Композиція, яка містить хітозан, глюкозамін та амінокислоти, для сільськогосподарського застосування

Реферат: Винахід належить до процесів та композицій, які підвищують урожайність сільськогосподарських культур, підсилюють захисні процеси у рослинах, знижують рівень патогенів рослин і знижують кількість добрив, що використовуються. Заявлено композицію, яка містить HYTd, причому зазначений HYTd містить рідку фракцію, отриману в результаті ферментації HYTb і HYTc з використанням HQE (патентне позначення депозиту АТСС РТА10861), причому зазначений HYTb містить рідку фракцію, отриману в результаті ферментації хітиновмісних членистоногих з використанням HQE, а зазначений HYTc містить тверду фракцію, отриману в результаті ферментації хітиновмісних членистоногих з використанням HQE. Також заявлено спосіб обробки ґрунту, насіння, саджанців або листя рослин за допомогою композицій, що містять HYTa, HYTb, HYTc та HYTd. UA 113736 C2 (12) UA 113736 C2 UA 113736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0001] Дана заявка претендує на пріоритет за попередньою заявкою США № 61/500543, яка була подана 23 червня 2011 р. Галузь техніки [0002] У даній заявці описуються процеси та композиції, які підвищують урожайність сільськогосподарських культур, підсилюють захисні процеси у рослинах, знижують рівень патогенів рослин, і знижують кількість добрив, що використовуються. Рівень техніки [0003] Мікроорганізми застосовували в сільському господарстві й раніше. Приклади включають мікроорганізми, описані в патентах США 4,952,229; 6,232,270 і 5,266,096. [0004] Хітин також застосовують у сільському господарстві у вигляді білкового комплексу (патент США 4,536,207) або в комбінації з різними мікроорганізмами (патенти США 6,524,998 і 6,060,429) [0005] Хітозан застосовують у сільському господарстві в комбінації з іншими компонентами. Див., наприклад, патенти США № 6,649,566; 4,812,159; 6,407,040; 5,374,627 і 5,733,851. Його також застосовують для обробки насіння зернових культур. Див., наприклад, патент США 4,978,381. Крім того, у патенті США 6,524,998 описано, що хітозан можна застосовувати в комбінації зі специфічними мікроорганізмами в сільському господарстві. [0006] HYTb сам по собі або в комбінації з HYTc і мікробіологічною композицією HYTa можна застосовувати для обробки ґрунту, насіння, саджанців і листя, як описано в заявці на патент США № 61/355447, яка була подана 16 червня 2010 р. під назвою Мікробіологічний спосіб і композиція для сільськогосподарського застосування, і заявці на патент США № 13/160333, яка була подана 14 червня 2011 р. під назвою Мікробіологічний спосіб і композиція, кожна з яких повністю включена в дану заявку за допомогою посилання. [0007] Не дивлячись на вищевикладене, існує потреба в забезпеченні поліпшених композицій і способів, що підвищують урожай культур і знижують кількість традиційних фунгіцидів та інсектицидів, які застосовуються у сільському господарстві та садівництві. Суть винаходу [0008] Дана заявка описує композиції, які містять хітозан, глюкозамін і амінокислоти, причому концентрація хітозану в зазначених композиціях становить більше 1,5 мас.%, а глюкозаміну - більше 1,5 мас.%. У переважних варіантах реалізації концентрація хітозану становить від 2 до 2,5 мас.%, а глюкозаміну - від 2 до 6 мас.%. Композиція також може містити твердий хітин, але зазвичай в кількості не більше 2 мас.%. [0009] Композиція також може містити мікроелементи, білок та інші полісахариди. [0010] У загальному випадку композиція є рідкою, але може бути твердою. У більшості варіантів реалізації тверду речовину можна розчинити у воді перед застосуванням. [0011] У переважних варіантах реалізації композиція містить HYTd і, щонайменше, один з HYTa, HYTb і HYTc. В інших варіантах реалізації композиція містить HYTd і два або більше з HYTa, HYTb і HYTc. Композиція також може містити HYTd, HYTa, HYTb і HYTc. [0012] У способах, що описуються, ґрунт, насіння, саджанці або листя рослин взаємодіють з HYTd або будь-якою з вищезазначених композицій. [0013] Крім того, описана оброблена ґрунтова композиція, що містить ґрунт, оброблений HYTd або будь-якою з вищезазначених композицій. [0014] Крім того, описана оброблена рослина, що включає рослину, оброблену HYTd або будь-якою з вищезазначених композицій. [0015] Крім того, описано оброблене насіння або саджанець, що включають насіння або саджанець, оброблені HYTd або будь-якою з вищезазначених композицій. Короткий опис креслень [0016] На Фігурі 1 показані результати обробки спаржі HYTa + HYTb. [0017] На Фігурі 2 показані результати обробки спаржі HYTa + HYTb + HYTd. [0018] Фігура 3 являє собою графік, на якому показана кількість бульб і розподіл за розміром картоплі, обробленої HYTa, у порівнянні з контролем. [0019] Фігура 4 являє собою графік, на якому показана кількість бульб і розподіл за масою картоплі, обробленої HYTa, у порівнянні з контролем. [0020] Фігура 5 містить фотографії, що порівнюють картоплю, отриману після обробки HYTa, з контролем. [0021] Фігура 6 являє собою графік, на якому показана кількість бульб і розподіл за розміром картоплі, обробленої HYTa, у порівнянні з контролем. [0022] Фігура 7 являє собою графік, на якому показана кількість бульб і розподіл за масою картоплі, обробленої HYTa, HYTc, HYTc і HYTd, у порівнянні з картоплею, обробленою HYTa. [0023] Фігура 8 містить фотографії, що порівнюють картоплю, отриману після обробки HYTa, 1 UA 113736 C2 5 10 15 20 25 30 35 HYTc, HYTc і HYTd, з картоплею, отриманою після обробки HYTa. [0024] Фігура 9 являє собою графік, на якому показана кількість бульб і розподіл за розміром картоплі, обробленої HYTa, HYTc, HYTc і HYTd, у порівнянні з картоплею, обробленою метамнатрієм. [0025] Фігура 10 являє собою графік, на якому показана кількість бульб і розподіл за масою картоплі, обробленої HYTa, HYTc, HYTc і HYTd, у порівнянні з картоплею, обробленою метамнатрієм. [0026] Фігура 11 містить фотографії, що порівнюють картоплю, отриману після обробки HYTa, HYTc, HYTc and HYTd, з картоплею, обробленою метам-натрієм. [0027] Фігура 12 являє собою блок-схему, що ілюструє розкладання ракоподібних для утворення HYTb і HYTc. Потім HYTc і HYTb обробляють HQE з утворенням HYTd, розчину з відносно високою кількістю хітозану та глюкозаміну в порівнянні з HYTb. [0028] Фігура 13 являє собою блок-схему, що ілюструє розкладання грибів, у тому числі міцеліальних грибів, дріжджів та/або комах для утворення HYTb і HYTc. Потім HYTc і HYTb необов'язково обробляють HQE з утворенням HYTd, розчину з відносно високою кількістю хітозану та глюкозаміну в порівнянні з HYTb. Докладний опис Дана заявка описує композиції, які містять хітозан, глюкозамін і амінокислоти, причому концентрація зазначеного хітозану становить більше 1,5 мас.%, а зазначеного глюкозаміну більше 1,5 мас.%. У переважних варіантах реалізації концентрація хітозану становить від 2 до 2,5 мас.%, а глюкозаміну - від 2 до 6 мас.%. Композиція також може містити твердий хітин, але зазвичай в кількості не більше 2 мас.