Комбінація, що містить кандесартан та розувастатин, фармацевтична композиція, яка її містить, та застосування

1. Комбінація, що містить кандесартан, або його фармацевтично прийнятну сіль, та розувас C2 2 UA 1 ТА (19) ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ 3 зи, звичайно відомими як статини, призводить до нижчого ризику серцево-судинних інцидентів. Активація системи ренін-ангіотензин (RAS) можна розглядати як ще один важливий фактор ризику в атеросклерозі. Активація RAS з утворенням ангіотензину (II) (А (II)) та активація рецепторів А (II) приймають участь в атерогенезисі, руйнуванні тромбоцитів, міокардіальній ішемічній дисфункції та застійній серцевій нестачі (Singh та Mehta, Arch Intern Med, 2003, vol 163, 1296-1304). Міжнародна патентна заявка WO 95/26188 розкриває лікування атеросклерозу блокаторами рецептору A(II)1 як варіант, у комбінації з інгібіторами HMG-CoA-редуктази. Міжнародна патентна заявка\ЛГО 01/76573 розкриває застосування комбінації принаймні двох з антагоністів A(II)1 інгібітору АСЕ (фермент перетворення ангіотензину) та інгібітору HMG-CoA-редуктази для попередження або затримки прогресування станів, серед яких є атеросклероз. Ми несподівано виявили, що комбінація антагоністу A(II) кандесартану та інгібітору HMG-CoAредуктази розувастатину має синергічну дію у зменшенні атеросклерозу. Ця синергічн дія, здається, виникає від синергічного інгібування експресії ряду запальних медіаторів, приймаючих участь у RAS (наприклад, у CD40, металопротеїназах (MMP)) та/або інгібування експресії рецептору LOX-1 (котрий є рецептором для окисненого ЛНГ на ендотеліальних клітинах). Синергічна дія забезпечує сильне підтвердження стосовно перехресної дії між RAS та дисліпідемією в атерогенезисі. Треба розуміти, що активність MMP може бути регульованою in vivo їх тканинними інгібіторами (ТІМР). Нами також показано, що експресія ТІМР-1 та ТІМР-2 є підвищувано регульованою високохолестериновою дієтою, та помітно ослабленою комбінацією кан-десартану та розувастатину. Ці дані призводять до концепції, що баланс між MMP та TIMP змінюється високо-холестериновою дієтою, та що цей дисбаланс мож бути "нормалізованим" комбінацією антагоністу A(II) та ліпідзнижувального агенту. Згідно з одним аспектом винаходу запропоновано комбінацію, що містить канде-сартан або його фармацевтично прийнятну сіль та розувастатин або його фармацевтично прийнятну сіль для попередження або лікування атеросклерозу. Згідно з одним аспектом винаходу запропоновано комбінацію, що містить канде-сартан або його фармацевтично прийнятну сіль та розувастатин або його фармацевтично прийнятну сіль для попередження серцево-судинних інцидентів. Така комбінація може також бути корисною у лікуванні або попередженні інших хвороб, асоційованих з цими медіаторами, наприклад, у запальних хворобах або станах, як-то ішемічнореперфузійне поранення (серця, мозку, нирок, легень та печінки), індуковане радіацією поранення, опіки та хвороб периферійних судин. Кандесартан може підхоже бути у формі кандесартану, або у формі проліків кан-десартану цилексетилу. Ці форми можна формувати з наступним агентом, як-то діуре-тик, як-то гідрохлортіа 90249 4 зид (наприклад, що продають як Atacand Plus™). Там, де тут названо кандесартан, це охоплює кандесартан та кандесартан цилек-сетил. Переважно сіль кальцію розувастатину, котру можна розглядати як розувастатин кальцій, застосовують у різних аспектах заявленого винаходу. Загалом, фармацевтично прийнятні солі охоплюють кислотно-адитивні солі, як-то метансульфонат, тозилат, -гліцерофосфат, фумарат, гідрохлорид, цитрат, малеат, тартрат