Композиція вакцини для свиней, спосіб та набір для вакцинації

1. Вакцина для свиней, що містить плазміду(плазміди), яка (які) включає (ють) і забезпечує(ють) експресію in vivo в клітинах свині-хазяїна послідовності (послідовностей) нуклеїнової кислоти вірусу хвороби Aujeszky, що кодує(ють) білок (білки), вибраний(ні) з групи, що складається з gB, gD та gВ і gD, і фармацевтично прийнятний носій. 2. Вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що плазміда включає послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують як gВ, так і gD білки. 3. Вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що плазміда включає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок gВ. 4. Вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що плазміда включає послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок gD. C2 2 UA 1 3 77935 4 Загального поширення набуло інтенсивне розвеWO-A-9421997 і WO-A-9520660 описане викорисдення в закритому просторі, і як наслідок, драматання нещодавно розробленої технології полінуктичний розвиток респіраторних патологій. леотидних вакцин. Відомо, що в цих вакцинах виСимптоми респіраторних патологій свиней користовують плазміду, що забезпечує в клітинах звичайно об'єднують під комплексною назвою рехазяїна експресію вбудованого антигена. Були спіраторного захворювання свиней, із чого виплизапропоновані всі шляхи введення (внутрішньоває велика різноманітність патогенних агентів, що брюшинний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовключають як віруси, так і бактерії і мікоплазми. вий, підшкірний, внутрішньошкірний, через слизову Головними агентами, що викликають респіраторні і т.д.). Також можуть бути використані різні засоби порушення, є Actinobacillus pleuropneumoniae, вівакцинації, такі як ДНК, що вміщена на поверхню рус безплідності і респіраторного синдрому часток золота і разпорошується таким чином, що (PRRS), що також називають вірусом таємничої вона проникає в шкіру тварини [Tang і ін., Nature хвороби, вір ус хвороби Aujeszky (PR V) і вірус гри356, 152-154, 1992], і рідиннострумінні упорскувачі, пу свиней. що дозволяють здійснити трансфекцію одночасно Інші віруси викликають порушення репродукв шкіру, у м'язи, у жирові тканини і у тканині молотивної функції, що виявляються у виді викиднів, чної залози [Furth і ін.. Analytical Biochemistry, 205. муміфікації зародків і безплідності. Основними з 365-368, 1992]. таких вірусів є PRRS, парвовірус і вірус класичної У полінуклеотидних вакцинах можна викорисчуми свиней (HCV). Крім того, такі порушення мотовувати як неодягнені ДНК. так і ДНК, наприклад, жуть викликати віруси PRV, грипу свиней і A. у складі ліпосом і катіонних ліпідів. Pleuropneumoniae. Смертність можлива у випадку [M-F Le Potier і ін. (Second International A. Pleuropneumoniae, HCV і PR V. Symposium on the Eradication of AujeszkyS Disease Крім цього, у респіраторному комплексі свиней (pseudo rabies) Virus August 6th tu 8th 1995 дуже важливе значення мають взаємодії між мікCopenhagen, Denmark) і Μ. Monteil і ін (Наукові дні роорганізмами. Дійсно, велика частина патогенних Кафедри Патології тварин. INRA-ENV. Ліонськая бактерій складає звичайну мікрофлору носоглотДержавна Ветеренарна школа. 13-14 грудня 1994. кових зон і мигдалин молодої тварини. Ці патогени Ліон, Франція)] здійснили спробу вакцинації свиней виділяються свиноматкою і часто вдихаються попроти вірусу хвороби Aujeszky за допомогою пларосятами в перші години життя, коли колостральзміди. що забезпечує експресію гена gD під контний імунітет ще не ефективний. Організми, що ролем сильного промотору, пізнього мажорного живуть у верхніх відділах ди хальних шляхів мопромотору аденовірусу типу 2. Незважаючи на жуть поширюватися в нижні відділи, якщо захисні хороший рівень антитільної відповіді, не було вимеханізми дихальної системи ослаблені впливом явлено встановлення захисту. Однак, гарні репопереднього агента, такого як Actinobacillus зультати у відношенні захисту були зафіксовані pleuropneumoniae або віруси. Інвазія в легені може після зараження свиней рекомбінантним аденовібути дуже швидкою, зокрема, якщо попередніми русом, в який був вбудований ген gD і той же пропатогенами є такі, як Actinobacillus мотор, що доводить, що наявність глікопротеїну pleuropneumoniae, що виділяють сильні цитотокgD достатньо для встановлення захисту у свиней. сини, здатні викликати ушкодження війок клітин Практика минулого не дала ніяких результатів дихального епітелію і альвеолярних макрофагів. у відношенні встановлення захисту у свиней метоВажливі вірусні інфекції, такі як грип, респірадом полінуклеотидної вакцинації. торні коронавірусні інфекції і вірус Aujeszky, моЗавданням винаходу є розробка формули пожуть відігравати роль у патогенезі респіраторного лівалентної вакцини, що дозволяє