Композиція глікозилованого альфа-фетопротеїну та індукторів апоптозу для лікування раку

1. Композиція, що містить нековалентний комплекс для орального введення з глікозилованого альфа-фетопротеїну (AFP), одержаного від ссавця і приготовленого з сировинного матеріалу за допомогою екстракції бутанолом, і щонайменше одного агента, що індукує апоптоз, який вибраний з групи, що складається з агентів, які підвищують проникність мітохондріальної мембрани, агентів, що індукують відкривання мітохондріальних пор, іонофорів, активаторів каспази 9, активаторів каспази 3 і ретиноїдів, причому щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язаний з глікозилованим AFP. 2. Композиція за п. 1, в якій представлені два агенти, що індукують апоптоз, які оборотно зв'язані з глікозилованим AFP. 3. Композиція за п. 1 або 2, в якій глікозилований AFP одержаний наступним чином: (a) збиранням крові і амніотичної рідини від ембріонів ссавців на терміні вагітності приблизно від 3 до 14 тижнів; (b) розділенням зібраної на стадії (а) крові і амніотичної рідини на супернатант і преципітат; (c) збиранням супернатанту, одержаного на стадії (b); (d) концентруванням супернатанту, одержаного на стадії (с) з одержанням концентрованого розчину; (e) додаванням бутанолу до концентрованого розчину зі стадії (d) до одержання кінцевої концентрації бутанолу у розчині, що приблизно складає від 5 % до 10 %; (f) перемішуванням розчину бутанолу, одержаного на стадії (e); 2 (19) 1 3 94924 4 ції бутанолу у розчині, що приблизно складає від 5 % до 10 %; (f) перемішуванням розчину бутанолу, одержаного на стадії (e); (g) розділенням розчину бутанолу, одержаного на стадії (f), на верхню безводну фазу і нижню водну фазу; і (h) збиранням безводної фази, одержаної на стадії (g), з одержанням кінцевого розчину, що містить глікозилований AFP. 11. Спосіб екстракції AFP з сировинного матеріалу від ссавця з використанням бутанолу, що включає в себе наведені далі послідовні стадії: (a) збирання крові і амніотичної рідини від ембріонів ссавців на терміні вагітності приблизно від 3 до 14 тижнів; (b) розділення зібраної на стадії (а) крові і амніотичної рідини на супернатант і преципітат; (c) збирання супернатанту, одержаного на стадії (b); (d) концентрування супернатанту, одержаного зі стадії (с) з одержанням концентрованого розчину; (e) додавання бутанолу до концентрованого розчину з етапу (d) до одержання кінцевої концентрації бутанолу у розчині, що приблизно складає від 5 % до 10 %; (f) перемішування розчину бутанолу, одержаного на стадії (e); (g) розділення розчину бутанолу, одержаного на стадії (f), на верхню безводну фазу і нижню водну фазу; і (h) збирання безводної фази, одержаної на стадії (g), з одержанням кінцевого розчину, що містить глікозилований AFP. 12. Спосіб за п. 11, в якому джерелом матеріалу від ссавців і їх ембріонів служать людина, примати, велика рогата худоба, коні, собаки, коти або вівці. 13. Спосіб за п. 11, в якому джерелом матеріалу від ссавців і їх ембріонів служить свиня. 14. Спосіб за будь-яким з пп. 11-13, в якому глікозилований AFP, одержаний на стадії (h), знаходиться у вільному (незв'язаному) стані. 15. Застосування глікозилованого AFP, одержаного відповідно до способу за будь-яким з пп. 11-14, для доставки в організмі хворого щонайменше одного агента, що індукує апоптоз, який вибраний з групи, що складається з агентів, що підвищують проникність мітохондріальної мембрани, агентів, що індукують відкриття мітохондріальних пор, іонофорів, активаторів каспази 9, активаторів каспази 3 і ретиноїдів, у ракову клітину, що експресує на своїй поверхні щонайменше один рецептор AFP, причому щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язується з глікозилованим AFP, а глікозилований AFP специфічно зв'язується щонайменше з одним рецептором AFP. 16. Застосування композиції за будь-яким з пп. 110 для одержання лікарського засобу для націле ної доставки в організмі хворого щонайменше одного агента, що індукує апоптоз, у ракову клітину, що експресує на своїй поверхні щонайменше один рецептор AFP, причому щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язується з глікозилованим AFP, а глікозилований AFP зв'язується щонайменше з одним рецептором AFP. 17. Застосування композиції за будь-яким з пп. 110 для інгібування проліферації ракової клітини у хворого, причому зазначена ракова клітина експресує на своїй поверхні щонайменше один рецептор AFP, де щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язується з глікозилованим AFP, a глікозилований AFP зв'язується щонайменше з одним рецептором AFP на клітинній поверхні. 18. Застосування композиції за будь-яким з пп. 110 для лікування множинної лікарської резистентності рефрактерних злоякісних новоутворень у хворого, що містять ракові клітини, які експресують на своїй поверхні щонайменше один рецептор AFP, де щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язується з глікозилованим AFP, а глікозилований AFP зв'язується щонайменше з одним рецептором AFP на клітинній поверхні. 19. Застосування композиції за будь-яким з пп. 110 для одержання лікарського засобу для інгібування проліферації ракової клітини у хворого, причому зазначена ракова клітина експресує на своїй поверхні щонайменше один рецептор AFP, де щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язується з глікозилованим AFP, а глікозилований AFP зв'язується щонайменше з одним рецептором AFP на клітинній поверхні. 20. Застосування композиції за будь-яким з пп. 110 для одержання лікарського засобу для лікування множинної лікарської резистентності рефрактерних злоякісних новоутворень у хворого, причому у зазначених рефрактерних злоякісних новоутвореннях є ракові клітини, що експресують на своїй поверхні щонайменше один рецептор AFP, де щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язується з глікозилованим AFP, а глікозилований AFP зв'язується щонайменше з одним рецептором AFP на клітинній поверхні. 