольовану нуклеїнову кислоту, що кодує декілька амінокислотних замін, за умови, що заміваріабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, яка нені антитіла мають по суті таку саму (або поліпвключає амінокислотну послідовність, яка відповішену чи послаблену, у залежності від потреби) дає Послідовності №10 (тобто HCVR 4A5-3.1.1активність (активності), що і антитіла, які розкриB4). За варіантом, якому віддається перевага, ця ваються у цьому описі. За варіантом, якому віддануклеїнова кислота включає нуклеотидну послідоється перевага, гіперваріабельна ділянка (CDR) за вність, яка відповідає Послідовності №9, хоча досцим винаходом має 3 або менше консервативних відченому фахівцю буде зрозуміло, що завдяки замін. За варіантом, якому віддається перевага, виродженню генетичного коду амінокислотну посгіперваріабельна ділянка (CDR) за цим винаходом лідовність, яка відповідає Послідовності №10, момає 2 або менше консервативних замін. За варіанжуть кодувати інші нуклеотидні послідовності. Згатом, якому віддається перевага, гіперваріабельна дана нуклеїнова кислота може кодувати лише ділянка (CDR) за цим винаходом має одну консерHCVR або може також кодувати константну ділянвативну заміну. Досвідченому фахівцю буде зроку важкого ланцюга антитіла, функціонально зчепзуміло, що антитіла, які мають консервативні амілену з HCVR. Наприклад, згадана нуклеїнова киснокислотні заміни, можуть одержуватись лота може включати константну ділянку IgG1 або різноманітними способами, відомими у цій галузі. IgG4. За одним із варіантів втілення, цією нуклеїНаприклад, може застосовуватись ряд методів новою кислотою є рекомбінантний вектор експремутагенезу, у тому числі постановка полімеразносії. ланцюгової реакції, олігонуклеотид-спрямований Пересічним фахівцям у цій галузі зрозуміло, мутагенез із застосуванням тіофосфату що наслідком модифікацій амінокислотної послі(Amersham Sculptor kit) та за методом Кункеля довності згаданого антитіла може бути антитіло з (Kunkel (dut-ung-)) еквівалентними або вищими функціональними У Таблиці 1 показані прийнятні консервативні характеристиками, порівняно з вихідним антитізаміни, а також заміни, яким віддається перевага. лом. Зміни у антитілах за цим винаходом можуть Таблиця 1 Консервативні заміни Залишок Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) Ile (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) Заміни gly, val, leu, ile, ser, met, thr lys, gln, asn, his Gln Glu Ser Asn Asp Ala, ile, leu, pro, ser, met, val, val Asn, gln, lys, arg Leu, val, met, ala, phe, norleucine norleucine, ile, val, met, ala, phe Arg, gln, asn, his Ala, gly, ile, leu, phe, ser, val Leu, val, ile, ala, trp, tyr Заміна, якій віддається перевага Val Lys Gln Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu Ile Arg Leu Tyr Ala, gly, ile, leu, met, thr, val Ala, gly, ile, leu, met, ser, val tyr, phe trp, phe, thr, ser Ala, ile, leu, met, ser, met, norleu Thr Ser Tyr Phe Leu Цей винахід пропонує також рекомбінантні вектори експресії, які кодують антитіло, що включає поліпептид, вибраний з групи, до складу якої входять поліпептид, який відповідає Послідовності №2; поліпептид, який відповідає Послідовності №4; поліпептид, який відповідає Послідовності №6; поліпептид, який відповідає Послідовності №8; поліпептид, який відповідає Послідовності №10; поліпептид, який відповідає Послідовності №12; поліпептид, який відповідає Послідовності №14; поліпептид, який відповідає Послідовності №16. Цей винахід пропонує також рекомбінантні вектори експресії, як кодують як важкий ланцюг антитіла, так і легкий ланцюг антитіла. Наприклад, за 21 89017 22 одним із варіантів втілення, цей винахід пропонує Фармацевтичні композиції, за типовим варіанрекомбінантний вектор експресії, який кодує: том, повинні бути стерильними і стійкими за умов a) важкий ланцюг антитіла, що має варіабельвиготовлення та збереження. Таким чином, фарну ділянку, яка включає амінокислотну послідовмацевтичні композиції можуть піддаватись стериність, яка відповідає Послідовності № 10; та льній фільтрації після одержання лікарської форb) легкий ланцюг антитіла, що має варіабельми або їхня мікробіологічна прийнятність може ну ділянку, яка включає амінокислотну послідовзабезпечуватись іншим чином. Типова композиція ність, яка відповідає Послідовності № 2. для внутрішньовенного вливання може містити до Після завершення експресії, антитіла у повно250мл рідини, наприклад, стерильного розчину му об'ємі, їхні димери, окремі легкі та важкі ланцюРінгера-Локка з концентрацією антитіл 1-100мг/мл. ги або інші імуноглобулінові форми за цим винаТерапевтичні агенти за цим винаходом можуть усі ходом можуть очищатись за стандартними заморожуватись або ліофілізуватись для збереметодиками цієї галузі, у тому числі шляхом осаження і відновлюватись у придатному стерильнодження за допомогою сульфату амонію, засобами му носії перед застосуванням. Наслідком ліофілііонообмінної хроматографії, афінної хроматогразації та відновлення може бути різний ступінь фії, хроматографії з оберненою фазою, хроматогвтрати активності