Консервування та контрольована доставка/вивільнення сперматозоїдів

Реферат: Винахід стосується біополімерних частинок для консервування сперматозоїдів, де сперматозоїди вміщені в сітку біополімерного гелю, а біополімер, в який вміщені сперматозоїди, містить альгінат, збагачений гулуроновою кислотою. UA 98467 C2 (12) UA 98467 C2 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується біополімерних частинок для консервування сперматозоїдів. Даний винахід також стосується способу консервування, зберігання та контрольованої доставки/вивільнення сперматозоїдів і застосування біополімерних частинок згідно з даним винаходом в розведенні тварин. Штучне осіменіння (ШО) являє собою метод, при якому сперматозоїди вміщають в матку або в шийку матки тварини штучними способами більш імовірно, ніж шляхом природного спаровування. Його широко застосовують як спосіб схрещування і при розведенні тварин для примноження бажаних характеристик, зокрема, у випадку сільськогосподарських тварин, таких як велика рогата худоба, свині, вівці, свійська птиця і коні, але також і у випадку домашніх вихованців, таких як породисті собаки, водних тварин або вимираючих видів. Звичайно сперматозоїди збирають, розбавляють, а потім консервують шляхом, наприклад, кріоконсервування. Застосування методів кріоконсервування передбачає, що сперматозоїди від конкретного виду тварини витримують таку обробку, яка не призводить в результаті до дуже великого пошкодження якості сперматозоїдів, їх життєздатності та здатності до запліднення. Потім сперматозоїди транспортують до місця розташування самиць або в кріоконсервованому, або в свіжому вигляді залежно від того, що в даному випадку є придатним. Дуже важливо, щоб сперматозоїди зберігали життєздатність до моменту осіменіння і протягом достатнього періоду часу всередині самиці тварини після осіменіння доти, доки яйцеклітина(и) не досягне місця запліднення. Штучне осіменіння сільськогосподарських тварин застосовують з 1940-х років і в наш час широко застосовують у сільськогосподарському виробництві, зокрема, для розведення молочних порід корів, а також свиней. Огляд з розвитку сучасного ШО і проблем тваринників відносно застосування штучного осіменіння і консервування сперматозоїдів розкритий у R.H.Foote (2002), American Society of Animal Science (http://www.asas.org/svmposia/esupp2/Footehist.pdf) та в книзі "Reproduction in farm animals", edited by B. Hafez, E.S.E. Hafez.-7th ed., Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2000. -XIII, ISBN 0-683-30577-8 (ib.). Штучне осіменіння стало важливим економічним засобом для розведення тварин у сільськогосподарському виробництві, як відносно розведення тварин з конкретними переважними генетичними характеристиками, так і для тваринництва в цілому. Проте існують деякі обмеження відносно одержання вагітностей у самиць тварин в результаті проведення штучного осіменіння. Наприклад, термін зберігання і життєздатність зібраних сперматозоїдів, як в процесі зберігання після відтавання у випадку кріоконсервованих сперматозоїдів, так і після осіменіння, суттєві для успішного результату розведення. Доступність придатних методик консервування для конкретного виду тварин варіює. Для великої рогатої худоби широко використовують методи кріоконсервування. З іншого боку, сперматозоїди від інших видів, таких як свині, менш толерантні до методів кріоконсервування, що призводить в результаті до меншої гнучкості відносно можливостей обробки та зберігання сперми. Крім того, для одержання сперматозоїдів з придатною запліднюючою здатністю бажано, щоб використовуваний метод консервування також забезпечував збереження запліднюючої здатності після осіменіння. Зосереджено безліч зусиль і досліджень способів консервування, спрямованих на забезпечення способів та засобів зберігання, які гарантують, що сперматозоїди зберігають запліднюючу здатність, протягом тривалішого часу після збору і до моменту осіменіння. Якщо термін зберігання відносно збереження запліднюючої здатності після осіменіння короткий, важче знайти підходящий момент для осіменіння відносно овуляції. У випадку властивості короткого терміну зберігання необхідні хороші методи консервування сперматозоїдів, які забезпечують триваліший термін зберігання і, отже, тривалішу запліднюючу здатність. Все ще відсутній доступний спосіб консервування, який забезпечує достатній термін зберігання і життєздатність сперматозоїдів протягом достатнього періоду після осіменіння, щоб відповідати потребі тваринників в гнучкості застосування, зокрема, коли існує далека відстань між розташуванням самців і, отже, місцем, де здійснюють збір сперми, і самиць-реципієнтів, і потрібен час для транспортування. Крім того, спосіб консервування, який забезпечує більш контрольовану і тривалу доступність сперматозоїдів, знизив би необхідність в штучно стимульованій овуляції шляхом гормональної обробки. Це було б переважно як економічно, відповідно до потреб споживача, так і відносно здоров'я тварин. Отже, існує необхідність в способах, які гарантують, що сперматозоїди зберігають запліднюючу здатність, протягом тривалішого часу після осіменіння, і зберігають запліднюючу здатність, протягом тривалішого часу, коли вони вміщені всередину самиці-реципієнта. 1 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В наш час штучне осіменіння (ШО) у великої рогатої худоби в широкому масштабі проводять, використовуючи кріоконсервування сперматозоїдів. Кріоконсервовані сперматозоїди можна зберігати в рідкому азоті протягом десятиліть до застосування. Проте, коли сперматозоїди відтають, ШО необхідно проводити в межах декількох годин. Після осіменіння кріоконсервовані сперматозоїди мають запліднюючий потенціал протягом приблизно 12-24 годин, і ШО необхідно проводити приблизно за 12-24 години до овуляції. Тому існує необхідність в методах консервування для розведення великої рогатої худоби, що забезпечують сперматозоїди, які мають характеристики достатнього терміну зберігання і які переважно зберігають запліднюючу здатність, протягом декількох діб. У деяких країнах використовують бичачі сперматозоїди, що зберігаються в рідині, з метою зменшення кількості клітин сперми на дозу ШО. Сперматозоїди мають запліднюючу здатність протягом приблизно 24-36 годин до осіменіння. ШО слід проводити в межах приблизно 24 годин після збору сперматозоїдів. Проте бичачі сперматозоїди рідкого консервування обтяжені деякими недоліками, такими як скорочений/знижений термін зберігання і знижений обсяг розподілу. У свиней кріоконсервовані сперматозоїди застосовують лише для спеціальних цілей, таких як експорт, перевезення на далекі відстані, а також для контролю заразних захворювань. ШО у свиней звичайно здійснюють спермою рідкого консервування. Час зберігання сперми (сперматозоїдів) рідкого консервування повинен залежати від того, який розріджувач використовують. Сперматозоїди, розведені розріджувачами короткочасної дії, зберігають запліднюючу здатність, протягом приблизно 2-3 діб, тоді як сперматозоїди, розведені розріджувачами тривалої дії можуть зберігати запліднюючу здатність протягом аж до 5-6 діб. Після осіменіння запліднююча здатність сперматозоїдів зберігається протягом приблизно 12-24 годин. Більшість свиноматок осіменяють двічі під час обігріву з інтервалом приблизно 24 години. При більш гнучкій системі, яка забезпечує триваліший час зберігання до осіменіння (наприклад, один тиждень) і/або пролонговане зберігання і вивільнення сперматозоїдів після осіменіння (наприклад, більш ніж 24 години) тваринництво мало б ефективнішу продуктивність і поширення, і тваринники мали б меншу потребу в точності періодизації осіменіння відносно овуляції. У конярстві тваринник, в основному, залежить від наявності свіжозібраної сперми у зв'язку із відсутністю прийнятних методів консервування для кінських сперматозоїдів. Це представляє велику проблему в конярстві та в індустрії кінних перегонів, оскільки переважний жеребецьплідник для конкретної племінної кобили найчастіше знаходиться в іншій країні, що вимагає тривалого часу транспортування. Крім того, у зв'язку із відсутністю придатних методів консервування для кінських сперматозоїдів, ШО свіжих кінських сперматозоїдів необхідно здійснювати в межах 24 годин після збору сперматозоїдів. Конярство, таким чином, супроводжується небажаним дефіцитом часу, що часто призводить до зниженої якості сперми або зниження запліднення у зв'язку з некоректним осіменінням відносно овуляції. Отже, існує необхідність в способах консервування, які гарантують як триваліший термін зберігання відносно необхідного часу на транспортну доставку, так і триваліший термін зберігання після осіменіння. Спосіб консервування, що застосовується до кінської сперми, мав би велику економічну та практичну цінність і, можливо, призвів би до перевороту в конярстві. Система консервування сперматозоїдів, яка забезпечує достатню життєздатність, як під час зберігання, так і до і після осіменіння, була б вигідна для тваринництва в цілому. Більш гнучка система консервування зробила б роботу із розведення всіх видів тварин легшою і призвела б в результаті до підвищення успішного запліднення. Система, де тваринник у меншій мірі залежний від відповідності найбільш переважному моменту часу осіменіння відносно овуляції, забезпечує велику гнучкість. В цілях підвищення запліднюючої здатності випорскуваних