здійснити ваккомплексу разом із бактеріями респіраторного цинацію свиней проти певного числа патогенних тропізму і мікроплазмами. агентів, що викликають, зокрема, респіраторні паНарешті, деякі агенти впливають одночасно на тології і/ або патології репродукції. Іншою метою дихальну і на репродуктивну системи. Також мовинаходу є розробка такої формули вакцини, що жуть відбутися взаємодії в плані патології репросполучить різні валентності, при збереженні всіх дукції. Необхідно, отже, подбати про налагодженнеобхідних критеріїв сумісності і стабільності ваня ефективних превентивних методів проти лентностей. головних патогенних агентів, що викликають ресІншою метою винаходу є розробка такої форпіраторні патології репродукції свиней. мули вакцини, що дозволяє сполучити різні валенСполучення, які розроблені до цього часу, бутності в одному носії. Іншою метою винаходу є ли одержані на основі інактивованих вакцин або розробка такої формули вакцини, яка була б просживих вакцин і, у деяких випадках, сумішей таких тір в застосуванні і не була б дорогою. вакцин. При їхньому застосуванні виникають проЩе одною метою винаходу є розробка формублем сумісності валентностей і стабільності. Так, ли вакцини і методики вакцинації свиней, яка допотрібно забезпечити одночасно сумісність різних зволяє домогтися встановлення високоефективновалентностей вакцини, як по відношенню різних го довгострокового захисту, у т.ч. полівалентного, антигенів, що використовуються, так і по віднопри нешкідливості і відсутності відходів. Таким шенню самих сумішей, зокрема, якщо використочином, об'єктом винаходу є формула вакцини, вують разом інактивовані вакцини і живі вакцини. зокрема, проти респіраторних патологій і/ або паТакож виникає проблема зберігання таких комбітологій репродукції свиней, що включає щонайменованих вакцин і їхньої нешкідливості, зокрема, у нше 3 валентності полінуклеотидної вакцини, кожприсутності добавок. Ці вакцини звичайно досить на з яких включає плазміду, що містить і дорогі. У заявках WO-A-9011092, WO-A-9319183, (забезпечує його експресію in vivo в клітинах хазя 5 77935 6 їна) ген однієї валентності патогена свиней, прирусу грипу, зокрема, штамів, що зустрічаються в чому ці валентності обирають із групи, представданій місцевості. На відміну від цього, NP забезпеленої вірусом хвороби Aujeszky (вірус PR V або чує перехресний захист і, отже, можна обмежитися псевдосказу ι вірусом грипу свиней (SIV), вірусом використанням послідовності одного єдиного штатаємничої хвороби свиней (вірус PRRS), вірусом му вірусу. парвовірозу (вірус PR V), вір усом класичної чуми У відношенні валентності PRRS використовусвиней (вірус HCV або Hog Cholera virus) і бактеріють, переважно, гени Ε і ORF3 або, також, М. Моєю, що викликає актинобацильоз (A. жна використовувати ці гени окремо або в комбіpleuropneumoniae), а плазміди містять для кожної нації; у випадку комбінації, гени можна валентності один або декілька генів, обраних із вбудовувати в окремі плазміди або в плазміди, що групи, поданої gB і gD для вірусу хвороби комбінують два або три з цих генів. Вигідно викоAujeszky, НА, NP, N для вірусу грипу свиней, ORFS ристовувати в одній вакцині гени, що походять від (Е) , ORF3, ORF 6 (М) для вірусу PRRS, VP2 для принаймні двох штамів, зокрема, від одного євровірусу парвовірозу. Е1, Е2 для вірусу класичної пейського штаму і від одного американського штачуми свиней і архІ, арІІ і архІІІ для A. му. pleuropneumoniae. У відношенні валентності класичної чуми свиПід валентністю в рамках цього винаходу роней можна використовува ти один із генів Е1 і Е2 зуміють щонайменше один антиген, шо забезпечує або гени Е1 і Е2 разом. В двох різних плазмідах захист проти вірусу розглянутого патогена, причоабо, можливо, в одній плазміді. У відношенні ваму валентність може містити в якості підвалентнолентності актинобацильозу, можна використовувасті один або декілька змінених природних генів ти один із трьох вище названих генів або комбінаодного або декількох штамів розглянутого патогецію 2 або 3 із цих генів, у різних плазмідах або в на. Під геном патогенного агенту розуміють не складі змішаних плазмід, щоб забезпечити захист тільки повний ген, але і різні нуклеотидні послідовпроти різних серотипів A. Pleuropheumoniae. В ності, включаючи фрагменти, що зберігають здатантигенах арх І, II і III можна змінити кодуючі поність індукувати захисну відповідь. слідовності, щоб одержати нетоксичні антигени, У поняття гена входять нуклеотидні послідовзокрема, як зазначено в прикладах. ності, еквівалентні в точності описаним у приклаОб'єм дози формули вакцини за винаходом дах, тобто різні, але не кодуючі один і той самий може складати, у цілому, від 0,1 до 10мл, і зокрепротеїн послідовності. У нього також входять нукма, від 1 до 5мл для вакцинації при внутрішньолеотидні послідовності інших штамів розглянутого м'язовому введенні. патогена, що забезпечують перехресний захист Доза складає від 10нг до 1мг, краще, від 100нг або специфічний захист від штаму або гр упи штадо 500мкг, ще краще - від 1мкг до 250мкг на кожмів. В нього також входять нуклеотидні послідовний тип плазміди. ності, що були змінені для полегшення експресії in Використовують, краще, неодягнені плазміди, vi vo в організмі тваринного хазяїна, але кодуючі просто вміщені у вакцинуючий носій, яким звичайтой же протеїн. но є фізіологічний розчин (0,9% NaCI), ультрачисКраще, формула вакцини за винаходом вклюта вода, буфер ТЕ і т.