21. Застосування за будь-яким з пп. 15-20, в якому ракове захворювання вибране з групи, що складається з раку сечового міхура, раку молочної залози, раку товстої і прямої кишки, раку ендометрія, раку нирок, лейкозу, раку печінки, раку легенів, меланоми, неходжкінської лімфоми, раку яєчників, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, раку шкіри, раку яєчок і раку щитовидної залози. 22. Застосування за будь-яким з пп. 15-21, відповідно до якого AFP одержаний згідно з п. 13 або п. 14, і щонайменше один агент, що індукує апоптоз, являє собою атрактилозид. Дана заявка претендує на пріоритет патентної заявки США (серійний номер 11/274906), зміст якої включений у даний документ як посилання у всій повноті. Галузь техніки, якої стосується винахід 5 Даний винахід стосується галузі медицини, особливо, онкології. Винахід пропонує нові композиції і способи для лікування, профілактики і придушення проліферації злоякісних клітин у ссавців, що включають застосування альфа-фетопротеїну (AFP), зв'язаного з індуктором апоптозу. Винахід також передбачає спосіб екстракції бутанолом свинячого альфа-фетопротеїну, одержаного з крові та амніотичної рідини на ранніх стадіях ембріогенезу. Рівень техніки Альфа-фетопротеїн (AFP) є основним транспортним білком плоду, що діє як човник і має період напіввиведення 3-5 днів (Mizejewski, G.J., у книзі "AFP and Congenital Disorders", pp. 5-34, Academic Press, Orlando, 1985; Abelev, GI, Alphafetoprotein: 25 years of study, Tumor Biology, 10:6374; 1989). Експресія AFP у період розвитку (плоду) строго регламентована, і рівень експресії, що виявляється, у значній мірі залежить від стадії розвитку. Було встановлено, що AFP діє як регулятор росту як в онтогенезі, так і при прогресії пухлин. У зв'язку з експресією у період розвитку і при туморогенезі AFP розглядається як онкофетальний антиген. AFP є глікопротеїном, що належить до суперсімейства альбуміноїдних генів, членом якого також є альбумін. Молекулярна вага AFP може варіювати від 64000 до 72000 дальтон в залежності від джерела походження, стадії розвитку і способу очищення. Процентний вміст зв'язаних вуглеводів варіює від 3% до 5%, знов-таки, в залежності від джерела походження і стадії розвитку. AFP існує у двох основних молекулярних формах: 1) вільна форма і 2) зв'язана форма, в якій AFP з'єднаний з різними лігандами (наприклад, з жирними кислотами, естрогенами, фітостероїдами). Однак були ідентифіковані варіантні форми AFP. Існують різні конформації (голоформи) зв'язаного AFP, що залежать від природи і концентрації приєднаного ліганду (лігандів). Були ідентифіковані молекулярні варіанти AFP людини (HAFP), в яких варіації пов'язані з мікрогетерогенністю вуглеводів (тобто з відмінностями вуглеводних компонентів у сайті глікозилування HAFP), а також з відмінностями ізоелектричних точок (Keel, В.А, et al., CRC Press; vol. 2, 24-31, 1989; Mizejewski, G.J., Exp. Biol. Med. 226(5):377-408, 2001; Morinaga, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(15):4604-8, 1983; Parker, M.H. et al., Purification and characterization of a recombinant version of human AFP expressed in the milk of transgenic goats, Protein Expression and Purification, 38:177-183, 2004). Були виявлені генетичні варіанти HAFP, походження яких приписується специфічній для фаз розвитку експресії мРНК HAFP. Групою авторів Mizejewski G. J. et al. (Tumour Biol. 7(1): 19-36, 1986) була описана циклічна фізіологія AFP за типом "годин розвитку". Автори зазначають, що структура і функція AFP змінюються у ході розвитку організму, причому під час розвитку плоду білок експресується на флуктуючому рівні, а у постнатальному періоді його експресія знижується до нехтувано малого рівня, оскільки у нормі концентрація AFP у сироватці дорослої лю 94924 6 дини складає менше 50 нг/мл (Ruoslahti and Seppala, Int. J. Cancer 8:374-378, 1971). Однак у хворих різними формами раку рівень AFP у плазмі може підвищуватися у тисячу разів (Ruoslahti and Seppala, Adv. Cancer Res. 29:275-310, 1979). На додаток до цього, при багатьох ракових захворюваннях на поверхні пухлинних клітин експресується високий рівень рецепторів AFP (Uriel, J. et al., in "Biological Activities of AFP", CRC Press, 1987, Boca Raton, Florida, vol. 2, pp. 104-117; Мого, R., у книзі "Biological Activities of AFP", CRC Press, 1987, Boca Raton, Florida, vol. 2, pp. 120-127). Таким чином, у людини AFP функціонує не тільки як маркер пороків розвитку плоду у період ембріогенезу, але і як постнатальний пухлинний маркер. Для лікування раку використовують різні хімічні препарати, наприклад, алкалоїдні засоби, антиметаболіти, алкалоїди, антибіотики, гормони та імуномодулятори, раніше відомі у даній галузі знань. Однак ці препарати не мають специфічного націлювання на пухлинні клітини, і їх ефект прийнято називати "фоновим", тобто таким ефектом, коли чутливістю до протиракового засобу володіють також нормальні, непухлинні клітини. Надлишкова експресія рецепторів HAFP (HAFPR) на поверхні злоякісних клітин у порівнянні з нехтувано малою експресією рецепторів на нормальних клітинах послужила стимулом для досліджень з застосування HAFP як носія/транспортувальника протиракових ліків (Severin, S. Ε. et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 37(2):385-92, 1995; Severin, S.E. et al., Dokl. Akad. Nauk 366(4): 561-4, 1999), що специфічно націлює їх на ракові клітини. Було продемонстровано, що HAFP може націлювати кон'югати протиракових ліків на пухлинні клітини (Moskaleva et al., Cell Biol Int. 21(12):793-799, 1997; Sotnichenko et al., FEBS Letters 450:49-51, 1999; U.S. Patent No. 6,630,445 to Murgita). Підвищення ефективності ліків, пов'язане з їх специфічним націлюванням на пухлинні клітини, обумовлене високою специфічністю HAFP стосовно ракових клітин, що несуть рецептори для AFP. На додаток до цього, такий спосіб доставки активного агента безпечніший для хворого, оскільки нормальні оточуючі клітини не зачіпаються. HAFP утворює зв'язки з багатьма протираковими ліками, включаючи доксорубіцин, дауноміцин, каліхеаміцин, карбоксифосфамід, блеоміцетин, хлорбутин, цисплатинум, метотрексат і карміноміцин, які описані у літературі (Moskaleva et al., Cell Biol. Int. 21(12):793-799, 1997; Lutsenko et al., Tumor Biology 21(6):367-374, 2000). У цих випадках активні агенти були зв'язані з HAFP за допомогою методів хімічної кон'югації, що дають утворення ковалентних зв'язків між HAFP і протираковим агентом. Оптимальне молярне співвідношення АРР:ліки у кон'югатах AFP-ліки, що дозволяють інгредієнтам з'єднуватися без втрати їх біологічної активності і забезпечує цілеспрямовану доставку ліків за даними наукових досліджень, складає 1:2 (Feldman, N.B. et al., Biochemistry 65:1140-1145, 2000). Такого ж молярного співвідношення 1:2 можна досягти при нековалентному зв'язуванні AFP і діоксину (Sotnichenko et al., FEBS Letters 450:49-51, 1999). 