сперматозоїдів досліджено декілька способів консервування, включаючи кріоконсервування і рідке консервування. Опубліковано декілька досліджень зберігання сперматозоїдів всередині капсул. У цих дослідженнях використовували способи інкапсуляції, які призводять в результаті до частинки, де сперматозоїди розташовані всередині рідкої серцевини, оточеної напівпроникною мембраною. Nebel et al. (1985), Microencapsulation of bovine spermatozoa. J. Anim. Sci. 1985 60(6): 163139, описали спосіб інкапсуляції бичачих сперматозоїдів в капсулах, виготовлених з альгінату у поєднанні з полілізином. Даний спосіб оснований на раніше опублікованому способі від Lim and Sun (1980), Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science 1980 210(4472):908-10, які розробляли одержання інкапсульованого інсуліну на основі інкапсуляції клітин острівців Лангерганса. Nebel et al. (1985) повідомили про результати як зберігання при 2 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 37 °C, так і 335 осіменінь і результати для інкапсульованих сперматозоїдів порівнювали з не інкапсульованими контрольними зразками. У даному дослідженні не було повідомлено про великі відмінності між інкапсульованими і контрольними зразками. В інших опублікованих дослідженнях також продемонстровано, що сперматозоїди можуть бути інкапсульовані всередині капсул подібними способами, і вони можуть зберігати свою функціональність in vivo (Munkittrick et al. (1992) Accessory sperm numbers for cattle inseminated with protamine sulfate microcapsules. J. Dairy Sci., 75(3):725-31 (Bovine), Vishwanath et al. (1997) Selected times of insemination with microencapsulated bovine spermatozoa affect pregnancy rates of synchronized heifers. Theriogenology, 48: 369-76 (Bovine), і Maxwell et al. (1996). Survival and fertility of microencapsulated ram spermatozoa stored at 5 °C. Reprod. Dom. Anim., 31:665-73 (Sheep). Munkittrick et al. (1992), та Vishwanath et al. (1997) повідомили, проте, що інкапсульовані сперматозоїди не є настільки ж ефективними, як необроблені сперматозоїди, при осіменінні в один і той самий час. Це було пояснено тим, що інкапсульованим сперматозоїдам може потребуватися деякий час для вивільнення з капсул перш ніж може статися запліднення. Conte et al. (1998) в ЕР 0922451 В1, опублікованому Universita di Pavia и Universita Degli Studi Di Milano, і Torre et al. (2002), Boar semen controlled delivery system: storage and in vitro spermatozoa release. J. Contol. Release, 85:83-89, розробили альтернативний спосіб інкапсуляції сперматозоїдів кнура. При даному способі сперматозоїди додають в розчин, що містить кальцій або барій, і цю суспензію переносять по краплях в розчин, що містить альгінат. Капсула з альгінату кальцію або барію спонтанно утворюється довкола краплі як тільки вона потрапляє в розчин альгінату. Цей спосіб заявлений як м'якший по відношенню до клітин в порівнянні із способом, описаним Nebel et al. (1985). Інша перевага полягає в тому, що в даний спосіб залучено дуже невелике розбавлення розчину сперматозоїдів, яке заявлене як сприятливе для життєздатності клітин. Faustini et al. (2004), Boar spermatozoa encapsulated in barium alginate membranes: a microdensitometric evaluation of some enzymatic activities during storage at 18 °C, Theriogenology, 61(1): 173-184, повідомили про значно більшу фракцію сперматозоїдів з інтактною акросомою і меншим витіканням ферментів із сперматозоїдів, що зберігаються в інкапсульованому стані, де даний спосіб порівняли з необробленими сперматозоїдами, що зберігаються в таких самих умовах. У нещодавній статті Weber et al (2006), Design of high-throughput-compatible protocols for microencapsulation, cryopreservation and release of bovine spermatozoa. Journ. Biotechnol., 123:155-163, також описана нова система для інкапсуляції бичачих сперматозоїдів. Дана система призначена для виробництва інкапсульованих сперматозоїдів з високою пропускною здатністю з використанням капсул з Са-альгінату або целюлози сульфату і полідіалілдиметиламонію хлориду (pDADMAC). Нарешті, Chou et al., US 6596310 Bl (2003), розкритий спосіб штучного осіменіння шляхом регульованого за часом вивільнення сперми з капсул або твердих гранул, де сперму зберігають в не капацитованому стані за рахунок використання джерела енергії, яке не підтримує капацитацію. Даний винахід оснований на надзвичайному відкритті, що вміщення сперматозоїдів всередину біополімерних матриксів, де цей біополімерний матрикс складається з альгінату, збагаченого гулуроновою кислотою, призводить в результаті до сперматозоїдів з кращими характеристиками консервування відносно терміну зберігання, життєздатності і запліднення. Біополімерні частинки та їх сперматозоїди можна, таким чином, застосовувати при штучному осіменінні тварин. Одна з не обмежуючих переваг даної біополімерної системи консервування сперматозоїдів полягає в тому, що вона забезпечує переваги в результаті надання сперматозоїдам запліднюючої здатності протягом більш тривалого періоду після осіменіння і, таким чином, робить час осіменіння відносно овуляції менш критичним. Біополімерні частинки згідно з даним винаходом можна застосовувати при розведенні тварин і в тваринницькому виробництві у сільськогосподарському виробництві. Біополімерні частинки, таким чином, застосовні, коли мета полягає в одержанні тварин з особливо бажаними характеристиками. Біополімерні частинки також застосовні, коли метою є одержання тварин в цілому, наприклад, для продукції великої рогатої худоби м'ясного спрямування. Згідно з даним винаходом біополімерні частинки можна використовувати безпосередньо і осіменяти ними як такими тварину-реципієнта, якщо біополімерні частинки, такі як частинки альгінату, розчиняються у фізіологічних умовах всередині тварини-реципієнта (тобто всередині матки або шийки матки). Біополімерні частинки згідно з даним винаходом, таким чином, 3 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 забезпечують контрольоване вивільнення сперматозоїдів. Сперматозоїди можна також розчиняти з біополімерної частинки перед осіменінням сперматозоїдів. Як обговорено вище, на попередньому рівні техніки, в основному, запропонована інкапсуляція сперматозоїдів в біополімерних капсулах, де сперматозоїди містяться в рідкій серцевині біополімерної капсули. Лише в одному посиланні (Chou et al., US 6596310 Bl) згадана можливість вміщення сперматозоїдів в твердому полімерному матриксі, хоча не наведено жодного прикладу описаних там твердих гранул. Замість цього авторами даного винаходу відкритий інший підхід до іммобілізації сперматозоїдів. Згідно з даним винаходом сперматозоїди вміщені всередині сітки з твердого гелю, утвореної альгінатними гелями, де використовуваний альгінат збагачений гулуроновою кислотою. Авторами даного винаходу зроблено відкриття, що іммобілізація всередині сітки з твердого гелю має декілька переваг в порівнянні з інкапсуляцією всередині капсул і гранул, розкритої на попередньому рівні техніки. Не зв'язуючись з конкретною теорією, передбачають, що шляхом використання біополімерних частинок і способу згідно з даним винаходом це вміщення призводить в результаті до іммобілізації, наприклад, до обмеження природної рухливості сперматозоїдів за рахунок обмежувальних зв'язків сітки гелю. Фізичне обмеження рухливості за рахунок високих концентрацій клітин і присутності полімерів високої в'язкості може бути одним з факторів, який впливає на виживаність і підтримку функціональності сперматозоїдів в хвості придатка яєчка (Watson 1993). Сперматозоїди зберігаються протягом тривалих періодів часу (більш ніж 1 тиждень) в хвості придатка яєчка (Watson 1993). Використання альгінату, збагаченого гулуроновою кислотою, дає можливість одержання біополімерних частинок, що містять вміщенні в них сперматозоїди, які корисні на практиці як система консервування, і які можна застосовувати при штучному осіменінні, наприклад, в розведенні тварин. Таким чином, згідно з одним аспектом у винаході запропонована біополімерна частинка для консервування сперматозоїдів, де сперматозоїди вміщені в біополімерній сітці гелю, і де біополімерна частинка, в якій вміщений сперматозоїд, містить альгінат, збагачений гулуроновою кислотою. Згідно з іншим аспектом даного винаходу біополімер, що вміщує сперматозоїди, містить альгінат кальцію. Згідно з іншим аспектом вказаний біополімер містить альгінат з низькою в'язкістю. Згідно з ще одним іншим аспектом винаходу концентрація альгінату в біополімерних частинках за винаходом становить, щонайменше, 0,1 %. Згідно з ще одним іншим аспектом винаходу концентрація альгінату в біополімерних частинках за винаходом становить між, щонайменше, 0,1 % та 6 % альгінату. Згідно з ще одним з іншим аспектом винаходу концентрація альгінату в біополімерних частинках за винаходом становить, щонайменше, 1 %. Крім того, згідно з одним аспектом винаходу концентрація сперматозоїдів в біополімерних 6 частинках становить, щонайменше, 0,1×10 сперматозоїдів/мл, як наприклад, щонайменше, 6 9 100×10 сперматозоїдів/мл, як, наприклад, аж до, щонайменше, 2,5×10 сперматозоїдів/мл. Згідно з ще одним іншим аспектом частинки згідно з даним винаходом зберігають в розчині, наприклад, де відношення розчин для зберігання: біополімерні частинки знаходиться, щонайменше, між 1:1 та 1:100. Згідно з ще одним іншим аспектом сперматозоїди можуть бути вміщені спільно