% . Композиція також може містити мікроелементи, білок та інші полісахариди. У загальному випадку композиція є рідкою, але може бути твердою. У більшості варіантів реалізації тверду речовину можна розчинити у воді перед застосуванням. У переважних варіантах реалізації композиція містить HYTd. В інших варіантах реалізації композиція містить HYTd і, щонайменше, один з HYTa, HYTb і HYTc. В інших варіантах реалізації композиція містить HYTd і два або більше з HYTa, HYTb і HYTc. Композиція також може містити HYTd, HYTa, HYTb і HYTc. В описуваних способах ґрунт, насіння, саджанці або листя рослин взаємодіють з HYTd або будь-якою з вищезазначених композицій. HYTa [0029] У даному описі термін "HYTa" відноситься до консорціуму мікроорганізмів, отриманих зі зразків родючого ґрунту та комерційних джерел. HYTa депонований в Американській колекції типових культур (ATCC), Роквілл, штат Меріленд, США, 19 травня 2010 р. з привласненим позначенням депозиту PTA-10973. [0030] У Таблиці 1 визначені деякі з мікроорганізмів у складі HYTa, які, як вважається, відповідають за сприятливу дію, яка спостерігається при його застосуванні для обробки ґрунту та/або листя. Таблиця 1 Бактерії I. Azotobacter 1. Azotobacter vinlandii II. Clostridium 1. Clostridium pasteurianum 2. Clostridium beijerinckii 3. Clostridium sphenoides 4. Clostridium bifermentans III. Lactobacillus 1. Lactobacillus paracasei ss. paracasei 2. Lactobacillus acidophillus 3. Lactobacillus delbrueckii ss. Bulgaricus 4. Lactobacillus brevis IV. Bacillus 1. Bacillus amyloliquefaciens (Bacillus subtilis ((Silosil® BS)) 2. Bacillus thuringiensis var. kurstakii (Bacillus thuringiensis (Strains HD-1)) 3. Bacillus thuringiensis var. canadensis (Bacillus cereus group) 4. Bacillus pasteurii (Bacillus cereus group) 5. Bacillus sphaericus (subgroup I, III, and IV) 6. Bacillus megaterium (subgroup A) V. Acetobacter or Gluconacetobacter 2 UA 113736 C2 Таблиця 1 1. Acetobacter aceti ss. liquefaciens 2. Acetobacter aceti ss. xylimum VI. Enterococcus 1. Enterococcus faecium (subgroup A) VII. Pediococcus 1. Pediococcus pentosaceus VII. Rhizobium 1. Rhizobium japonicum Гриби I. Saccharomyces 1. Saccharomyces cerevisiae II. Penicillium 1. Penicillium roqueforti III. Monascus 1. Monascus ruber IV. Aspergillus 1. Aspergillus oryzae V. Trichoderma 1. Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) Рослини I. Arthrospiro 1. Arthrospira platensis II. Ascophyllum 1. Ascophyllum nodosum 5 10 15 20 25 30 35 [0031] Інші мікроорганізми, що містяться в HYTa: Nitrobacter, Nitrosomonads, Nitrococcus, Pseudomonas, Micrococcus luteus, Actinomycete, Azotobacter vinelandii, Lactobacillus casei, Trichoderma harzianum, Bacillus licheniformis, Pseudomonas fluorescens і Streptomyces. [0032] Активні мікроорганізми в складі HYTa включають азотофіксатори, що зустрічаються в ґрунті в природних умовах. Зазначені азотофіксатори являють собою Azotobacter vinelandii і Clostridium pasteurianum. Bacillus subtilis забезпечує ферменти для розщеплення рослинних залишків. Bacillus cereus забезпечує додаткові ферменти для розщеплення рослинних залишків і пеніциліназу для придушення небажаних бактерій. Bacillus megaterium руйнує складні вуглеводи після розщеплення залишків сільськогосподарських культур. Lactobacillus забезпечує поживні речовини для мікроорганізмів у складі HYTa і контролює pH навколишнього середовища. Організми Nitrobacter окислюють аміак до нітриту (NO 2), а мікроорганізми Nitrosomonas окислюють нітрит до нітрату (NO3). [0033] Важлива властивість HYTa - фіксація атмосферного азоту. Здатність мікроорганізмів HYTa до фіксації азоту підсилюється іншими організмами HYTa. Для фіксації азоту потрібні фосфор (P), калій (K) і вуглець (C). HYTa містить мікроорганізми, здатні розкладати P, K і C ґрунту. Крім того, бактерії-азотофіксатори забезпечують азотом інші мікроорганізми в складі HYTa. [0034] Фіксація азоту може відбуватися бактеріями Nitrosomonas, Nitrobacter, Azotobacter vinelandii і Clostridium pasteurinum, які є наявними в HYTa, не симбіотично або в симбіозі, як відбувається в бульбочках за допомогою бактерій Rhyzobium. [0035] Вуглець, необхідний для азотфіксуючих мікроорганізмів у складі HYTa, надають редуценти C, які перетворюють складні органічні сполуки ґрунту в прості сполуки, наприклад, вуглеводи, спирти та органічні кислоти. До редуцентів C відноситься багато з вищезазначених мікроорганізмів. [0036] Фосфор необхідний мікроорганізмам-азотфіксаторам для розмноження; його джерелом є метаболічна активність редуцентів P, які перетворюють іммобілізований фосфор ґрунту в біодоступний фосфор. Редуценти P у складі HYTa включають Azotobacter, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens і Micrococcus luteus. [0037] Калій, необхідний для азотфіксаторів, забезпечують мікроорганізми-редуценти K, які є наявними в HYTa, що активують калій ґрунту. Редуценти K у складі HYTa включають Pseudomonas fluorescens. [0038] Три важливі мікроорганізми в складі HYTa являють собою штами Bacillus subtilis (SILoSil ® BS), Bacillus thuringiensis HD-1 і HD-73 (SILoSil ® BT) і Trichoderma harzianum (TRICHOSIL). Зазначені організми являють собою депозит ATTC PTA-10973. Спочатку їх 3 UA 113736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отримали від Biotecnologia Agroindustrial S.A. DE C.V., Морелія, Мічоакан, Мексика. [0039] Bacillus subtilis (SILoSil® BS) - грампозитивна мезофільна бактерія з оптимальною температурою росту від 25 до 35 °C. Зазначена бактерія є аеробною і може рости в анаеробних умовах і використовувати широкий спектр джерел вуглецю. Зазначена бактерія містить дві нітритредуктази, одна з яких використовується для асиміляції азоту. Зазначена бактерія здатна секретувати амілазу, протеази, пулуланази, хітинази, ксиланази та ліпази. [0040] Bacillus thuringiensis (штами HD-1 і HD-2 (SILoSil® BT)) - грампозитивні факультативно-анаеробні бактерії з перитрихіальним розташуванням джгутиків. Штами HD-1 і HD-73 у ході споруляції синтезують білкові кристали різної геометричної форми, що мають інсектицидну активність. Штами HD-1 і HD-2 у хітиновмісному середовищі секретують екзохітинази і можуть застосовуватися для руйнування залишків ракоподібних при отриманні хітоолігосахаридів. [0041] Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) - сапрофітний гриб. Зазначений гриб проявляє дію антибіотика і є здатним до біологічної конкуренції, і тому має властивості біологічного контролю. Зазначений гриб продукує ферменти, що руйнують клітинні стінки або, що мають комбіновану дію. Зазначений гриб продукує глюконази, хітинази, ліпази та позаклітинні протеази при взаємодії з деякими патогенними грибами, наприклад, Fusarium. [0042] Як показано вище, метаболізм будь-якої групи бактерій є незалежним, і вони існують у тісній симбіотичній взаємодії, забезпечуючи правильне функціонування HYTa. [0043] Крім вуглецю, водню, фосфору, калію, сірки та різних мікроелементів, для оптимального росту бактерій важлива суміш специфічних факторів росту, наприклад, BКомплекс, вільні L-Амінокислоти та високорозчинні мікроелементи. Для забезпечення зазначених компонентів до складу HYTa включені дріжджі, які ферментують. Процес фіксації N2 вимагає великої кількості АТФ. Кількості АТФ, наявної в природніх умовах, недостатньо для енергетичного забезпечення фіксації N2. Ферментація дріжджів в HYTa компенсує зазначений значний недолік енергії. Під час ферментації за рахунок дихального процесу утворюються органічні кислоти, і разом з вивільненням фосфору редуцентами P утворюється АТФ. Зазначена АТФ використовується в процесі біологічної фіксації азоту. [0044] HYTa містить ферменти та корисні ґрунтові мікроорганізми, що заміщають мікроорганізми, виснажені внаслідок інтенсивного застосування хімікатів, що призводить до зниження врожаїв культур. За рахунок посилення мікробіологічної активності в ґрунті за допомогою HYTa зазначені бактерії викликають більш ефективне поглинання поживних речовин і