7 Група авторів Herve et al. (у книзі "Biological activities of alpha-fetoprotein", Florida Congresses, ed. Mizejewski, G.J., CRC Press, Inc., Boca Raton, Vol. 1, 1987) продемонструвала сайта зв'язування варфарину і фенілбутазону на щурячому AFP, подібні до таких для альбуміну. На додаток до цього, вони продемонстрували, що ці агенти зв'язуються з AFP у тому самому великому гідрофобному кармані, нарівні з естрогенами, жирними кислотами, піразольними сполуками і пропіоновими ліками. В огляді, представленому Mizejewski (Mizejewski, G.J., у книзі "AFP and congenital disorders", ed. G.J. Mizejewski, Academic Press, Inc., 1985), наводяться дані про те, що жирні кислоти здатні зв'язуватися з AFP людини і AFP гризунів, тоді як фітоестрогени здатні зв'язуватися тільки з AFP гризунів, а це свідчить про міжвидові відмінності в особливостях зв'язування AFP. Основним джерелом AFP, використовуваним в експериментах з націленої доставки AFP/ліків був AFP людини, або виділений з жіночої ретроплацентарної сироватки (Moskaleva et al., Cell Biol Int. 21(12):793-799, 1997), або матеріал плодового походження (www.alfetin.ru). Плодовий матеріал людини важко одержувати через бідність джерел (екстрагування з абортного матеріалу у терміні вагітності до 12 тижнів), що робить його занадто дорогим. У Росії плодовий (фетальний) AFP людини зареєстрований як імуномодулюючий ін'єкційний лікарський препарат під назвою "Альфетин" (1 ампула містить 0,075 мг AFP 95% чистоти). Таким чином, дуже корисні і вигідні були б альтернативні джерела AFP, здатного доставляти цитотоксичні агенти у ракові клітини. За опублікованими даними протиракові агенти з різними способами дії запускають апоптоз у клітинах, чутливих до хіміотерапевтичних препаратів (Fisher, Cell 78:539-542, 1994). Основну роль в апоптотичній загибелі клітин, включаючи клітинну смерть, індуковану протираковими агентами, відіграють зміни у мітохондріальній функції, зокрема, проникність мітохондріальної мембрани і/або альтерації у поровому комплексі перехідної проникності (Kroemer et al., Immunol Today 18:44-51, 1997; Susin et al., J Exp. Med. 186:5-37, 1997; Marchetti et al., J. Exp Med. 184:1155-1160, 1996; Zamzani et al., J. Exp. Med. 183:1533-1544, 1996; Decaudin et al., Can Res 57:62-67, 1997). Багато традиційних хіміотерапевтичних агентів викликають мітохондріальну проникність опосередкованим чином через індукцію ендогенних ефекторів, залучених до фізіологічного контролю апоптозу, наприклад, р53. Однак часті мутації гена р53 при багатьох різноманітних ракових захворюваннях людини роблять ці раки резистентними до впливу традиційних хіміотерапевтичних агентів. Відкриття цитотоксичних агентів, що впливають безпосередньо на мітохондрії, таких як лонідамін, арсеніт, бетулінова кислота і CD437 лягло в основу альтернативної терапевтичної стратегії, застосовної у тих ситуаціях, коли традиційні ліки неефективні через руйнування ендогенних шляхів індукції апоптозу, наприклад, із залученням р53 (див. огляд з цієї проблеми у посиланні Costantini et al., J. Natl. Cancer Institute 92:1042-1053, 2000). У літературі описані цитоток 94924 8 сичні агенти, що націлені на мітохондрії та індукують клітинний апоптоз, наприклад, бетулінова кислота (Fulda, S. et al., J. Biol. Chem. 18; 273 (51): 33942-8, 1998; Pezzuto et al. Публікація патентної заявки США № 20030186945). Costantini et al. у своєму огляді розглядають механізм індукції апоптозу через руйнування мітохондрій за допомогою альтерацій проникності мітохондріальної мембрани і/або змін у поровому комплексі перехідної проникності (РТРС) і перераховують цитотоксичні агенти, що націлені на мітохондрії для індукції апоптозу (J. Natl. Cancer Inst. 92(13): 1042-53, 2000). Застосування єдиного кон'югату HAFP/протираковий агент (наприклад, кон'югату HAFP-естрон-доксорубіцин) розглядається як лімітуючий фактор при лікуванні злоякісних новоутворень у зв'язку з тією обставиною, що багато і різні типи раку не піддаються хіміотерапії і, як прийнято говорити, проявляють мультилікарську резистентність (MDR) (Lehnert Μ., Eur. J. Cancer, 32A:912920, 1996; Germann U.A., Eur. J. Cancer, 32A:927944, 1996). Крім того, багато протиракових агентів належить до алкілувальних сполук і антибіотиків, тобто індукують загибель пухлинних клітин за рахунок націлювання на ДНК, тобто їх дія у значній мірі базується на інтактності сигнального шляху р53 (Bykov, V.J. et al., Nat. Med. 8(3):282-8, 2002). Якщо врахувати, що велике число пухлин асоціюється з втратою функціонального р53, таке лікування часто виявляється неефективним. Таким чином, існує потреба у поліпшених механізмах доставки цитотоксичних агентів у ракові клітини, які є простими, недорогими у виробництві, реалізуються без інвазивного втручання і характеризуються одночасно як високою ефективністю, так і специфічністю у знищенні ракових клітин. Даний винахід може реально забезпечити одну і більше з вказаних вище переваг або інших переваг, що стануть очевидними для компетентних фахівців після ознайомлення з даною заявкою. Суть винаходу Коротко, винахід пов'язаний з новими композиціями, що містять AFP, і способами попередження, лікування або придушення злоякісних новоутворень, що експресують альфафетопротеїновий рецептор (AFPR). Винахід також пов'язаний зі способом екстракції бутанолом свинячого альфа-фетопротеїну, одержаного з крові та амніотичної рідини на ранніх стадіях ембріогенезу. В одному з варіантів реалізації винахід пропонує композицію, що містить нековалентний