із сполуками або агентами, які корисні у значенні запліднюючої здатності і/або здоров'я тварини, як, наприклад, одна або більш ніж одна із сполук або агентів, вибраних з не обмежуючої групи, яка складається з розріджувачів, кріопротекторів, антибіотиків, антитіл, антиоксидантів, білків та гормонів. Згідно з іншим аспектом винаходу сперматозоїди вміщені спільно з одним або більш ніж одним антиоксидантом, вибраним з групи, яка складається з пірувату, 2,2,6,6тетраметилпіперидин-1 -оксилу, 4-гідрокси-2,2,6,6-тетраметилпшеридин-1 -оксилу, супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази бутильованого гідрокситолуолу, бутильованого гідроксіанізолу (гваяколу). Згідно з одним аспектом біополімерні частинки покриті оболонкою. Ця оболонка може бути вибрана з не обмежуючої групи, яка складається з полілізину, хітозану, сульфату целюлози, гідроксипропілметилцелюлози і полідіалілдиметиламонію хлориду. Біополімерні частинки згідно з даним винаходом містять сперматозоїди, зібрані від тварини, вибраної з не обмежуючої групи, яка складається із свиней, великої рогатої худоби, коней, овець, кіз, кроликів, свійської птиці, домашніх вихованців, таких як породисті собаки, водних тварин і вимираючих видів тварин, переважно свиней, великої рогатої худоби, хутрових звірів і 4 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 коней. Біополімерні частинки за даним винаходом можна, таким чином, застосовувати при одержанні вагітностей у самиць тварин того самого виду за допомогою загальноприйнятих способів штучного запліднення, таких як ШО, ЕКЗ (екстракорпоральне запліднення) та ВЦІС (внутришньоцитоплазматична ін'єкція сперми). Згідно з одним аспектом винаходу сперматозоїди, що використовуються для утворення вказаної частинки, містяться в сім'яній рідині. Можливо, біополімерна частинка може бути додатково оброблена шляхом дегідратації, кріоконсервування або ліофілізації. У винаході також запропонований спосіб одержання частинок згідно з винаходом, при якому суміш альгінату, збагаченого гулуроновою кислотою, і сперматозоїдів додають по краплях до гелеутворюючого розчину, гелеутворюючий розчин містить згідно з одним аспектом винаходу один або більш ніж один з нижченаведених іонів, вибраних з не обмежуючої групи, яка складається з кальцію, натрію, барію і магнію, переважно іонів кальцію та натрію. Крім того, біополімерні частинки можуть бути можливо утворені безпосередньо в сім'яному контейнері. Згідно з одним аспектом способу за винаходом частинки додатково обробляють шляхом дегідратації, кріоконсервування або ліофілізації. У даному винаході також запропоновано застосування біополімерних частинок згідно з даним винаходом при розведенні тварин, таких як свині, велика рогата худоба, коні, вівці, кози, кролики, свійська птиця, домашні вихованці, такі як породисті собаки, водні тварини і вимираючі види тварин. Згідно з одним аспектом винаходу біополімерні частинки застосовують при розведенні свиней, великої рогатої худоби або коней. Згідно з одним аспектом частинками осіменяють безпосередньо. Згідно з іншим аспектом частинки розчиняють перед осіменінням. Згідно з ще одним іншим аспектом частинки за винаходом використовують разом з вільними, іммобілізованими сперматозоїдами. Нарешті, в даному винаході запропонований спосіб запліднення тварини, при якому сперматозоїди, консервовані в частинках згідно з даним винаходом, вводять самиці-реципієнту тварини. На фіг. 1 показане зберігання in vitro сперматозоїдів бика (панель А) і кнура (панель Б) при температурах оточуючого середовища (бик 20 °C, кнур 18 °C). Значення рухливості наведені у вигляді функцій часу зберігання в порівняльних зразках і в зразках з іммобілізованими сперматозоїдами. На фіг. 2 показано зберігання in vitro сперматозоїдів бика (панель А) і кнура (панель Б) при 37 °C. Значення рухливості наведені у вигляді функцій часу зберігання в порівняльних зразках і в зразках з іммобілізованими сперматозоїдами. На фіг. 3 показано зберігання in vitro сперматозоїдів при температурах оточуючого середовища (18 °C). Значення рухливості наведені у вигляді функцій часу зберігання в порівняльних зразках і в зразках з іммобілізованими сперматозоїдами. В експериментах із зберігання використана різна кількість середовища для зберігання відносно кількості гранул, що вказано номером серії. Сперматозоїди іммобілізовані на гранулах діаметром 1 мм при концентрації 1×10 сперматозоїдів/мл. Фіг. 4: Зберігання in vitro сперматозоїдів кнура при температурах оточуючого середовища (18 °C). Значення рухливості наведені у вигляді функцій часу зберігання в порівняльних зразках і в зразках з іммобілізованими сперматозоїдами. В експериментах із зберігання використані гранули з різними концентраціями іммобілізованих сперматозоїдів, що вказано номером серії. Сперматозоїди іммобілізовані на гранулах діаметром 3 мм. Як описано раніше, основна увага досліджень раніше була зосереджена у напрямку інкапсуляції сперматозоїдів в цілях полегшення запліднення in vitro та штучного осіменіння. Автори даного винаходу зробили принципово інший підхід до іммобілізації сперматозоїдів, де сперматозоїди вміщують всередину сітки гелю або біополімеру всередині частинки твердого гелю, і де сітка біополімеру складається з альгінату, збагаченого гулуроновою кислотою. Даний підхід принципово відрізняється від інкапсуляції сперматозоїдів, раніше описаної на попередньому рівні техніки, де сперматозоїди містяться всередині капсули з рідкою серцевиною, де сперматозоїди можуть здійснювати кругові рухи, як в їх природному оточенні. Біополімерні частинки, що містять сперматозоїди, згідно з даним винаходом не залежать від використання розчинів, що гарантує, що сперматозоїди підтримуються в не капацитованому стані. Термін "вміщати" або "що містить", як використовують тут, слід розуміти як іммобілізацію сперматозоїдів, що призводить в результаті до того, що запобігають природній можливості руху сперматозоїдів. Ступінь іммобілізації повинен варіювати залежно від характеристик 5 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 біополімерної частинки, таких як механічна міцність, і від типу полімеру, що використовується. Проте повинно бути зрозуміло, що запобігають природній можливості руху сперматозоїдів, вміщених у біополімерних частинках згідно з даним винаходом, яку сперматозоїди в іншому випадку мали б, якщо б вони зберігалися в рідині, такій як рідка серцевина капсули. Термін "біополімерна частинка", як використовують тут, означає частинку, яка, коли вона містить сперматозоїди, забезпечує знижену можливість руху. Біополімерні частинки згідно з даним винаходом складаються з речовини, яка утворює сітку, що складається з альгінатного гелю, збагаченого гулуроновою кислотою. Функція біополімерної частинки відносно консервування сперматозоїдів не залежить від тривимірної форми біополімерної частинки згідно з даним винаходом. Таким чином, біополімерні частинки згідно з даним винаходом можуть мати різні форми, такі як, наприклад сфеична або циліндрична форма. Альгінат являє собою полімер, який складається з гулуронової кислоти (G) і маннуронової кислоти (М). Альгінат є спільною складовою частиною клітинної стінки у всіх видів бурих водоростей (Phaeophyceae), і звичайно його екстрагують лужним розчином. Відношення маннуронової кислоти до гулуронової кислоти (M/G) в альгінаті широко варіюють залежно від конкретних альгінофітів (бурих водоростей, продукуючих альгінат) і впродовж різних сезонів. Альгінат також синтезується бактеріями Pseudomonas та Azotobacter (Svanem et al. (2001), The Journal of Biological Chemistry, Vol 276:34, 31542-31550, Jain et al. (2003), Molecular Microbiology, 47(4), 1123-1133, Scott and Quatrano (1982), Applied and Environmental Microbiology, 44:3, 754-756). Альгінати широко застосовують, наприклад, у харчовій промисловості, як, наприклад, як стабілізатори і для регуляції в'язкості, у фармацевтичній та косметичній промисловості як, наприклад, розпушувач. Для різних цілей доступні як альгінати, збагачені гулуроновою кислотою, так і маннуроновою кислотою, відповідно (Mancini et al., (1999), Journal of Food Engineering 39, 369-378), і відомі різні способи одержання альгінатів, збагачених гулуроновою кислотою (див. WO 8603781, US 4990601, US 5639467). Термін "альгінат, збагачений гулуроновою кислотою" або "G-збагачений альгінат", як його використовують тут, означає альгінат, що містить вищі кількості гулуронової кислоти, ніж маннуронової кислоти в полімерних ланцюгах, що складають полісахарид. Приклади розуміння терміну "G-збагачений", як звичайно він використовується фахівцями в даній галузі техніки, очевидні з попереднього рівня техніки, викладеного в двох попередніх параграфах. Альгінатні гелі утворюються за рахунок взаємодій між двовалентними іонами, такими як 2+ Са , і блокують структуру гулуронової кислоти в полімерному ланцюзі альгінату. Таким чином, утворення альгінатних гелів можна здійснювати в дуже м'яких умовах, і воно придатне для іммобілізації клітин. Альгінатні гелі, таким чином, широко застосовують для іммобілізації різних типів клітин. Проте іммобілізацію в альгінаті найчастіше застосовують як вихідну точку для подальшого утворення різних типів капсул з рідкою серцевиною. При посиланні тут далі на альгінат, альгінатний гель, альгінатну сітку або біополімерну частинку згідно з даним винаходом, повинно бути