Застосування антипрогестину 11b-(4-ацетилфеніл)-17b-гідрокси-17a-(1,1,2,2,2-пентафторетил)естра-4,9-дієн-3-ону для лікування раку шляхом індукування апоптозу клітини

1. Застосування антипрогестину 11  -(4ацетилфеніл)-17  -гідрокси-17  -(1,1,2,2,2пентафторетил)естра-4,9-дієн-3-ону або його фармацевтично прийнятного похідного, або аналога як активного компонента лікарського засобу для лікування типу раку, вибраного з групи, що включає рак молочної залози, рак яєчників, рак ендометрію, мієлому і менінгіому з високим ризиком кількості пухлинних клітин на S-фазі клітинного циклу, внаслідок індукування апоптозу клітин при застосуванні вказаного антипрогестину або його фармацевтично прийнятного похідного, або аналога в добовій дозі приблизно від 0,1 до 400 мг. 2. Застосування за п. 1, в якому рак являє собою рак молочної залози. Даний винахід стосується застосування антипрогестинів для індукції апоптозу клітини. Зокрема, винахід стосується застосування антипрогестину, тобто 11-(4-ацетилфеніл)-17-гідрокси-17(1,1,2,2,2-пентафторетил)естра-4,9-дієн-3-ону, або його фармацевтично прийнятного похідного або аналога для індукції апоптозу в клітині. Крім того, даний винахід стосується застосування антипрогестинів для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування певного типу раку, такого як рак молочної залози, індикатором високого ризику виникнення якого є підвищена кількість пухлинних клітин на S-фазі клітинного циклу. Антипрогестини являють собою відносно новий і перспективний клас терапевтичних агентів, які можуть мати велике значення для лікування залежних від гормонів пухлин і інших захворювань. Хоча антипрогестини спочатку були розроблені для медичного нехірургічного припинення вагітності, виявилося, що деякі антипрогестини мають велике значення, наприклад, для ендокринної терапії таких типів раку молочної залози, які відрізняються тим, що пухлинні клітини мають рецептори прогестерону [Т. Maudelonde і ін., у: J.G.M. Klijn і ін., Hormonal Manipulation of Cancer: Peptides, Growth Factors and New (Anti) Steroidal Agents, видво Raven Press, New York, 1987, cтop.55-59]. Ця нова стратегія ендокринної терапії заснована на даних про те, що антипрогестини мають протипухлинну активність in vitro у відношенні ліній клітин пухлини молочної залози, які мають рецептор прогестерону, і in vivo у відношенні деяких типів залежних від гормонів пухлин молочної залози мишей і щурів. Зокрема, механізм протипухлинної активності таких антипрогестинів, як онапристон і міфепристон (RU 486) уже був вивчений з використанням моделі залежної від гормонів пухлини молочної залози миші МХТ, а також на моделях пухлини молочної залози, індукованої канцерогеном ДМБА (7,12-диметилбенз(а)антрацен) і НММ (нітрозометилсечовина) у щурів [М. R. Schneider і ін., Eur. J. Cancer Clin. Oncol, т.25, №4, стор.691701, 1989; Η. Michna і ін., Breast Cancer Research and Treatment 14:275-288, 1989; H. Michna, J. Steroid. Biochem. т.34, №№1-6, стор.447-453, 1989]. Однак внаслідок низької активності і побічних впливів, наприклад, міфепристону, цю сполуку не можна рекомендувати як індивідуальний агент (19) UA (11) 76729 (13) C2 (21) 2003054311 (22) 17.10.2001 (24) 15.09.2006 (86) PCT/EP01/12006, 17.10.2001 (31) 00250342.3 (32) 18.10.2000 (33) EP (31) 60/240,991 (32) 18.10.2000 (33) US (46) 15.09.2006, Бюл. № 9, 2006 р. (72) Хоффманн Енс , DE, Ліхтнер Роземарі , DE, Сімайстер Герд , DE, Шнайдер Мартін , DE, Фурманн Ульріке , DE (73) ШЕРІНГ АКЦІЄНГЕЗЕЛЬШАФТ, DE (56) DE, A, 197 06 061, 13.08.1998 3 76729 4 для лікування раку молочної залози [D. Perrault і При створенні винаходу несподівано було ін., J. Clin. Oncol 1996 Oct, 14(10), стор.2709-2712]. встановлено, що антипрогестин 11-(4Крім того, міфепристон має виражені антиглюкоацетилфеніл)-17-гідрокси-17-(1,1,2,2,2кортикоїдні побічні дії [див. L.M. Kettel і ін., Fertil. пентафторетил)естра-4,9-дієн-3-он (або його фаSteril. 1991 Sep, 56(3), стор.402-407; X. Bertagna, рмацевтично прийнятне похідне або аналог) можPsychoneuroendocrinology 1997; 22 додат. І, на застосовувати для індукції апоптозу клітини. стор.51-55]. При створенні винаходу несподівано було Відсоток пухлинних клітин, які знаходяться на встановлено, що антипрогестин 11-(4відповідних фазах клітинного циклу, можна оцінюацетилфеніл)-17-гідрокси-17-(1,1,2,2,2вати шляхом визначення ДНК за допомогою ефекпентафторетил)естра-4,9-дієн-3-он (нижче в данотивного методу проточної цитометрії ]див. G.M. му описі позначений як "антипрогестин (І)") індукує Clark і ін., N. Engl. J. Med. 320, 1989, March, апоптоз і загибель пухлинних клітин у дослідах з стор.627-633; L.G. Dressier і ін., Cancer 61(3), 1988, використанням стандартних моделей пухлин раку стор.420-427 і процитовану в цих роботах літерамолочної залози. Було встановлено, що антипротуру]. Було встановлено, що стадії клітинного цикгестин (І) має здатність індукувати апоптоз клітин лу пухлинних клітин і насамперед кількість пухшляхом ініціації термінального диференціювання. линних клітин, які