антитіл (наприклад, зі стандартрафії на колонках із гідрофобною взаємодією, ними імуноглобулінами, IgM антитіла мають схиелектрофорезу у гелі тощо. Для застосування у льність до більшої втрати активності, аніж IgG анфармацевтичних цілях перевага віддається по суті титіла). Для того, щоб компенсувати деяку втрату чистим імуноглобулінам з щонайменше приблизно активності, може виникнути необхідність регулю90-95% гомогенністю, і найбільша перевага віддавання дози рН композиції, буде підбиратись таким ється 98-99% або вищому рівню гомогенності. Пісчином, щоб врівноважити стійкість антитіл (хімічну ля завершення очищення з досягненням часткової та фізичну) і забезпечити зручність для пацієнта або повної гомогенності, поліпептиди можуть запри введенні. Взагалі, прийнятним є рН у межах стосовуватись у терапевтичних або профілактичвід 6 до 8. них цілях, як вказується у цьому описі. TNFSF13b відіграє критичну роль у патології, Антитіла за цим винаходом можуть включапов'язаній з цілим рядом захворювань, що залутись до складу фармацевтичних композицій, причають імунні та запальні фактори. Таким чином датних для введення суб'єкту. За типовим варіанфармацевтична композиція, що містить антитом фармацевтична композиція містить антитіло hTNFSF13b людське антитіло за цим винаходом, або частину антитіла за цим винаходом і фармаможе застосовуватись для лікування захворювань, цевтично прийнятний розчинник, носій та/або нау яких активність hTNFSF13b є шкідливою, наприповнювач. Фармацевтичні композиції для введенклад, імунопатологічних захворювань, у тому числі ня розробляються таким чином, щоб бути автоімунних захворювань та запальних захворюпридатними для вибраного способу введення, фавань. рмацевтично прийнятні розчинники, носій та/або До розладів, яким віддають перевагу, наленаповнювачі, наприклад диспергуючі агенти, бужать (але ними не обмежуються) системний черферні розчини, поверхнево-активні речовини конвоний вовчак, ревматоїдний артрит, ювенільний серванти, солюбілізувальні агенти, агенти для рехронічний поліартрит, артрит Ліма, хвороба Крона, гулювання ізотонічності стабілізатори тощо неспецифічний виразковий коліт, запальна хворозастосовуються відповідним чином. ба кишечнику, астма, алергійні захворювання, Фармацевтична композиція, що містить антипсоріаз, реакція "трансплантат проти хазяїна", відhTNFSF13b людське антитіло за цим винаходом, торгнення-трансплантата органа, гостре або хроможе вводитись ссавцю з підвищеним ризиком або нічне імунопатологічне захворювання, пов'язане з такому, що демонструє патологію або симптоми, трансплантацією органів, саркоїдоз, інфекційні пов'язані з автоімунним захворюванням, напризахворювання, паразитарні захворювання, жіноче клад, системним червоним вовчаком, за допомобезпліддя, автоімунна тромбоцитопенія, автоімунгою стандартних способів введення внутрішньона хвороба щитовидної залози, хронічний лімфовенним, внутрішньоочеревинним підшкірним, матозний тиреоїдит, сухий кератокон'юнктивіт та легеневим, черезшкірним, внутрішньом'язовим, різні форми раку, зокрема, лімфоми або мієломи інтраназальним, суббукальним, сублінгвальним В- чи Т-клітин. шляхом або за допомогою супозиторіїв. За варіантом, якому віддається більша переАнтитіла за цим винаходом можуть включавага, фармацевтична композиція, що містить антитись до складу фармацевтичної композиції, придаhTNFSF13b людське антитіло та/або фрагмент тної для парентерального введення. Перевага антитіла за цим винаходом, застосовується для віддається периферичній системній доставці шлялікування системного червоного вовчака. хом внутрішньовенної, внутрішньоочеревинної або Цим винаходом передбачається також застопідшкірної ін'єкції. Придатні носії для таких ін'єкцій сування анти-hTNFSF13b людського антитіла за є простими. Окрім того, однак, введення можуть цим винаходом для виготовлення лікарського заздійснюватись також через слизові оболонки за собу для лікування щонайменше одного із вищедопомогою інтраназальних аерозолів або супозизгаданих розладів, при якому шкідливою є активторіїв. Придатні лікарські форми для таких спосоність TNFSF13b. бів введення є добре відомими і, як правило, місУ певних ситуаціях антитіло за цим винаходом тять поверхнево-активні речовини, які полегшують буде включатись до складу однієї композиції і ввоперенесення через мембрани. дитись разом з одним або декількома додатковими терапевтичними агентами, які застосовуються 23 89017 24 для лікування автоімунних та/або запальних заможуть застосовуватись для виявлення TNFSF13b хворювань. Перевагою таких комбінованих спосополіпептидів (наприклад, у біологічному зразку, бів лікувального впливу може бути застосування наприклад, сироватці або плазмі) за допомогою менших- доз терапевтичних агентів, що вводяться, стандартного імуноаналізу, наприклад, твердофазавдяки чому запобігаються можливі токсикози зного імуноферментного аналізу (ELISA), радіоіабо ускладнення, пов'язані зі способами лікувальмуноаналізу (RIA) або імуногістохімічних досліного впливу із застосуванням одного лікарського джень. Цей винахід пропонує спосіб