зрозуміло, що вказаний альгінат, альгінатний гель, альгінатна частинка або біополімерна сітка або частинка згідно з даним винаходом є збагаченою гулуроновою кислотою. Не обмежуючими прикладами придатних типів альгінату є FMC LF 10/40, FMC LF 10/60 и FMC LF 20/60, доступні від FMC Biopolymer AS, Драммен, Норвегія, або А2ОЗЗ від Sigma, Осло, Норвегія. Термін "термін зберігання", як його використовують тут, означає час, протягом якого сперматозоїди зберігають запліднюючу здатність, як відносно зберігання in vitro до осіменіння, так і in vivo після осіменіння в тварини-реципієнта. Конкретний термін зберігання сперматозоїдів різного походження може варіювати. Проте, дана система консервування, де сперматозоїди вміщені в біополімерні частинки згідно з даним винаходом забезпечує триваліший термін зберігання після осіменіння в порівнянні із сперматозоїдами, якими осіменяють, після загальноприйнятих способів зберігання після збору сперми. Відповідно до одного з прикладів винаходу свинячі сперматозоїди зберігають відмінну запліднюючу здатність протягом більш ніж 12 годин після осіменіння, переважніше більш ніж 24 годин після осіменіння. Згідно з ще одним іншим прикладом винаходу бичачі сперматозоїди зберігають відмінну запліднюючу здатність, протягом більш ніж 12 годин після осіменіння, переважніше більш ніж 24 годин після осіменіння. Термін "розведення", як використовують тут, означає будь-який спосіб, що використовується для досягнення вагітності у самиці тварини. Не обмежуючий перелік таких способів включає ЕКЗ, штучне осіменіння та ВЦІС. Крім того, розведення охоплює як розведення відносно одержання тварин, які мають особливо бажані характеристики, так і відносно комерційної продукції. 6 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "сперматозоїди", як використовують тут, включає сперматозоїди як такі, а також сперматозоїди, які містяться в сім'яній рідині, тобто сперму можна використовувати безпосередньо при утворенні біополімерів згідно з даним винаходом. Проте також сперматозоїди виділені із сім'яної рідини, що, можливо, містяться в інших придатних розчинах для зберігання, можна використовувати для утворення біополімерних частинок згідно з даним винаходом. Термін "сім'яний контейнер", як використовують тут, включає всі види упаковок, придатних для вмісту та зберігання сперматозоїдів. Попередні способи інкапсуляції, розкриті на попередньому рівні техніки і такі, як обговорено вище, є трудомісткими, і методи іммобілізації звичайно містять декілька стадій. Проте препарат біополімерних частинок згідно з даним винаходом можна готувати в одностадійній методиці. Точніше, частинки альгінату кальцію, що містять сперматозоїди, легко утворюються при мінімальному фізіологічному і хімічному навантаженні на іммобілізовані клітини. Можуть бути одержані альгінатні частинки різних розмірів і форм і з варіюючими типами альгінату, концентраціями альгінату і концентраціями іммобілізованих сперматозоїдів. З метою вміщення сперматозоїдів згідно з даним винаходом використання альгінату як біополімерного матеріал особливо придатне внаслідок того факту, що і) можна утворити гелі в м'яких умовах, іі) альгінат нетоксичен по відношенню як до сперматозоїдів, так і до твариниреципієнта, і ііі) альгінат розчиняється у фізіологічних умовах і, отже, здатний вивільняти сперматозоїди всередині матки або шийки матки. Згідно з одним аспектом даного винаходу альгінатні частинки одержують шляхом додавання розчину, що містить альгінат і сперматозоїди, по краплях в гелеутворюючий розчин, що призводить в результаті до утворення альгінатних гранул із сперматозоїдами, вміщені в них. Одержання альгінатних гранул відоме фахівцям в даній галузі техніки, наприклад, як розкрито в Smidsrad, О. and Skjak-Brak, G. (1990) Alginate as immobilization matrix for cells. Trends in Biotechnology 8, 71-78, і в US 6497902. Різні гелеві розчини можна застосовувати для утворення біополімерних частинок, таких як альгінатні гранули. Різні розчини, які придатні для утворення різних біополімерних частинок, знаходяться в межах знань фахівців в даній галузі техніки. Згідно з даним винаходом двовалентні іони (тут також названі гелеутворюючими іонами), такі як кальцій і барій, можна використовувати для утворення альгінатних частинок, наприклад, для досягнення гелеутворення альгінату. Альгінати утворюють гелі у присутності багатьох двовалентних іонів і багатовалентних іонів. Застосування іонів кальцію призводить в результаті до швидкого гелеутворення і відносно міцних частинок. З іншого боку, використання іонів барію призводить в результаті навіть до міцніших частинок, які більш стабільні у фізіологічних умовах. Повинно бути зрозуміло, що тип і кількість гелеутворюючого іона, які слід використовувати для утворення біополімерних частинок згідно з даним винаходом, можуть варіювати у відповідності, серед іншого, з бажаною міцністю утвореного гелю, типом і концентрацією використовуваного альгінату, вмістом гулуронової кислоти і довжиною G-блока альгінату, типом і джерелом використовуваних сперматозоїдів, типом додаткових агентів, які потрібно включати в частинки (таких як антибіотики, розріджувачі, антиоксиданти тощо), і що такі модифікації знаходяться в межах обсягу даного винаходу. Ґрунтуючись на попередньому рівні техніки і на керівництві даного опису, фахівець в даній галузі техніки повинен ідентифікувати і визначити без зайвого навантаження різні сполуки, які можуть бути спільно вміщені із сперматозоїдами в біополімерних частинках згідно з даним винаходом. Згідно з одним аспектом даного винаходу іони кальцію та іони натрію використовують для утворення біополімерних частинок. Таким чином, шляхом варіювання концентрації альгінату і ступені зшивання можна одержати частинки з різними характеристиками вивільнення сперматозоїдів і ті, які, наприклад адаптовані до конкретного виду тварин або до конкретних умов овуляції у різних тварин. Крім того, концентрація альгінату впливає на механічні характеристики біополімерних частинок, і, отже, також на характеристики розчинення частинок. Концентрація альгінату може, таким чином, варіювати залежно від характеристик розчинення, необхідних в кожному випадку залежно, наприклад, від тварини-реципієнта. Фахівець в даній галузі техніки, ґрунтуючись на загальних знаннях і ґрунтуючись на наведеному тут керівництві і без зайвого навантаження, визначить різні застосовні концентрації G-багатого альгінату для використання при одержанні біополімерних частинок згідно з даним винаходом. Згідно з одним аспектом винаходу концентрація альгінату в біополімерних частинках згідно з даним винаходом знаходиться між, щонайменше, 0,1 та 6 %. 7 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Концентрація сперматозоїдів, вміщених в біополімерних частинках згідно з даним винаходом, може варіювати залежно, наприклад, від типу/джерела сперматозоїдів, породи, тварини-реципієнта, методик або системи осіменіння, методик або системи запліднення, присутності інших агентів, включених в частинки (антибіотиків, антиоксидантів, розріджувачів, білків тощо). В принципі, не існує нижньої межі концентрації сперматозоїдів, і ця концентрація може варіювати залежно, наприклад, від способу запліднення, походження сперматозоїдів, тварини-реципієнта, характеристик розчинення біополімерних частинок тощо. При керівництві даного опису і загальних знаннях фахівець в даній галузі техніки повинен без зайвого навантаження експериментування визначати придатну концентрацію сперматозоїдів, яку потрібно використовувати в кожному випадку на підставі бажаного способу запліднення, походження сперматозоїдів тварини-реципієнта тощо. Слід взяти до уваги, що при застосуванні ВЦІС як бажаного способу запліднення можна використовувати нижчі кількості сперматозоїдів у порівнянні, наприклад, із штучним осіменінням. Згідно з одним аспектом винаходу концентрація сперматозоїдів, таким чином, становить, 6 щонайменше, 0,1×10 сперматозоїдів/мл. Відкриття даного винаходу показують, що для деяких тварин виживаність сперматозоїдів у високому ступені підвищена при підвищенні концентрації сперматозоїдів. Отже, відповідно до 9 одного прикладу даного винаходу, щонайменше, 25×10 свинячих сперматозоїдів/мл вміщують 6 в біополімерну частинку (див. фіг. 4). Проте 100×10 свинячих сперматозоїдів/мл також призводять в результаті до вагітностей у самиць тварин. Для бичачих сперматозоїдів застосований такий самий діапазон концентрації, як для свинячих сперматозоїдів. Концентрацію сперматозоїдів в біополімерних частинках можна, крім того, модифікувати шляхом зміни кількості сперматозоїдів щодо кількості альгінату перед гелеутворенням, або шляхом концентрації або розведення розчину сперматозоїдів перед змішуванням розчину альгінату і розчину, що містить сперматозоїдів. Проте, оскільки модифікація кількості сперматозоїдів, кінець кінцем, призводить до модифікації концентрації альгінату в одержаних частинках, концентрація альгінату у вихідному розчині альгінату має бути відрегульована, якщо концентрацію альгінату в біополімерних частинках слід зберегти. Внаслідок високої в'язкості альгінату в розчині на практиці може бути складним використання розчину альгінату більш ніж з 4-6 % альгінату. Таким чином, згідно з одним аспектом винаходу біополімерні частинки складаються з альгінату з низькою в'язкістю. Крім того, сперматозоїди, вміщені в