п. Можна використовувати, чає валентності Aujeszky і грипу свиней до яких зрозуміло, будь-які форми полінуклеотидних вакможуть бути додані інші валентності, обрані, перецин, описані в практиці минулого. важно, із валентностей PRRS і A. Кожна плазміда містить промотор, здатний заpleuropneumoniae (актинобацильоз). Можна додабезпечити експресію залежного від нього гена в ти інші валентності, обрані ι валентностей парвоклітинах хазяїна. Таким промотором є сильний вірозу і класичної чуми свиней. еукаріотичний промотор, і зокрема, ранній промоМожливі, зрозуміло, усі комбінації валентностор цитомегаловірусу C MV-IE, що походить від тей. Однак, у рамках винаходу, перевагу віддають людини або миші, або, можливо, від іншої тваривалентностям Aujeszky і грипу свиней, вірусу ни, такої як пацюк, свиня, морська свинка. PRRS і A. Pleuropheumoniae. Для вакцинації, Загалом, промотор може бути як вірусного, так спрямованої більш конкретно проти респіраторних і клітинного походження. У якості вірусного промопатологій у свиней, перевагу при виборі валентнотора можна назвати ранній або пізній промотор стей віддають Aujeszky, грипу свиней, PRRS і аквірусу SV 40 або промотор LTR вірусу Саркоми тинобацильозу. Руса. Це може бути також промотор вірусу, від Для вакцинації, спрямованої конкретно проти якою походить ген. наприклад, власний промотор патологій репродукції, валентності вибирають, гена. переважно, із PRRS, парвовірозу, класичної чуми У якості клітинного промотору можна назвати свиней і Aujeszky. У відношенні валентності промотор гена цитоскелету, наприклад, промотор Aujeszky можна використовувати один із генів gB і десміну [Bolmont і ін., Journal of Submicroscopic gD. Краще, використовують обидва гени, які у Cytology and Patholigy, 1990, 22. 117-122; і цьому випадку, вбудовують у різні плазміди або в ZHENLIN і ін.. GENE, 1989, 78, 243-254] або проодну плазміду. мотор актину. Якщо одна плазміда містить декільУ відношенні валентності грипу свиней, викока генів, вони можуть знаходитися в одній одиниці ристовують, переважно, гени НА і NP. Можна витранскрипції або в двох різних одиницях. Комбінакористовувати один із цих дво х генів або обидва ція різних валентностей вакцини за винаходом гени одночасно, вбудовані в різні плазміди або в може бути отримана, переважно, змішуванням одну плазміду. Переважно, в одній вакцині сполуполінуклеотидних. плазмід, що забезпечують ексчають послідовності НА більше одного штаму віпресію одного або декількох антигенів кожної ва 7 77935 8 лентності. але можна також здійснити експресію цію внутрішньошкірним шляхом за допомогою антигенів декількох валентностей за допомогою рідкострумінного, краще, багатострумінного упорсоднієї плазміди. кувача, і зокрема, упорскувача 5 упорскуючою наЩе одним об'єктом винаходу є формули односадкою, що має декілька отворів, зокрема, від 5 до валентної вакцини, що включають одну або декі6 отворів, як в апарат і Pigjet що випускається лька плазмід, що кодують один або декілька генів компанією Endoscoptic, Laons, Франція. Об'єм дози одного з вірусів, обраних із групи, поданої PRV, при використанні такого апарату складає, переваPRRS, PPV, HCV і A. Pleuropneumoniae, причому жно, від 0,1 до 0,9мл, зокрема, від 0б2 до 0,6мл, гени такі, як описано вище. За винятком одновакраще, від 0,4 до 0,5мл, причому даний об'єм молентного характеру, ці формули можуть мати виже бути введений за один або декілька разів, пеще перераховані характеристики в тому, що стореважно, за два рази. сується вибору генів, їхніх комбінацій, композицій Нарешті, об'єктом винаходу є методика вакциплазмід, об'ємів доз, доз і т.