мікроелементів рослинами. [0045] Деякі з мікроорганізмів, що входять до складу HYTa, і що проникають як у ґрунт, так і в кореневу систему рослини, перетворюють гумус. Зазначений процес забезпечує рослину посиленим живленням. Це підвищує кількість поживних речовин і незамінних елементів, які є наявними у ґрунті, і які можуть поглинатися рослинами. [0046] Застосування HYTa самого по собі або в комбінації з хітином, хітозаном, глюкозаміном та/або амінокислотами (1) забезпечує поживні речовини та елементи ґрунту, що підвищують урожай культур на 25-55%, (2) знижує вивільнення газів парникового ефекту, (3) підвищує ефективність мінеральних добрив (3) знижує застосування традиційних фунгіцидів та інших пестицидів, (4) підвищує продукцію регуляторів росту рослин, (5) поліпшує структуру, обробку ґрунту, проникність і втримання води, (6) видаляє хімічні залишки і (7) зсуває pH ґрунту в область нейтральних pH. Мікробіологічні композиції [0047] HYTa можна застосовувати окремо або в комбінації з одним або більше компонентами, обраних з групи, яка складається з однієї або більше амінокислот, хітину, хітозану та/або глюкозаміну. У деяких випадках у мікробіологічну композицію включають ацетил-d-глюкозамін. Мікробіологічна композиція містить різноманітні комбінації вищезазначених компонентів. Особливо переважні комбінації включають: (1) HYTa і хітин; (2) HYTa і хітозан; (3) HYTa і глюкозамін; (4) HYTa і амінокислоти; (5) HYTa, хітин і амінокислоти; (6) HYTa, хітин, хітозан і амінокислоти; (7) HYTa, хітозан, глюкозамін і амінокислоти; (8) HYTa, хітозан і глюкозамін і (9) HYTa, хітин, хітозан, глюкозамін та амінокислоти, причому остання комбінація є особливо переважною. HYTb і, особливо, HYTd є переважними джерелами хітозану, глюкозаміну та амінокислот. [0048] Якщо HYTa росте за наявності хітину, хітозану та/або амінокислот, він може містити залишковий хітин, хітозан та/або амінокислоти. При деяких обставинах, культура бактерій HYTa містить описану мікробіологічну композицію та її можна вносити безпосередньо в ґрунт, насіння, саджанці або листя рослин. Як альтернативу, до композиції для зміни або доповнення її складу можна додати один або кілька другорядних компонентів. 4 UA 113736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0049] У даній заявці термін "амінокислоти" відноситься до композиції, що містить дві або більше амінокислоти. Амінокислоти включають триптофан, гістидин, треонін, тирозин, валін, метіонін, ізолейцин, лейцин, фенілаланін, лізин, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, серин, гліцин, аланін, пролін, аспарагін та аргінін. У переважних варіантах реалізації амінокислоти забезпечуються за рахунок застосування HYTb (див. нижче). [0050] У даній заявці термін "хітин" відноситься до біополімеру, що складається переважно з повторюваних одиниць бета-1-4-зв'язаного N-ацетил-D-глюкозаміну. Хітин зустрічається в природі як основний структурний матеріал екзоскелету тварин, наприклад, членистоногих (Arthropoda), наприклад, ракоподібних, комах, павуків і т.д., молюсків (Mollusca), наприклад, черевоногих, головоногих і т.д., кишковопорожнинних (Coelentara), наприклад, таких організмів, як гідроїди та медузи, і круглих черв’яків (Nematoda), наприклад, некільчастих черв’яків. Хітин також зустрічається в різних грибах, включаючи членів роду Fusarium. Хітин можна виділити із зазначених природних джерел обробкою лугами або шляхом біорозкладання. Молекулярна маса хітину варіює залежно від його джерела та способу виділення. У переважних варіантах реалізації хітин отримують у вигляді твердої речовини при біорозкладанні хітиновмісних членистоногих (Arthropods), як описано в заявках Bioderpac. Переважний діаметр хітину становить приблизно 50-75 мікрон для полегшення його нанесення за допомогою краплинних та таких, що розприскують, систем зрошення. [0051] У даній заявці термін "хітозан" являє собою полісахарид, що складається переважно з повторюваних одиниць D-глюкозаміну. Хітозан отримують деацетилюванням хітину. Ступінь деацетилювання в порівнянні з хітином становить переважно більше 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% і 95%. Переважно, щоб рівень деацетилювання був достатній для розчинності хітозану у воді при кислих pH. Молекулярна маса хітозану варіює залежно від його джерела і способу виділення. Хітозан включає олігомери хітозану. У переважних варіантах реалізації хітозан осаджують при pH 9,0 з водної фракції, отриманої при біорозкладанні хітиновмісних членистоногих, як описано в заявках Bioderpac. [0052] У даній заявці термін "олігомер хітозану" відноситься до хітозану, що містить два або більше повторюваних ланок D-глюкозаміну та, у випадку неповного деацетилювання хітину, одну або більше одиниць N-ацетил-D-глюкозаміну. У переважних варіантах реалізації олігомери хітозану отримують із водної фракції, отриманої при біорозкладанні хітиновмісних членистоногих, як описано в заявках Bioderpac. У деяких варіантах реалізації олігомери хітозану використовують як другий компонент мікробіологічної композиції. [0053] У даній заявці термін "глюкозамін" відноситься до аміномоносахариду. У переважних варіантах реалізації зазначений моносахарид представляє собою вуглеводний залишок, який утворює каркас біополімерів хітину та хітозану. Глюкозамін є наявним у водній фракції, отриманій при біорозкладанні хітиновмісних членистоногих, як описано в заявках Bioderpac. Глюкозамін індукує у рослинах синтез хітинази як засобу захисту від хітиновмісних шкідників. HYTb і HYTc [0054] У даній заявці термін "HYTb" відноситься до водної фракції, а "HYTc" відноситься до твердої фракції, отриманої при біорозкладанні хітиновмісних членистоногих, наприклад, описаних у заявці на патент США № 61/289706, яка була подана 23.12.09 під назвою "Біодеградація побічних продуктів ракоподібних", у заявці на патент США № 61/299869, яка була подана 20.01.10 під назвою "Спосіб біорозкладання і мікробіологічна композиція", у заявці на патент США № 61/355365, яка була подана 16.06.2010 під назвою "Спосіб і композиція для біорозкладання", і в заявці PCT/EP2010/070285, яка була подана 20.12.2010 під назвою «Спосіб і композиція для біорозкладання», кожна з яких повністю включена в даний документ за допомогою посилання. [0055] Коротко, у способі біорозкладання членистоногих для розкладання членистоногих або відходів членистоногих застосовують мікробіологічну композицію. Зазначений спосіб являє собою молочнокисле зброджування. Мікробіологічна композиція містить мікроорганізми, які продукують ферменти, які можуть розкладати хітиновмісні компоненти членистоногих на хітин, хітозан, N-ацетилглюкозамін і глюкозамін. Вона також містить мікроорганізми, які продукують ферменти, які можуть розкладати білки та жири з отриманням амінокислот і ліпідів. [0056] Переважну мікробіологічну композицію для розкладання членистоногих називають HQE. HQE депонована в Американській колекції типових культур (ATCC), Манассас, штат Віргінія, США, 27 квітня 2010 р. із привласненим патентним позначенням депозиту PTA-10861. [0057] У переважному варіанті реалізації морське членистоноге є ракоподібним, а переважне ракоподібне є креветкою. Побічний продукт переробки креветок включає головогруди та/або екзоскелет креветок. [0058] У процесі біорозкладання переважно, щоб ферментація була факультативною 5 UA 113736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аеробною ферментацією. Крім того, переважно, щоб ферментацію здійснювали при температурі приблизно 30-40 °С. pН