комплекс екзогенного альфа-фетопротеїну (AFP) і щонайменше одного агента, який індукує апоптоз, що вибраний з групи, яка включає агенти, що підвищують проникність мітохондріальної мембрани, агенти, що індукують відкриття мітохондріальних пор, іонофори, активатори каспази 9, активатори каспази 3 і ретиноїди, причому щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язаний з екзогенним AFP. В одному з варіантів реалізації винаходу композиція включає два агенти, що індукують апоптоз, які здатні оборотно зв'язуватися з екзогенним AFP. В іншому варіанті реалізації винаходу композиція включає агенти, що індукують 9 апоптоз, які можуть бути вибрані з групи, що включає: атрактилозид, бетулінову кислоту, тапсигаргін, ротенон, піерицидин А, лонідамін, CD437, триокис миш'яку, А23187, іономіцин, вітаміни D2 і D3, дексаметазон і акутан. У даному винаході запропоновано також використовувати екзогенний AFP для доставки у ракову клітину (в організмі ссавця) щонайменше одного агента, що індукує апоптоз, який можна вибрати з групи, що включає агенти проникності мітохондріальної мембрани, агенти, що індукують відкриття мітохондріальних пор, іонофори, активатори каспази 9, активатори каспази 3 і ретиноїди, де щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язується з AFP, ракове захворювання експресує щонайменше один рецептор AFP, а екзогенний AFP зв'язується щонайменше з одним рецептором AFP. В одному з варіантів реалізації у винаході запропоноване застосування композиції, що містить нековалентний комплекс з екзогенного альфафетопротеїну (AFP) і щонайменше одного агента, що індукує апоптоз, який можна вибрати з групи, що включає агенти проникності мітохондріальної мембрани, агенти, що індукують відкриття мітохондріальної пори, іонофори, активатори каспази 9, активатори каспази 3 і ретиноїди, для одержання лікарського засобу для націленої доставки у ракову клітину ссавця щонайменше одного агента, що індукує апоптоз, причому зазначена ракова клітина експресує щонайменше один рецептор AFP на своїй поверхні, щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язується з екзогенним AFP, а екзогенний AFP зв'язується щонайменше з одним рецептором AFP. В іншому варіанті реалізації винаходу запропоноване застосування композиції, що містить нековалентний комплекс з екзогенного альфафетопротеїну (AFP) і щонайменше одного агента, що індукує апоптоз, який можна вибрати з групи, що включає агенти проникності мітохондріальної мембрани, агенти, що індукують відкриття мітохондріальної пори, іонофори, активатори каспази 9, активатори каспази 3 і ретиноїди, для придушення проліферації ракових клітин у ссавця, причому зазначена ракова клітина експресує щонайменше один рецептор AFP на своїй поверхні, щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язується з екзогенним AFP, а екзогенний AFP специфічно зв'язується щонайменше з одним рецептором AFP на поверхні клітини. Ще в одному варіанті реалізації у винаході запропоноване застосування композиції, що містить нековалентний комплекс з екзогенного альфафетопротеїну (AFP) і щонайменше одного агента, що індукує апоптоз, який можна вибрати з групи, що включає агенти проникності мітохондріальної мембрани, агенти, що індукують відкриття мітохондріальної пори, іонофори, активатори каспази 9, активатори каспази 3 і ретиноїди, для лікування множинної лікарської резистентності рефрактерних злоякісних новоутворень, причому зазначені рефрактерні злоякісні новоутворення містять ракову клітину, яка експресує щонайменше один рецептор AFP на своїй поверхні, щонайменше один 94924 10 агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язується з екзогенним AFP, а екзогенний AFP специфічно зв'язується щонайменше з одним рецептором AFP на поверхні клітини. Ще в одному варіанті реалізації винахід також пропонує спосіб придушення проліферації ракової клітини у ссавця, причому зазначена ракова клітина експресує на своїй поверхні щонайменше один рецептор АРР, а зазначений спосіб включає введення ссавцю терапевтично ефективної кількості композиції, що містить нековалентний комплекс з екзогенного AFP і щонайменше одного агента, що індукує апоптоз, який можна вибрати з групи, що включає агенти проникності мітохондріальної мембрани, агенти, що індукують відкриття мітохондріальної пори, іонофори, активатори каспази 9, активатори каспази 3 і ретиноїди, причому щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язаний з екзогенним AFP, а екзогенний AFP специфічно зв'язаний щонайменше з одним рецептором AFP на поверхні клітини. Ще в одному варіанті реалізації винахід пропонує спосіб лікування множинної лікарської резистентності рефрактерних злоякісних новоутворень, причому зазначені рефрактерні злоякісні новоутворення містять ракові клітини, що експресують на своїй поверхні щонайменше один рецептор AFP, а зазначений спосіб включає введення ссавцю терапевтично ефективної кількості композиції, що містить нековалентний комплекс з екзогенного AFP і щонайменше одного агента, що індукує апоптоз, який можна вибрати з групи, що складається з агентів проникності мітохондріальної мембрани, агентів, що індукують відкриття мітохондріальної пори, іонофорів, активаторів каспази 9, активаторів каспази 3 і ретиноїдів, причому щонайменше один агент, що індукує апоптоз, оборотно зв'язаний з екзогенним AFP, а екзогенний AFP специфічно зв'язаний щонайменше з одним рецептором AFP на поверхні клітини. Ще в одному варіанті реалізації винахід пов'язаний зі способом екстракції свинячого AFP з сировинного матеріалу з використанням бутанолу, причому зазначений спосіб включає послідовні етапи: (a) збирання крові і амніотичної рідини від свинячих ембріонів у терміні вагітності приблизно від 3 до 14 тижнів; (b) розділення крові і амніотичної рідини, зібраної на етапі (а) на супернатант і преципітат; (c) збирання супернатанту, одержаного на етапі (Ь); (d) згущування супернатанту, накопиченого на етапі (с) для одержання концентрованого розчину; (e) додавання бутанолу до концентрованого розчину з етапу (d) до одержання кінцевої концентрації бутанолу у розчині приблизно від 5% до 