біополімерних частинках згідно з даним винаходом, деяким чином ізольовані від оточуючого середовища і не вивільняються до тих пір, доки сітка гелю альгінату кальцію на розчиниться. Крім того сітка гелю альгінату кальцію розчиняється повільно у фізіологічних умовах, що викликає повільно вивільнення сперматозоїдів з матриксу іммобілізації. За рахунок цього ефекту сперматозоїди із запліднюючою здатністю, можуть бути присутніми протягом триваліших періодів часу. Швидкості розчинення можна контролювати, використовуючи різні типи покриттів на матриксі іммобілізації. Різні корисні покриття відомі, включаючи, але не обмежуючись ними, полілізин, хітозан, сульфат целюлози, гідроксипропілметилцелюлозу або полідіалілдиметиламонію хлорид. Для подальшого поліпшення якості сперматозоїдів сперматозоїди можна спільно вміщати з різними розчинами, важливими для виживаності і життєздатності сперматозоїдів. Згідно з одним втіленням винаходу в біополімерну частинку за даним винаходом включають розріджувач. Розріджувачі для сперматозоїдів звичайно використовують для декількох цілей: - для збільшення об'єму - для стандартизації кількості сперми в дозі ШО - для одержання буферної ємності - для забезпечення фізіологічного оточуючого середовища відносно осмомолярності - для підтримки живлення клітин сперми - для контролю мікробіологічного зараження (антибіотики), або у випадку кріоконсервування - для захисту клітин сперми від пошкоджень при заморожуванні і відтаванні. В межах знань фахівців в даній галузі техніки знаходиться вибір відповідного розріджувача, який можна використовувати в біополімерних частинках згідно з даним винаходом, ґрунтуючись, наприклад, на типі (походженні) сперматозоїдів, виді, способі консервування, температурі зберігання, способі осіменіння, зоосанітарних вимогах і міжнародному законодавстві. Молочні розріджувачі і Трис є лише небагатьма не обмежуючими прикладами розріджувачів серед величезної кількості застосовних, наявних в продажі розріджувачів для сперматозоїдів. Іншими корисними розріджувачами є розріджувачі, описані в Aalbers, JG, Rademaker, JHM, Grooten, HJG and Johnson, LA, 1983: Fecundity of boar semen stored in BTS, Kiev, Zorlesco, и Modena extenders under field conditions. J. Anim. Sci. 75 (Suppl. 1), 314-315, і Aalbers, JG, Johnson, LA, Rademaker, 8 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 JHM and Grooten, HJG, 1984: Use of boar spermatozoa for AI: fertility and morphology of semen diluted in BTS and used for insemination within 24 hrs or 25 to 48 hrs after collection. Proc. 10th Int Congr. Anim. Reprod and Artif. Insemin. Urbana IL, Vol II, No 180, pp 1-3, звичайно відомий як BTS. BTS є в продажу от Minitub і Tyskland (Minitub Abftill und Labortechnik GmbH & Co.KG, Hauptstrasse 41, DE-84184 Тієфенбач, Німеччина). Ще одним іншим корисним розріджувачем є розріджувач Tri Х-Cell™, наявний в продажі від IMV (Instrument de Medecine Veterinaire, 10, rue Georges Clemenceau, B.P. 81, FR-61302 L'AIGLE Cedex, Франція). Різні розріджувачі розрізняються за складом, рН, буферною ємністю, осмомолярністю та антибіотиками. Багато з них опубліковані, тоді як інші є комерційною таємницею. Найпростіші розріджувачі складаються лише з різних розчинів цукрів, як, наприклад, лактози і глюкози. На основі загальних знань фахівців в даній галузі техніки в сфері консервування сперми повинно бути зрозуміло, що різні розріджувачі можна використовувати згідно з даним винаходом. Типи розріджувачів, використовуваних згідно з даним винаходом, можуть варіювати залежно від походження сперми, типу використовуваного полімеру, способу консервування, температури зберігання тощо. В межах знань фахівців в даній галузі техніки знаходиться визначення і вибір типу і підходящої кількості використовуваного розріджувача без відхилення від обсягу винаходу, розкритого в описі і вкладеній формулі винаходу. Згідно з даним винаходом можуть бути утворені біополімерні частинки різних розмірів відповідно до способів, відомих на попередньому рівні техніки. Який розмір є придатним, залежить від різних факторів, таких як джерело сперматозоїдів, тип і розмір використовуваного пристрою для запліднення, розмір і форма використовуваного сім'яного контейнера тощо. Біополімерні частинки згідно з даним винаходом можуть бути утворені діаметром, придатним для всіх методів осіменіння попереднього рівня техніки для забезпечення легкості маніпуляцій, поводження, транспортування і консервування. Згідно з ще одним іншим аспектом винаходу біополімерні частинки утворюють всередині контейнера, такого як, наприклад, трубка для осіменіння, внаслідок чого одержують частинки, відмінно пристосовані до розміру контейнера. Таким чином, у випадку утворення біополімерних частинок всередині контейнера може не бути необхідності в якому-небудь розчині для зберігання. Згідно з одним аспектом винаходу біополімерні частинки містять сперматозоїди, зібрані від великої рогатої худоби. Згідно з ще одним іншим аспектом винаходу дані біополімерні частинки містять сперматозоїди, зібрані від свиней. Хоча даний винахід проілюстрований альгінатними частинками, що містять сперматозоїди, зібрані від великої рогатої худоби та свиней, відповідно, в біополімерні частинки можна також вміщати сперматозоїди від інших видів тварин. Без обмеження в біополімерні частинки можна також вміщати сперматозоїди, зібрані, наприклад, від коней, овець, кіз, кроликів, свійської птиці, домашніх вихованців, таких як породисті собаки, водних тварин і різних вимираючих видів. Крім того, ніде не зустрічаються вказівки на те, що дані біополімерні частинки не можуть бути корисні при консервування людських сперматозоїдів, і, отже, корисні при лікуванні безпліддя. Таким чином, повинно бути зрозуміло, що термін "тварина", як його використовують тут, також охоплює людей. Крім того, методи консервування сперматозоїдів також широко потребуються в рибницькому виробництві. Таким чином, сперматозоїди, які мають походження від водних тварин, також можна вміщати в біополімерні частинки згідно з даним винаходом, і, отже вони також охоплені терміном "тварина", як використовують тут. Іммобілізацію сперматозоїдів в сітці біополімерного гелю можна також застосовувати для створення мікрооточення, яке сприятливе для зберігання сперматозоїдів навіть всередині статевих органів самиці. Це можна здійснити з додатковими розчинами для спільного вміщення, які сприятливі по відношенню до сперматозоїдів, ступеня запліднення, здоров'я тварини тощо. Наприклад, не обмежуючими прикладами речовин, які підвищують життєздатність під час зберігання, є антиоксиданти або білки, гормони тощо. Сперматозоїди можуть бути також спільно вміщені з іншими агентами або сполуками які сприятливі в світлі запліднюючої здатності або здоров'я тварини. Такі агенти або сполуки можуть являти собою, наприклад, антибіотики, такі як, наприклад, стрептоміцин, неоміцин, гентаміцин, пеніцилін, лінкоміцин, спектиноміцин, амоксицилін, тілозин тощо, які можна застосовувати для контролю або запобігання венеричним захворюванням, кріопротектори, антитіла гормони або сполуки, що підвищують репродуктивну ефективність, наприклад, такі як сполуки, відомі з US 5972592. Таким чином, згідно з ще одним іншим аспектом винаходу біополімерні частинки містять додатково до сперматозоїдів сполуки, які сприятливі по відношенню до запліднюючої здатності 9 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або здоров'я тварини, такі як, наприклад, антиоксиданти, антибіотики, антитіла, гормони або агенти, які підвищують репродуктивну ефективність, або їх комбінації. Згідно з одним переважним втіленням даного винаходу біополімерні частинки містять антиоксиданти, наприклад, такі як піруват. Біополімерні частинки згідно з даним винаходом, можливо, можна зберігати в добре відомих розчинах для зберігання сперматозоїдів, таких як, наприклад, молочні розріджувачі, ФСБ (фосфатно-сольовий буферний розчин), BTS, Tri Х-Cell™, ЕДТА розріджувачі, розріджувачі Kiev, Modena, MR-A, Androhep, Acromax, Triladyl®, Biladyl®, Bioxcell, Biociphos plus тощо, що містять або не містять антиоксиданти, такі як, наприклад, піруват, 2,2,6,6-тетраметилпіперидин1-оксил (звичайно скорочений як Tempo), 4-гідрокси-2,2,6,6-тетраметилпіперидин-1-оксил (звичайно скорочений як Tempol), супероксиддисмутаза, каталаза, глутатіонпероксидаза, бутильований окситолуол (звичайно скорочений як ВНТ), бутильований гідроксианізол (звичайно скорочений як ВНА). Вибір розчину для зберігання не є критичним, наскільки цей розчин зберігання не містить сполук, які можуть негативно впливати на характеристики біополімерних частинок. Наприклад, у випадку альгінатних частинок розчин для зберігання не повинен містити дуже великі кількості хелатуючих агентів, що призводять в результаті до видалення двовалентних іонів і, отже, розчинення гелю. В процесі зберігання доля біополімерних частинок відносно розчину для зберігання може варіювати залежно від типу і концентрації G-багатого альгінату, джерела сперматозоїдів, використовуваного способу запліднення тощо. Відповідно до прикладів даного винаходу відношення розчину для зберігання до біополімерних частинок становить, щонайменше, 1:1, як, наприклад, щонайменше, 1:2, щонайменше, 1:3, щонайменше, 1:4, щонайменше, 1:5, щонайменше, 1:6, щонайменше, 1:7, щонайменше, 1:8 щонайменше, 1:9 або, щонайменше, 1:10. Згідно з