переважно становить менше приблизно 6, більш переважно - менше приблизно 5,5. У той самий час pH слід підтримувати вище приблизно 4,3. Ферментацію проводять протягом приблизно 24-96 годин. У деяких варіантах реалізації ферментацію проводять протягом приблизно 24-48 годин, а більше переважно - 24-36 годин. Зазначений час зброджування значно коротший, ніж типовий час зброджування, описаний раніше і який становив від 10 до 15 днів для досягнення практично аналогічного гідролізу, хоча і без формування, що виявляється, хітозану і глюкозаміну. [0059] Розділення суміші переважно здійснюють центифугуванням (наприклад, приблизно 920 g). Крім того, можна використовувати гравітаційне розділення, однак воно не є переважним через час, необхідний для розділення. [0060] Суміш розділяють на три фракції: тверду, водну і ліпідну. Тверда фракція містить хітин і називається HYTc. Водна фракція містить гідролізат білка, амінокислоти, хітозан і глюкозамін і називається HYTb. Ліпідна фракція містить стерини, вітамін А и Е та каротиноїдні пігменти, наприклад, астаксантин. [0061] Застосування HQE у способі біодеградації є переважним. В інших варіантах реалізації переважним є додавання попередньо отриманого HYTb до HQE або ферментаційного середовища. Як описано вище, HYTb містить амінокислоти, хітозан, глюкозамін і мікроелементи, у тому числі кальцій, магній, цинк, мідь, залізо і марганець. HYTb також містить ферменти, наприклад, молочнокислі ферменти, протеази, ліпази, хітинази, молочну кислоту, поліпептиди та інші вуглеводи. HYTb може також містити неактивні мікроорганізми від попереднього процесу біорозкладання. Такі мікроорганізми можуть реактивуватися і, у комбінації з HQE, сприяти більш надійному біорозкладанню в порівнянні із застосуванням HQE окремо, як описано в іншому варіанті реалізації в даній заявці. [0062] Більш докладно, зазначений спосіб включає наступні етапи: a. Активацію мікробних клітин у вуглеводному основному розчині для стимуляції їхнього росту та утворення біомаси. b. Перемелювання побічних продуктів креветок (головогрудей та екзоскелету) з отриманням однорідної пасти. c. Однорідне змішування пасти побічного продукту креветок з, щонайменше, 10% активного інокуляту. d. Регулювання pH до значень менше 6,0 у суміші з використанням розчину лимонної кислоти для інгібування росту мікроорганізмів і стимуляції розвитку мікробних клітин, що входять до складу інокуляту. e. Ферментація суміші в періодичній системі, що перемішується, при температурах у діапазоні від 30 до 40 °C, протягом, щонайменше, 96 годин при pH, яке підтримується на рівні менше 5,0. Періодично виконують моніторинг pH. Якщо pH перевищує 5,0, додають цитратний буфер у такій кількості, щоб підтримувати pH нижче 5,0. f. Центрифугування продукту зброджування для розділення трьох основних фракцій: хітину, рідкого гідролізату та пігментованої пасти. g. Промивання неочищеного хітину та повторний збір промивних вод для відновлення дрібних твердих часток або мінеральних компонентів. h. Висушування хітину та його зберігання. i. Висушування та зберігання рідкого гідролізату. j. Пігментовану пасту (ліпідну фракцію) зберігають у закритому резервуарі для збереження. [0063] Для кращого розуміння зазначеного способу та основ його експлуатації наведене посилання на наступний докладний опис. Активація мікробних клітин [0064] Мікробну композицію, описану в даній заявці, використовують як інокулят. Інокулят HQE містить від приблизно 2,5 до 3,0% (мас/об) мікроорганізмів. HQE активують розведенням до 5% у розчині тростинного цукру (кінцева концентрація тростинного цукру 3,75%) та інкубують при 37 °С протягом 5 днів. Переважно додають HYTb (10 мол на літр культури) для забезпечення джерела мінералів і природних амінокислот. Ріст мікроорганізмів оцінювали за оптичною густиною, яка вимірювалась при 540 нм. Активація завершувалася при оптичній гуcтині приблизно 1,7. Концентрація мікроорганізмів після активації становила приблизно 1,93,0% (мас/об). Підготовка зразків [0065] Зразки побічного продукту переробки креветок отримували на підприємствах з переробки креветок. Злегка розморожений і подрібнений залишок (1500 г на партію) змішують з 99 грамами тростинного цукру (кінцева концентрація 6,6% мас.%) і 85,5 мол активованої HQE 6 UA 113736 C2 5 10 15 5% (об/мас) (оптична густина клітин = 1,7). Потім коректують pH до величини 5,5 за допомогою 2 М лимонної кислоти. Контроль ферментації [0066] Суміш інкубують при 36 °С і періодичному перемішуванні протягом 96 годин. У процесі ферментації pH контролюють за допомогою потенціометра, а загальну кислотність (TTA,%), яка титрується, визначають титруванням 0,1 н. NAOH до одержання pH 8,5. TTA виражали у відсотках молочної кислоти. Умови розділення [0067] Продукт ферментації являє собою в’язкий силос інтенсивного оранжевого кольору через наявність астаксантину. Зазначений силос центрифугують (5 °С) при 1250 об./хв.(930 g) протягом 15 хв. з отриманням хітину, рідкого гідролізату та пігментної пасти. Верхню фазу (пігментну пасту) відокремлюють вручну. Рідкі гідролізати відокремлюють декантацією, а осад, який являє собою неочищений хітин, промивають дистильованою водою для відділення дрібних твердих часток. Отриману рідину збирають і висушують. Неочищений хітин, рідкі гідролізати та дрібні тверді частки висушують при 60 °С. Усі фракції зберігають без доступу світла. [0068] Інші мікробіологічні композиції для одержання HYTb і HYTc представлено в наступній Таблиці 2. Таблиця 2 Композиція культур Мікроорганізм Bacillus subtilis Bacillus cereus Bacillus megaterium Azotobacter vinelandii Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei Trichoderma harzianum Rhizobium japonicum Clostridium pasteurianum Bacillus licheniformis Pseudomonas fluorescens Bacillus thuringiensis Streptomyces Nitrobacter Micrococcus Proteus vulgaris 20 25 30 35 1 X X X X X X X X X X X X X X X X 2 X X X X X X X X X X X 3 X X X X X 4 X X X X X X X 5 6 X X 7 X X X X X X X X X X X X X X X X X 8 X X X X X X X 10 X X X X X X X X X X X X X 9 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Зазначені мікроорганізми переважно отримані з HQE і відносяться до Bacillus subtilis ((SILoSil® BS), Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), Bacillus thuringiensis strains HD-1 and HD-73 (SILoSil® BT), Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) і Proteus (Bioderpac, 2008). Кожний з цих організмів легко виділити з HQE і рекомбінувати з утворенням описаної мікробіологічної композиції для розкладання членистоногих з отриманням HYTb і HYTc. HYTb [0069] HYTb містить амінокислоти (приблизно 12 мас.%), хітозан (приблизно 1,2 мас.%), глюкозамін (приблизно 1 мас.%) і мікроелементи (приблизно 6 мас.% , у тому числі кальцій, магній, цинк, мідь, залізо та марганець. Він також містить ферменти, наприклад, у числі іншого, молочнокислі ферменти, протеази, ліпази, хітинази, молочну кислоту, поліпептиди та інші вуглеводи. Питома вага HYTb зазвичай становить приблизно 1,050-1,054. Середній вміст деяких амінокислот в HYTb представлено в Таблиці 2. 7 UA 113736 C2 Таблиця 3 Амінокислотний профіль сухих порошкоподібних гідролізатів (мг на г сухої ваги) Амінокислота Аспарагінова кислота Глутамінова кислота Серин Гістидин Гліцин Треонін Аланін Пролін Тирозин Аргінін Валін Метіонін Ізолейцин Триптофан Лейцин Фенілаланін Лізин Усього 5 10 15 20 25 30 Сухі порошкоподібні гідролізати 38 39 16 9 28 14 36,1 25,8 70 22,2 20 16,4 18,3 3,1 23 39 13 431 [0070] У деяких варіантах реалізації HYTb може являти собою другий компонент, який поєднують із HYTa або застосовують окремо як добриво для ґрунту та/або при обприскуванні листя. HYTc [0071] Основним компонентом HYTc є хітин. Його середня молекулярна маса дорівнює приблизно 2300 дальтон, і він становить приблизно 64 мас.