знаходяться на певних стадіях Таким чином, одним з об'єктів даного винахоциклу, можуть служити важливим джерелом інфоду є застосування антипрогестину (І) або його фармації для клінічного пророкування розвитку хвормацевтично прийнятного похідного або аналога роби й успіху терапії. У цьому відношенні найбільш для приготування лікарського засобу, призначеноважлива кількість клітин, які знаходяться на S-фазі го для індукції апоптозу клітини. Переважно індукклітинного циклу. цію апоптозу викликають шляхом ініціації термінаУ ЕР 0495825 В1 описане застосування антильного диференціювання. Клітина переважно прогестинів (конкурентних антагоністів прогестеявляє собою клітину ссавця, більш переважно клірону) для приготування лікарських засобів, призтину людини і найбільш переважно пухлинну кліначених для лікування карцином молочної залози, тину, причому пухлина переважно являє собою які відрізняються підвищеним вмістом пухлинних рак молочної залози. клітин, які знаходяться на S-фазі клітинного циклу, Наступним об'єктом даного винаходу є застощо розглядається як високий фактор ризику. Це сування антипрогестину (І) або його фармацевтиґрунтується на даних про те, що антипрогестини чно прийнятного похідного або аналога для пригомають здатність блокувати розвиток пухлинних тування лікарського засобу, призначеного для клітин, які знаходяться на G0G1-фазі клітинного лікування різних типів раку, індикатором високого циклу, що приводить до істотного зменшення кільступеня ризику виникнення якого є підвищена кількості пухлинних клітин, які знаходяться на S-фазі. кість пухлинних клітин, які знаходяться на S-фазі Однак такий вплив не був виявлений при стандарклітинного циклу. тній терапії раку молочної залози з використанням Ще одним об'єктом даного винаходу є застотамоксифену, естрогену або при оваріектомії. Ансування антипрогестину (І) або його фармацевтитипрогестини, протестовані в ЕР 0495825 В1, явчно прийнятного похідного або аналога для індукляли собою 11-[4-N,N-диметиламіно)феніл]-17ції апоптозу клітини in vitro. Клітина переважно гідрокси-17-(3-гідроксипропіл)-13-метил-4,9(10)являє собою клітину ссавця, більш переважно клігонадієн-3-он і 11-(4-ацетилфеніл)-17-гідрокситину людини і найбільш переважно пухлинну клі17-(проп-1-ініл)-4,9(10)естрадієн-3-он. тину, причому пухлина переважно являє собою рак молочної залози. 17-фторалкілстероїди, які мають виражену Наступним об'єктом даного винаходу є спосіб антипрогестинну активність, а також методи їх індукції апоптозу клітини шляхом введення в кліодержання, описані в WO 98/34947. У WO тину ефективної кількості антипрогестину (І). Цей 98/34947 не наведене обговорення або результати спосіб можна застосовувати in vitro або in vivo. дослідження ролі, яку описані в цій заявці 17Клітина переважно являє собою клітину ссавця, фторалкілстероїди можуть відігравати в апоптозі більш переважно клітину людини і найбільш переклітин або припиненні клітинного циклу. важно пухлинну клітину, причому пухлина переваЗ урахуванням потенційного значення агентів, жно являє собою рак молочної залози. які індукують апоптоз клітин, наприклад, у випадку Завдяки здатності індукувати апоптоз клітини пухлинних клітин шляхом блокади їх розвитку на антипрогестин (І) або його фармацевтично прийнG0G1-фазі, доцільним є виявлення також інших ятне похідне або аналог можна застосовувати для агентів, наприклад, антипрогестини, які мають талікування певних типів раку, наприклад, раку мокий специфічний механізм дії. Такі агенти можна лочної залози, індикатором високого ступеня ризизастосовувати при лікуванні і попередженні певних ку виникнення якого є підвищена кількість пухлинтипів раку, наприклад, раку молочної залози, індиних клітин, які знаходяться на S-фазі клітинного катором високого ступеня ризику виникнення якого циклу. Інші типи раку або залежні від гормонів зає підвищена кількість пухлинних клітин, які знахохворювання, на які можна впливати і які можна дяться на S-фазі клітинного циклу. лікувати за допомогою антипрогестину (І) завдяки Таким чином, в основу даного винаходу була його здатності індукувати клітинний апоптоз, мопокладена задача подальшого дослідження мехажуть включати, наприклад, рак молочної залози, нізму дії антипрогестинів, що приводить до інгібурак яєчника, рак ендометрію, мієлому, ановулятовання залежних від гормонів захворювань, таких рну безплідність, менінгому, тобто захворювання, як рак молочної залози, і розробка способу спряякі в основному зумовлені або на які впливає наямованої індукції апоптозу клітин. 5 76729 6 вність рецепторів гормонів і/або залежних від гор17-гідрокси-17-(1,1,2,2,2-пентафторетил)естрамонів шляхів метаболізму. 