д. Формули одноваленації, що полягає в тому, що проводять первинну нтної вакцини можуть бути використані (і) для одевакцинацію, як вона описана вище і вторинну вакржання формули полівалентної вакцини, як вона цинацію формулою вакцини за винаходом. Відпоописана вище, (іі) в індивідуальному порядку, провідно до кращої форми здійснення способу за вити конкретної патології, (ііі) в сполученні з вакцинаходом, спочатку тварині вводять ефективну ною іншого типу (суцільної живої або інактивовадозу вакцини класичного типу, зокрема, інактивоної, рекомбінантної, субодиничної), проти іншої вану, живу, ослаблену або рекомбінантну, або патології або (iv) у якості вторинної вакцини після субодиничну вакцину таким чином, щоб забезпевакцини, описаної нижче Дійсно, ще одним об'єкчити первинну вакцинацію, і, через, переважно, 2-6 том цього винаходу є використання однієї або детижнів, вводять полівалентну або одновалентну кількох плазмід за винаходом для одержання ваквакцину за винаходом. цини, призначеної для вакцинації свиней, Винахід також стосується методики одержання первинновакцинованих за допомогою першої, звиформул вакцини, а саме, до одержання валентночайної, вакцини з числа тих, що використовувалистей і їхніх сумішей, як випливає з даного опису. ся в практиці минулого, а саме, обраної з групи, Далі іде більш детальний опис винаходу за представленої цілісною живою вакциною, цілісною допомогою способів здійснення винаходу з посиінактивованою вакциною, субодиничною вакциною ланням на малюнки додатку. рекомбінантною вакциною, причому ця перша вакФігура №1: Плазміда pVR1012 цина (одновалентна або полівалентна· несе (тобто Фігура №2: Послідовність гена PRV gB (штам містить або забезпечує його експресію) один або NIA3) декілька антигенів, що кодуються однією або декіФігура №3: Констр укція плазміди рАВ090 лькома використовуваними плазмідами, або антиФігура №4: Послідовність гена PRV g (штам генів, що забезпечують перехресний захист. ЗаNIA3) слуговує на увагу той факт, що полінуклеотидна Фігура №5: Констр укція плазміди рРВ098 вакцина спричиняє сильну дію в якості вторинної Фігура №6: Послідовність гена грип свиней НА вакцини, що виявляється в посилені імунної відпо(штам Н1 N1) віді і у встановленні довгострокового імунітету. Фігура №7: Констр укція плазміди рРВ143 В цілому, вакцини для первинної вакцинації Фігура №8: Послідовність гена грип свиней NP можуть бути обрані з числа вакцин, запропонова(штам Н1 N1) них для продажу різними виробниками ветеринарФігура №9: Констр укція плазміди рРВ142 них вакцин. Ще одним об'єктом винаходу є набір Фігура №10: Послідовність гена грип свиней для вакцинації, у який входять вакцина для перНА (штам Н3 N2) винної вакцинації, як вона описана вище, і формуФігура №11: Конструкція плазміди рРВ144 ла вакцини за винаходом для використання в якоФігура №12: Послідовність гена грип свиней сті вторинної вакцини. Винахід також стосується NP (штам Н3 N2) формули вакцини за винаходом з прикладеною до Фігура №13: Конструкція плазміди рРВ132 неї інструкцією, у якій зазначене використання цієї Фігура №14: Плазміда рАВ025 формули для вторинної вакцинації після первинної Фігура №15: Плазміда рАВ001 вакцинації як вона описана вище. Фігура №16: Плазміда рАВ091 Також об'єктом цього винаходу є методика ваФігура №17: Плазміда рАВ092 кцинації свиней проти респіраторних патологій і/ Фігура №18: Плазміда рАВ004 або репродукції свиней, що включає введення Фігура №19: Плазміда рАВ069 ефективної дози формули вакцини як вона описаФігура №20: Плазміда рАВ061 на вище. Ця методика вакцинації включає введенФігура №21: Плазміда рРВ162 ня однієї або декількох доз формули вакцини, приФігура №22: Плазміда рРВ163 чому ці дози можуть бути введені послідовно Фігура №23: Плазміда рРВ174 через короткі проміжки часу і/ або послідовно чеФігура №24: Плазміда рРВ189 рез тривалі проміжки часу. Фігура №25: Плазміда рРВ190 Формули вакцини за винаходом можуть бути Список послідовностей SEO ID No введені, у рамках даної методики вакцинації, різSEQ ID №1: Послідовність гена PRV gB (штам ними шляхами введення, запропонованими в NIA3) практиці минулого для полінуклеотидної вакцинаSEQ ID №2: Олігонуклеотид АВ166 ції, і за допомогою будь-якої відомої техніки ввеSEQ ID №3: Олігонуклеотид АВ167 дення. Зокрема, можна використовувати вакцинаSEQ ID №4: Олігонуклеотид АВ168 9 77935 10 SEQ ID №5: Олігонуклеотид АВ169 вують як описано A.Rycroft і ін. [J Gen. Microbiol. SEQ ID №6: Послідовність гена PRV gD (штам 1991, 137, 561-568]. ДНК із великою молекулярною NIA3) масою (хромосомна ДНК) була отримана за станSEQ ID №7: Олігонуклеотид РВ101 дартними технологіями, описаними J.Sambrook і SEQ ID №8: Олігонуклеотид РВ102 ін. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2 виSEQ ID №9: Олігонуклеотид рВ107 дання. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring SEQ ID №10: Олігон уклеотид РВ108 Harbor .New York. 1989]. SEQ ID №11: Послідовність гена грип свиней Приклад 3: Екстракція геномних вірусни х ДНК НА (штам H1N1) Після культивування, збирають зруйновані кліSEQ ID №12: Олігон уклеотид РВ097 тки і їхні плаваючі на поверхи уламки, вірусну суSEQ ID №13: Олігон уклеотид РВ098 спензію центрифугують при 1000g і +4°С протягом SEQ ID №14: Послідовність гена грип свиней 10 хвилин, щоб видалити уламки клітин. Вірусні NP (штам Η1Ν1) частинки осаджують ультрацентрифугуванням при SEQ ID №15: Олігон уклеотид РВ095 400000g і +4°С протягом 1 години. Осад збирають SEQ ID №16: Олігон уклеотид РВ096 у мінімальному об'ємі буфер у (Tris 10мМ, EDTA SEQ ID №17: Послідовність гена грип свиней 1мМ; рН 8,0). Цю концентровану вірусну суспензію НА (штам H3N2) обробляють протеїназою К (100мкг/мл кінц.) в приSEQ ID №18: Послідовність гена грип свиней сутності натрійдодецілсульфату (SDS) (0,5% кінц.) NP (штам H3N2) протягом 2 годин при 37°С. Потім вірусну ДНК ексSEQ ID №19: Олігон уклеотид АВ055 трагують сумішшю фенол/ хлороформ, потім преSEQ ID №20: Олігон уклеотид АВ056 ципітують 2 об'ємами абсолютного етанолу. Через SEQ ID №21: Олігон уклеотид АВ001 ніч при -20°С, ДНК центрифугують при 10000g і SEQ ID №22: Олігон уклеотид АВ002 +4°С протягом 15 хвилин. Осаджену ДНК висушуSEQ ID №23: Олігон уклеотид АВ170 ють, потім збирають у мінімальному об'ємі стериSEQ ID №24: Олігон уклеотид АВ171 льної ультрачистої води. Після цього вона може SEQ ID №25: Олігон уклеотид АВ172 бути розщеплена рестрикційними ферментами. SEQ ID №26: Олігон уклеотид АВ173 Приклад 4: Ізолювання геномних вірусни х РНК SEQ ID №27: Олігон уклеотид АВ007 Віруси, що містять РНК, очищали за добре віSEQ ID №28: Олігон уклеотид АВО10 домими фахівцям технологіями. Потім ізолювали SEQ ID №29: Олігон уклеотид АВ126 РНК геному кожного вірусу, використовуючи те хніSEQ ID №30: Олігон уклеотид АВ127 ку екстракції «тіоціонат гуаніSEQ ID №31: Олигон уклеотид АВ118 дію/фенолхлороформ», що описана SEQ ID №32: Олігон уклеотид АВ119 [P.Chomczynski і N.Sacchi (Anal.Biochem. 1987, SEQ ID №33: Олігон уклеотид РВ174 162, 156-159]. SEQ ID №34: Олігон уклеотид РВ189 Приклад 5: Технології молекулярної біології SEQ ID №35: Олігон уклеотид РВ190 Всі плазмідні конструкції були отримані з викоSEQ ID №36: Олігон уклеотид РВ175 ристанням стандартних те хнологій молекулярної SEQ ID №37: Олігон уклеотид РВ176 біології, описаних [J. Sambrook і ін. (Molecular SEQ ID №38: Олігон уклеотид РВ191 Cloning: A Laboratory Manual. 2 видання. Cold SEQ ID №39: Олігон уклеотид РВ192 Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor New SEQ ID №40: Олігон уклеотид РВ177 York. 1989)]. Усі рестрикцiйні фрагменти, що були SEQ ID №41: Олігон уклеотид РВ278 використані в цьому винаході, ізолювали, викорисSEQ ID №42: Олігон уклеотид РВ279 товуючи набір Gene-clean (BIO 101 Inc. La Jolla. SEQ ID №43: Олігон уклеотид РВ280 CA). SEQ ID №44: Олігон уклеотид РВ307 Приклад 6: Технологія RT-PCR SEQ ID №45: Олігон уклеотид РВ303 Специфічні олігонуклеотиди ( що містять на SEQ ID №46: Олігон уклеотид РВ306 своїх 5'кінцях сайти рестрикції для полегшення SEQ ID №47: Олігон уклеотид РВ304 клонування розширених фрагментів) були синтеSEQ ID №48: Олігон уклеотид РВ305 зовані таким чином, що вони цілком охоплюють Приклади кодуючі ділянки генів, які повинні бути розширені Приклад 1: Культура вір усів (див. Специфічні приклади). Реакцію зворотної Віруси культивують на відповідній системі клітранскрипції (RT) і розширення в ланцюзі поліметин до прояву цитопатичного ефекту. Системи разою (PCR) проводили за стандартними технолоклітин, що використовуються для кожного вірусу, гіями [J. Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory добре відомі фахівцям. Коротко кажучи, клітини, Manual. 2 видання. Cold Spring Harbor Laboratory. чутливі до використаного вірусу, що культивуютьCold Spring Harbor . New York. 1989)]. Кожну реакся в мінімальному необхідному середовищі Ігла цію RT-PCR проводили з парою специфічних амп(середовище «MEM») або в іншому відповідному лімерів, використовуючи в якості матриці екстрасередовищі, заражають досліджуваним вірусним говану геномну вірусну РНК. Розширену штамом, використовуючи множинність зараження комплементарну ДНК екстрагували сумішшю фе1. Інфіковані клітини інкубують при 37°С протягом нол/хлороформ/ізоаміловий спирт (25:24:1) перед часу, що необхідний для прояву повного цитопарозщепленням рестрикційнними ферментами. тичного ефекту ( у середньому 36 годин). Приклад 7: Плазміда pVR1012 Приклад 2: Культура бактерій і екстракція бакПлазміда pVR1012 (Фігура №1) була отримана теріальної ДНК при Vical Inc. San Diedo, CA. USA. Її конструкція Штами Actinobacillus pleuropneumoniae культибула описана в [J.Hartikka і ін. (Human Gene 11 77935 12 Therapy. 1996, 7, 1205-1217)]. ми: Приклад 8: Конструювання плазміди рАВ090 РВ107 (32mer) (SEQ ID №9) (ген PRV gB) 5"GTTCTGC AGC ACCCGGGAGC AAAAGC AGGGGA Плазміду pPR 2.15 [M.Riviere і ін. J.Virol. 1992. 3' 66. 