виявлення засобу. Досвідченим фахівцям буде зрозуміло, що TNFSF13b у біологічному зразку, що включає кону разі застосування антитіл за цим винаходом як тактування біологічного зразка з антитілом або складової комбінованого способу лікувального частиною антитіла за цим винаходом і виявлення впливу, придатною може виявитись менша доза антитіла (або частини антитіла), зв'язаного з антитіла, аніж у тому разі, коли суб'єкту вводять hTNFSF13b або незв'язаного антитіла (або частилише антитіло (наприклад, завдяки застосуванню ни антитіла) з виявленням, таким чином, комбінованого способу лікувального впливу може hTNFSF13b у біологічному зразку. Згадане антитідосягатись синергічний терапевтичний ефект, що, ло безпосередньо або опосередковано мітиться у свою чергу, дозволяє застосовувати меншу дозу речовиною, що піддається виявленню, для полегантитіла для досягнення потрібного терапевтичношення виявлення зв'язаного або незв'язаного анго ефекту). титіла. Придатними речовинами, що піддаються Фармацевтичні композиції за цим винаходом виявленню, є різні ферменти, простетичні групи, можуть містити "терапевтично ефективну кількість" флуоресцентні матеріали, люмінісцентні матеріаабо "профілактично ефективну кількість" антитіла ли та радіоактивні матеріали. Прикладами придаза цим винаходом. Словосполучення "терапевтичтних ферментів є пероксидаза з хрону, лужна фоно ефективна кількість" означає кількість, ефектисфатаза, -галактозидаза або вну, у дозах та впродовж необхідних періодів часу, ацетилхолінестераза; прикладами придатних комдля досягнення необхідного терапевтичного реплексів простетичних груп є стрептавідин/біотин та зультату. Терапевтично ефективна кількість антиавідин/біотин; прикладами придатних флуоресцетіла може змінюватись у залежності від таких факнтних матеріалів є умбеліферон, флуоресцеїн, торів, наприклад, як хворобливий стан, вік, стать, флуоресцеїну ізотіоціанат, родамін, дихлортриамаса індивіда та здатність антитіла або частини зиніламінфлуоресцеїн, дансилу хлорид або фікоеантитіла викликати необхідну реакцію у згаданого ритрин; прикладом люмінесцентного матеріалу є індивіда. Терапевтично ефективною кількістю є люмінол; прикладами придатних радіоактивних також кількість, при якій токсичні або шкідливі матеріалів є 125І, 131І, 35S або 3Н. ефекти антитіла або частини антитіла, які вона За варіантом, альтернативним міченню антимістить, переважуються терапевтично благотвортіла, TNFSF13b може аналізуватись у біологічних ними ефектами. Словосполучення "профілактично рідинах засобами конкурентного імуноаналізу із ефективна кількість" означає кількість, ефективну, застосуванням стандартів TNFSF13b, мічених реу дозах та впродовж необхідних періодів часу, для човиною, що піддається виявленню та неміченого досягнення необхідного профілактичного резульанти-hTNFSF13b людського антитіла. У цьому тату. За типовим варіантом, оскільки профілактичаналізі, біологічний зразок, мічені стандарти на доза застосовується на суб'єктах перед або на TNFSF13b та анти-hTNFSF13b людське антитіло ранній стадії захворювання, профілактично ефекоб'єднуються і визначається кількість міченого тивна кількість буде меншою, аніж терапевтично стандарту TNFSF13b, яка зв'язалась із неміченим ефективна кількість. антитілом. Кількість TNFSF13b у біологічному зраСхема приймання лікарського засобу може резку є обернено пропорційною до кількості міченого гулюватись для забезпечення одержання оптимастандарту TNFSF13b, яка зв'язалась з антильної бажаної реакції (наприклад, терапевтичної hTNFSF13b людським антитілом. або профілактичної реакції). Наприклад, може За іншим варіантом втілення цей винахід провводитись одна ударна доза, декілька невеликих понує застосування антитіла, яке нейтралізує акдоз, що повторюються через певні періоди часу тивність TNFSF13b шляхом зв'язування з антигенабо доза може бути пропорційно зменшеною або ною детермінантою TNFSF13b. Згадана антигенна збільшеною у залежності від вимог терапевтичної детермінанта була ідентифікована, як описано у ситуації. Прикладі 10. Для посилання, розчинна частина Приймаючи до уваги їхню здатність до зв'язуhTNFSF13b виглядає таким чином: вання із hTNFSF13b , антитіла за цим винаходом Амінокислоти hTNFSF13b, залучені до зв'язування нових анти-hTNFSF13b людських антитіл, включають щонайменше одну амінокислоту, вибрану з групи, до складу якої входять: треонін у положенні 69, лізин у положенні 71, треонін у положенні 72, тирозин у положенні 73, глутамінова кислота у положенні 105, треонін у положенні 106, лейцин у положенні 107 та аспарагінова кислота у положенні 109. За іншим варіантом втілення амінокислоти, залучені до зв'язування нових антиhTNFSF13b людських антитіл, включають щонайменше дві амінокислоти, вибрані з групи, до скла 25 89017 26 ду якої входять: треонін у положенні 69, лізин у Flanders, штат Нью-Джерсі). Були використані миположенні 71, треонін у положенні 72, тирозин у ші обох ліній: НСо7 та НСо12. Мишей імунізували положенні 73, глутамінова кислота у положенні 15-50мкг розчинного hTNFSF13b у RIВІ, повному 105, треонін