% композиції. Приблизно 6% HYTc містить мінерали, включаючи кальцій, магній, цинк, мідь, залізо та марганець, близько 24 мас.% 3 білка та 6% води. Його питома вага дорівнює приблизно 272 кг/м . У деяких варіантах реалізації HYTc може являти собою другий компонент, який поєднують з HYTa або застосовують окремо як добриво для ґрунту та/або при обприскуванні листя. [0072] HYTa переважно застосовують з HYTb і HYTc у комбінації або окремо як добриво для ґрунту або при обприскуванні листя. [0073] Мікроорганізмам у складі HYTa необхідні мікроелементи кальцій, магній, сірка, бор, марганець, цинк, молібден, залізо, мідь, натрій і кремній. Ці важливі мікроелементи часто можна отримати за рахунок токсичних хімічних реакцій, які не підходять для органічної сертифікованої продукції. Відповідно, переважним є одержання зазначених мікроелементів з органічних джерел, наприклад, HYTb та/або HYTc. HYTd [0074] HYTd отримують шляхом ферментації хітину з мікробіологічною композицією, наприклад, HQE, суспендованою в HYTb. Зазначений спосіб аналогічний способу, описаному вище для одержання HYTb і HYTc, за винятком того, що субстратом є хітин, наприклад, HYTc, а не хітиновмісні членистоногі. [0075] Фігура 12 являє собою блок-схему, що ілюструє розкладання ракоподібних для утворення HYTb і HYTc. Потім HYTc і HYTb обробляють HQE з утворенням HYTd, розчину з відносно високою кількістю хітозану та глюкозаміну в порівнянні з HYTb. [0076] Фігура 13 являє собою блок-схему, що ілюструє розкладання грибів, у тому числі міцеліальних грибів, дріжджів та/або комах для утворення HYTb і HYTc. Потім HYTc і HYTb переробляються з HQE для утворення HYTd. [0077] HYTb Вже містить хітозан (приблизно 0,5-1,5 мас.%) і глюкозамін (приблизно 0,5-1,5 мас.%). Кількість хітозану та глюкозаміну в HYTd становить приблизно 2-2,5 мас.% хітозану і приблизно 2-5 мас.% глюкозаміну. Це є збільшенням кількості хітозану та глюкозаміну в порівнянні з HYTb, де міститься приблизно 0,5-2,5 мас.% хітозану та приблизно 0,5-5 мас.% 8 UA 113736 C2 5 10 15 20 25 30 35 глюкозаміну. [0078] HYTd у нерозведеному стані аналогічний HYTb, але містить більшу кількість хітозану та глюкозаміну. HYTd містить амінокислоти (приблизно 5-12 мас.%) і мікроелементи (приблизно 6 мас.%), у тому числі кальцій, магній, цинк, мідь, залізо і марганець. Він також містить ферменти, наприклад, у числі іншого, молочнокислі ферменти, протеази, ліпази, хітинази, молочну кислоту, поліпептиди та інші вуглеводи. У деяких варіантах реалізації ступінь ацетилування отримуваного хітозану становить 20% або менше, переважно 15% або менше, більш переважно 10% або менше, ще більш переважно 8% або менше і найбільш переважно 5% або менше. Переважний вміст деяких амінокислот в HYTd аналогічний HYTb. Див. Таблицю 3. [0079] HYTd переважно містить 12 мас.% L-Амінокислот (аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти, серину, гістидину, гліцину, треоніну, аланіну, проліну, аргініну, валіну, метіоніну, ізолейцину, триптофану, фенілаланіну, лізину та треоніну) і 5 мас.% глюкозаміну та хітозану. HYTd також переважно містить один або більше або всі з розчинних мінералів (P, Ca, Mg, Zn, Fe і Cu), ферментів і молочної кислоти, що містяться в продукті гідролізу хітину, а також інші полісахариди. [0080] У даній заявці термін "глюкозамін" включає глюкозамін або суміш глюкозаміну та Nацетилглюкозаміну. У більшості варіантів реалізації HYTd містить і N-ацетилглюкозамін. [0081]HYTd може також містити не повністю гідролізовані частинки хітину. У загальному випадку ферментаційну суміш фільтрують для видалення великих частинок хітину. Фільтрат містить, як правило, не більше 2 мас.% хітину. Активація HYTa [0082] Вищезазначену мікробіологічну композицію можна застосовувати для обробки ґрунту, насіння, саджанців та/або листя рослин. Разом з тим, HYTa спочатку активують перед застосуванням. [0083] У переважних варіантах реалізації HYTa активують шляхом інкубування інокуляту HYTa у водяному розчині протягом 24-168 годин, дозволяючи мікроорганізмам вирости і розмножитися перед застосуванням у способі обробки ґрунту, насіння, саджанців та/або листя рослин. Умови інкубування впливають на загальні вихідні властивості HYTa. [0084] В одному варіанті реалізації інокулят HYTa розводять водою в співвідношенні 1/100 та інкубують при температурі приблизно 36 °С при pH 6,8-7,1 протягом від приблизно 24 до приблизно 168 годин (7 днів). Під час зазначеної активації необов'язково можна використовувати HYTb. Мікроорганізми-азотофіксатори Azotobacter vinelandii і Clostridium pasteurianum розмножуються в ростових умовах при зниженій концентрації азоту. Крім того, при зниженні концентрації кисню розмножуються Lactobacilli, у тому числі Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei. Кількість колонієутворюючих одиниць (КУО) деяких бактерій в активованої HYTa представлено в таблиці 3: Таблиця 4 Azotobacter vinelandii Clostridium pasteurianum Bacillus subtilis Bacillus cereus Bacillus megaterium Lactobacillus Nitrobacter Nitrosomonas Усього 40 45 101050000 КУО/мол 104275000 КУО/мол 1100000 КУО/мол 25000 КУО/мол 10000 КУО/мол 500000 КУО/мол 5000 КУО/мол 2500 КУО/мол 206967000 КУО/мол [0085] HYTa, отримана після цього інкубування, зберігає корисні властивості HYTa, але особливо підходить як грунтопокращувач для обробки ґрунтів, збіднених на азот, з урахуванням здатності Azotobacter vinelandii and Clostridium pasteurianum до азотофіксації. [0086] Якщо є наявними або за припущенням є наявними ґрунтові патогени, наприклад, міцеліальні гриби з роду Fusarium або нематоди, HYTa можна активувати практично в тих же умовах, але за наявності хітину. Хітин стимулює розмноження хітин-чутливих мікроорганізмів, наприклад, Pseudomonas fluorescens, Trichoderma harzianum, Bacillus thuringiensis, Streptomyces 9 UA 113736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 sp., Nitrobacter sp., Micrococcus sp. і Bacillus subtilis. HYTa, отримана в цих умовах, має протигрибкові, фунгіцидні, протинематодні, нематоцидні та інсектицидні властивостями в тій мірі, у якій такі патогени містять хітин. Такі мікробіологічні композиції можна застосовувати для обробки ґрунту, насіння, саджанців та/або листя рослин. Такі мікробіологічні композиції також мають здатність фіксувати азот, як і при вищезазначеному інкубуванні за відсутності хітину. [0087] На додаток до інкубування з хітином, HYTa можна активувати з хітином і амінокислотами. Переважним джерелом хітину є HYTc. При використанні HYTc білок і мінерали в складі HYTc також є наявними під час активації. [0088] Крім того, HYTa можна активувати за наявності амінокислот і хітозану. Переважним джерелом амінокислот і хітозану є HYTb та/або HYTd. При використанні HYTb та/або HYTd глюкозамін та інші компоненти в складі HYTb та/або HYTd також є наявними під час активації. [0089] Необов'язково HYTa можна інкубувати з хітином, амінокислотами та хітозаном. Переважним джерелом хітину є HYTc. Переважним джерелом амінокислот і хітозану є HYTb та/або HYTd. При використанні HYTb, HYTd і HYTc інші компоненти зазначених складів також є наявними під час активації. Застосування активованої HYTa [0090] Активовану HYTa можна застосовувати окремо або в