10%; (f) збовтування розчину бутанолу, одержаного на етапі (e); (g) розділення розчину бутанолу, одержаного на етапі (f), на верхню безводну фазу і нижню водну фазу; 11 (h) збирання безводної фази, одержаної на етапі (g), для одержання кінцевого розчину, що містить незв'язаний свинячий AFP. У межах деяких специфічних варіантів реалізації винаходу описані вище композиції містять перший і другий агенти, що індукують апоптоз, в унікальних дозах. В одному з варіантів реалізації винаходу джерелом AFP, що використовується у композиціях, є організм ссавця. Ще в одному варіанті реалізації винаходу AFP дістають з організму свині (PAFP). В інших варіантах реалізації винаходу AFP походить від приматів, великої рогатої худоби, коней, собак, котів або овець. AFP може мати природне походження або являти собою рекомбінантну форму AFP. Короткий опис креслень Фіг. 1 - схема шляху апоптозу, опосередкованого каспазою у ракових клітинах, підданих впливу хіміотерапевтичного агента. Фіг. 2 - електрофорез у гелі чистого концентрату AFP (доріжка "С"), концентрату AFP, зв'язаного з атрактилозидом (доріжка "А"), і стандартних маркерів молекулярної ваги. Доріжка "В" скинута для іншого експерименту. 3 Фіг. 3 - об'єм пухлини (у см ) як функція часу (у днях) у мишачій моделі лейкозу після лікування композиціями PAFP-агент, що індукує апоптоз. Клітини лейкозу Р-388 вводили мишам DBA2 підшкірною ін'єкцією. Через один день після інокуляції тварини почали одержувати щоденне лікування за наступною схемою: 1. препарат A (PAFP - атрактилозид (А)); 2. препарат Τ (ΡAFP - тапсигаргін (Τ)); 3. препарат S (екстракт селезінки (S)); 4. препарат A+S; 5. препарат T+S; 6. контроль (масло); 7. контроль (вода). Фіг. 4 - показники виживання мишей DBA2 після підшкірної ін'єкції клітин лейкозу Р-388 і подальшого щоденного лікування через день після інокуляції за наступною схемою: 1. препарат A (PAFP - продукт атрактилозиду); 2. препарат Τ (PAFP продукт тапсигаргіну); 3. препарат S (екстракт селезінки); 4. препарат A+S; 5. препарат T+S; 6. контроль (масло); 7. контроль (вода). 3 Фіг. 5 - об'єм пухлини (у см ) як функція часу (у днях) після підшкірної ін'єкції мишам DBA2 клітин лейкозу Р-388 і їх подальшого щоденного лікування, яке почалося через один день після інокуляції, за наступною схемою: 1. контроль (вода); 2. контроль (масло); 3. PAFP - бетулінова кислота; 4. PAFP - бетулінова кислота плюс додаткова незв'язана бетулінова кислота. Фіг.6 - порівняння комп'ютерних томограм до (ліворуч) і після (праворуч) 8-тижневого курсу перорального лікування капсулами PAFPатрактилозид ракового хворого Р. з метастатичною аденокарциномою товстої кишки, що демонструє елімінацію метастазу у печінці. Фіг.7 - порівняння комп'ютерних томограм до (ліворуч) і після (праворуч) 6-тижневого курсу перорального лікування капсулами PAFPатрактилозид ракового хворого P.N.G. з метастатичною аденокарциномою товстої кишки, що демонструє елімінацію метастазу у печінці. Докладний опис винаходу 94924 12 Винахід стосується композицій, що корисні для націленої доставки агентів, які індукують апоптоз, до ракових клітин. Композиції, що пропонуються даним винаходом, складаються з екзогенного AFP, нековалентно зв'язаного зі сполуками, що індукують апоптоз за рахунок прямого впливу на мітохондріальну функцію, тобто діють в обхід потреби викликати апоптотичну реакцію через вихідні ядерні сигнали. В одному варіанті реалізації винаходу джерелом AFP є свинячий організм, а в іншому AFP екстрагують зі свинячих ембріонів і амніотичної рідини у терміні вагітності від 3 до 14 тижнів. Специфічні сполуки, корисні у даному винаході для нековалентного зв'язування з AFP, включають атрактилозид, бетулінову кислоту, тапсигаргін, CD437, ротенон, піерицидин А і лонідамін. Термін «агент, що індукує апоптоз», стосується тут хімічних або природних сполук, що володіють здатністю індукувати апоптотичну загибель клітин. В одному з варіантів реалізації винаходу агент, що індукує апоптоз, прямим чином впливає на мітохондрії. Такі сполуки можуть викликати апоптоз, впливаючи на проникність мітохондріальної мембрани, індукуючи відкриття мітохондріальних пор, змінюючи потенціал мітохондріальної мембрани, а також активуючи керуючі каспази, зокрема, каспазу 3 і каспазу 9. У контексті даного винаходу агент, що індукує апоптоз, індукує апоптоз у цільових ракових клітинах, які експресують на своїй поверхні рецептори AFP. Приклади агентів, що індукують апоптоз і придатні для застосування у даному винаході, включають (або одержані з них), але, не обмежуючись ними, агенти, що індукують проникність мітохондріальної мембрани, наприклад, атрактилозид, бетулінову кислоту, тапсигаргін, CD437, лонідамін, триокис миш'яку і ротенон, активатори каспази, наприклад, Рас-1 (Putt et al., Nature Chem. Biol. 2:543-550, 2006), іонофори, наприклад, кальциміцин/А23187 і валіноміцин, а також ретиноїди, наприклад, акутан і цис-ретиноєву кислоту, такий відомий хіміотерапевтичний агент як дексаметазон, такі антибіотики як олігоміцин В, гідроксихлорохін фосфат, антиоксиданти, наприклад, кверцетин, вітамін А, вітаміни D2 і D3, куркумин і капсаїцин, важкі метали, наприклад, цинк, свинець, мідь, нікель і кадмій (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/TablePa ge/9560323, http://www.biomol.com/Online_Catalog/Online_Catalo g/Products/36/?categoryId=234, http://www.emdbiosciences.com/html/cbc/apoptosis_i nducers.html, http://www. axxora.com/apoptosisinducers inhibitors/opfa. 1014.2.1.0.html). Термін «оборотність» при використанні тут означає здатність повертатися у вихідний («незв'язаний») стан, коли екзогенний AFP після доставки у ракову клітину першого агента, що індукує апоптоз (атрактилозиду, тапсигаргіну, бетулінової кислоти, CD 437, триокису миш'яку, ротенону, лонідаміну), повторно у незв'язаному вигляді переходить у позаклітинне середовище, де він здатний зв'язуватися з іншою сполукою, до якої він має невід'ємну афінність зв'язування (атрактилозид, 13 94924 тапсигаргін, бетулінова кислота, CD 437, триокис миш'яку, ротенон, лонідамін). Можливо, що екзогенний AFP рециркулює у позаклітинне