у положенні 106, лейцин у положенні ад'юванті Фрейнда або неповному ад'юванті 107 та аспарагінова кислота у положенні 109. За Фрейнда. Вісьмом мишам із сироватковими титраіншим варіантом втілення амінокислоти, залучені ми антитіл до hTNFSF13b інтравенозно вводили до зв'язування нових анти-hTNFSF13b людських 10мкг hTNFSF13b у забуференому фосфатом фіантитіл, включають щонайменше три амінокислозіологічному розчині (PBS). Селезінки усіх мишей ти, вибрані з групи, до складу якої входять: треонін видаляли через три дні і зливали з мієломними у положенні 69, лізин у положенні 71, треонін у клітинами за методом, опис якого було наведено у положенні 72, тирозин у положенні 73, глутамінова роботі Золя (Zola) (Золя Г. (Zola H.), Monoclonal кислота у положенні 105, треонін у положенні 106, Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, лейцин у положенні 107 та аспарагінова кислота у Boca Raton, FL. (1987)). положенні 109. За іншим варіантом втілення аміГібридоми випробували на зв'язування з нокислоти, залучені до зв'язування нових антиhTNFSF13b і для того, щоб пересвідчитись у тому, hTNFSF13b людських антитіл, включають щонайщо вони експресують важкі та легкі ланцюги людменше чотири амінокислоти, вибрані з групи, до ського імуноглобуліну. Зв'язування антитіл з складу якої входять: треонін у положенні 69, лізин hTNFSF13b виявляли засобами ELISA таким чиу положенні 71, треонін у положенні 72, тирозин у ном: положенні 73, глутамінова кислота у положенні Планшети сенсибілізували 50мкл розчину 105, треонін у положенні 106, лейцин у положенні (5мкг/мл) hTNFSF13b у РВS впродовж ночі при 107 та аспарагінова кислота у положенні 109. За температурі 4°С. Після цього планшети випорожіншим варіантом втілення амінокислоти, залучені нювали і блокували сумішшю 100мкл PBS 0,05% до зв'язування нових анти-hTNFSF13b людських твін 20 (PBST) 5% курячої сироватки впродовж антитіл, включають лізин у положенні 71, треонін у 1год при кімнатній температурі. Після потрійного положенні 72, тирозин у положенні 73 та глутаміпромивання PBST, планшети висушували і до конову кислоту у положенні 105. жної лунки вносили 100 мкл розбавлених вторинЗа іншим варіантом втілення амінокислоти, них реактивів (HRP (пероксидаза з хрону)залучені до зв'язування нових анти-hTNFSF13b HulgGFc, №109-036-098 за каталогом фірми людських антитіл, включають глутамінову кислоту Jackson або HRP-HuKappa, №А80-115Р за каталоу положенні 105 і щонайменше одну амінокислоту, гом фірм Bethyl; 1:5000 у блокувальному буфері). вибрану з групи, до складу якої входять: треонін у Після інкубування при кімнатній температурі впроположенні 69, лізин у положенні 71, треонін у подовж 1год планшети тричі промивали як описуваложенні 72 та тирозин у положенні 73. За іншим лось вище. Планшети проявляли за допомогою варіантом втілення амінокислоти, залучені до зв'я10мл цитратно-фосфатного буфера (рН4,8), 80мкл зування нових анти-hTNFSF13b людських антитіл, ABTS (2,2'-азино-ди-(3включають треонін у положенні 106 і щонайменше етилбензтіазолінсульфонат)), 8мкл Н2О2 на планодну амінокислоту, вибрану з групи, до складу якої шет. Після інкубування впродовж періоду часу від входять: треонін у положенні 69, лізин у положенні 30хв до 1год при кімнатній температурі, оптичну 71, треонін у положенні 72 та тирозин у положенні густину планшетів зчитували при А415-А490. Для 73. За іншим варіантом втілення, амінокислоти, субклонування відбирали гібридоми, які демонзалучені і зв'язування нових анти-hTNFSF13b стрували зв'язування з hTNFSF13b і являли собою людських антитіл, включають лейцин положенні важкий ланцюг та легкий ланцюг каппа людського 107 і щонайменше одну амінокислоту, вибрану з IgG. групи, до складу якої входять: треонін у положенні Культуральні середовища субклонованих гіб69, лізин у положенні 71, треонін у положенні 72 та ридом концентрували у тангенціальних фільтрутирозин у положенні 73. За іншим варіантом втівальних системах Amicon ProFlux M12 із застосулення амінокислоти, залучені до зв'язування нових ванням ультрафільтрувальних мембран Amicon aHra-hTNFSF13b людських антитіл, включають S3Y30 UF. Концентровані живильні середовища аспарагін у положенні 109 і щонайменше одну пропускали через колонки protein-A Sepharose амінокислоту, вибрану з групи, до складу якої вхо(колонка 5-20мл) зі швидкістю 5мл/хв. Колонки дять: лізин у положенні 71, треонін у положенні 72 промивали буфером A (PBS, рН7,4) доти, доки та тирозин у положенні 73. оптична густина не поверталась до вихідного рівЗа іншим варіантом втілення амінокислоти, ня, і зв'язані поліпептиди елюювали 50мМ розчизалучені до зв'язування нових анти-hTNFSF13b ном лимонної кислоти, рН3,2. Фракції негайно нейлюдських антитіл, включають лізин у положенні 71, тралізували 1М трис-буфером, рН8,0. Після цього треонін у положенні 72, тирозин у положенні 73 та фракції аналізували шляхом електрофорезу у поглутамінову кислоту у положенні 105. ліакриламідному гелі у присутності додецилсульПодальші приклади призначені для ілюструфату натрію (SDS-PAGE). Фракції, що містили анвання, а не для