комбінації з іншими компонентами, наприклад, хітином (наприклад, HYTc), хітозаном, глюкозаміном та амінокислотами (наприклад, HYTb та/або HYTd) для обробки ґрунту, насіння, саджанців або листя. У деяких варіантах реалізації комбінації зазначених компонентів можна застосовувати у вигляді суміші. В інших варіантах реалізації їх можна застосовувати окремо. В інших варіантах реалізації зазначені компоненти можна застосовувати в різний час. [0091] В одному варіанті реалізації активовану HYTa можна вносити в ґрунт, на насіння або саджанці, або використовувати для позакореневого внесення шляхом безпосереднього нанесення на листя. У той же час, якщо є наявними рослинні патогени, те переважно, щоб мікробіологічна композиція містила активовану HYTa, хітин та/або хітозан. Як альтернативу, HYTa можна активувати за наявності хітину. Хітозан, як відомо, виявляє бактерицидну, фунгіцидну та противірусну дію, а також є здатним стимулювати ріст рослин і індукувати стійкість рослин до патогенів. В інших варіантах реалізації частиною мікробіологічної композиції є глюкозамін. [0092] У переважному варіанті реалізації активовану HYTa наносять на ґрунт, насіння, саджанці та/або листя окремо або в комбінації з хітином (переважно, HYTc) та/або хітином, хітозаном і амінокислотами (наприклад, HYTb, HYTd та/або HYTc). Переважним є застосування HYTa у комбінації з хітином, хітозаном, глюкозаміном та амінокислотами. HYTc є переважним джерелом хітину, у той час як HYTb та/або HYTd є переважним джерелом хітозану, глюкозаміну та амінокислот. Проте, компоненти мікробіологічної композиції, а саме HYTa, хітин, хітозан, глюкозамін та амінокислоти можна застосовувати окремо або в будь-якій комбінації або субкомбінації. Їх можна застосовувати одночасно або послідовно, у будь-якому заданому порядку. Однак переважний спосіб застосування полягає в їхньому первісному одночасному застосуванні. Застосування вищезазначених компонентів передбачає безпосередню обробку патогенів рослин, індукцію шляхів стійкості до патогенів у рослин і підживлення мікроорганізмів HYTa, природної непатогенної ґрунтової флори і рослини. [0093] Якщо ґрунт спочатку обробляють мікробіологічною композицією, що включає тільки активовану HYTa, існує можливість заселення ґрунту мікроорганізмами, що є наявними в композиції, і змінення її таксономічного складу. У деяких ситуаціях початкова колонізація HYTa забезпечує малу кількість поживних речовин або взагалі не забезпечує рослину поживними речовинами. У таких випадках важливо підтримувати запас поживних речовин у ґрунті для підтримки як росту мікробів при колонізації ризосфери, так і росту рослин. Можливо, необхідно повторити застосування HYTa, залежно від циклу росту рослини та режиму живлення. В інших випадках може бути достатньо забезпечити додаткове внесення амінокислот, хітину та/або хітозану, наприклад. HYTb і HYTc, у попередньо оброблений ґрунт. [0094] Якщо HYTa використовують у комбінації з, наприклад, HYTb, HYTd та/або HYTc, для мікроорганізмів HYTa і рослин, що є наявними в обробленому ґрунті, доступні додаткові поживні речовини. [0095] У Таблиці 5 наведена типова чотирнадцятитижнева програма застосування HYTa, HYTb і HYTc при краплинному поливі рослин, які вирощуються у ґрунті. Наведені значення на гектар. Для HYTa і HYTb значення виражені в літрах на тиждень. Для HYTc значення виражені в кілограмах на тиждень. 10 UA 113736 C2 Таблиця 5 л/кг/ тиждень HYT-A HYT-B HYT-C 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 БВ1 БВ2 БВ3 W4 W5 W6 W7 W8 W9 W10 Wll W12 W13 W14 3 10 1 0 5 0 0 1 3 1 0 2 1 3 0 2 1 3 1 0 2 1 3 0 2 1 3 1 0 2 1 3 [0096] Періодичність введення мікробіологічної композиції в систему зрошення повинна бути такою, при якій мікробіологічна композиція здатна досягти кореневої системи і залишатися там протягом ночі, під час відпочинку кореневої системи. Для максимальної продуктивності HYTc іі слід наносити в той самий час у суміші з HYTa. Зазначену процедуру слід продовжувати, поки рослина продовжує плодоносити. Зазначений протокол охоплює всі етапи розвитку рослини, включаючи проростання, коренеутворення, ріст рослини, цвітіння, зав'язування плодів, збір і повторний збір урожаю. Зазначений протокол призначений для можливості отримання максимального врожаю і передбачає аспекти живлення, біостимуляції та захисту від захворювань, наприклад, нематод і грибів. [0097] Зазначений спосіб можна здійснити шляхом обробки ґрунту з отриманням обробленого ґрунту. У деяких випадках зазначений спосіб застосовують повторно. У деяких випадках рослини, саджанці або насіння вже є наявними в ґрунті до обробки мікробіологічною композицією. В інших випадках рослини, саджанці або насіння пересаджують у ґрунт після обробки мікробіологічною композицією. [0098] У загальному випадку перед застосуванням визначають число гектарів або акрів, що підлягають обробці. Потім рекомендовану кількість активованої HYTa на гектар або акр множать на оброблювану площу І розводять у достатній кількості води для зрошення або обприскування ґрунту або рослин на площі, що підлягає обробці. Аналогічну процедуру можна здійснювати для рідкої HYTb та/або HYTd. HYTc, оскільки він є твердою речовиною, можна вносити безпосередньо у вигляді твердої речовини або у вигляді суспензії у воді. HYTc переважно подрібнюють до часток мікронного розміру перед застосуванням. [0099] Зазначений спосіб підходить для неродючого ґрунту. Такі ґрунти, як правило, мають, щонайменше одну з наступних характеристик: низька катіонобмінна ємність, низька водоутримуюча здатність, низький вміст органічних речовин і низький рівень доступних поживних речовин. У загальному випадку неродючі ґрунти не підтримують інтенсивного зростання рослин та/або дають низькі врожаї. [00100] Для систем без ґрунту, наприклад, гідропонних, застосовують аналогічний протокол, але із щоденним розподіленням відповідно до програми підживлення і зрошення. [00101] Мікробіологічні композиції можна застосовувати для будь-якої рослини, включаючи люцерну, банан, ячмінь, броколі, моркву, кукурудзу, огірок, часник, виноград, цибулю-порей, диню, цибулю, картоплю, малину, рис, сою, кабачки, полуницю, цукровий очерет, помідор і кавун, але не обмежуючись ними.[00102] При нанесенні як грунтопокращувача мікробна композиція, що містить HYTa, хітин, амінокислоти та хітозан, поліпшує врожайність сільськогосподарських культур у середньому приблизно на 25%-55% у порівнянні з 15-25% ростом урожайності культур, який спостерігався для E2001. Від Karl Co. SA de CV, Навохоа, штат Сонора, Мексика. [00103] Мікробіологічні композиції також можуть призводити до зниження кількості хітину, який використовується. Наприклад, відомо застосування хітину як грунтопокращувача. Як правило, використовують приблизно 600 кг хітину на гектар. Однак позитивний ефект від такого застосування не спостерігався протягом шести місяців. При активації HYTa за наявності хітину, а потім об'єднанні з хітином і застосуванні як грунтопокращувача сприятливі ефекти спостерігалися через сім днів при використанням лише 4-6 кг хітину на гектар. [00104] Хоча даний опис спрямований у першу чергу на застосування описаних мікробних композицій HYTb, HYTc та/або HYTd у сільському господарстві, такі композиції або їхні компоненти та способи також можна застосовувати в садівництві для поліпшеного утворення листя і квітів та зниження застосування традиційних інсектицидів і фунгіцидів. [00105] При внесенні HYTd і активованої HYTa, HYTb та/або HYTc у ґрунт, насіння, саджанці або