середовище неодноразово. Раніше у багатьох дослідженнях in vitro було продемонстровано, що AFP здатний доставляти у клітини поліненасичені жирні кислоти (PUFA) через ендоцитоз, опосередкований рецепторами AFP, після чого він повертається у позаклітинне середовище у незміненому вигляді (Torres et al., Int. J. Cancer 47:1 110-117, 1991; Uriel et al., у книзі "Biological activities of alphafetoprotein", Florida Congresses, за редакцією Mizejewski, GJ, CRC Press Inc., Boca Raton, Vol. 2, 1987; a також Laborda et al., Int. J. Cancer 40:314318, 1987). Ці дослідження дозволили припустити, що рециркулюючий AFP після повернення у позаклітинний простір здатний повторно зв'язуватися з агентом, що індукує апоптоз. Термін «терапевтично ефективна кількість» при використанні тут означає таку кількість композиції, що пропонується даним винаходом, яка при введенні хворому поліпшує або полегшує симптоми описаного тут раку (солідного або несолідного). Специфічна доза композиції, що вводиться відповідно до даного винаходу, безсумнівно, буде визначатися індивідуальними обставинами конкретного випадку, включаючи, наприклад, композицію, що вводиться, спосіб її введення, клінічний стан хворого і тип раку, що підлягає лікуванню. Ракові захворювання, що підходять для лікування, яке пропонується даним винаходом, це такі форми раку, при яких ракові клітини експресують рецеп 14 тори альфа-фетопротеїну (AFPR). Приклади ракових захворювань, що демонструють експресію AFPR, включають, але, не обмежуючись ними, рак сечового міхура, рак молочної залози, рак товстої і прямої кишки, рак ендометрію, рак нирок (нирковоклітинний), лейкоз, рак печінки, рак легенів, меланому, неходжкінську лімфому, рак яєчників, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак шкіри (не меланома), рак яєчок і рак щитовидної залози (Moro-Vidal, R., Curex Technologies Inc., www.biocurex.com). Термін «хворий» означає всіх ссавців, включаючи людину. Приклади хворих включають людину, інших приматів, велику рогату худобу, собак, котів, кіз, овець, свиней, коней і кроликів. Даний винахід стосується застосування екзогенного альфа-фетопротеїну (AFP), що діє як носій або транспортувальник агентів, які індукують апоптоз, безпосередньо у ракові клітини, що приводить до апоптозу ракових клітин. Патенти США під номерами 6630445 і 6534479 описують застосування рекомбінантного AFP людини для кон'югації з цитотоксичними агентами. Раніше Nishi et al. (Ann. New York Acad. Sci. 259:109-118, 1975) продемонстрували перехресно-видову подібність AFP ссавців стосовно імунологічних і антигенних властивостей, що породжує можливість використання альтернативних джерел AFP від різних ссавців. Подібність свинячого AFP і AFP людини дозволяє припустити, що свинячий AFP можна застосовувати для доставки агентів, які індукують апоптоз, у ракові клітини замість AFP людини (таблиця 1). Таблиця 1 Порівняння властивостей AFP людини (HAFP), рекомбінантного AFP людини (rHAFP) і свинячого AFP (PAFP) Властивість % амінокислотної подібності доальбуміну % глікозилування Глікозилуючі цукри Мікрогетерогенність Можливість патогенної контамінації з джерела походження Етичні проблеми, пов'язані з джерелом походження Здатність зв'язувати жирні кислоти Афінність до гідрофобного ліганду Протиракова активність (AFP-опосередкована доставка зв'язаних агентів, що індукують апоптоз, у ракові клітини) (Бластний аналіз NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/; Parker, M.H. et al., Protein Expression and Purification, 38:177-183, 2004). Термін «екзогенний» означає тут такий, що походить ззовні хворого або організму. Винахід стосується композиції екзогенного AFP і першого агента, що індукує апоптоз, який оборотно зв'язаний з екзогенним AFP in vitro, утворюючи комплекс AFP-перший агент, що індукує апоптоз, причому така композиція також може включати другий агент, що індукує апоптоз, обидва агенти, що індукують апоптоз, являють собою протиракові ліки (тобто атрактилозид, тапсигаргін, HAFP 40 3-4 Різні Так Так Так Так Так rHAFP 40 0 0 Ні Ні Ні Невідома Невідома PAFP 38 3-4 Невідомі Ні Ні Ні Так Так Так Невідома Так бетулінову кислоту, CD 437, триокис миш'яку і лонідамін), а другий агент, що індукує апоптоз, здатний оборотно зв'язуватися з рециркулюючим екзогенним AFP in vivo. Перший і другий агенти, що індукують апоптоз, можуть бути тією самою речовиною (наприклад, бетуліновою кислотою) або різними речовинами (наприклад, бетуліновою кислотою і CD 437). Наявність множинних доменів зв'язування на AFP створює можливість одночасного зв'язування з AFP in vitro більш ніж одного класу агентів, що індукують апоптоз (Ніrаnо, K. et al., Biochem. J., 231:189-191, 1985; Mizejewski, G.J., Exp. Biol. Med. 226(5): 377-408, 2001). Це пов'язано з тим фактом, 15 що одні зв'язувальні домени взаємодіють з гідрофобними ліками, а інші зв'язувальні домени взаємодіють з гідрофільними або амфіфільними ліками. Відповідно до одного з варіантів реалізації винаходу раковий хворий повинен одержувати щоденну дозу винайденої композиції, в якій загальна добова доза споживаного AFP складає від 0,07 мг до 1,2 мг в залежності від стану хворого і агресивності захворювання. Така концентрація AFP базується на його фізіологічній концентрації, що звичайно виявляється у циркулюючій крові під час вагітності. У мишачих аналогах порівнянні дози складають від 0,0014 мг до 0,024 мг відповідно до керуючих вказівок, представлених у посиланні "Natural Compounds in Cancer Therapy", (Boik, J., Natural Compounds in Cancer Therapy. Oregon Medical Press, 2001, pp. 8-10). Композиція, що пропонується даним винаходом, може містити молярні співвідношення, що варіюють, першого і другого агентів, які індукують апоптоз, наприклад, від еквімолярного співвідношення до надлишку першого агента, що індукує апоптоз, стосовно AFP або від еквімолярного співвідношення до надлишку другого агента, що індукує апоптоз, стосовно AFP. Умови зв'язування in vitro першого агента, що індукує апоптоз, з AFP залежать від властивостей першого агента, що індукує апоптоз (тобто від його гідрофільності або гідрофобності). У типовому випадку