обмеження цього винаходу. титіло, об'єднували і концентрували за допомогою Приклад 1: Одержання анти-hTNFSF13b людцентрифугальної фільтрувальної установки ських моноклональних антитіл Ultrafree (Milliроге, смуга пропускання фільтра Моноклональні антитіла одержували за техно10кДа). TM логією HuMAb-Mouse у медарексі (Medarex) Приклад 2: Функціональна активність антишляхом імунізації мишей розчинним hTNFSF13b hTNFSF13b людських антитіл (амінокислоти 133-285, закуплені від фірми RDI, 27 89017 28 Нейтралізуючу активність анти-hTNFSF13b Експерименти із застосуванням системи ВІАлюдських антитіл за цим винаходом визначали за Соге здійснювали для визначення того, чи зв'язудопомогою лінії мишачих IL-1-залежних В-клітин, ються ненейтралізуючі антитіла та нейтралізуючі Т1165.17. Згадані клітини тричі промивали експеантитіла з однією і тією самою ділянкою на риментальним живильним середовищем hTNFSF13b. По-перше 4А5-3.1.1-В4 наносили на (RPMI1640, що містить 10% FBS (сироватка зародчип із подальшим впорскуванням спочатку ка великої рогатої худоби), 1мМ розчин пірувату hTNFSF13b, а потім насичувальної кількості ненейтралізуючого антитіла. Після досягнення насинатрію, 5 10 5М розчин 2-меркаптоетанолу, пенічення через чип пропускали 4А5-3.1.1-В4 у високій цилін, стрептоміцин та фунгізон) для видалення ILконцентрації. Одинадцять ненейтралізуючих анти1 Клітини ресуспендували з концентрацією 100000 тіл виявились нездатними до конкурування із 4А5клітин/мл з експериментальному живильному се3.1.1-В4 за одне і те саме місце зв'язування. Одна редовищі, що містило 2,5нг/мл розчинного ненейтралізуюча гібридома виявилась здатною до huTNFSF13b, висівали з концентрацією 5000 кліблокування зв'язування 4А5-3.1.1-В4 приблизно на тин/лунку на 96-лунковий планшет і інкубували при 45%, що вказує на те, що вона може мати антитемпературі 37°С у 5% СО2. Супернатанти ELISAгенну детермінанту поблизу від антигенної детерпозитивних гібридом включали у розведенні 1:4. мінанти 4А5-3.1.1-В4. Через 48год додавали 20мкл розчину Promega За допомогою тієї самої експериментальної CellTiter 96 Aqueous One Solution (Madison, штат схеми визначили, що нейтралізуюче моноклонаВісконсин) і планшет додатково інкубували впрольне антитіло (mAb), 4А5-3.1.1-В4, могло конкурудовж 5 год, при температурі 37°С у 5% СO2. Оптивати за те саме місце зв'язування, що і один із чну густину, для визначення проліферації, визнарецепторів hTNFSF13b, ТАСІ. Результати цих ексчали при А490. Приклад нейтралізуючої активності периментів дозволяють зробити припущення про одного із гібридомних супернатантів, 4А5-3.1.1-В4, те, що TACI-Fc та 4А5-3.1.1-В4 можуть мати на показано на Фіг.1. Антитіла, для контролю, додаhTNFSF13b антигенні детермінанти, що взаємно вали до IL-1-стимульованих клітин. Ознак пригніперекриваються. чення IL-1-стимульованої проліферації не спосте4А5-3.1.1-В4 іммобілізували на твердій фазі рігалось, проліферацію стимулював лише шляхом пропускання розчину антитіла над смолою hTNFSF13b. для ІМАС (афінна хроматографія з іммобілізоваНейтралізуючі антитіла перевіряли на здатним іоном металу), навантаженою СО+2. Після ність до пригнічення стимульованої проліферації зв'язування кобальт окиснювали до стану 3 шлялюдських ембріональних В-клітин у відповідь на анти-IgM стимуляцію. Людські ембріональні Вхом інкубування згаданої смоли з розбавленим клітини виділяли з людської крові шляхом СD19розчином пероксиду. Після промивання смоли позитивної селекції із застосуванням системи магнативний hTNFSF13b та hTNFSF13b, підданий нітної ізоляції MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, штат модифікації (шляхом відновлення/алкілування або Каліфорнія). В-клітини вносили до лунок 96теплової денатурації), пропускали через колонку. Після промивання зв'язаний білок елюювали кислункового планшета з концентрацією 2 105 клілотним розчином і елюйовані білки аналізували тин/лунку у повному живильному середовищі засобами MALDI MS (мас-спектрометрія з іонізаціRPMI, що містило 10% FCS (повним живильним єю методом лазерної десорбції у матричному розсередовищем RPMI є живильне середовище чині). 4А5-3.1.1-В4 зв'язувало нативний рекомбіRPMI1640, що містить 10мМ розчин L-глутаміну, нантний hTNFSF13b, але не зв'язувало ні хімічно, 100Од/мл пеніциліну, 100мкг/мл стрептоміцину, ні термічно модифікований hTNFSF13b. Таким 1мМ розчин пірувату натрію, 0,1мМ розчин замінчином, видається, що 4А5-3.1.1-В4 розпізнає конних амінокислот та 1 10 5М розчин формаційну антигенну детермінанту на розчинномеркаптоетанолу). Деякі лунки сенсибілізували му hTNFSF13b. розчином (10мкг/мл) антилюдського IgM у PBS Рекомбінантний розчинний hTNFSF13b (RDI) (фірма BD PharMingen/ Clone G20-127) впродовж інкубували з 4А5-3.1.1-В4 або анти-TNFSF13b кроночі при температурі 4°С і промивали чотири рази лячим поліклональним антитілом (МоВіТес, Marco за допомогою PBS перед використанням. Деякі Island, FL; проти амінокислот 254-269 hTNFSF13b) клітини стимулювали розчинним hTNFSF13b на льоду впродовж 2год, і суміш білків піддавали (25нг/мл) у присутності або за відсутності