4,9-дієн-3-он, представлений нижче формулою (І): На кресленнях представлено: на Фіг.1 - порівняння даних про інгібуючу ріст пухлини дію, зумовлену індукцією апоптозу антипрогестином (І), які отримані при вивченні залежності реакції від дози в дослідах з використанням індукованої ДМБА карциноми молочної залози щура, з даними, отриманими в контрольних дослідах з використанням антипрогестину онапристону, а також з даними, отриманими після оваріектомії. Дослід проводили з використанням добових доз Антипрогестин (І) (або його фармацевтично антипрогестину (І), які вводяться підшкірно (s.c.), прийнятне похідне або аналог) являє собою фарщо становлять 0,5, 2,0, 5,0 і 10,0мг/кг; мацевтичний агент, що має велике значення, який на Фіг.2 - порівняння даних про інгібуючу ріст має виражену антипрогестиніву активність. Антиппухлини дію, зумовлену індукцією апоптозу антипрогестин (І) можна застосовувати відповідно до рогестином (І), які отримані в дослідах з викорисданого винаходу для індукції апоптозу клітин. танням індукованої НММ карциноми молочної заУ контексті даного винаходу поняття "антипролози щурів, з даними, отриманими в контрольних гестин" стосується насамперед всіх сполук, які дослідах, і з даними, отриманими після оваріектомають здатність конкурентно інгібувати рецептори мії. Дослід проводили з використанням добових прогестерону. Однак воно включає також сполуки, доз антипрогестину (І), які вводяться підшкірно які мають здатність інгібувати біосинтез прогес(s.c.), що становлять 0,5 і 1,0мг/кг; тинів. на Фіг.3 - порівняння даних про індукцію апопУ контексті даного опису фармацевтично притозу й зумовлену ним інгібуючу ріст пухлини дію йнятні похідні або аналоги антипрогестину (І) моантипрогестину (І), який застосовується в дозі жуть включати, наприклад, будь-яку зі сполук, зая10мг/кг s.c, отриманих у дослідах на безтимусних влених у WO 98/34947. мишах, яким вводили ксенотрансплантати людсьДослідження, виконані при створенні даного ких пухлин лінії T47D, з даними, отриманими в винаходу, свідчать про те, що антипрогестин (І) контрольних дослідах, і після оваріектомії; має виражену активність у відношенні інгібування на Фіг.4 - порівняння даних про індукцію апоппухлини, що продемонстровано на різних моделях тозу й зумовлену ним інгібуючу ріст пухлини дію залежних від гормонів пухлин (див. приклади 1-6). антипрогестину (І), який застосовується в дозі Крім того, встановлено, що активність антипрогес10мг/кг s.c, отриманих у дослідах на безтимусних тину (І) у відношенні інгібування пухлини внаслідок мишах на моделі раку молочної залози людини індукції апоптозу перевищує відповідну активність (клітини лінії MCF-7), з даними, отриманими в конзвичайних протипухлинних агентів, таких як антиетрольних дослідах, і після оваріектомії; строген тамоксифен. Ефективність лікування раку на Фіг.5А-5Е - дані гістологічного аналізу, які молочної залози з використанням антипрогестину стосуються індукції апоптозу в дослідах на щурах з (І) за даним винаходом перевищує навіть ефективикористанням моделі раку молочної залози, індувність оваріектомії. кованого НММ (див. приклад 5). Зокрема, на Фіг.5А Як продемонстровано нижче в прикладах з вивидно, що в пухлинах, оброблених антипрогестикористанням різних моделей пухлин, застосування ном (І), на відміну від контролю присутні утворення антипрогестину (І) приводить до збільшення кільу вигляді проток і гронеподібні утворення, як пракості пухлинних клітин, які знаходяться у фазі G0G1 вило заповнені секреторним продуктом (Фіг.5Б). клітинного циклу, що супроводжується істотним Для порівняння на Фіг.5В представлене зображензменшенням кількості клітин, які знаходяться у ня необробленої тканини індукованого НММ раку фазах S і G2M клітинного циклу, що має біологічне молочної залози, яка має високу імунореактивність значення. Ці дані свідчать про індукцію диферену відношенні ЯАПК (ядерний антиген проліферуюціювання. Раніше вже пропонувалося використанчих клітин), а на Фіг.5Г - зображення тканини індуня припинення специфічної для фази G1 диферекованої НММ пухлини, обробленої антипрогестинціювання для інших систем стовбурових клітин ном (І), яка має низьку імунореактивность у [див. J.J. Wille Jr., Cancer Res. 1982, 42(12):5139відношенні ЯАПК. На Фіг.5Д представлене зобра46; R.E. Scott, J. Cell. Biol. 1982, 94(2):400-405]. ження тканини індукованої НММ пухлини молочної Експериментальні дані, отримані з викорисзалози, обробленої антипрогестином (І), а на танням різних моделей пухлини, свідчать про те, Фіг.5Е - зображення, отримане для контролю; що лікування за допомогою антипрогестину (І), на Фіг.6 - порівняння даних про інгібуючу ріст очевидно, ініціює диференціювання полігональних пухлини дію антипрогестину (І) на клітини пухлини пухлинних клітин, які мають мітотичну активність, молочної залози лінії T47D (стимульованої естращо приводить до утворення гландулярних струкдіолом) при використанні ефективної граничної тур і грон, що супроводжується інтенсивним зменконцентрації 10-9-10-8моля/л, з дією антипрогестишенням продуктів секреції, а також до утворення ну онапристону і чистого антиестрогену 11-фторверетеноподібних некробіотичних (некрозних) субпопуляцій (див. приклад 5 і, зокрема, Фіг.5А і 5Б). У 7-{5-[Ν-метил-Ν-3-(4,4,5,5,5той час як розмір пухлини, мітотичний індекс і ріпентафторпентилтіо)пропіламіно]пентил}естравень розвитку злоякісної