даним винаходом можна використовувати відношення розчину для зберігання до біополімерних частинок аж до, щонайменше, 1:100. Крім того, біополімерні частинки згідно з даним винаходом можна, можливо, зберігати як при температурі оточуючого середовища, наприклад, при 18 °C або 20 °C, при фізіологічній температурі (37 °C), так і в умовах охолоджування, наприклад, при 5 °C. Крім того біополімерні частинки можна додатково обробляти шляхом дегідратації, кріоконсервування або ліофілізації. Тоді у випадку кріоконсервування біополімерні частинки відтають перед осіменінням. Сперматозоїди, які звичайно представлені в рідині, можна зберігати протягом тривалого періоду часу при вміщенні в біополімерну частинку згідно з даним винаходом. Згідно з іншим втіленням винаходу біополімерні частинки використовують безпосередньо для осіменіння тварини-реципієнта. Можливо, біополімерні частинки можна розчиняти для вивільнення сперматозоїдів перед осіменінням. Проте біополімерні частинки можна також, згідно з ще одним іншим втіленням, використовувати разом і в комбінації з вільними сперматозоїдами. Хоча даний винахід описаний у зв'язку з його конкретними втіленнями, має бути зрозуміло, що він здатний до подальших модифікацій. Мають на увазі, що дана заявка охоплює будь-які варіації, застосування або пристосування винаходу в цілому дотримуючись принципів винаходу і включаючи такі відхилення від даного опису, які приходять з відомої і загальноприйнятої практики в галузі техніки, до якої належить винахід, і які можна застосувати до істотних ознак, розкритих вище і відповідно до обсягу вкладеної формули винаходу. Наведений вище опис різних аспектів даного винаходу виявляє загальну природу винаходу, і фахівець в даній галузі техніки шляхом застосування загальних знань в галузі штучного осіменіння і технології розведення (включаючи зміст цитованих тут посилань) легко модифікує і/або адаптує дані біополімерні частинки та їх одержання і використання для різних застосувань без непотрібного експериментування, не відхиляючись від загальної концепції даного винаходу та обсягу вкладеної формули винаходу. Отже, мають на увазі, що такі адаптації або модифікації знаходяться в межах значення ряду еквівалентів розкритих втілень, основаних на положеннях і керівництвах, наведених тут. Повинно бути зрозуміло, що використовувана тут термінологія призначена для цілей опису і не для обмеження. Таким чином, термінологію даної заявки фахівець в даній галузі техніки повинен інтерпретувати в світлі положень і керівництв, представлених тут, у поєднанні із знаннями фахівців в даній галузі техніки. Наведені нижче не обмежуючі приклади додатково ілюструють даний винахід. Приклад 1. Іммобілізація сперматозоїдів в альгінаті Матеріали Використовували наступні хімічні речовини: CaCl2H2O, К2НРО4, NaH2PO4, NaCl та цитрат натрію від Riedel de Haen (Зєєльце, Німеччина); моногідрат глюкози від Norsk Medisinaldepot (Осло, Норвегія); альгінат натрію (PROTANAL LF 10/60), що постачається FMC Biopolymer A/S (Драммен, Норвегія). 10 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Джерело сперматозоїдів Бичачі сперматозоїди збирали в тваринницькому комплексі Geno при Hallsteingard при м. Тронхейм, Норвегія. Сперматозоїди кнура збирали в тваринницькому комплексі Norsvin при Хамаре, Норвегія. Бичачі сперматозоїди розводили 1+2 в молочному розріджувачі через короткий час після еякуляції. Сперматозоїди кнура розводили 1+4 в TRI X-CELL™ (IMV Technologies, L'Aigle Cedex, Франція). Ні дане розбавлення, ні вибір буферів для розведення не є критичним для методики іммобілізації або для довготривалого виживання сперматозоїдів після іммобілізації, але виключно проводиться для полегшення зберігання доти, доки сперматозоїди можна обробляти далі. Буферні розчини Використовували наведене нижче культуральне середовище. Модифікована IVT: 3 г/л глюкози, 20 г/л цитрату натрію, 2,1 г/л NaHCO3,1,16 г/л NaCl, 3 г/л ЕДТА, рН 7,35. BTS (с 3 мМ Са): 37 г/л глюкози, 0,44 г/л СаСl2,4,5 г/л цитрату натрію, 1,25 г/л NaHCO3, 1,25 г/л ЕДТА, 0,74 г/л КС1,1 г/л неоміцину, рН 7,2. Гелеутворюючий розчин для гранул: 7,3 г/л СаСl2, 5,96 г/л NaCl. Молочний розріджувач: 110 г/л знежиреного молока Моlісо, 120 мл/л яєчного жовтка, 6,25 г/л стрептоміцину, 1,5 млн. І.Е./л пеніциліну. Іммобілізація клітин Клітини сперматозоїдів збирали в тваринницьких комплексах Geno або Norsvin і розводили, як описано вище. Перед іммобілізацією сперматозоїди концентрували центрифугуванням (800 г, 20 хв, 20 °C). Кількість надосадової рідини, яку потрібно видаляти в кожній партії, залежить від бажаної концентрації сперматозоїдів у готових гранулах. Після видалення надлишку надосадової рідини клітинний осад обережно ресуспендують шляхом м'якого перемішування. Потім клітинну суспензію обережно змішують із стерильним 6 % (мас/об) розчином альгінату натрію. Альгінатний розчин додають в об'ємному відношенні 2 частини клітинної суспензії на 1 частину альгінатного розчину (Досліджена велика кількість різних комбінацій концентрації альгінату, об'ємних відношень альгінатного розчину і клітинної суспензії. Типові значення і методики наведені тут). Суміш альгінату і клітин додають по краплях до гелеутворюючого розчину для гранул (див. вище). В цілях одержання гранул з діаметром 3 мм розчин додають через наконечники шприца з внутрішнім діаметром 0,5 мм. В цілях одержання гранул з меншими діаметрами (аж до менш ніж 1 мм в діаметрі) використовують систему, основану на використанні повітряного потоку в цілях обмеження розміру крапель, які утворюються на голках. Хлорид натрію використовують в гелеутворюючому розчині в цілях забезпечення однорідної концентрації полісахариду впродовж гранули (Smidsrad, О. and Skjak-braek, G. (1990) Alginate as immobilization matrix for cells. Trends 2+ in Biotechnology 8, 71-78). В цілях обмеження кількості Са в гранулах гранули перемішують не більше ніж протягом 8 хв в гелеутворюючому розчині для гранул. Всю процедуру іммобілізації проводять при температурі оточуючого середовища. Зберігання іммобілізованих сперматозоїдів in vitro при температурі оточуючого середовища Однією з цілей методики іммобілізації є продовження періоду часу, протягом якого можна зберігати сперматозоїди до осіменіння. Отже, були проведені експерименти, в яких сперматозоїди зберігають in vitro при температурі оточуючого середовища в буферних розчинах. Порівняльні зразки з не іммобілізованими сперматозоїдами з того самого еякуляту включають у всі експерименти. Якість сперматозоїдів оцінюють шляхом вимірювань рухливості в різні моменти часу протягом періоду зберігання. У кожен момент часу зразки аналізують і реєструють рухливість іммобілізованих сперматозоїдів та рухливість контрольних зразків. Досліджений ряд комбінацій розчинів для зберігання і щільності клітин в цілях оптимізації експериментальної системи (дані не представлені). Експериментальні умови, описані нижче, є типовими, і їх використовували в описаних нижче експериментах. В експериментах з бичачими сперматозоїдами приблизно 2 мл гранул з іммобілізованими сперматозоїдами переносили в 13 мл центрифуговані пробірки і додавали розчин молочного розріджувача при об'ємному відношенні 1+2. Контрольні зразки з вільно суспендованими сперматозоїдами готують шляхом одержання сумарного розведення 1+15 в 13 мл центрифугованих пробірках (у всіх пробірках використовують об'єм приблизно 6 мл). У попередніх експериментах показано, що дане розведення є майже оптимальним для обмеження рухливості протягом зберігання в порівняльних зразках (дані не представлені). В експериментах із сперматозоїдами кнура сперматозоїди зберігали при 18 °C в BTS (з 3 мм Са). В описаних нижче експериментах контрольні зразки розводили 1+10 у всіх експериментах із одержанням сумарного об'єму 20 в 50 мл центрифугованих пробірках (Раніше показано, що дане розведення є майже оптимальним для обмеження рухливості протягом зберігання). Гранули, що містять іммобілізовані сперматозоїди, переносили в 50 мл центрифуговані 11 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пробірки і додавали BTS (с 3 мМ СаСl2) у відношенні 1+3. Гранули, що містять іммобілізовані сперматозоїди, промивали розчином для зберігання перед перенесенням в розчин для зберігання. Зберігання іммобілізованих сперматозоїдів при 37 °C З метою оцінки виживаності сперматозоїдів при фізіологічних температурах реєстрували рухливість сперматозоїдів протягом зберігання сперматозоїдів при 37 °C. Бичачі сперматозоїди переносили в буферний розчин перед експериментами із зберігання при 37 °C. Як описано вище, порівняльні зразки з того самого еякуляту включали в кожен експеримент. Тести проводили в 13 мл центрифугованих пробірках із сумарним об'ємом 8 мл в кожній пробірці. Порівняльні зразки розводили 1+4 в розчині для зберігання. Для іммобілізованих сперматозоїдів 3 мл гранул, що містять сперматозоїди, додавали до 6 мл буферного розчину і зберігали в 13 мл центрифугованій пробірці. Сперматозоїди кнура обробляли подібним способом за винятком того, що використовували нормальний BTS (з 3 мМ Са). Оцінка рухливості Рухливість сперматозоїдів оцінювали за допомогою мікроскопічної оцінки. Зразки (типово 1 мл) відбирали з контейнерів для зберігання і переносили в 1,5 мл пробірки Еппендорф. Пробіркам давали підігрітися протягом мінімум 15 хвилин в термоблоці при 37 °C перед оцінкою. Під час вимірювання 