3424-3434] розщепили за допомогою Араl і PB108 (33 mer) (SEQ ID №10) Nael, щоб визволити фрагмент Apal-Nael (2665 pb) 5'ATTGCGGCCGCTAGTAGAAAC AAGGGTGTTTTT (фрагмент А), що містить ген, кодуючий глікопро3' теїн gB вірусу хвороби Aujeszky (Штам NIA3) (Фігущоб точно ізолювати ген, який кодує протеїн ра №2 i SEQ ID No 1). НА вір усу SIV HINI (фігура №6 і SEQ ID N 11), у Гібридизацією наступних 2 олігонуклеотидів: формі фрагменту PCR (1803 pb). Після очищення, АВ166 (33 mer) (SEQ ID №2) цей фрагмент зшили з вектором PCRII-прямої (Ін5'GATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGGCGCG вітроген №К2000-01), щоб одержати вектор GGCC 3' рРВ137 (5755 pb). Вектор рРВ137 розщепили за АВ167 (33 mer) (SEQ ID №3) допомогою EcoRV і NotI, щоб визволити фрагмент 5'ACGTCTACGGGCGACCACCGCCAGAAACC EcoRV-Notl (1820 pb), що містить ген НА. Потім GCGC 3' цей фрагмент зшили з вектором PVR1012 (прифрагмент (33 pb), що містить послідовність геклад 7), попередньо розщепленим за допомогою на gD, від ініціального кодону ATG до сайта АраI, EcoRVh NotI, і одержали плазміду рРВ 143 (6726 був перетворений з утворенням сайта PstI на 5' pb) (фігура №7). (фрагмент В). Приклад 11: Конструювання плазміди рРВ142 Гібрідізацією наступних 2 олігонуклеотидів: (ген Грипу свиней NP штам H1N1) АВ168 (45 mer) (SEQ ID №4) За технологією з прикладу 6 провели реакцію. 5'GGCACTACC AGCGCCTCGAGAGCGAGGAC RT-PCR із РНК геному вірусу грипу свиней (штам CCCGACGCCCTGTAGG 3' S1Y HIM «SW»), отриманої за технологією, описаAB169 (49 mer) (SEQ ID №5) ною в прикладі 4, і такими олігонуклеотидами: 5'GATCCCTAC AGGGCGTCGGGGTCCTCGCT PS097 (36 mer) (SEQ ID №12) CTCGAGGCGCTGGTAGTGCC 3' 5'CCGGTCGACCGGGATAATC ACTC ACTGAGTGA фрагмент (45 pb), що містить послідовність геCATC 3' на gD. від сайта Nael до стопуючого кодона TAG PB098 (33 mer) (SEQ ID №13) був перетворений з утворенням сайта BamHI на 3' 5’TTGCGGCCGCTGTAGAAAC AAGGGTATTTTTCT (фрагмент С). Фрагменти А, В і С разом зшили з 3’ вектором pVR1012 (приклад 7. попередньо розщещоб точно ізолювати ген, який кодує протеїн пленим за допомогою PstI і BamHI, і одержали NP SIV HINI (фігура №8 SEQ ID №14), у формі плазміду рАВ090 (7603 pb) (Фігура №3). фрагменту Sall-Notl. Після очищення, продукт RTПриклад 9: Конструювання плазміди рРВ098 PCR (1566 pb) зшили з вектором PCRII-прямої (ген PRV gD) (Інвітроген №К2000-01), щоб одержати вектор Плазміду pPR29 [M.Riviere і ін. J.Virol. 1992, 66, рРВ127 (5519 pb) Вектор рРВ127 розщепили за 3424-3434] розщепили за допомогою Sall і BgIII, допомогою Sall і NotI, щоб визволити фрагмент щоб визволити фрагмент Sall-BgIII (711 pb) (фрагSall-Notf (1560 pb), що містить ген NP. мент А), що містить 3'-кінець гена, що кодує глікоПотім цей фрагмент зшили з вектором протеїн gD вірусу хвороби Aujeszky (Штам NIA3) pVB.1012 (приклад 7), попередньо розщепленим (Фігура №4 і SEQ ID No 6). за допомогою Sall і NotI. і одержали плазміду Плазміду pPR29 розщепили за допомогою рРВ142 (6451 pb) (фігура №9) Есо47III і Sall, щоб визволити фрагмент Eco47IIIПриклад 12: Конструювання плазміди рРВ144 SaII (498 pb), що містить 5'-кінець гена, що кодує (ген грипу свиней НА штам H3N2) глікопротеїн gD вірусу хвороби Aujeszky (Штам За технологією з прикладу 6 провели реакцію NIA3) (фрагмент В). RT-PCR з РНК геному вірусу грипу свиней (штам Гібридизацією наступних 2 олігонуклеотидів: SIV H3N2 Cotes du Nord 1987), отриманої за техРВ101 (15 mer) (SEQ ID №7) нологією, що описана в прикладі 4, і з такими олі5'GATGCTGCTCGC AGC 3' гонуклеотидами: PB102 (19 mer) (SEQ ID №8) Р9095 (31 mer) (SEQ ID №15) 5'GCTGCGAGC AGC ATCTGC A 3' 5'GTTCTGC AGGCAGGGGATAATTCTATC AACC 3' фрагмент (55 pb), що містить послідовність 5' РВ096 (36 mer) (SEQ ID №16) гена gD, від ініціального кодона ATG до сайта 5'TTGCGGCCGC AAGGGTGTTTTTAATTACTAATAT Есо47III, був перетворений з утворенням сайта AC 3' PstI на 5' (фрагмент С). Після очищення, фрагменщоб точно ізолювати ген, який кодує протеїн ти А, В і С разом були зшиті з вектором pVR1012 НА вір усу SIV H3N2 (Фігура №10 і SEQ ID №17), у (приклад 7), попередньо розщепленим за допомоформі фрагменту Pstl-Notl. Після очищення, прогою PstI і Bglll, і одержали плазміду рРВ098 (6076 дукт RT-PCR (1765 рb) зшили з вектором PCRIIpb) (Фігура №5). прямої (Інвітроген №К2000-01), щоб одержати векПриклад 10: Конструювання плазміди рРВ143 тор рРВ120 (5716 pb). (ген Грипу свиней НА штам H1N1) Вектор рРВ120 розщепили за допомогою NotI, За технологією з прикладу 6 провели реакцію щоб визволити фрагмент Notl-Notl (1797 pb), що RT-PCR з РНК геному вірусу грипу свиней (штам містить ген НА. Потім цей фрагмент зшили з векSIV HINI «SW»), отриманої за технологією, що тором pVR1012 (приклад 7), попередньо розщепописана в прикладі 4, і з такими олігонуклеотидаленим за допомогою NotI, і одержали плазміду 13 77935 14 рРВ144 (6712pb), що містить ген НА H3N2 у норщоб ізолювати фрагмент Pstl-BamHI (606 pb). Цей мальній орієнтації в порівнянні з промотором (Фіг. фрагмент зшили з вектором pVR1012 (приклад 7), №11). попередньо розщепленим за допомогою PstI і Приклад 13: Конструювання плазміди рРВ132 BamHI, і одержали плазміду рАВ001 (5463 