пухлини помітно змен1,3,5(10)-триєн-3,17-діолу (WO 98/07740). шуються, об'ємна частка гландулярних структур у Антипрогестин (І), тобто 11-(4-ацетилфеніл) 7 76729 8 пухлинах, а також симптоми апоптозу збільшуютьготування галенових форм для перорального або ся в 3 рази в порівнянні з контролями (див. прикпарентерального, наприклад, внутрішньочеревинлад 5, Фіг.5Д і 5Е). ного, внутрішньом'язового, підшкірного або черезНе обмежуючись якою-небудь окремою теорішкірного введення. Їх можна також імплантувати у єю, можна вважати, що ці результати свідчать про тканину. Імплантати можуть являти собою інертні те, що основний механізм протипухлинної дії анматеріали, наприклад, біорозкладні полімери і типрогестину (І) у вивчених моделях полягає в синтетичні силікони, такі, наприклад, як силіконобезпосередній антипроліферативній дії, яка оповий каучук. середковується рецептором прогестерону, на кільїх можна вводити у формі таблеток, пігулок, кість пухлинних клітин, яка полягає в індукції тердраже, желатинових капсул, гранул, супозиторіїв, мінального диференціювання, що імплантатів, ін'єкованих стерильних водних або супроводжується термінальною загибеллю клітин. масляних розчинів, суспензій або емульсій, мазей, Таким чином, антипрогестин (І), очевидно, має кремів, гелів або інтравагінальних (наприклад, здатність елімінувати блокування термінального вагінальних кілець) або внутрішньоматкових сисдиференціювання, що має важливе значення, тем (наприклад, діафрагм, петель). властиве клітинам злоякісних пухлин, що мають Для приготування лікарського засобу, признарецептори прогестерону. Така антипроліферативченого для перорального введення, описані вище на дія антипрогестину (І), очевидно, обумовлена антипрогестини, придатні для застосування згідно антигормональною (антипрогестинною) активністю із даним винаходом, можна змішувати із широко антипрогестину (І). відомими і загальноприйнятими допоміжними реТакі агенти, як антипрогестин (І), які індукують човинами і носіями, такими, наприклад, як гуміаапоптоз клітин, наприклад, у випадку пухлинних рабік, тальк, крохмаль, цукри, такі, наприклад, як клітин шляхом блокування їх розвитку в G0G1-фазі, маніт, метилцелюлоза, лактоза, желатин, поверхможна застосовувати для лікування і попередженнево-активними речовинами, стеаратом магнію, ня різних станів. Такі агенти, включаючи антипроводними або неводними ексципієнтами, похідними гестин (І), можна застосовувати для лікування тих парафіну, зшиваючими агентами, розпушувачами, типів раку, наприклад, раку молочної залози, індиемульгаторами, замаслювачами, консервантами і катором високого ступеня ризику виникнення яких коригентами (наприклад, ефірними оліями). У фає підвищена кількість пухлинних клітин, які знахормацевтичній композиції антипрогестин може знадяться на S-фазі клітинного циклу. ходитися в диспергованому стані у вигляді мікроТаким чином, одним з об'єктів даного винахочастинок, наприклад, у вигляді наночастинок. ду є застосування антипрогестину (І) або його фаДля додаткового підвищення біологічної досрмацевтично прийнятного похідного або аналога тупності діючої речовини описані вище антипрогедля приготування лікарського засобу, призначеностини, придатні для застосування згідно із даним го для індукції апоптозу клітини. У переважному винаходом, можна включати також у вигляді цикваріанті здійснення антипрогестин (І) або його фалодекстринових клатратів до складу препаративрмацевтично прийнятне похідне або аналог застоної форми, піддаючи їх взаємодії з -, - або совують як лікарський засіб для індукції апоптозу циклодекстринами або їх похідними відповідно до пухлинних клітин, переважно клітин раку молочної методу, описаному в РСТ/ЕР95/02656. залози людини. Такий лікарський засіб можна заДля парентерального введення описані вище стосовувати для лікування залежних від гормонів антипрогестини, придатні для застосування згідно захворювань, таких як рак молочної залози, індиіз даним винаходом, можна розчиняти або суспенкатором високого ступеня ризику виникнення яких дувати у фізіологічно прийнятному розріджувачі, є підвищена кількість пухлинних клітин, які знахотакому, наприклад, як олії разом із солюбілізатодяться на S-фазі клітинного циклу. рами, поверхнево-активними агентами, диспергуПриготування лікарських засобів можна здійсвальними агентами або емульгаторами або без нювати за допомогою методів, відомих у даній них. Прикладами олій, які можна застосовувати галузі. Можна застосовувати широко відомі і зага(але не обмежуючись ними), є маслинова олія, льноприйняті допоміжні речовини, а також прийняарахісова олія, бавовняна олія, соєва олія, рицитні носії і розріджувачі. Як прийнятні носії і допомінова олія і кунжутна олія. жні речовини можна використовувати сполуки, Призначена для введення кількість (тобто рекомендовані для застосування у фармацевтиці, «фармацевтично ефективна кількість») змінюється косметиці і споріднених галузях, які описані в: в широких межах і залежить від стану, який підля[Ullmann's Encyclopedia of Technical Chemistry, т.4, гає лікуванню, і шляху введення. Вона може явля(1953), стор.1-39; Journal of Pharmaceutical ти собою будь-яку кількість, яка є ефективною для Sciences, т.52 (1963), стор.918 і далі; H.v.Czetschздійснення потрібного лікування. Визначення «фаLindenwald, "Hilfsstoffe fur Pharmazie und рмацевтично ефективної кількості» знаходиться в angrenzende Gebiete"; Pharm. Ind. 2, 1961, стор.72 і компетенції фахівця в даній галузі. далі; Dr. H.P. Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe für Одна стандартна доза може містити приблизPharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, видно від 0,1 до 100мг діючих(ої) речовин(и). Для ввево Cantor KG, Aulendorfin Württemberg, 1971]. дення людині добова доза діючих(ої) речовин(и) Антипрогестини, які можна застосовувати для становить приблизно від 0,1 до 400мг, переважно цілей даного винаходу, переважно антипрогестин від 10 до 100мг, найбільш переважно 50мг. (І) або його фармацевтично прийнятне похідне або Лікарські засоби можна вводити також шляхом аналог, можна включати до складу фармацевтичін'єкції депо або імплантату, що необов'язково них композицій за допомогою відомих методів призабезпечує уповільнене вивільнення діючих(ої) 9 76729 10 речовин(и). так і механізмом дії цього агента, пов'язаного з Переважним шляхом введення є пероральне індукцією апоптозу (див., зокрема приклад 5) і введення. Антипрогестини, придатні для застосуприпиненням клітинного циклу. вання відповідно до винаходу, зокрема, антипроІншим об'єктом даного винаходу є спосіб індугестин (І), найбільш переважно вводять пероралькції апоптозу клітини. Клітина переважно являє ним шляхом. собою клітину ссавця і найбільш переважно клітиЗгідно з всіма об'єктами даного винаходу прину людини, причому спосіб можна здійснювати як наймні один з описаних вище антипрогестинів, in vitro, так і in vivo. Переважно апоптоз індукують зокрема, антипрогестин (І) або його фармацевтичза допомогою механізму ініціації термінального но прийнятне похідне або аналог, можна застосодиференціювання, наприклад, шляхом введення вувати в сполученні з принаймні одним антиестроантипрогестину (І) або його фармацевтично пригеном, оскільки для багатьох залежних від гормону йнятного похідного або аналога. Відповідно до захворювань, зокрема для раку молочної залози, даного способу розглянуту клітину піддають вплихарактерна наявність не тільки рецепторів прогесву ефективної кількості антипрогестину (І) або його терону, але також і рецепторів естрогену. Антиесфармацевтично прийнятного похідного або аналотроген можна вводити як одночасно, так і послідога. Наприклад, у клітин раку молочної залози лінії вно з антипрогестином, і, зокрема, з T47D, ріст яких стимулювали шляхом введення антипрогестином (І) або його фармацевтично приестрадіолу, антипрогестин (І) індукував повне інгійнятним похідним або аналогом. Кількість антипбування росту клітин при використанні ефективної рогестину й антиестрогену можуть бути однаковиграничної концентрації від 10-9 до 10-8молів (див. ми або один з компонентів може бути присутнім у приклад 6 і Фіг.6). Це є найбільш несподіваним, більшій кількості, ніж інший, наприклад, співвіднооскільки відомий антипрогестин онапристон не шення антипрогестин:антиестроген може становивикликав впливу, що викликає зменшення росту ти від 1:50 до 50:1, переважно від 1:30 до 30:1, і клітин при дослідженні на даній моделі пухлини. найбільш переважно від 1:15 до 15:1. Таким чином, антипрогестин (І) є більш переважПрикладами антиестрогенів, які можна застоним з погляду сили дії й ефективності в порівнянні совувати відповідно до винаходу, є нестероїдні з іншими антипрогестинами, такими як онаприсантиестрогени, такі як тамоксифен і нафоксифен, тон, і антиестрогенами, такими як тамоксифен, і а також ралоксифен, фаслодекс і ЕМ800. Прикланавіть з багатьма антиестрогенами, такими як 11дами стероїдних антиестрогенів є сполуки, описані фтор-7-{5-[N-метил-N-3-(4,4,5,5,5в ЕР 0348341 А і сполуки, описані в WO 98/07740, пентафторпентилтіо)пропіламіно]пентил}естразокрема, 11-фтор-7-{5-[Ν-метил-Ν-3-(4,4,5,5,51,3,5(10)-триєн-3,17-діол (WO 98/07740). пентафторпентилтіопропіламіно]пентил}естраТой факт, що антипрогестин (І) має здатність 1,3,5(10)-триєн-3,17-діол, або сполуки, описані в індукувати апоптоз клітини, свідчить про те, що WO 99/33855, зокрема, 11-фтор-7-{5-[метилвказаний антипрогестин (або його фармацевтично (7,7,8,8,9,9,10,10,10прийнятне похідне або аналог) можна застосовунонафтордецил)аміно]пентил}естра-1,3,5(10)вати для лікування різноманітних станів, насамперед залежних від гормонів станів, при яких найтриєн-3,17-діол або їх фармацевтично прийнятні більш бажано індукувати апоптоз. Конкретно його або похідні аналоги. Як антиестрогени можна заможна застосовувати для лікування таких захвостосовувати також інгібітори ароматази, які мають рювань, як рак молочної залози, рак яєчника, рак антиестрогенну активність, такі, наприклад, що ендометрію, мієлома, ановуляторна безплідність, описані на стор.7-8 ЕР 0495825 