AFP змішується з першим агентом, що індукує апоптоз так, що молярне співвідношення AFP і першого агента, що індукує апоптоз, варіює від 1:1 до 1:3. Більш типове змішування AFP з першим агентом, що індукує апоптоз, проводиться у молярному співвідношенні AFP і першого агента, що індукує апоптоз, яке варіює у діапазоні від 1:1 до менш ніж 1:3. Перший агент, що індукує апоптоз, може бути складений з одних і більше протиракових ліків. Однак, при використанні складених ліків необхідно бути впевненим у тому, що кожні ліки зв'язуються з іншим (самостійним) доменом зв'язування на AFP, як згадувалося вище. Матеріал, що екстрагується, піддають діафільтрації для видалення дрібних незв'язаних молекул без руйнування комплексу PAFP-агент, що індукує апоптоз. Раніше Sotnichenko et al. (FEBS Letters 450:49-51, 1999) продемонстрували, що фетальний AFP людини утворює комплекс з діоксином у молярному співвідношенні 1:2, а фільтрація у гелі ефективно видаляє незв'язані молекули без руйнування комплексу AFP-діоксин. У типовому випадку другий агент, що індукує апоптоз, представлений у такій кількості, яка щонайменше у 10 разів нижча кількості, використовуваної у способах, описаних у відомому рівні техніки. Наприклад, Pezzuto et al. (патентна заявка США № 20030186945) рекомендують дозу бетулінової кислоти 3000 мкг (щоденна пероральна доза від 0,2 мг до 500 мг), тоді як у даному винаході доза бетулінової кислоти (другого агента, що індукує апоптоз) може бути знижена до 150 мкг. У даному винаході пропонується комплексувати 0,6 мг PAFP з 0,007 мг бетулінової кислоти. В іншому варіанті реалізації винаходу у лікарську рецептуру 94924 16 включають 0,15 мг незв'язаної бетулінової кислоти. PAFP нестабільний і може агрегуватися, випадати в осад або ставати неактивним у результаті маніпуляцій, наприклад, таких, які пов'язані зі способом кон'югації і були описані раніше (G.J. Mizejewski, "Alpha-fetoprotein", у книзі Monographs on Endocrinology, ed. Ulrich Westphal, Steroidprotein interactions II, Springer-Verlag, Berlin, NewYork, Tokyo, 1986, pp. 320-356; Nunez, E.A. et al., The physiochemical and biological properties of AFP depend on its ligand environment, J. Nucl. Med. Allied Sci., 33:18-16,1989). У даному винаході час, необхідний для того, щоб in vitro при 18-25°С відбувся зв'язок PAFP з першим агентом, що індукує апоптоз складає 10 хвилин, що набагато менше часу, необхідного для здійснення способу нековалентного зв'язування, описаного на раніше відомому рівні техніки, коли час відстоювання при 18-25°С складає 10-12 годин (наприклад, патент США № 6878688, виданий Рак et al.). Зменшення часу для досягнення зв'язку in vitro між PAFP і першим агентом, що індукує апоптоз, можна приписати наступним факторам: (1) більш високій концентрації незв'язаного PAFP, здатного вступати у зв'язок, що представлений у концентраті, одержаному методами ультрафільтрації і екстракції бутанолом, запропонованими даним винаходом, і (2) мікрогомогенністю PAFP, одержаного у запропонованому способі, у порівнянні з HAFP, одержаним іншими способами, для якого, як зазначено вище, характерна мікрогетерогенність (Wu, J.T. and Clayton, F., "Detection and isolation of various isoforms of human AFP", у книзі "Biological activities of AFP", CRC Press, 1987, Boca Raton, Florida, vol. 2, pp. 3-14; 'Mizejewski, G.J., Exp. Biol. Med., vol. 226(5):377408, 2001). У типовому випадку перший агент, що індукує апоптоз, належить до одного з класів протиракових ліків і представлений у щоденній концентрації не більше 150 мкг. Агенти, що індукують апоптоз, які корисні у даному винаході, переважно, вибираються з групи, що включає агенти проникності мітохондріальної мембрани, агенти, що індукують відкриття мітохондріальних пор, активатори каспази 9, активатори каспази 3, іонофори і ретиноїди. Стійкість до багатьох ліків або множинна лікарська резистентність (MDR), часто асоційована з високим рівнем експресії насоса gp170 на поверхні ракових клітин (Lehnert Μ., Eur J Cancer 32A: 912920, 1996; Germann U.A., Eur. J. Cancer 32A:927944, 1996; Thomas, H., et al., Cancer Control 10(2): 159-165, 2003). Однак відомо, що MDR також спостерігається у клітинах з ушкодженим р53 або з підвищувальною регуляцією експресії такого інгібітору апоптозу як Bcl-2 (Jaattela, Μ., Εχρ. Cell Res. 248:30-43, 1999). Багато хіміотерапевтичних агентів націлені на мішені, розташовані вище активності р53, наприклад, ДНК, РНК, тілоізомерази і топоізомерази. Ці агенти не ефективні в індукції апоптозу у клітинах з ушкодженим р53 або з підвищувальною регуляцією Bcl-2 (Evan, G.I. and Vousden, K.H, Nature 411:342-348, 2001) (Фіг. 1). Група авторів Moskaleva et al. (Cell Biol. Int., 21(12):793-799, 1997) продемонструвала, що кон' 17 югати AFP-ліки ефективно знищують ракові клітини з множинною лікарською резистентністю, в яких спостерігається надлишкова експресія MDR (насос відкачки р-глікопротеїнових ліків), а це дозволяє припустити, що опосередкований рецепторами ендоцитоз кон'югатів AFP-ліки здатний перемагати раки з множинною лікарською резистентністю. У даному винаході вибір агентів, що індукують апоптоз, базується на їх здатності індукувати апоптоз на рівні мітохондрій, тобто нижче р53. Завдяки своїм впливам на проникність мітохондріальної мембрани, перенесення через мітохондріальні пори і/або активацію каспази, ці індуктори апоптозу здатні викликати цитотоксичні ефекти стосовно ракових клітин, що володіють множинною лікарською резистентністю (Фіг. 1). Переважно, щоб агенти, які індукують апоптоз, застосовно до даного винаходу, були одержані з природних джерел (Pessayre et al., "Apoptosis Trigged by Natural Substances", у книзі "Apoptosis and Its Modulation by Drugs", eds. R.G. Cameron, G. Feuer, Springer Press, 2000, pp. 86-108). Наприклад, бетулінову кислоту одержують з бетуліну, речовини, яка у великій кількості знаходиться у бересті берези пухнатої (Betula alba). Типові агенти, що індукують апоптоз, які корисні для застосування у даному винаході, включають, але, не обмежуючись ними, тапсигаргін, атрактилозид, бетулінову кислоту, CD437, триокис миш'яку, ротенон, піерицидин