та (менш переважно) гідробромід. Фармацевтично прийнятні солі загалом також охоплюють солі, утворені з фосфатною та сульфатною кислотою. Фармацевтично прийнятні солі звичайно охоплюють солі основ, як-то лужного металу, наприклад, натрію, лужно-земельного металу, наприклад, кальцію або магнію, органічного аміну, наприклад, триетиламіну, морфоліну, N-метилпіперидину, Nетилпіперидину, прокаїну, дибен-зиламіну, N,Nдибензилетиламіну, трис-(2-гідроксіетил)аміну, трис(гідроксиметил)метиламонію, N-метил-dглюкаміну та амінокислоти, як-то лізин. Може бути більше одного катіона чи аніона залежно від числа заряджених функціональних груп та валентності катіонів чи аніонів. Там, де застосовують термін "комбінація", слід розуміти, що це стосується одночасного, роздільного чи послідовного застосування. Згідно з одним аспектом винаходу "комбінація" стосується одночасного застосування. Згідно з ще одним аспектом винаходу "комбінація" стосується роздільного застосування. Згідно з наступним аспектом винаходу "комбінація" стосується послідовного застосування. Де застосування є послідовним або роздільним, затримка у застосуванні другого компоненту повинна бути такою, щоб обидва агенти були присутніми у тілі так, щоб продукувати синергічну дію комбінації. Згідно з наступним аспектом винаходу запропоновано фармацевтичну композицію, яка містить кандесартан або його фармацевтично прийнятну сіль та розувастатин або його фармацевтично прийнятну сіль, в асоціації з фармацевтично прийнятним розріджувачем чи носієм для застосування у попередженні або лікуванні атеросклерозу. Згідно з наступним аспектом винаходу запропоновано фармацевтичну композицію, яка містить кандесартан або його фармацевтично прийнятну сіль та розувастатин або його фармацевтично прийнятну сіль, в асоціації з фармацевтично прийнятним розріджувачем чи носієм для застосування у попередженні або зменшенні ризику серцевосудинних інцидентів. Композиції, описані тут, можуть бути у формі, придатній для перорального застосування, наприклад, як таблетка або капсула, для парентеральної ін'єкції (охоплюючи внутрішньовенну, підшкірну, внутрішньом'язову, внутрішньосудинну або інфузію), наприклад, як стерильний розчин, суспензія або емульсія, для топічного застосування, наприклад, як мазь або крем, для ректального застосування, наприклад, як супозиторій, або шлях застосування можу бути безпосередньою ін'єкцією у пухлину або регіонарною доставкою чи локальною доставкою. В інших втіленнях заявле 5 ного винаходу сполуки комбінації лікування можна доставляти ендоскопічно, інтратрахеально, безпосередньо в ураження, підшкірно, внутрішньовенно, підшкірно, інтраперитонеально або внутрішньопухлинно. Загалом композиції, описані тут, можна отримувати звичайними способами, застосовуючи звичайні наповнювачі або носії, що добре відомі у рівні техніки. Придатні фармацевтично прийнятж'наповнювачі або носії для композиції таблеток охоплюють, наприклад, інертні наповнювачі, як-то лактоза, натрій карбонат, кальцій фосфат або кальцій карбонат, грануляційні та дезинтеграційні агенти, якто кукурудзяний крохмаль або алгінова кислот; зв'язувальні агенти, як-то желатин або крохмаль; мастильні агенти, як-то магній стеарат, стеаринова кислота або тальк; консерванти, як-то етил або пропіл 4-гідроксибензоат, та а нті оксид анти, як-то аскорбінова кислота. Композиції таблеток мож бути непокритими або покритими для модифікації їх руйнування та наступного поглинання активного інгредієнту у шлунково-кишковому тракті, або для поліпшення їх стабільності та/або зовнішнього