нейтрависокоефективному рідинному гельлізуючого hTNFSF13b антитіла (2,5мкг/мл). Фіг.2 хроматографуванню (дві послідовно сполучені ілюструє здатність 4А5-3.1.1-В4 до нейтралізації колонки TosoHaas TSK-GEL G3000PW, урівноваефекту стимуляції hTNFSF13b. жені PBS, зі швидкістю 0,25мл/хв.). Білки елююваПриклад 3. Визначення характеристик монокли за допомогою PBS. Як контролі, розчини антилональних антитіл тіл і розчин hTNFSF13b аналізували окремо. Усі згадані нейтралізуючі анти-hTNFSF13b анЛюдський TNFSF13b елюювали з гельтитіла були людськими IgG1 або людськими IgG4. хроматографічної колонки у положенні, яке відпоВони аналізувались також на здатність до зв'язувідало тримеру молекули TNFSF13b. Елюювання вання із hTNFSF13b у денатурованому стані, тобто тримерного hTNFSF13b зсувалось на більш ранню hTNFSF13b відокремлювали за допомогою SDSчасову точку у присутності 4А5-3.1.1-В4, але не у PAGE і блотували на нітроцелюлозі. Усі нейтраліприсутності анти-hTNFSF13b поліклональних анзуючі антитіла виявились нездатними до зв'язутитіл, що вказувало на зв'язування тримерного вання hTNFSF13b у вестерн-блотингу у той час як hTNFSF13b з антитілом 4А5-3.1.1-В4. Ці дані додекілька ненейтралізуючих антитіл виявились здазволяють зробити припущення про те, що нейтратними до цього. 29 89017 30 лізуюче моноклональне антитіло 4А5-3.1.1-В4 Приклад 5: Клонування та секвенування антизв'язується з конформаційною антигенною детерген-зв'язувальних ділянок важких та легких ланцюмінантою на hTNFSF13b. гів Приклад 4: Визначення афінності моноклонаВаріабельні ділянки важких та легких ланцюгів льних антитіл за допомогою системи ВІАсоге нейтралізуючого людського моноклонального анАфінність різних анти-hTNFSF13b людських титіла 4А5-3.1.1-В4 клонували і секвенували за антитіл до hTNFSF13b визначали за допомогою наведеними нижче методиками. вимірювальної системи ВІАсоге. Згадана система мРНК одержали з 2 106 гібридомних клітин за використовує оптичні властивості поверхневого методикою Micro-Fast Track (фірма Invitrogen) з плазмонного резонансу для визначення зміни кондодатковим набором. кДНК одержали з 200мкл центрації білків взаємодіючих молекул у межах етанолового преципітату мРНК із застосуванням декстринової біосенсорної матриці. За виключеннабору cDNA Cycle kit (фірма Invitrogen) шляхом ням визначених випадків, усі реактиви і матеріали центрифугування аліквоти мРНК впродовж 30хв були закуплені від фірми ВІАсоге АВ (Upsala, при 14000об/хв. при температурі 4°С із подальшим Швеція). Усі визначення здійснювали при темпепромиванням осаду 70% етанолом. Висушений на ратурі 25°С. Зразки розчиняли у HBS-EP буфері повітрі осад ресуспендували у 11,5мкл стерильної (150мМ розчин NaCl, 3М розчин EDTA (етилендіаводи, і кДНК одержували у відповідності з рекомемінтетраоцтова кислота), 0,005% розчин (у віднондаціями інструкції до набору. Факультативну друшенні маси до об'єму) поверхнево-активної речогу стадію синтезу кДНК випускали, однак кДНК вини Р-20 та 10мМ розчин ГЕПЕС-буфера). очищали на стадії екстрагування феноКозячий антимишачий IgG (Fc-специфічний; фірма лом/хлороформом та осадження етанолом. Осад Jackson Immunoresearch. West Grove, штат ПенсікДНК ресуспендували у 30мкл ТЕ (Трис-EDTA бульванія) іммобілізували у протоковій кюветі 1 на фер) для використання у полімеразно-ланцюговій сенсорному чипі СМ5 за допомогою набору для реакції. сполучення аміну. Козячий антилюдський IgG (FcПолімеразно-ланцюгові реакції ставили з виспецифічний; фірма Jackson Immunoresearch) імродженими праймерами на 5' кінці варіабельної мобілізували у протоковій кюветі 2 також за доподілянки важкого та легкого ланцюга, спарованими могою набору для сполучення аміну. Обидва анз 3' праймерами на константній ділянці. На кожні титіла були іммобілізовані для досягнення кожним 50мкл реакційної суміші було використано 1мкл рівня 700 одиниць реагування. кДНК. Реакцію здійснювали у відповідності з інЗв'язування рекомбінантного hTNFSF13b (фіструкцією для застосування з Pful з 20 подальширма Research Diagnostics Inc., Flanders, штат Ньюми циклами. Продукти полімеразно-ланцюгової Джерсі) визначали впродовж численних аналітичреакції перевіряли шляхом пропускання 5мкл кожних циклів. Кожен цикл здійснювали при швидкості ної реакційної суміші через 1% агарозний гель. 30мкл/хв., і він включав такі стадії: введення Позитивні реакційні суміші клонували із застосу150мкл 4А5-3.1.1-В4 з концентрацією 20мкг/мл, ванням набору для клонування Zero Blunt TOPO введення 250мкл hTNFSF13b (розпочинаючи з PCR cloning kit (фірма Invitrogen). Мініпрепарати з 50нМ із застосування двократних серійних розвепозитивних клонів секвенували і аналізували для день для кожного циклу) з подальшими 15хв для виявлення продуктивного реаранжування генів. відокремлення та регенерація із застосуванням Шляхом проведення незалежних полімеразно90мкл 10мМ розчину гліцину НСl (рН1,5). ланцюгових реакцій та секвенування численних Швидкість приєднання та відокремлення для клонів одержали послідовності, опис яких наведекожного циклу визначали за допомогою моделі но