pb) (фі(ген грипу свиней NP штам H3N2) гура №15). За технологією з прикладу 6 провели реакцію Приклад 16: Конструювання плазміди рАВ091 RT-PCR з РНК геному вірусу грит свиней (штам (ген PRRSV ORF3 штам Leiystad) SIV H3N2 Cotes du Nord 1987). що отримана за За технологією з прикладу 6 провели реакцію технологією, описаною в прикладі 4, і з такими RT-PCR з РНК геному вірусу PRRSV (Штам олігонуклеотидами: Leiystad) [J. Meulenberg і ін. Virology, 1993, 19, 62РВ097 (36 mer) (SEQ ID №12) 72], отриманою за технологією, що описана в при5'CCGGTCGACCGGGATAATC ACTC ACTGAGTGA кладі 4, і з такими олігонуклеотидами: CATC 3' АВ170 (32 mer) (SEQ ID №23) PB098 (33 mer) (SEQ ID №13) 5'AAACTGC AGC AATGGCTC ATC AGTGTGC ACGC 5'TTGCGGCCGCTGTAGAAAC AAGGGTATTTTTCT 3' 3' АВ171 (30 mer) (SEQ ID №24) щоб точно ізолювати ген. що кодує протеїн NP 5'CGCGGATCCTTATCGTGATGTACTGGGGA 3' вірусу SIV H3N2 (Фігура №12 і SEQ ID №18), в фощоб точно ізолювати ген «ORF3», що кодує рмі фрагменту Sall-Notl. Після очищення, продукт оболонковий глікопротеїн (gp45) вірусу PRRS RT-PCR (1564 pb) зшили з вектором PCRII-прямої штама Leiystad. Після очищення, продукт RT-PCR (Інвітроген №К2000-01), щоб одержати вектор (818 pb) розщепили за допомогою PstI і BamHI, рРВ123 (5485 pb). Вектор рРВ123 розщепили за щоб ізолювати фрагмент Pstl-BamHI (802 pb). Цей допомогою Sall і NotI, щоб визволити фрагмент фрагмент зшили з вектором pVR1012 (приклад 7), Sall і NotI (1558 pb), що містить ген NP. Потім цей попередньо розщепленим за допомогою PstI і фрагмент зшили з вектором pVR1012 (приклад 7). BamHI, і одержали плазміду рАВ091 (5660 pb) (фіпопередньо розщепленим за допомогою Sall і NotI, гура №16). і одержали плазміду рРВ132 (6449 pb) (фігура Приклад 17: Конструювання плазміди рАВ092 №13). (ген PPRSV ORF3 штам USA) Приклад 14: Конструювання плазміди рАВ025 За технологією з прикладу 6 провели реакцію (ген PRRSV ORF5) штам Leiystad RT-PCR з РНК геному вірусу PRRSV (Штам ATCCЗа технологією з прикладу 6 провели реакцію VR2332) [M.Murtaugh і ін. Arch. Virol. 1995, 140, RT-PCR з РНК геному вірусу PRRSV (штам 1451-1460], отриманої за технологією, що описана Leiystad) [J.Meulenberg і ін. Virology. 1993, 19, 62в прикладі 4, і з такими олігонуклеотидами: 72], отриманої за технологією, що описана в приАВ172 (32 mer) (SEQ ID №25) кладі 4, і з такими олігонуклеотидами: 5AAACTGC AGC AATGGTTAATAGCTGTACATTC 3' АВ055 (34 mer) (SEQ ID №19) AB173 (32 mer) (SEQ ID №26) 5'ACGCGTCGAC AATATGAGATGTTCTCAC AAATT 5'CGCGGATCCCTATCGCCGTACGGCACTGAGGG G 3' 3' АВ056 (33 mer) (SEQ ID №20) щоб точно ізолювати ген ORF3, що кодує обо5'CGCGGATCCCGTCTAGGCCTCCCATTGCTCAG лонковий глікопротеїн (gp45) вірусу PRRS штаму C 3' ATCC-VR2332. Після очищення, продукт RT-PCR щоб точно ізолювати ген «ORF5», що кодує (785 pb) розщепили за допомогою PstI і BamHI, глікопротеїн оболонки Ε (gp25) вірусу PRRS штаму щоб ізолювати фрагмент Pstl-BamHI (769 pb). Цей Leiystad. Після очищення, продукт RT-PCR (630 фрагмент зшили з вектором pVR1012 (приклад 7), pb) розщепили за допомогою Sall і BamHI, щоб попередньо розщепленим за допомогою PstI і ізолювати фрагмент Sall-BamHI (617 pb). Цей фраBamHI, і одержали плазміду рАВ092 (5627 pb) (фігмент зшили з вектором pVR1012 (приклад 7), погура №17). передньо розщепленим за допомогою Sall i BamHI, Приклад 18: Конструювання плазміди рАВ004 і одержали плазміду рДВ025 (5486 pb) (фігура (ген парвовірусу свиней VP2) №14). За технологією з прикладу 6 провели реакцію Приклад 15: Конструювання плазміди pAB001 RT-PCR з РНК геному парвовірусу свиней (Штам PRRSV ORF5 штам USA NADL2) [J. Vasudevacharya і ін. Virology. 1995, 178, За технологією з прикладу 6 провели реакцію 611-616], отриманої за технологією, що описана в RT-PCR з РНК геному вірусу PRRSY (Штам ATCCприкладі 4, і з такими олігонуклеотидами: VR2332) [M.Murtaugh і ін. Arch. Virol. 1995, 140, АВ007 (33 mer) (SEQ ID №27) 1451-1460], отриманої за технологією, що описана 5'AAAACTGC AGAATGAGTGAAAATGTGGAAC в прикладі 4, і з такими олігонуклеотидами: AAC 3' ABO 10 (33 mer) (SEQ ID №28) АВ001 (30 mer) (SEQ ID №21) 5'CGCGGATCCCTAGTATAATTTTCTTGGTATA 5'AACTGC AGATGTTGGAGAAATGCTTGACCG 3' AG 3' AB002 (30 mer) (SEQ ID №22) щоб розширити фрагмент (1757 pb), що міс5rCGGGATCCCTAAGGACGACCCCATTGTTCC 3' тить ген, що кодує протеїн VP2 парвовірусу свищоб точно ізолювати ген, що кодує оболонконей. Після очищення, продукт RT-PCR розщепили вий глікопротеїн Ε (gp25) вірусу PRRS штаму за допомогою PstI i BamHI, щоб ізолювати фрагATCC-VR2332. Після очищення, продукт RT-PCR мент Pstl-BamHI (1740 pb). Цей фрагмент зшили з (620 pb) розщепили за допомогою PstI і BamHI, вектором pVR1012 (приклад 7), попередньо роз 15 77935 16 щепленим за допомогою PstI і BamHI, і одержали pleuropneumoniae), у формі фрагменту Sall-EcoRI. плазміду рАВ004 (6601 pb) (фігура №18). Після очищення, продукт PCR (2193 рb) розщепиПриклад 19: Конструювання плазміди рАВ069 ли за допомогою Sall і EcoRI, щоб ізолювати фра(ген Чуми свиней HCVE1) гмент Sall-EcoRI (2183 pb) (фрагмент А). Провели За технологією з прикладу 6 провели реакцію реакцію PCR з ДНК геному Actinobacillus RT-PCR з РНК геному вірусу чуми свиней (Hog pleuropneumoniae (Серотип 1) [J.Frey і ін. Infect Cholera Virus) (HCV) (Штам Alfort) [G. Me yers і ін. Iinmun. 