вигляду, у будь-якому разі застосовуючи звичайні покривальні агенти та способи, добре відомі у рівні техніки. Композиції для перорального застосування можуть бути у формі твердих желатинових капсул, у котрих активний інгредієнт змішано з інертним твердим наповнювачем, як-то кальцій карбонат, кальцій фосфат або каолін, або у формі м'яких желатинових капсул, у котрих \ активний інгредієнт змішано з водою або маслом, як-то олія арахісу, рідкий парафін або олія оливки. Кандесартан комерційно доступний як 'Atacand™' та 'Atacand Plus™'. Розувастатин кальцій комерційно доступний як 'Crestor™'. Придатні композиції заявленого винаходу охоплюють композиції, котрі комерційно доступні. Придатні дози кожного компоненту комбінації є дозами продажних комерційних продуктів. Альтернативно, синерпі між компонентами можна досягти нижчими дозами одного або обох застосовуваних компонентів, наприклад, можна застосовувати дозу 4 мг, 8 мг, 16 мг, 32 мг, або до 160 мг кандесартану у комбінації з дозою 80 мг, 40 мг, 20 мг, 10 мг, 5 мг або 2.5 мг розувастатину. Слід розуміти, що будь-яку одну з доз кандесартану можна поєднувати з будь-якою придатною дозою розувастатину. Згідно з одним аспектом застосовують 80 мг розувастатину. Згідно з ще одним аспектом застосовують 40 мг розувастатину. Згідно з наступним аспектом застосовують 20 мг розувастатину. Згідно з наступним аспектом застосовують 10 мг розувастатину. Згідно з наступним аспектом застосовують 5 мг розувастатину. Згідно з наступним аспектом застосовують 2.5 мг розувастатину. Згідно з одним аспектом застосовують між 32 та 160 мг, як-то приблизно 64 - 128 мг, наприклад, 64-112 мг, як-то приблизно 64-96 мг кандесартану. Звичайно, застосовують приблизно 72 мг кандесартану. Згідно з ще одним аспектом застосовують 32 мг кандесартану. Згідно з наступним аспектом 16 мг кандесартану застосовують. Згідно з наступ 90249 6 ним аспектом застосовують 8 мг кандесартану. Згідно з наступним аспектом застосовують 4 мг кандесартану. Треба розуміти, що фармацевтична композиціязгідно з заявленим винаходом охоплює композиції, що містять кандесартан або його фармацевтично прийнятну сіль та розувастатин або його фармацевтично прийнятну сіль та фармацевтично прийнятний наповнювач або носій. Така композиція, наприклад, в одинарній пероральній композиції звичайно забезпечує терапевтичну комбінацію продукт винаходу для одночасного застосування у попередженні або лікуванні атеросклерозу. Переважно обидва компоненти комбінації застосовують перорально. Переважно обидва компоненти комбінації застосовують як одинарну пероральну композицію. Переважно комбінацію формують для дозування раз на добу. Звичайно, комбінацію формують як одинарну таблетку або капсулу. Дозировку та режими, описані перед тим, можна змінювати згідно з конкретним хворобливим станом та загальним станом пацієнта. Наприклад, може бути необхідним чи потрібним зменшувати вищезгадані дози компонентів комбінації лікування для зменшення токсичності. Дозування та режими можна також змінювати, якщо на додаток до комбінаційного лікування заявленого винаходу застосовують один чи більше додаткових хемотерапевтичних агентів. Режим прийому може визначати виконавець, який лікує будь-якого конкретного пацієнта, застосовуючи свої професіональні вміння та знання. Фармацевтична композиція згідно з заявленим винаходом також охоплює роздільні композиції, що містять першу композицію, яка містить кандесартан або його фармацевтично прийнятну сіль та фармацевтично прийнятн/наповнювач або носій, та другу композицію, що містить розувастатин або його фармацевтично