В1. менінгома, тобто захворювань, які в основному Ще одним об'єктом даного винаходу є застозумовлені або на які впливає наявність рецепторів сування антипрогестину (І) або його фармацевтигормону і/або залежних від гормонів шляхів метачно прийнятного похідного або аналога для пригоболізму. Крім того, антипрогестини, такі як антиптування лікарського засобу, призначеного для рогестин (І), можна застосовувати для приготуванлікування раку такого типу, індикатором високого ня лікарських засобів, які індукують апоптоз або ризику виникнення якого є підвищення кількості загибель клітин, призначених для лікування вже пухлинних клітин у S-фазі клітинного циклу. Кільописаних вище залежних від гормонів захворюкість пухлинних клітин, які знаходяться в S-фазі вань. можна оцінювати шляхом визначення ДНК за доНижче винахід проілюстрований на прикладах. помогою методу проточної цитометрії, описаного в Слід мати на увазі, що наведені нижче приклади [Dressier і ін., "DNA Flow Cytometry and Prognostic не обмежують обсяг винаходу. Factors in 1331 Frozen Breast Cancer Specimens," Приклади Cancer, т.61(3), 1988, стор.420-427; див. також Приклад 1: McGuire і Dressier, "Emerging Impact of Flow Дослідження залежності реакції від дози на Cytometry in Predicting Recurrence and Survival in моделі пухлини, індукованої ДМБА Breast Cancer Patients," JNCI, т.75(3), 1985, Матеріали і методи: стор.405-409]. Кількість пухлинних клітин, які знаДане дослідження проводили на статевонезріходяться в S-фазі, що зумовлює високий ризик лих самках щурів лінії Sprague-Dawley (віком 49-51 захворювання, являє собою найбільш переважну день; 10 тварин/групу). Пухлини молочної залози мішень для застосування сполук за винаходом. У індукували шляхом однократного перорального випадку антипрогестину (І), перевага його застосувведення 10мг 7,12-диметилбенз[а]антрацену вання зумовлена як сильною протипухлинною ді(ДМБА, фірма Serva, Гейдельберг). Щурів, у яких єю, що продемонстровано на стандартних модебула виявлена принаймні одна пухлина, що має лях з використанням тварин (див. приклади 1-4), 11 76729 12 розмір, який перевищує 150мм2, протягом 4 тижнів інгібування росту використовували зміну площі піддавали наступним обробкам: 1) вводили розпухлини (у % по відношенню до вихідного розміру чинник (контроль), 2) піддавали оваріектомії перед пухлини), яку оцінювали шляхом щотижневого початком досліду, уводили щодня 3) антипрогесвимірювання за допомогою циркуля. Для статистин (І), 0,5мг/кг s.c, 4) антипрогестин (І), 2мг/кг s.c, тичного аналізу відмінностей середніх значень між 5) антипрогестин (І), 5мг/кг s.c, 6) антипрогестин групами використовували критерій Крускала(І), 10мг/кг s.c. і 7) онапристон, 5мг/кг, s.c. Як параУолліса. метр для оцінки інгібування росту використовуваРезультати: ли зміну площі пухлини (у % по відношенню вихідУ інтактних тварин спостерігався прогресивний ного розміру пухлини), яку оцінювали шляхом ріст пухлини, у той час як оваріектомія приводила щотижневого вимірювання за допомогою циркуля. до повного інгібування росту пухлини. Введення Для статистичного аналізу відмінностей середніх антипрогестину (І) у дозах 0,5 або 1,0мг/кг привозначень між групами використовували критерій дило до істотного інгібування росту пухлини, зумоКрускала-Уолліса. Більш докладний опис і оцінка вленого індукцією апоптозу, у порівнянні з контромоделі, призначеної для вивчення запобігання лем (див. Фіг.2). Онапристон (5мг/кг) виявився розвитку індукованої ДМБА пухлини, наведені в помітно менш ефективним, ніж антипрогестин (І), [R.G. Metha, European Journal of Cancer 36 (2000), що вводиться в істотно меншій дозі 0,5мг/кг. cтop.1275-1282]. Висновки: Результати: У дослідах на моделі індукованої НММ пухлиУ інтактних контрольних тварин спостерігався ни молочної залози в щурів встановлено, що анпрогресивний ріст пухлини, у той час як у 90% підтипрогестин (І) завдяки його вираженій здатності даних оваріектомії тварин спостерігалася істотний індукувати апоптоз пухлинних клітин повністю прирегрес пухлини. Лікування антипрогестином (І) у гнічував ріст пухлини в інтактних тварин. Обидві дозах, що дорівнюють або перевищують 2мг/кг, дози (1,0мг/кг, також як і 0,5мг/кг) антипрогестину викликало виражену індукцію апоптозу, що приво(І) викликали істотну апоптозну дію на пухлинні дило до інгібування росту пухлини в порівнянні з клітини. контролем (див. Фіг.2). У цьому випадку спостеріПриклад 3: галася виражена залежність реакції від дози. У той Ксенотрансплантат пухлини лінії T47D молоччас як лікування з використанням 0,5мг/кг антипроної залози людини, імплантований безтимусним гестину (І) не приводило до істотного інгібування мишам росту пухлини, при використанні дози 2мг/кг споМатеріали і методи: стерігалися максимальна індукція апоптозу й обуСамкам безтимусних мишей лінії Fox Chase мовлене цим інгібування росту. У цій групі в 50% (фірма М&В) вводили пелети естрадіолу (фірма щурів був виявлений повний регрес пухлини. Innovative Research of America). Клітини лінії T47D