нижче. зв'язування (1:1) Langmuir із застосуванням комПослідовності легкоголанцюга людського анп'ютерної програми BIAevaluation. Значення КD титіла 4А5-3.1.1-В4 (гіперваріабельні ділянки виді4А5-3.1.1-В4 для hTNFSF13b, за результатами лені жирним шрифтом) визначення, дорівнювало 38пМ. 31 89017 32 Послідовності важкого ланцюга людського антитіла 4А5-3.1.1-В4 (гіперваріабельні ділянки виділені жирним шрифтом, сигнальна послідовність виділена курсивом) 33 Приклад 6: Видова перехресна реактивність анти-hTNFSF13b людських антитіл з нелюдським TNFSF13b З метою визначення видової перехресної реактивності нейтралізуючих моноклональних антитіл, твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) провели із застосуванням 4А5-3.1.1-В4 як іммобілізованого, так і ідентифікувального моноклонального антитіла. Людський рекомбінантний TNFSF13b використали, як стандартну криву. Людський TNFSF13b може виявлятись у культуральному супернатанті СНО клітин, трансфікованих вектором, що експресує hTNFSFBb, супернатантах культури людських моноцитів, людській сироватці або плазмі. Супернатанти СНО клітин, що експресують мишачий TNFSF13b, випробували на реактивність у ELISA і одержали негативний результат. 4А5-3.1.1-В4 також виявилось нездатним до утворення імунопреципітату з мишачим TNFSF13b, однак було здатним до утворення імунопреципітату з людським TNFSF13b. 89017 34 Мишачий TNFSF13b застосовували у реакції проліферації, опис якої наведено у Прикладі 2. За результатами реакції проліферації встановили, що 4А5-3.1.1-В4 виявилось нездатним до нейтралізації проліферації, індукованої мишачим TNFSF13b. Це вказує на те, що 4А5-3.1.1-В4 є нездатним до розпізнавання мишачого TNFSF13b. Приклад 7: Амінокислотна послідовність важкого ланцюга 4А5-3.1.1-В4 Нижче наведена амінокислотна послідовність важкого ланцюга антитіла 4А5-3.1.1-В4, який включає HCVR та константну ділянку IgG4. Людська константна ділянка IgG4 має серин у положенні 231. Однак серин у положенні 231 замінили на пролін, що внесло структурну зміну у шарнірну ділянку для одержання оптимальних міжланцюгових дисульфідних зв'язків. Це зменшує рівень утворення напівантитіл. Напівантитіла утворюються з одного важкого ланцюга і одного легкого ланцюга. 35 89017 36 Окрім того, для послаблення ефекторної фуПриклад 8: Амінокислотна послідовність важнкції згаданого антитіла, фенілаланін у положенні кого ланцюга 4А5-3.1.1-В4 237 може бути заміненим на аланін, а лейцин у Нижче наведена амінокислотна послідовність положенні 238 може бути заміненим на аланін важкого ланцюга антитіла 4А5-3.1.1-В4, який або глутамінову кислоту. включає HCVR та константну ділянку IgG1. Приклад 9: Амінокислотна послідовність легкого ланцюга 4А5-3.1.1-В4 Нижче наведена амінокислотна послідовність легкого ланцюга антитіла 4А5-3.1.1-В4, який включає LCVR та константну ділянку каппа. Приклад 10: Ідентифікація антигенної детермінанти 4А5-3.1.1-В4 Визначили антигенну детермінанту, з якою зв'язується 4А5-3.1.1-В4 і нейтралізує людський TNFSF13b. Послідовності людського та мишачогоTNFSF13b були впорядковано розміщені, як показано нижче: Виходячи з відомої кристалічної структури декількох членів сімейства TNF, створили гомологічну модель людського TNFSF13b. Доступні залишки, якими різняться мишачий та людський TNFSF13b, є потенційними місцями зв'язування для 4А5-3.1.1-В4, оскільки 4А5-3.1.1-В4 нейтралізує людський, але не мишачий TNFSF13b. Ідентифікували три потенційні антигенні детермінанти: 1) К71, Т72, Y73, Е105; 2) Q26, S29, L139, D140; 3) L53, К55, Е56, К119. Мутагенез з метою одержання химерних молекул здійснили шляхом заміни амінокислотної послідовності з людської на мишачу. Химера A: L139R, D140N; Химера В: К71Р, Т72І, Y73F; Химера С: К71Р, Т72І, Y73F, Е105К; Химера D: L53V, K55R, E56Q; Химера Е: Е105К. За допомогою реакції проліферації, опис якої було наведено у Прикладі 2, усі химери були перевірені на функціональну активність та нейтралізацію 4А5-3.1.1-В4. Початкові реакції були поставлені з використанням супернатантів 293 тимчасових трансфекцій для кожної з химер та вихідних молекул як людського, так і мишачого TNFSF13b. Усі химери індукували подібну проліферацію, що вказує на те, що одержані химери були функціональними. У разі використання 6мкг/мл 4А5-3.1.1-В4, спостерігали 100% нейтралізацію людського TNFSF13b та химер А, В, D та Е. Нейтралізації мишачого TNFSF13b або химери С не спостерігалось. Для химер А, В та С одержали очищені TNFSF13b мутанти і згадану реакцію повторили з використанням 11нг/мл кожного вихідного TNFSF13b або химерного TNFSF13b та 1мкг/мл 4А5-3.1.1-В4. Результати показали, що спостерігалась 100% нейтралізація людського TNFSF13b та химери А, 88% нейтралізація химери В; нейтралізація мишачого TNFSF13b або химери С не спостерігалась. Приклад 11: In vivo дослідження із застосуванням 4А5-3.1.1-В4 Трансгенних мишей з надекспресією розчинного людського TNFSF13b одержали за відомими методами, опис яких наведено у роботі Хоган Б. (Hogan В.) та інших (1986), [Manipulating the 37 89017 38 Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring лідними мишами. Спостерігалось також незначне Harbor Laboratory, NY], модифікованими Фокс зростання периферичних Т-клітин. hTNFSF13b(Fox) та Солтер (Solter) (Моl. Cell. Biol. 8:5470, трансгенних мишей піддавали обробці 4А5-3.1.11988). Стисло, чоловічим пронуклеусам щойно В4 для визначення, чи приведе нейтралізація запліднених одноклітинних зародків (зигот) лінії hTNFSF13b до зменшення кількості В-клітин до FVB/N робили мікроін'єкцію фрагмента ДНК, що нормальних рівнів. У 15-тижневому віці включав ген hTNFSF13b. Зародки культивували hTNFSF13b-мишам-caмицям двічі на тиждень in vitro впродовж ночі до досягнення ними двоклівпродовж трьох тижнів підшкірно впорскували тинної стадії розвитку. Після цього двоклітинні 25мкг 4А5-3.1.1-В4 або ізотипового контрольного зародки трансплантували до яйцепроводів псевантитіла. Через чотири дні після останнього вподовагітних мишей лінії CD-1 для їх розвитку до рскування антитіла мишей забивали і селезінку встановленого строку. Для визначення присутновидаляли для аналізів. Кількість В- та Т-клітин сті трансгену у новонароджених мишей, у кожної підраховували шляхом визначення відсотка тварини видаляли невеликий фрагмент пальця CD19 клітин, у разі В-клітин, та CD3 клітин, у стопи і піддавали його гідролітичному розщепразі Т-клітин, із застосуванням протокової цитоленню для виділення нуклеїнових кислот. Зразок метрії та абсолютної лейкоцитарної формули для екстракту пальця стопи у подальшому піддавали кожної .селезінки. Наведені нижче результати аналізу засобами полімеразно-ланцюгової реакції показують, що введення in vivo 4А5-3.1.1-В4 для ідентифікування мишей, які мали трансгени. hTNFSF13b-трансгенним мишам може відновити У hTNFSF13b-трансгенних мишей спостерінормальні кількості Т- та В-клітин (середнє знагалось різке збільшення периферичних В-клітин, чення середнє квадратичне відхилення) в загальній кількості приблизно у три рази, порівняно з підібраними за віком та статтю одноприпВ-клітини ( 106) Експериментальна група Одноприплідні миші дикого типу Трансгенне+ізотипове моноклональне антитіло Трансгенне+4А5 моноклональне антитіло Т-клітини ( 106) 29 11 122 30 29 5 46 15 75 14 46 12 Послідовності за цим винаходом: Послідовність № 1 полінуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга Послідовність №2 амінокислотна послідовність, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга Послідовність №3 полінуклеотидна послідовність, що кодує гіперваріабельну ділянку (CDR1) легкого ланцюга AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCCGCTATTAGCC Послідовність №4 амінокислотна послідовність, що кодує гіперваріабельну ділянку (CDR1) легкого ланцюга RASQSVSRYLA Послідовність №5 полінуклеотидна послідовність, що кодує гіперваріабельну ділянку (CDR2) легкого ланцюга GATGCATCCAACAGGGCCACT Послідовність №6 амінокислотна послідовність, що кодує гіперваріабельну ділянку (CDR2) легкого ланцюга DASNRAT Послідовність №7 полінуклеотидна послідовність, що кодує гіперваріабельну ділянку (CDR3) легкого ланцюга CAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCGGACG Послідовність №8 амінокислотна послідовність, що кодує гіперваріабельну ділянку (CDR3) легкого ланцюга QQRSNWPRT Послідовність №9 полінуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга 39 Послідовність №10 89017 40 амінокислотна послідовність, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга Послідовність №11 го ланцюга полінуклеотидна послідовність, що кодує гіперваріабельну ділянку (CDR1) важко Послідовність №12 ланцюга амінокислотна послідовність, що кодує гіперваріабельну ділянку (CDR1) важкого Послідовність №13 го ланцюга полінуклеотидна послідовність, що кодує гіперваріабельну ділянку (CDR2) важко Послідовність №14 го ланцюга амінокислотна послідовність, що кодує гіперваріабельну ділянку (CDR2) важко Послідовність №15 го ланцюга полінуклеотидна послідовність, що кодує гіперваріабельну ділянку (CDR3) важко Послідовність №16 ланцюга амінокислотна послідовність, що кодує гіперваріабельну ділянку (CDR3) важкого 41 89017 42 43 89017 44 45 89017 46 47 89017 48 49 89017 50 51 89017 52 53 89017 54 55 89017 56 57 89017 58 59 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 89017 Підписне 60 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Human antibody that specifically binds to htnfsf13b

Автори англійською

Gelfanova Valentina Pavlovna, Hale John Edward, Kikly Kristine Kay, Witcher Derrick Ryan, Rathnachalam Rahakrishnan

Назва патенту російською

Человеческое антитело, которое специфически связывается с человеческим тнфсф13б

Автори російською

Гельфанова Валентина Павловна, Хейл Джон Эдуард, Кикли Кристин Кей, Уитчер Деррик Райан, Ратначалам Радхакришнан

МПК / Мітки

МПК: C07K 16/28

Мітки: людським, специфічно, зв'язується, антитіло, людське, tnfsf13b

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/30-89017-lyudske-antitilo-shho-specifichno-zvyazuehtsya-z-lyudskim-tnfsf13b.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Людське антитіло, що специфічно зв’язується з людським tnfsf13b</a>

Подібні патенти