прийнятну сіль та фармацевтично прийнятїЙаповнювач або носій. Така композиція звичайно забезпечує терапевтичну комбінацію винаходу для послідовного або роздільного застосування у синергічному попередженні або лікуванні атеросклерозу, але роздільні композиції можна також застосовуавти одночасно. Згідно з ще одним аспектом винаходу запропоновано комбінацію, що містить кандесартан або його фармацевтично прийнятну сіль та розувастатин або його фармацевтично прийнятну сіль, для застосування як медикаменту для попередження або лікування атеросклерозу. Згідно з ще одним аспектом винаходу запропоновано комбінацію, що містить кандесартан або його фармацевтично прийнятну сіль та розувастатин або його фармацевтично прийнятну сіль, для застосування як медикаменту для попередження серцево-судинних інцидентів. Згідно з ще одним аспектом винаходу запропоновано комбінацію, що містить кандесартан або його фармацевтично прийнятну сіль та розувастатин або його фармацевтично прийнятну сіль, для застосування у виробництві медикаменту. Згідно з ще одним аспектом винаходу запро 7 поновано комбінацію, що містить кандесартан або його фармацевтично прийнятну сіль та розувастатин або його фармацевтично прийнятну сіль, для застосування у виробництві медикаменту для попередження або лікування атеросклерозу. Згідно з ще одним аспектом винаходу запропоновано комбінацію, що містить кандесартан або його фармацевтично прийнятну сіль та розувастатин або його фармацевтично прийнятну сіль, для застосування у виробництві медикаменту для попередження серцево-судинних інцидентів. Згідно з наступним аспектом винаходу запропоновано спосіб попередження або лікування атеросклерозу у теплокровної тварини, як-то людини, котрий полягає у застосуванні комбінації кандесартану або його фармацевтично прийнятної солі, та розувас-татину або його фармацевтично прийнятної солі. Згідно з наступним аспектом винаходу запропоновано спосіб попередження серцево-судинних інцидентів у теплокровної тварини, як-то людини, котрий полягає у застосуванні комбінації кандесартану або його фармацевтично прийнятної солі, та розу-вастатину або його фармацевтично прийнятної солі. Згідно з наступним аспектом заявленого винаходу запропоновано комплект, що містить комбінацію кандесартану або його фармацевтично прийнятної солі, та розувас-татину або його фармацевтично прийнятної солі, як варіант, з інструкціями для застосування у попередженні або лікуванні атеросклерозу. Згідно з наступним аспектом заявленого винаходу запропоновано комплект, що містить: a) кандесартан у формі першої одиничної дози; b) розувастатин у формі другої одиничної дози; та c) упаковку, що містить вказані першу та другу форми доз; та, як варіант, d) з інструкціями для застосування у попередженні або лікуванні атеросклерозу. Згідно з ще одним аспектом заявленого винаходу запропоновано спосіб інгібування експресії CD40 та/або металопротеїназ (MMP) застосуванням комбінації кандесартану або його фармацевтично прийнятної солі, та розувастатину або його фармацевтично прийнятної солі. Конкретними металопротеїназами є ММР-1, ММР-2 та ММР-9. Згідно з ще одним аспектом заявленого винаходу запропоновано спосіб лікування атеросклеротичних пацієнтів інгібуванням експресії CD40 та/або металопротеїназ (MMP) застосуванням кількість комбінації кандесартану або його фармацевтично прийнятної солі, та розувастатину або його фармацевтично прийнятної солі, придатної для інгібування експресії CD40 та/або металопротеїназ (ММР). Згідно з наступним аспектом винаходу, запропоновано спосіб нормалізування балансу між MMP та TIMP