2,5 мкл зразка додавали на підігріте предметне скло і відразу досліджували, використовуючи світловий мікроскоп. Кількість рухливих сперматозоїдів в кожному зразку було встановлене майже до 5 % інтервалу. Якщо це практично можливо, експериментатор не знає про ідентифікацію зразків під час оцінки. Іммобілізовані сперматозоїди мають бути вивільнені з гранул перед оцінкою рухливості. З метою розчинення альгінатних гранул 1 частину гранул додавали до 3 частин розчину IVT в 13 мл центрифугованій пробірці. Потім ці пробірки вміщали в барабан для пробірок, що обертався, і давали перемішуватися протягом приблизно 30 хв перед оцінкою. Результати та обговорення Виживаність іммобілізованих сперматозоїдів Дані експериментів із зберігання сперматозоїдів в порівняльних зразках (з не іммобілізованими сперматозоїдами) і в зразках з іммобілізованими сперматозоїдами представлені на фіг. 1 для сперматозоїдів як бика, так і кнура. Для сперматозоїдів кнура представлені дані по 2 різних розмірах гранул. Причина цього полягає в тому, що розмір гранул має бути нижче 1 мм з метою застосування цих гранул для внутришньоматкового осіменіння при існуючому доступному обладнанні. Як видно з даних, представлених на фіг. 1, виявляється, що іммобілізовані сперматозоїди мають дещо нижчу рухливість, ніж сперматозоїди в порівняльних зразках, через короткий час після іммобілізації. Ця відмінність в рухливості може бути викликана як процедурою іммобілізації, так і процедурою розчинення, оскільки гранули, що містять іммобілізовані сперматозоїди, необхідно розчинити перед оцінкою рухливості. Проте немає необхідності в розчиненні гранул перед осіменінням, оскільки гранули у фізіологічних умовах повинні розчинятися повільно (дані не представлені). Відмінність в рухливості між порівняльними зразками та іммобілізованими сперматозоїдами зменшується протягом періоду зберігання, оскільки виявляється, що рухливість в порівняльних зразках падає швидше, ніж в іммобілізованих зразках, особливо для сперматозоїдів кнура. Для іммобілізованих сперматозоїдів кнура рухливість приблизно 50 % була зареєстрована після 5 діб зберігання в гранулах діаметром 3 мм в даному конкретному експерименті. В цей час рухливість 10 % була зареєстрована в порівняльних зразках. Ці результати показують, що іммобілізація впливає на клітини або локальне оточення клітин сприятливо для їх здатності витримувати зберігання in vitro 18 °C. Для бичачих сперматозоїдів відсутня значима відмінність в рухливості між порівняльними зразками та іммобілізованими сперматозоїдами в останній період представленого експерименту. Подальша оптимізація умов зберігання і методики іммобілізації може, проте, поліпшити періоди зберігання іммобілізованих бичачих сперматозоїдів. Вимірювання споживання глюкози і продукування лактату іммобілізованих бичачих сперматозоїдів і не іммобілізованих сперматозоїдів в порівняльних зразках показують, що сперматозоїди, які зберігаються всередині сітки гелю альгінату кальцію, мають знижену швидкість метаболізму (див. Приклад 2). З метою оцінки, чи витримують іммобілізовані сперматозоїди фізіологічні умови, тобто умови, де активність сперматозоїдів має бути максимальною, експерименти із зберігання проводили при температурі 37 °C. Дані експериментів із зберігання in vitro сперматозоїдів бика і кнура під час зберігання при 37 °C показані на фіг. 2. 12 UA 98467 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Як видно в експериментах із зберігання in vitro при температурах оточуючого середовища, існує відмінність в рухливості між порівняльними зразками і зразками із сперматозоїдами, іммобілізованими альгінатом, після приготування зразків. Проте для сперматозоїдів як бика так і кнура рухливість падає досить швидко в порівняльних зразках з не іммобілізованими сперматозоїдами під час зберігання при 37 °C. У зразках з іммобілізованими сперматозоїдами рухливість падає значно повільніше. Після 15 годин зберігання in vitro при 37 °C рухливість сперматозоїдів кнура при обох діаметрах гранул все ще вище 50 %. Дійсно, рухливість все щестановить приблизно 30 % після 60 годин зберігання при 37 °C в гранулах діаметром 3 мм. Для бичачих сперматозоїдів виявляється, що рухливість падає швидше, ніж для сперматозоїдів кнура, в даній експериментальній системі. Проте, як і для сперматозоїдів кнура, існує значима відмінність між швидкостями падіння рухливості під час зберігання в даному експерименті для бичачих сперматозоїдів. Після 24 годин зберігання іммобілізовані бичачі сперматозоїди все ще мають рухливістю 45 %, тоді як в порівняльних зразках рухливість не зареєстрована. Необхідно пам'ятати, що дані, представлені на фіг. 2, одержані з використанням штучної експериментальної системи, яка не є репрезентативною для ситуації in vivo у самиці тварини. Дані, представлені на фіг. 2, проте, вказують на те, що сперматозоїди як бика так і кнура виживають і можуть зберігати рухливість достатньо тривалих періодів при іммобілізації в сітці гелю альгінату кальцію навіть при фізіологічній температурі. Ці дані можуть також вказувати на те, що іммобілізацію в сітках гелю альгінату кальцію можна застосовувати з метою обмеження рухливості сперматозоїдів під час зберігання при фізіологічних температурах. Це може бути особливо важливе, оскільки час осіменіння є критичним, в цілях одержання добрих результатів запліднення. Час осіменіння є критичним, оскільки сперматозоїди мають обмежений час виживання після осіменіння. Ці результати можуть, отже, вказувати на те, що іммобілізацію сперматозоїдів у поєднанні з контрольованим вивільненням після осіменіння можна застосовувати з метою збільшення періоду часу від осіменіння до запліднення. Випробування осіменіння Випробування осіменіння проводили сумарно у 9 свиноматок в одному стаді. Ці свиноматки були призначені для вибраковування відразу після відбирання попереднього виводка поросят, але вибраковування було відстрочене аж до приблизно 4 тижнів після осіменіння. На бойні статеві органи збирали безпосередньо після видалення з порожнини і досліджували протягом 15 хвилин. Кількість жовтих тіл в яєчниках і кількість ембріонів (якщо вони були) в рогах матки підраховували і записували. В результаті переривання вагітності на цій ранній стадії можливість спостереження кожного присутнього ембріона (навіть дегенерованого) відносно висока. В результаті спостереження кількості доношених поросят, що народилися, існує високий ризик втрати високого відсотка ембріонів, оскільки будь-яке запліднене яйце та ембріон, що загинув до осифікації, розсмоктується материнською системою, і в цей час жодні залишки не будуть видимими. Настільки багато як 30 % запліднених яєць свині, можуть загинути і зникнути від запліднення до осифікації. У випробуваннях авторів винаходу хороший показник вірогідності запліднення може бути обчислений для кожної свиноматки шляхом підрахунку кількості ембріонів і кількості жовтих тіл при 4 тижнях. Періодизація осіменінь варіювала від звичайної до однієї доби раніше звичайної, і проводили як однократні, так і двократні осіменіння. Результати цих випробувань осіменіння представлені в таблиці 1. 45 Таблиця 1 Кількість осіменіних свиноматок, частота вагітності і частота запліднення (у вагітних тварин) у випробуваннях осіменіння Спосіб 5 Частота запліднення (%) 57 % 4 1 Імм. сперма, сутки 1 + 2 Повторно розчинена імм. сперма, доба 1+2 50 Вагітні (%) 4 (80 %) 2 (50 %) 66 % № свиноматок Випробування осіменіння також проводили з бичачими сперматозоїдами. Ці випробування менш прості для кількісного визначення, оскільки великі дослідні стада недоступні. Ці випробування проводили в одному стаді з 20 нетелями, що є в наявності. Нетелі були синхронізовані за еструсом перед осіменінням. Хороші частоти запліднення досягнуті з 13 UA 98467 C2 5 використанням іммобілізованих бичачих сперматозоїдів. У цьому дослідженні 6 з 12 нетелей, осіменіних іммобілізованими сперматозоїдами, що зберігаються протягом 24 годин, були запліднені, що підтверджене контролем на вагітність. Сперматозоїди були іммобілізовані в альгінаті, їх зберігали в іммобілізованому стані при температурі оточуючого середовища протягом різних періодів, запліднювали розчиненими або нерозчиненими. Періодизація осіменінь варіювала від звичайної до однієї доби раніше звичайної і проводили лише однократні осіменіння. Вагітних тварин перевіряли шляхом ректального дослідження через 5-7 тижнів після осіменіння. Результати цих випробувань показані в таблиці 2. 