листя отримують оброблений ґрунт, оброблені насіння, оброблені саджанці, оброблене листя та оброблені рослини. HYTd також є новою композицією. Таким чином, ґрунт, насіння, саджанці, листя та рослини, оброблені HYTd і HYTa, HYTb та/або HYTc, також є новими. Оскільки HYTd, HYTa, HYTb і HYTc, як правило, розводять перед застосуванням, ґрунт, насіння, 11 UA 113736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 саджанці та листя, як правило, містять компоненти HYTd, HYTa, HYTb і/або HYTc у розведеному виді. [00106] Ґрунт, оброблений HYTa, визначають як ґрунт, що містить один або декілька унікальних для HYTa мікроорганізмів, диспергованих в обробленому ґрунті. Такі мікроорганізми можна генетично виявити в обробленому ґрунті за допомогою біочіпу, що виявляє популяції мікроорганізмів на основі ДНК. Див., наприклад, публікацію США 2007/0015175, включену в даний документ за допомогою посилання. Крім того, можна застосовувати інші методи, відомі спеціалістам у даній області техніки, наприклад, ПЛР. Особливо переважними мікроорганізмами у складі HYTa є Bacillus subtilis (SILoSil® BS), Bacillus thuringiensis штам HD-1, Bacillus thuringiensis штам HD-73 (SILoSil® BT) і Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), кожний з яких можна виділити з депозиту HYTa або отримати з Biotecnologia Agroindustrial S.A. DE C.V., Морелія, Мічоакан, Мексика. Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) є найбільш переважним мікроорганізмом, оскільки він відіграє важливу роль при активації HYTa, викликаючи міжкомпонентний синергізм з іншими мікроорганізмами в складі HYTa. Надалі ідентифікацію одного або більше з цих мікроорганізмів можна при необхідності об'єднати з ідентифікацією інших мікроорганізмів у складі HYTa для підтвердження наявності HYTa або слідів наявності HYTa. Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) депоновано в АТСС 6 жовтня 2011 року з привласненим патентним позначенням депонування РОТА-12152. Bacillus subtilis (SILoSil® BS) депоновано в АТСС 7 жовтня 2011 року з привласненим патентним позначенням депонування РОТА-12153. Штами Bacillus thuringiensis HD-1 і HD-73 (SILoSil® BS) депоновано в АТСС 31 травня 2012 року з привласненим патентним позначенням депонування РОТА-12967. [00107] Аналогічним чином визначають оброблені насіння, саджанці, листя І рослини. У зазначених випадках мікроорганізми HYTa перебувають на поверхні обробленого насіння, саджанців, листя і рослин. [00108] У даному документі термін "що складається практично з" у зв'язку з HYTa, HYTb і HYTc означає кожну з HYTa, HYTb та/або HYTc окремо або в комбінації без додаткових мікроорганізмів. Спосіб отримання HYTd [00109] Спосіб отримання HYTd описаний у заявці на патент США № 61/500527, яка була подана 23 червня 2011 р. під назвою «Процес отримання хітину і похідних хітину», прямо включеної в дану заявку за допомогою посилання. [00110] Коротко, HQE або споріднену хітин-руйнуючу мікробіологічну композицію активують і додають до HYTb. Додають твердий хітин і зброджують суміш протягом 3-7 днів. Зазначений хітин можна отримати з HYTc або інших джерел, наприклад, шляхом хімічної обробки або біорозкладаня хітиновмісних грибів, міцеліальних грибів, дріжджів та/або комах. HYTc є переважним джерелом хітину. У переважному випадку хітин є мікронізованим. Можна використовувати мікронізований хітин або залишковий хітин. Застосування HYTd [00111] HYTd можна застосовувати як біостимулятор росту коріння і листя, і як фунгіцид. [00112] Якщо HYTd використовують окремо як фунгіцид, переважно застосовувати HYTd у кількості 20 літрів на гектар. [00113] Якщо HYTd використовують для обробки рослин у стані стресу, переважно застосовувати HYTd у кількості 3-10 літрів на гектар. [00114] HYTd також можна застосовувати в кількості 3-5 літрів на гектар. [00115] HYTd можна вносити безпосередньо в ґрунт та/або на листя. HYTd можна застосовувати в комбінації з іншими компонентами, наприклад, HYTb, HYTc та/або HYTa. При застосуванні з іншими компонентами HYTd можна поєднувати з компонентом з утворенням нових композицій. Такі композиції можна вносити безпосередньо в ґрунт та/або на листя. Як альтернативу, HYTd і один або більше з HYTa, HYTb та/або HYTc можна застосовувати окремо або в різний час. Приклад 1 [00116] Наступний протокол використовували для обробки ґрунту з рослинами спаржі. 12 UA 113736 C2 Таблиця 6 Тест HYTa 1 0 2 3 л/га, потім 1 л/га кожні 45 днів 3 5 10 15 20 3 л/га, потім 1 л/га кожні 45 днів 4 HYTb 0 0 2 л/га, потім 1 л/га кожні 12 днів 5 л/га, потім 2 л/га кожні 12 днів 3 л/га, потім 1 л/га кожні 45 днів HYTc 0 0 HYTd 0 0 0 0 0 5 л/га, потім 2 л/га кожні 12 днів [00117] Результати показані на Фігурах 1 і 2. Як видно, за відсутності застосування будьякого продукту HYT отримана порівняно невелика рослина з поганим розвитком корінь. У міру проходження досліджень 2, 3 і 4 видно, що кожна обробка призводила до поліпшеного розвитку листя і корінь. Приклад 2 [00118] У даному прикладі продемонстрована сприятлива дія обробки картоплі HYTa у порівнянні з контролем. [00119] Ґрунт містив 1% органічної речовини або менше і мав pH 7,3-7,5. Протягом тесту на гектар вносили: - 400-600 кг сульфату амонію. - 250-400 кг 11-52-0, фосфору. - 300 кг сульфату калію. - 150-200 кг нітрату калію. - 50-100 кг сульфату магнію. - 25-50 кг сульфату цинку. - HYTa - 10 л [00120] Два літри HYTa на гектар ґрунту вносили при першому внесенні води. При посадці в ґрунт вносили 4 літра HYTa на гектар. Після розвитку столонів у ґрунт вносили 2 літра HYTa на гектар. Після досягнення бульбами розміру 4 см у ґрунт вносили 2 літра HYTa на гектар. Результати представлено в Таблиці 7. Таблиця 7 розмір Гігантськи й 1-й 2-й 3-й 4-й MONO УСЬОГО 25 30 35 ТЕСТ % У ВІДНОШЕННІ КОНТРОЛЬ ВІДМІННІСТЬ HYT+A ДО КОНТРОЛЮ кількість кілограми кількість кілограми кількість кілограми кількість кілограми 0 0,00 0 0,00 0 0,00 4 18 21 71 6 120 1,20 3,33 2,74 3,24 0,79 11,3 1 11 25 118 7 162 0,30 1,93 3,37 5,27 1,30 12,1 3 7 -4 -47 -1 -42 0,91 1,41 -0,63 -2,03 -0,51 -0,86 300% 64% -16% -40% -14% -26% 307% 73% -19% -39% -39% -7% [00122] Найціннішою популяцією картоплі є гігантська картопля, потім картопля 1-го, 2-го й 3-го розміру. Наступні два розміри можна застосовувати для переробки картоплі або насінного матеріалу. На Фігурах 3 і 4 графічно представлені результати з Таблиці 7. Як можна бачити, існує значне збільшення кількості бульб і маси картоплі першого і другого розмірів. Фігура 5 містить фотографії, що порівнюють отриману картоплю. Приклад 3 [00123] У даному прикладі продемонстрована сприятлива дія обробки картоплі HYTa, HYTb, HYTc і HYTd у порівнянні з обробкою картоплі HYTa. [00124] Ґрунт містив 1% органічної речовини або менше і мав pH 7,3-7,5. Протягом дослідження на гектар вносили: - 400-600 кг сульфату амонію. - 250-400 кг 11-52-0, фосфору. - 300 кг сульфату калію. 13 UA 113736 C2 5 10 - 150-200 кг нітрату калію. - 50-100 кг сульфату магнію. - 25-50 кг сульфату цинку. - HYTa - 10 л - HYTb - 8 л - HYTc - 4 кг - HYTd - 5 л [00125] Два літри HYTa на гектар ґрунту вносили при першому внесенні води. При посадці в ґрунт вносили 4 літра HYTa, 3 кілограма HYTc і 5 літрів HYTd на гектар. Після розвитку столонів у ґрунт вносили 2 літра HYTa на гектар. Після досягнення бульбами розміру 4 см у ґрунт вносили 2 літра HYTa на гектар. [00126] Після початку формування бульб на листя рослин кожні 6-10 днів наносили 1 літр HYTb. Цю процедуру повторювали вісім разів. Результати представлено в Таблиці 8. 