застосуванням кількості комбінації кандесартану або його фармацевтично прийнятної солі, та розувастатину або його фармацевтично прийнятної солі. 90249 8 Згідно з ще одним аспектом заявленого винаходу запропоновано спосіб інгібування експресії LOX-1 застосуванням комбінації кандесартану або його фармацевтично прийнятної солі, та розувастатину або його фармацевтично прийнятної солі. Згідно з ще одним аспектом заявленого винаходу запропоновано спосіб лікування атеросклеротичних пацієнтів інгібуванням експресії LОX-1 застосуванням кількості комбінації кандесартану або його фармацевтично прийнятної солі, та розувастатину або його фармацевтично прийнятної солі, придатної для інгібування експресії LOX-1. Матеріали та способи Тваринна модель П'ять пар мишей C57BL/6J та три пари гомозиготних нокаутних мишей аро-Е (на фоні C57BL/6J) були отримані від Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Братів та сестер парували та поміщали у кімнату, освітлену з 6:00 ранку до 6:00 вечора та тримали при 21°С. Мишей C57BL/6J (n=10) залишали на регулярній дієті протягом усього періоду дослідження. Аро-Е нокаутних мишей поділяли на чотири групи. Групі 1 (n=10) тварин давали високохолестеринову дієту (1% холестерин) єдино протягом 12 тижнів з віку 6 тижнів; Групі 2 (n=10) тварин давали високо-холестеринову дієту з кандесартаном (1 мг/кг/доб) протягом 12 тижнів з віку 6 тижнів; Групі 3 (n=10) тварин давали високохолестеринову дієту з розувастатином (1 мг/кг/доб) протягом 12 тижнів з віку 6 тижнів; Групі 4 (n=10) тварин давали високо-холестеринову дієту з кандесартаном (1 мг/кг/доб) та розувастатином (1 мг/кг/доб) протягом 12 тижнів з віку 6 тижнів. У кінці 12-тижневого лікування мишей вбивали та досліджували як описано нижче. Усі експериментальні способи проводили за протоколами Institutional Animal Care та Usage Committee of University of Arkansas for Medical Sciences. Кількісний аналіз атеросклеротичних бляшок У кінці 12-тижневого лікування по 5 мишей від кожної групи вбивали та аорти відокремлювали від оточуючих тканин. Після видалення адвентиціальної жирової тканини, аорти відкривали вздовж від дуги аорти до здухвинного роздвоєння, та фіксували у 10% формаліні протягом 24 годин. Тоді аорти швидко промивали у 70% спирті, фарбували розчином Судану IV протягом 15 хвилин, диференціювали у 80% спирті протягом 20 хвилин та промивали у проточній воді протягом 1 години (Russell L. Techniques for studying atherosclerotic lesion, Lab Invest. 1958; 7:42-47). Аорти закріпляли та їх зображення отримували камерою, з'єднаною з дисекційним мікроскопом. Зображення аналізували програмою (Image Pro Plus, Media Cybernetics). Отримання PHK та аналіз RT-PCR У кінці 12-тижневого лікування по 5 мишей з кожної групи вбивали та аорти (від дуги аорти до здухвинного роздвоєння) відокремлювали від оточуючих тканин та зберігали на сухому льоді. Кожну аорту розрізали на чотири сегменти, два з яких застосовували для екстракції загальної PHK одноетапним способом сумішшю кислота-гуанідинтіоціанат-фенол-хлороформ як описано раніше (27). Один мікрограм загальної PHK зворотно транскриптували у кДНК з оліго-dT (Promega, Madison, 9 Wl, U.S.A.) та мишачим вірусом лейкемії Maloney (M-MLV) зворотної транскрипції (Promega) при 42°С протягом 1 години. Два мікролітри матеріалу від зворотної транскрипції (RT) ампліфікували з ДНК-полімеразою Taq (Promega) та парою праймерів, специфічних стосовно мишачих LOX-1, CD40 або MMP (ММР-1, -2, -9). Для мишачого LOX-1 застосовували передній праймер: 5'TTACTCTCCATGGTGGTGCC-3', зворотний праймер: 5'-AGCTTCTTCTGCTTGTTGCC-3'. 