Вплив максимальної вивченої в даному експерираку молочної залози, отримані з клітинної культументі дози антипрогестину (І) (10мг/кг), виявилося ри і суспендовані в матригелі, імплантували s.c. у порівнянною із впливом дози 2мг/кг. Онапристон пахвинну ділянку мишей. Обробку починали після (5мг/кг, s.c.) виявився істотно менш ефективним, того, як пухлини досягали розміру приблизно ніж антипрогестин (І), при застосуванні в порівню25мм2. Обробку продовжували доти, поки продовваних дозах. жувався розвиток пухлини. В експерименті викоВисновки: ристовували наступні групи тварин: 1) контрольна У дослідах на моделі індукованої ДМБА пухгрупа (оброблена носієм), 2) група, піддана оваріелини молочної залози в щурів встановлено, що ктомії, 3) група, яка оброблена антипрогестином антипрогестин (І) сильно індукував апоптоз клітин (І), 10мг/кг s.c. Площу пухлини визначали за допопухлини й у результаті цього повністю пригнічував могою циркуля. Для статистичного аналізу відмінріст пухлини в інтактних тварин. Встановлено, що ностей середніх значень між групами використовудоза 2мг/кг антипрогестину (І) виявляла максимавали критерій Крускала-Уолліса. льну апоптозну дію на пухлинні клітини. АнтипроРезультати: гестин (І) мав істотно більшу ефективність у відУ дослідах з використанням моделі раку молоношенні інгібування росту пухлини, ніж чної залози T47D оваріектомія приводила до істоонапристон. тного інгібування росту пухлини в порівнянні зі Приклад 2: швидким ростом у контролі. Дані, наведені на Вивчення інгібування росту пухлини на моделі Фіг.3, переконливо свідчать про те, що введення індукованого НММ раку молочної залози в щурів антипрогестину (І) у дозі 10мг/кг s.c. індукувало Матеріали і методи: апоптоз пухлинних клітин. Дія антипрогестину (І) Пухлини індукували шляхом однократної внутпрактично порівнянна з дією звичайної терапії, рішньовенної ін'єкції НММ (нітрозометилсечовина, призначеної для депривації естрогену (оваріекто50мг/кг) самкам щурів лінії Sprague-Dawley (отримії). маних від фірми Tierzucht Schönwalde, вік 50-55 Висновки: днів). Через 10 днів щурів, у яких була виявлена Дія антипрогестину (І) у відношенні індукції принаймні одна пухлина, піддавали протягом 4 апоптозу й зумовлене нею інгібування росту клітин тижнів наступним обробкам: 1) вводили розчинник T47D раку молочної залози людини, ксенотрансп(контроль), 2) піддавали оваріектомп перед початлантованих безтимусним мишам лінії Fox Chas, ком досліду, вводили щодня 3) антипрогестин (І), виявилася порівнянною з дією звичайної терапії, 1,0мг/кг/день, 4) антипрогестин (I), 0,5мг/кг/день і призначеної для депривації естрогену (оваріекто5) онапристон, 5мг/кг/день. Як параметр для оцінки мії), яка у даний час вважається методом інгібу 13 76729 14 вання росту пухлини молочної залози при викорипроліферації оцінювали експресію ЯАПК (ядерний станні даної моделі, який має максимальну ефекантиген проліферуючих клітин). Ядерний антиген тивність. проліферуючих клітин (ЯАПК) являє собою ядерПриклад 4: ний протеїн, який має молекулярну масу 36кДа, Ксенотрансплантат пухлини лінії MCF-7 молощо бере участь у клітинному циклі. Було встановчної залози людини, імплантований безтимусним лено, що ЯАПК має імунореактивність в компартмишам менті здорових тканин, які характеризується проМатеріали і методи: ліферацією. Для вивчення його розподілу в тканині Самкам безтимусних мишей лінії Fox Chase використовували моноклональне антитіло, яке (фірма М&В) вводили пелети естрадіолу (фірма розпізнає епітоп, стійкий у відношенні фіксації і Innovative Research of America). Клітини лінії MCF7 процесінгу. раку молочної залози, отримані з клітинної культуTUNEL (Тест для оцінки апоптозу): Біохімічним ри і суспендовані в матригелі, імплантували s.c. у критерієм апоптозу є деградація геномної ДНК, що пахвинну ділянку мишей. Обробку починали після являє собою необоротний процес, який приводить того, як пухлини досягали розміру приблизно до загибелі клітин. Він характеризується фрагмен25мм2. Обробку продовжували доти, поки продовтацією ДНК, що відбувається внаслідок активації жувався розвиток пухлини. В експерименті викоядерних ендонуклеаз, які вибірно розщеплюють ристовували наступні групи тварин: 1) контрольну ДНК у сайтах, розташованих між нуклеосомними групу (яку обробляли носієм), 2) групу, піддану ланками. Такі розриви ланцюга ДНК виявляли за оваріектомії, 3) групу, яку обробляли антипрогесдопомогою ферментного мічення 3'-ОН-кінців за тином (І), 10мг/кг s.c. Площа пухлини визначали за допомогою флуоресцин-дУТФ із використанням допомогою циркуля. Для статистичного аналізу термінальної дезоксинуклеотидил-трансферази відмінностей середніх значень між групами вико[TUNEL, Terminal Deoxynucleotidyl Transferaseристовували критерій Крускала-Уолліса. Mediated dUTP Nick End Labeling, див. у Gavrieli і Результати: ін., J. Cell. Biol. 119, 493, 1992]. Включений флуоУ дослідах з використанням моделі раку молоресцин виявляли за допомогою кон'югата антитіла чної залози лінії MCF7 оваріектомія приводила