10 Таблиця 2 Випробування осіменінь у великої рогатої худоби: Використовуваний спосіб, кількість осіменіних нетелей і частота вагітності Випробування осіменінь 1 2 3 1 15 20 25 № нетелей Спосіб Сперма, імм., зберігання протягом 24 годин при 18 °C, розчинена відразу перед осіменінням Сперма, імм., зберігання протягом 24 годин при 18 °C, осіменіння в нерозчиненому вигляді на одну добу раніше звичайного відносно еструса Сперма, імм., зберігання протягом 48 годин при 18 °C, розчинена безпосередньо перед осіменінням Вагітні (%) 12 6 (50 %) 3 1 (33,3 %) 5 4 (80 %) Доба 1 = доба збору сперматозоїдів Ці дані показують, що сперматозоїди, іммобілізовані в гранулах альгінату кальцію, не лише зберігають рухливість, але також зберігають всі функціональні властивості, необхідні для запліднення. Таким чином, Geno та Norsvin продемонстрували, що сперматозоїди іммобілізовані в гелі альгінату кальцію, можна застосовувати для осіменіння, і вони можуть викликати запліднення як великої рогатої худоби, так і свиней. Приклад 2. Споживання енергії іммобілізованими сперматозоїдами Не обмежуючись якою-небудь конкретною теорією, вважають, що іммобілізація сперматозоїдів призводить в результаті до зниженого споживання енергії сперматозоїдами, і що це корисно відносно терміну їх зберігання і здатності до запліднення. Таким чином, для дослідження цієї теорії бичачі сперматозоїди були іммобілізовані в гранулах альгінату при 6 концентрації приблизно 150×10 сперматозоїдів/мл і додані до 2-кратного об'єму гранул молочному буферу для розбавлення. Порівняльні зразки з вільно суспендованими сперматозоїдами готували з того самого еякуляту, і вони містили таку саму сумарну концентрацію сперматозоїдів на сумарний об'єм в молочному буфері для розбавлення. Зразки готували в анаеробних умовах шляхом продування N 2 перед зберіганням при 20 °C. Зразки молочного буфера для розбавлення відбирали протягом періоду зберігання і вимірювали продукування лактату сперматозоїдами в зразках за допомогою ВЕРХ. Результати представлені в таблиці 3: 30 Таблиця 3 Продукування лактату іммобілізованими і вільно суспендованими сперматозоїдами під час зберігання при температурах оточуючого середовища. Значення наведені в наномолях лактату, що продукується на 350 млн. сперматозоїдів Час зберігання (доба) 1 2 3 Іммобілізовані сперматозоїди 4,21 6,00 6,90 Порівняльні зразки 16,1 20,6 22,1 Приклад 3: Іммобілізація сперми від чорно-бурої лисиці (vulpes fulva) Змішану сперму хорошої якості від трьох дорослих самців чорно-бурої лисиці (Vulpes fulva) 6 розводили в ЕДТА розріджувачі 228×10 клітин сперми на мл і перевозили в лабораторію. Через 14 UA 98467 C2 5 три години після збору і розведення аліквоту сперми центрифугували при 2000 об/хв протягом 10 хв. Осад змішували з альгінатом (LF10/60) і утворили гранули, як описано в даній патентній заявці. Гранули зберігали в модифікованому Biladyl при 18 °C. Решту сперми зберігали в ЕДТА при 18 °C як контроль. Гранули розчиняли через 48 годин. Як розчинену сперму, так і контрольну сперму нагрівали до 3 5 °C протягом 20 хвилин, після чого проводили оцінку рухливості у вигляді відсотка рухливих сперматозоїдів за допомогою фазово-контрастної мікроскопії при збільшенні 10х та 25х на обігріваючому столику при 38 °C. Таблиця 4 Рухливість сперми чорно-бурої лисиці при зберіганні в іммобілізованому і не іммобілізованому (контроль) стані Рухливість після прибування Контрольна сперма Іммобілізована сперма розчинення) (після 75 % Рухливість після зберігання протягом 48 годин 45-50 % 55-60 % 10 15 20 25 30 Приклад 4: Поросята, народжені доношеними після однократного внутрішньоматкового осіменіння спермою кнура, іммобілізованою в альгінаті Змішану сперму від 3 дорослих кнурів обробляли згідно з даним винаходом, і гранули використовували для внутрішньоматкового осіменіння свиноматки, яка згодом опоросилася після повного терміну вагітності. Свиноматка була відлучена від попереднього посліду 12 лютого 2007 і була осіменіна спермою іммобілізованою в альгінатних гранулах, однократно 12 лютого 2007. Свиноматка народила 16 живих поросят 10 червня 2007. У цьому посліді не було мертвонароджених поросят, і всі поросята виглядали нормальними при клінічному дослідженні. Приклад 5: Іммобілізація сперми барана в альгінаті Сперму від двох баранів для ШО збирали за допомогою штучної вагіни і переносили в лабораторію протягом десяти хвилин. Сперму розводили 1+3 в розріджувачі на основі знежиреного молока (Curtis PG, Forteath AD, Polge C. Survival of bull sperm frozen in milk diluents containing varying concentrations of glycerol and fructose. Proc IVth Int Congr Anim Reprod 1961; 3: 952-956), після чого додавали альгінат та утворили гранули, як описано в патентній заявці 0613288.0, приклад 1. Гранули зберігали в розріджувачі на основі знежиреного молока або при 5 °C, або при температурі оточуючого середовища. Іммобілізовані сперматозоїди вивільняли з гранул перед мікроскопічною оцінкою рухливості у вигляді відсотка рухливих сперматозоїдів через 24 та 48 годин після іммобілізації. З практичних міркувань контролі не включали в дане дослідження. Проте параметри життєздатності, включаючи рухливість, повинні погіршуватися в процесі зберігання рідкої сперми барана при 5 °C або 20 °C протягом 30 годин (Paulenz H, Soderquist L, Perez-Pe R, Berg KA. Effect of different extenders and storage temperatures on sperm viability of liquid ram semen. Theriogenology 2002: 57(2):823-36). Таблиця 5 Рухливість іммобілізованої сперми барана, що зберігається при різних температурах протягом 24 годин та 48 годин Баран 1 Баран 2 Температура зберігання 5 °C 20 °C 5 °C 20 °C Рухливість після 24 годин зберігання 75-85 % 70-80 % 75-85 % 70-80 % 35 15 Рухливість після 48 годин зберігання 70-80 % 65-75 % 70-80 % 65-75 % UA 98467 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1. Біополімерні частинки для консервування сперматозоїдів, де сперматозоїди вміщені в сітку біополімерного гелю, і де біополімер, в який вміщені сперматозоїди, містить альгінат, збагачений гулуроновою кислотою. 2. Частинки за п. 1, де біополімер, в який вміщені сперматозоїди, включає альгінат кальцію. 3. Частинки за п. 1 або 2, де концентрація альгінату становить щонайменше 0,1 %. 4. Частинки за п. 3, де концентрація альгінату становить між щонайменше 0,1 та 6 % альгінату. 5. Частинки за п. 4, де концентрація альгінату становить щонайменше 1 %. 6. Частинки за п. 5, де концентрація альгінату становить щонайменше 2 %. 7. Частинки за п. 3, де концентрація альгінату становить 6 %. 6 8. Частинки за будь-яким з пп. 1-7, які мають концентрацію сперматозоїдів щонайменше 0,110 сперматозоїдів/мл. 6 9. Частинки за п. 8, які мають концентрацію сперматозоїдів щонайменше 10010 сперматозоїдів/мл. 9 10. Частинки за п. 8, які мають концентрацію сперматозоїдів щонайменше 2,510 сперматозоїдів/мл. 11. Частинки за будь-яким з пп. 1-10, де частинки зберігають в розчині. 12. Частинки за п. 11, де відношення розчин для зберігання : біополімерні частинки становить щонайменше між 1:1 та 1:100. 13. Частинки за п. 11 або 12, де сперматозоїди вміщені спільно з одним або більш ніж одним антиоксидантом. 14. Частинки за п. 13, де антиоксидант вибраний з групи, яка складається з пірувату, 2,2,6,6тетраметилпіперидин-1-оксилу, 4-гідрокси-2,2,6,6-тетраметилпіперидин-1-оксилу, супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази, бутильованого гідрокситолуолу, бутильованого гідроксіанізолу. 15. Частинки за будь-яким з пп. 1-14, де вказані частинки покриті оболонкою. 16. Частинки за п. 15, де покриття вибрані з групи, яка складається з полілізину, хітозану, сульфату целюлози, гідроксипропілметилцелюлози або полідіалілдиметиламонію хлориду. 17. Частинки за будь-яким з пп. 1-16, де сперматозоїди додатково вміщені спільно із сполуками або агентами, які корисні для запліднюючої здатності і/або здоров'я тварини. 18. Частинки за п. 17, де сперматозоїди вміщені спільно з одним або більш ніж одним із сполук або агентів, вибраних з групи, яка складається з розріджувачів, кріопротекторів, антибіотиків, антитіл, антиоксидантів, білків і гормонів. 19. Частинки за будь-яким з пп. 1-18, де сперматозоїди мають походження від тварини, вибраної з групи, яка складається із свиней, великої рогатої худоби, коней, овець, кіз, кроликів, свійської птиці, домашніх вихованців, таких як породисті собаки, хутрових звірів, водних тварин і вимираючих видів тварин. 20. Частинки за п. 19, де сперматозоїди збирають від тварини, вибраної з групи, яка складається із свиней, великої рогатої худоби, хутрових звірів і коней. 21. Частинки за будь-яким з пп. 1-20, де сперматозоїди містяться в сім'яній рідині. 22. Частинки за будь-яким з пп. 1-21, де частинки додатково обробляють шляхом дегідратації, кріоконсервування або ліофілізації. 23. Частинки за будь-яким з пп. 1-21, де частинки утворюють безпосередньо в сім'яному контейнері. 24. Спосіб одержання частинок за будь-яким з пп. 1-23, де суміш альгінату і сперматозоїдів додають в гелеутворюючий розчин. 25. Спосіб за п. 24, де гелеутворюючий розчин містить один або більш ніж один з нижченаведених іонів, вибраних з групи, яка складається з кальцію, натрію, барію, магнію. 26. Спосіб за п. 25, де гелеутворюючий розчин містить іони кальцію і натрію. 27. Спосіб за будь-яким з пп. 24-26, де частинки додатково обробляють шляхом дегідратації, кріоконсервування або ліофілізації. 28. Застосування біополімерних частинок за будь-яким з пп. 1-23 в розведенні тварин. 29. Застосування за п. 28, де частинки застосовують в розведенні тварин, вибраних з групи, яка складається із свиней, великої рогатої худоби, коней, овець, кіз, кроликів, свійської птиці, домашніх вихованців, таких як породисті собаки, хутрових звірів, водних тварин і вимираючих видів тварин. 30. Застосування за п. 28 або 29, де частинками осіменяють безпосередньо. 31. Застосування за п. 28 або 29, де частинки розчиняють перед осіменінням. 16 UA 98467 C2 32. Застосування за п. 28 або 29, де частинки використовують разом з вільними сперматозоїдами. 33. Спосіб запліднення тварини, при якому сперматозоїди, консервовані в частинках за будьяким з пп. 1-23, вводять самиці-реципієнту тварини. 17 UA 98467 C2 18 UA 98467 C2 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 19