30 циклів полімеразної ланцюгової реакції (PCR) проводили при 94°С протягом 40 с (виродження), 55 C протягом 1 хвилин (гібридизація), та 72°С протягом 1 хвилин (поширення). Розмір продукту полімеразної ланцюгової реакції (PCR) був 193 пари основ. Для мишачого CD40 застосовували передній праймер 5'-GTTTAAAGTCCCGGATGCGA-3' та зворотний праймер 5'CTCAAGGCTATGCTGTCTGT-3'. 35 циклів полімеразної ланцюгової реакції (PCR) проводили при 94°С протягом 1 хвилин (виродження), 55°С протягом 1 хвилин (гібридизація), та 72°С протягом 1 хвилин (поширення). Розмір продукту PCR був 408 пар основ. Для мишачого ММР-1 застосовували передній праймер 5'GGACTCTCCCATTCTTAATGA Т-3' та зворотний праймер 5'-CCTCTTTCTGGATAACATCATCAАС-3'. Для мишачого ММР-2 застосовували передній праймер 5'-ATCAAGGGGATCCAGGAGC-3' та зворотний праймер 5'-GCAGCGATGAAGATGATAG-3'. Для мишачого ММР-9 застосовували передній праймер 5'-AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-3' та зворотний праймер 5'TACATGAGCGCTTCCGGCAC-3'. Для усіх MMP 35 циклів PCR проводили при 94°С протягом 1 хвилин (виродження), 58°С протягом 1 хвилини (гібридизація), та 75°С протягом 1 хвилини (поширення). Розміри продуктів PCR були 627, 718 та 753 пар основ, відповідно. Праймерну пару, специфічну стосовно мишачого р-актину, застосовували як службовий ген (передній праймер: 5'TTCTACAATGAGCTGCGTTG-3', зворотний праймер: 5'-CACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3'). 30 циклів застосовували при 94°С протягом 30 с (виродження), 55°С протягом 1 хвилин (гібридизація), та 72°С протягом 1 хвилин (поширення). Розмір продукту PCR був 560 пар основ. Ампліфікований зворотною транскрипцією PCR (RT-PCR) зразок візуалізовали на 1.5% агаровому гелі, застосовуючи етидій бромід. Отримання білку та аналіз Вестернблотуванням Кожну мишачу аорту розрізали на чотири сегменти. Два з них застосовували для екстракції PHK, а залишкові два застосовували для екстракції білку, як описано раніше (14). Коротше, тканини аорт гомогенізували та лізували у лізисному буфері, тоді центрифугували при 4000 об/хв протягом 10 хвилин при 4°С. Білки лізату від аорти (20 мкг/смугу) відокремлювали за допомогою 10% SDS-PAGE1 та переносили на нітроцелюлозні мембрани. Після інкубації у блокувальному розчині (5% нежирне молоко, Sigma), мембрани інкубували з 1:750 розбавленням моноклонального антитіла до мишачого LOX-1, 1:500 розбавленням 90249 10 поліклонального антитіла до мишачого CD40 (Santa Cruz), 1 мкг/мл розбавленням моноклонального антитіла до мишачого ММР-1 (Oncogene), 1 мкг/мл розбавленням моноклонального антитіла до мишачого ММР-2 (Oncogene), 1 мкг/мл розбавленням моноклонального антитіла до мишачого ММР-9 (Oncogene), 1:500 розбавленням поліклонального антитіла до мишачого ТІМР-1 (Santa Cruz), 1:500 розбавленням поліклонального антитіла до мишачого ТІМР-2 (Santa Cruz), або 1:5000 розбавленням моноклонального антитіла до мишачого Рактину (Sigma) протягом ночі при 4°С. Мембрани промивали та тоді інкубували з 1:5000 розбавленням специфічного вторинного антитіла (Amersham Life Science) протягом 2 годин при кімнатній температурі та мембрани промивали та детектували системою ECL (Amersham Life Science). Відносні інтенсивності смуг білку аналізували програмою Scan-gel-it (Li DY1 Zhang YC1 Sawamura Т, Mehta JL Circ Res. 1999; 84:1043-1049). Дані аналізу Усі дані представляють значення дубльованих зразків. Дані представляють як значення ± CB. Статистичну значимість визначали множинним порівнянням серед незалежної групи даних, у котрих ANOVA та тест F показали значні різниці. Величину P