до до флуоресцину і лужної фосфатази і наступної істотного інгібування росту пухлини в порівнянні зі взаємодії із субстратом лужної фосфатази. швидким ростом у контролі. Дані, наведені на Результати: Фіг.4, переконливо свідчать про те, що введення Гістологія: На зрізах тканини індукованих НММ антипрогестину (І) s.c. у дозі 10мг/кг індукувало пухлин, оброблених антипрогестином (І), видні апоптоз пухлинних клітин. Дія антипрогестину (І) диспластичні утворення у вигляді проток і гронепрактично порівнянна з дією звичайної терапії, подібні утворення, як правило заповнені секреторпризначеної для депривації естрогену (оваріектоним продуктом (Фіг.5А). Крім того, спостерігається мії). збільшення об'ємної частки гранулярних структур Висновки: у порівнянні з контролями (Фіг.5Б). Крім того, у Дія антипрогестину (І) у відношенні індукції пухлинах молочної залози тварин, оброблених апоптозу й зумовлене нею інгібування росту клітин антипрогестином (І), видні морфологічні ознаки лінії MCF7 раку молочної залози людини, ксенотдиференціювання. рансплантованих безтимусним мишам лінії Fox Індекс проліферації: імунореактивність у відChas, виявилася порівнянною з дією звичайної ношенні ЯАПК виявилася найбільш високою в нетерапії, призначеної для депривації естрогену обробленій тканині раку молочної залози, індуко(оваріектомії). ваного НММ (Фіг.5В: необроблений контроль). Приклад 5: Кількість клітин, які мають імунореактивність у відВивчення індукованого НММ раку молочної ношенні ЯАЛК, зменшувалася в результаті індукції залози в щурів (гістологія, індекс проліферації і диференціювання в тканині раку молочної залози TUNEL-аналіз) щура, індукованого НММ, при обробці антипрогесМатеріали і методи: тином (І) (Фіг.5Г). Ці дані свідчать про те, що у виПухлини індукували шляхом внутрішньовенної падку раку молочної залози обробка антипрогесін'єкції НММ (нітрозометилсечовина, 50мг/мл) самтином зменшувала індекс проліферації внаслідок кам щурів лінії Sprague-Dawley (отриманим від індукції диференціювання. фірми Tierzucht Schönwalde, віком 50-55 днів). ЩуTUNEL (Апоптоз): На Фіг.5Д продемонстроварів, у яких була виявлена принаймні одна пухлина но, що на відміну від необробленого контролю в розміром більше 150мм2, піддавали протягом 7 тканині раку молочної залози, індукованого НММ, днів наступним видам обробки: 1) вводили розобробка антипрогестином (І) викликала апоптоз чинник (контроль), 2) здійснювали оваріектомію (Фіг.5Е). Зовсім очевидно, що введення лише одперед початком досліду, 3) вводили антипрогестин ного антипрогестину (І) індукувало апоптоз у тка(І), 3мг/кг s.c, щодня. Після завершення обробки нинах раку молочної залози, індукованого НММ, і пухлини вирізали, фіксували у формаліні і занурютим самим інгібувало ріст цих пухлин. вали в парафін. На цих виділених пухлинах проПриклад 6: водили гістологічний аналіз, оцінку індексу проліАнтипроліферативна активність антипрогестиферації й аналіз індукції апоптозу. Гістологія: Для ну (I) in vitro у клітинах лінії T47D здійснення гістологічного аналізу зрізи тканини Матеріали і методи: фарбували гематоксиліном і досліджували за доКлітини лінії T47D вирощували в обробленій помогою мікроскопа. активованим вугіллям сироватці, доповненій 0,1нМ Індекс проліферації: Для визначення індексу Е2 (естрадіол) і антипрогестином (І), протягом 6 15 76729 16 днів, протягом яких один раз здійснювали заміну робив якої-небудь помітної інгібуючої дії. Навіть середовища. Після здійснення фіксації і наступнозастосування чистого антиестрогену 11-фтор-го фарбування кристалічним фіолетовим вимірю{5-[Ν-мнтил-Ν-3-(4,4,5,5,5вали абсорбцію й отримані значення стандартизупентафторпентилтіо)пропіламіно]пентил}естравали по відношенню до рівня абсорції 1,3,5(10)-триєн-3,17-діолу (WO 98/07740) виявинеоброблених контролів відповідно до методу, лося істотно менш ефективним, ніж антипрогестиописаному в [R.B. Lichtner, J. Steroid Biochem. МоI. ну (І) (див. Фіг.6). Вiol. 1999, 71;181-189]. TUNEL-аналіз проводили Висновки: аналогічно до методу, описаному вище в прикладі Антипрогестин (І) за даним винаходом індуку5 з єдиною відміною, яка полягає в тому, що для вав повне інгібування стимульованого естрадіолом аналізу замість зрізів тканини використовували росту клітин лінії T47D при його застосуванні в клітини, які культивували на предметних стеклах дуже малих концентраціях і тому істотно перевидля мікроскопічного аналізу. щував у відношенні сили дії й ефективності інші Результати: досліджені антипрогестини, такі як онапристон і У цьому досліді in vitro на клітинах лінії T47D чистий антиестроген 11-фтор--{5-[Ν-мнтил-Ν-3встановлено, що антипрогестин (І) мав виражену (4,4,5,5,5інгібуючу ріст пухлини активність при використанні пентафторпентилтіо)пропіламіно]пентил}естра-9 ефективних граничних концентрацій від 10 до 10 1,3,5(10)-триєн-3,17-діол. 8 молів/л, у той час як антипрогестин онапристон не 17 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 76729 Підписне 18 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601