А і лонідамін. Інші приклади агентів, що індукують апоптоз, які підходять для застосування у даному винаході, включають, але, не обмежуючись ними (або одержані з них), дексаметазон, олігоміцин В, гідроксихлорохін фосфат, кверцетин, вітамін А, вітаміни D2 і D3, куркумін, капсаїцин, а також такі важкі метали як цинк, свинець, мідь, нікель, кадмій і хіміотерапевтичні агенти. Композиції, що пропонуються даним винаходом, можуть бути доставлені у ракову клітину будь-яким відомим у наш час способом введення, включаючи, але, не обмежуючись ними, пероральні дозові форми (капсули, м'які гелі і таблетки), супозиторії, інгаляції, носові або очні краплі, бандажі, нюхальні порошки, ін'єкційні форми, лініменти (рідкі мазі) і лікарські форми для місцевого застосування. В одному з варіантів реалізації винаходу композиції виготовляють для перорального дозування у вигляді м'яких гелів. В іншому варіанті реалізації винаходу композиції виготовляють для внутрішньовенного дозування у вигляді ін'єкційних препаратів. Приклад 1 Виділення і очищення PAFP PAFP екстрагували з печінки і крові свинячих ембріонів, з амніотичної рідини і з плаценти. Стадія розвитку плоду, на якій проводять екстракцію, критично важлива через флуктуацію посттрансляційних властивостей PAFP, що може вплинути як на його біологічну активність, так і на здатність зв'язуватися з агентами, що індукують апоптоз. PAFP, екстрагований з плодового матеріалу на ранніх термінах виношування (до 3 тижнів) або на пізніх термінах виношування (після 14 тижнів) має інші показники глікозилування у порівнянні з PAFP, 94924 18 екстрагованим з плодового матеріалу у терміні виношування від 3 до 14 тижнів (Ruoslahti, Ε. et al., Int. J. Cancer, 22:515-520, 1978; Keel, B.A. et al., у книзі "Biological Activities of Alpha 1-Fetoprotein", Boca Raton, Florida, CRC Press vol. 2, pp. 24-31, 1989; Mizejewski, G.J., Exp. Biol. Med. 226(5):377408, 2001; Parker, M.H. et al., Protein Expression and Purification, 38:177-183, 2004; Mizejewski, G.J., у книзі "Monographs on Endocrinology", ed. Ulrich Westphal, Steroid-protein interactions II, SpringerVerlag, Berlin, New-York, Tokyo, 1986, pp. 320-356). Було зазначено, що різні показники глікозилування впливають на зв'язувальні властивості HAFP, тобто терміни екстрагування рідин з ембріона критично важливі, оскільки глікозилування PAFP піддане варіаціям у ході ембріогенезу, а вихід (кількість) рідини після 14-го тижня вагітності значно знижується. В ідеальному варіанті плодовий матеріал у свиней збирають у проміжку від 3-го до 14-го тижня ембріогенезу і піддають його способу екстракції. Після екстракції кров і амніотичну рідину (далі "сировинний матеріал") витримували при температурі 4-10°С від 12 до 24 годин для розвитку природного осадження. Супернатант збирали і переносили в інший контейнер, після чого концентрували його у 3-5 разів ультрафільтрацією з використанням мембрани 50кДа. У способі ультрафільтрації температура не перевищувала 15°С. Цей етап концентрації дозволяв істотно збільшити вихід PAFP. Потім додавали бутанол до кінцевої концентрації 5-10% (у типовому випадку кінцева концентрація бутанолу складала приблизно 8%). Сировинний матеріал і бутанол перемішували протягом 2 хвилин, а одержану суміш додатково витримували ще хвилину, щоб розчин розділився на верхню безводну фазу і нижню водну фазу. Верхній безводний шар, що містить незв'язаний PAFP, акумулювали і піддавали діафільтрації, щоб видалити з суміші залишковий бутанол. Одержаний розчин, що містить PAFP, піддавали in vitro зв'язуванню з агентами, що індукують апоптоз, для подальшого застосування у лікуванні тривкого (лікарсько стійкого) раку. Спосіб екстракції PAFP, що пропонується даним винаходом, має переваги над традиційними способами екстракції AFP у тому відношенні, що він дозволяє істотно збільшити вихід висококонцентрованого і незв'язаного PAFP. Термін «не зв'язаний» означає, що PAFP не зв'язаний з ендогенними зв'язувальними партнерами. У результаті підвищеної концентрації незв'язаного PAFP очікувалося, що можна досягти більш високої концентрації PAFP, зв'язаного з потрібними агентами, що індукують апоптоз. PAFP, екстрагований докладно описаним вище способом, був підданий електрофорезу у поліакриламідному гелі (Фіг. 2). При забарвлюванні гелю барвником кумасі були чітко помітні дві мажорні білкові зони (Фіг. 2, доріжки А і С). Верхня смуга (приблизно 70 кДа) відповідає PAFP, а нижня смуга (приблизно 61 кДа) відповідає альбуміну. Приклад 2 PAFP має подібні характеристики зв'язування у порівнянні з HAFP. 19 У раніше проведених дослідженнях не розглядалося питання про те, чи володіє PAFP подібними до HAFP біологічними властивостями. PAFP, екстрагований способом, докладно описаним вище, був проаналізований із застосуванням двох різних імуноферментних наборів, щоб знайти присутність PAFP в екстракті, одержаному способом, який докладно описаний вище. Зразки PAFP порівнювали з AFP, виділеним з сироватки і амніотичної рідини людини. У вихідній стадії зразки проаналізували мембранним тестом ЕІА на альфафетопротеїн (№ за каталогом 410-1, IND Diagnostic Inc., Ванкувер, Канада), що базується на вбудовуванні моноклонального антитіла у HAFP. PAFP не давав реакції з набором тесту ЕІА на альфа-фетопротеїн у порівнянні зі зразком AFP людини, що дозволяло припускати наявність потенційних відмінностей у хімічній структурі PAFP і AFP людини. Пізніше був застосований другий аналітичний набір, що вбудовує поліклональне антитіло у HAFP (номер за каталогом Т-8456, AFPEIA-BEST-Strip, Vector-BEST, Новосибірськ, Росія), який дозволяв виявити присутність PAFP в екстракті. Спостерігалася позитивна реакція, що свідчить про здатність PAFP реагувати з антитілами проти AFP людини. Результати імуноаналізу дозволяють припустити, що PAFP здатний розпізнавати антитіла до HAFP, тобто має структурну подібність до HAFP. Раніше було продемонстровано, що HAFP, сам по собі, здатний індукувати апоптоз. Було показано, що індукція загибелі пухлинних клітин відбувається при високих фізіологічних дозах AFP (>250 мг/мл), але не відбувається при низьких дозах (