15 Таблиця 8 ТЕСТ % У ВІДНОШЕНННІ КОНТРОЛЬ ВІДМІННІСТЬ HYT+A+B+C+D ДО КОНТРОЛЮ розмір кількість кілограми кількість кілограми кількість кілограми кількість кілограми Гігантський 4 1,54 0 0,00 4 1,54 1-й 8 2,07 1 0,30 7 1,78 700% 602% 2-й 19 3,60 11 1,93 8 1,68 73% 87% 3-й 32 4,04 2,5 3,37 7 0,68 28% 20% 4-й 30 1,69 118 5,27 -79 -3,58 -67% -68% MONO 1 1,54 7 1,30 -6 0,24 -86% 19% УСЬОГО 103 14,5 162 12,1 -59 2,32 -36% 19% 20 25 [00128] На Фігурах 6 і 7 графічно представлені результати з Таблиці 8. Як можна бачити, існує значне збільшення кількості і маси картоплі з гігантського по третій розмір у порівнянні з обробкою картоплі тільки HYTa. Фігура 8 містить фотографії, що порівнюють отриману картоплю. Приклад 4 [00129] У даному прикладі продемонстрована сприятлива дія обробки картоплі HYTa, HYTb, HYTc і HYTd у порівнянні з обробкою картоплі метам-натрієм у ґрунті, зараженому грибами. Результати представлено в Таблиці 9. Ґрунт обробляли відповідно до опису у Прикладі 3. HYTa, HYTc і HYTd вносили, як описано в Прикладі 2. Вносили триста літрів метам-натрію на гектар. Таблиця 9 % У ВІДНОШЕННІ ДО КОНТРОЛЮ розмір кількість кілограми кількість кілограми кількість кілограми кількість кілограми Гігантський 4 1,54 1 0,43 3 1,11 300% 257% 1-й 8 2,07 1 0,32 7 1,75 700% 547% 2-й 19 3,60 35 6,46 -16 -2,86 -46% -44% 3-й 32 4,04 24 2,67 8 1,38 33% 52% 4-й 39 1,69 88 3,63 -49 -1,94 -56% -54% MONO 1 1,54 6 1,47 -5 0,06 -83% 4% УСЬОГО 103 14,5 155 15,0 -52 -0,50 -34% -3% ТЕСТ HYT+A+B+C+D 30 КОНТРОЛЬ Метам-натрій ВІДМІННІСТЬ [00130] На Фігурах 9 і 10 графічно представлені результати з Таблиці 9. Як можна бачити, існує значне збільшення кількості бульб і маси картоплі з гігантського, першого і третього розміру в порівнянні з обробкою картоплі метам-натрієм. Фігура 11 містить фотографії, що порівнюють отриману картоплю. [00131] Метам-натрій - препарат для окурювання ґрунту, який застосовується як пестицид, гербіцид та фунгіцид. Його застосування заборонене в деяких країнах у зв'язку із 14 UA 113736 C2 5 природоохоронними міркуваннями. Обробка HYTa, HYTb, HYTc і HYTd допомагає уникнути застосування метам-натрію в певних областях, тим самим знижуючи вплив на навколишнє середовище і витрати на застосування цього препарату для окурювання ґрунту. Приклад 5 [00132] У даному прикладі продемонстрована дія обробки HYTa і HYTc огірка, зараженого нематодою Rhabditis і грибком Fusarium oxisporum. [00133] У ґрунт вносили десять літрів HYTa і 3 кілограми HYTc на гектар. Зазначену процедуру повторювали через 8 днів. [00134] Результати показано в Таблиці 10. 10 Таблиця 10 Нематоди Rhabditis Грибок До Популяція нематод на кг ґрунту Невелика Середня Велика кількість кількість кількість 100 500 9600 Популяція нематод на кг ґрунту Невелика Середня Велика кількість кількість кількість 400 > 600 > 700 Fusarium oxisporum 15 Через 18 днів Популяція нематод на кг ґрунту Невелика Середня Велика кількість кількість кількість 100 500 850 Популяція нематод на кг ґрунту Невелика Середня Велика кількість кількість кількість 400 > 600 > 700 770 3 [00135] Як можна бачити, популяція зазначених організмів суттєво знижувалася через 18 днів після обробки. Приклад 6 [00136] У даному прикладі продемонстрована дія обробки HYTa, HYTc і HYTd помідору, зараженого грибком Fusarium oxisporum. [00137] У ґрунт вносили п'ять літрів HYTa, 1 кілограм HYTc і 5 літрів HYTd на гектар. Зазначену обробку повторювали кожні 15 днів. [00138] Результати показано в Таблиці 11. 20 Таблиця 11 Колонієутворюючі одиниці (КУО/г) Fusarium oxysporum Rhizoctonia solani Phytopthora sp. Pythium sp 25 30 HYTA, C + D 500 0 0 0 Контроль 1666 [00139] Як видно, обробка HYTa, HYTc і HYTd значно знижувала кількість колонієутворюючих одиниць гриба. Приклад 6 [00140] Листя рослин помідору, заражених гнилизною (грибком Phytophthora infestans), обробляли HYTd. Два, 4, 6 і 8 літрів HYTd розбавляли 100 л води на гектар. Контролем були необроблені помідори. Через тиждень зараження припинили. Грибок на контрольній культурі на той час розвився до ватоподібної цвілі, що призвело до ушкодження рослин і розвитку некрозу (результати не показані). Оптимальна кількість HYTd для обробки Phytophthora infestans склала 6 літрів на гектар. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 1. Композиція, яка містить HYTd, причому зазначений HYTd містить рідку фракцію, отриману в результаті ферментації HYTb і HYTc з використанням HQE (патентне позначення депозиту АТСС РТА-10861), причому зазначений HYTb містить рідку фракцію, отриману в результаті ферментації хітиновмісних членистоногих з використанням HQE, а зазначений HYTc містить 15 UA 113736 C2 5 10 15 20 25 30 35 тверду фракцію, отриману в результаті ферментації хітиновмісних членистоногих з використанням HQE. 2. Композиція за п. 1, яка додатково містить щонайменше один з HYTa, HYTb і HYTc, причому зазначений HYTa містить композицію, що включає патентне позначення депозиту АТСС РТА10973. 3. Композиція за п. 1, яка додатково містить два або більше з HYTa, HYTb і HYTc, причому зазначений HYTa містить композицію, що включає патентне позначення депозиту АТСС РТА10973. 4. Композиція за п. 1, яка додатково містить HYTa, HYTb і HYTc, причому зазначений HYTa містить композицію, що включає патентне позначення депозиту АТСС РТА-10973. 5. Спосіб, який включає обробку ґрунту, насіння, саджанців або листя рослин за допомогою компонентів композицій за будь-яким з пп. 1-4. 6. Спосіб, який включає обробку ґрунту, насіння, саджанців або листя рослин за допомогою HYTd, причому зазначений HYTd містить рідку фракцію, отриману в результаті ферментації HYTb і НУТс з використанням HQE (патентне позначення депозиту АТСС РТА-10861), причому зазначений HYTb містить рідку фракцію, отриману в результаті ферментації хітиновмісних членистоногих з використанням HQE, а зазначений HYTc містить тверду фракцію, отриману в результаті ферментації хітиновмісних членистоногих з використанням HQE. 7. Спосіб за п. 6, який додатково включає обробку ґрунту, насіння, саджанців або листя рослин за допомогою щонайменше одного з HYTa, HYTb і HYTc, причому зазначений HYTa містить композицію, що включає патентне позначення депозиту АТСС РТА-10973. 8. Спосіб за п. 6, який додатково включає обробку ґрунту, насіння, саджанців або листя рослин за допомогою двох або більше з HYTa, HYTb і HYTc, причому зазначений HYTa містить композицію, що включає патентне позначення депозиту АТСС РТА-10973. 9. Спосіб за п. 6, який додатково включає обробку ґрунту, насіння, саджанців або листя рослин за допомогою HYTa, HYTb і HYTc, причому зазначений HYTa містить композицію, що включає патентне позначення депозиту АТСС РТА-10973. 10. Спосіб за будь-яким з пп. 6-9, який відрізняється тим, що один або більше з HYTa, HYTb, HYTc і HYTd застосовують у різний час. 11. Спосіб, який включає змішування HYTd зі щонайменше одним з HYTa, HYTb і HYTc, з утворенням суміші. 12. Спосіб за п. 11, який додатково включає обробку ґрунту, листя, насіння або саджанців за допомогою зазначеної суміші. 13. Оброблений ґрунт, який включає ґрунт, оброблений за допомогою композиції за будь-яким з пп. 1-4. 14. Спосіб, який включає висадку насіння, саджанців або рослин в оброблений ґрунт за п. 13. 15. Оброблена рослина, насіння або саджанці, що включають рослину, насіння або саджанці, оброблені за допомогою композиції за будь-яким з пп. 1-4. 16 UA 113736 C2 17 UA 113736 C2 18 UA 113736 C2 19 UA 113736 C2 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 20