1991, 59, 3026-3032] і з наступними олігоVirology. 1989, 171, 18-27], отриманої за технологінуклеотидами : єю, що описана в прикладі 4, і з такими олігонукРВ190 (31 mer) (SEQ ID №35) леотидами: 5'TTGAATTCTATCGCTAC AGTAAGGAGTACGG 3' A3126 (36 mer) (SEQ ID №29) РВ175 (31 mer) (SEQ ID №36) 5'ACGCGTCGAC ATGAAACTAGAAAAAGCCCTGTT 5'TTGGATCCGCTATTTA7C ATCTAAAAATAAC 3' GGC 3' щоб розширити частину 3' гена apxl. що кодує AB127 (34 mer) (SEQ ID №30) протеїн гемолізин І (Actmobacillus 5'CGCGGATCCTCATAGCCGCCCTTGTGCCCCGG pleuropneumoniae), у формі фрагменту EcoRITC 3' BamHI. Після очищення, продукт PCR (576 pb) щоб ізолювати послідовність, що кодує протерозщепили за допомогою EcoRI і BaitiHI. щоб ізоїн Е1 вірусу HCV, у формі фрагмента RT-PCR лювати фрагмент EcoRI-BamHI (566 pb) (фрагмент (1364 pb). Після очищення, цей фрагмент розщеУ). Фрагменти А і В зшили разом із вектором пили за допомогою BamHI і Sall, щоб одержати pVR1012 (приклад 7). попередньо розщепленим за фрагмент Sall-BamHI (1349 pb). Цей фрагмент допомогою Sall і BamHI. і одержали плазміду зшили з вектором pVR.1012 (приклад 7), поперерРВ3162 (7619 pb) (Фігура №21). дньо за допомогою BamHI і Sall, і одержали плазПриклад 22: Конструювання плазміди рРВ163 міду рАВ069 (6218 pb) (фігура №19). (ген Actinobacillus pleuropneumoniae архІІ делеціПриклад 20: Конструювання плазміди рАВ061 льований) (ген Чуми свиней HCV E2) Ген архІІ (Actinobacillus pleuropneumoniae) був За технологією з прикладу 6 провели реакцію клонований таким чином, щоб мала місце делеція RT-PCR з РНК геному вірусу чуми свиней (Hog ділянки амінокислот з великим вмістом гліцину (що Cholera Virus) (HCV) (Штам Alfort) [G.Meyers і ін. бере участь у фіксації іона кальцію), який знахоVirology. 1989. 171. 18-27), отриманої за технологідиться між амінокислотами 716 і 813. єю, що описана в прикладі 4, і з такими олігонукПровели реакцію PCR з ДНК геному леотидами: Actinobacillus pleuropneumoniae (Серотип 9) [Μ. A3118 (36 mer) (SEQ ID №31) Smits і ін. Infection and Immunity. 1991, 59, 44975'ACGCGTCGAC ATGTC AACTACTGCGTTTCTC AT 4504], отриманої за технологією, що описана в TTG 3' прикладах 2 і 3, і з такими олігонуклеотидами: АВ119 (33 mer) (SEQ ID №32) РВ176 (31 mer) (SEQ ID №37) 5'CGCGGATCCTCACTGTAGACCAGCAGCGAGCT 5'TTGTCGACGATCAATTATATAAAGGAGACTC 3' G 3' РВ191 (30 mer) (SEQ ID №38) щоб ізолювати послідовність, що кодує проте5'TTGAATTCCTCTTCAACTGATTTGAGTGAG 3' їн Е2 вірусу HCV, у формі фрагмента RT-PCR щоб розширити частину 5' гена архІІ, що кодує (1246 pb). Після очищення, цей фрагмент розщепротеїн гемолізин II (Actinobacillus пили за допомогою BamHI і Sall, щоб одержати pleuropneumoniae), у формі фрагменту Sall-EcoRI. фрагмент Salll-BamHI (1232 pb). Цей фрагмент Після очищення, продукт PCR (2190 pb) розщепизшили з вектором pVR1012 (приклад 7), поперели за допомогою Sall і EcoRI, щоб ізолювати фрадньо розщеплений за допомогою BamHI і Sall, і гмент Sall-EcoRI (2180 pb) (фрагмент А). одержали плазмід) рАВ061 (6101 pb) (фігура Провели реакцію PCR з ДНК геному №20). Actinobacillus pleuropneumoniae (Серотип 9) [Μ. Приклад 21: Конструювання плазміди рРВ162 Smits і ін. Infection and Immunity. 1991, 59, 4497(ген Actino-bacillus pleuropneumoniae apxl делеці4504] і з такими олігонуклеотидами: льований) РВ192 (29 mer) (SEQ ID №39) Ген apxl (Actinobacillus pleuropneumoniae) був 5'TTGAATTCGTAAATCTTAAAGACCTCACC 3' клонований таким чином, щоб мала місце делеція РВ177 (30 mer) (SEQ ID №40) ділянки амінокислот з великим вмістом гліцину (що 5'TTGGATCCACCATAGGATTGCTATGATTTG 3' бере участь у фіксації іона кальцію), який знахощоб розширити частину 3' гена архІІ, що кодує диться між амінокислотами 719 і 846. протеїн гемолізин II (Actinobacillus Провели реакцію PCR із ДНК геному pleuropneumoniae) у формі фрагменту EcoRIActinobacillus pleuropneumoniae (Серотип 1) [J. BamHI. Після очищення, продукт PCR (473 pb) Frey і ін. Infect. Immun. 1991, 59, 3026-3032], отрирозщепили за допомогою EcoRI і BamHI, щоб ізоманої за технологією, що описана в прикладах 2 і лювати фрагмент EcoRI-BamHI (463 pb) (фрагмент 3, і з такими олігонуклеотидами: В). Фрагменти А і В зшили разом із вектором РВ174 (32 mer) (SEQ ID №33) pVR1012 (приклад 7), попередньо розщепленим за 5TTGTCGACGTAAATAGCTAAGGAGAC AACATG 3' допомогою Sall і BamHI, і одержали плазміду РВ189 (29 mer) (SEQ ID №34) рРВ163 (7513 pb) (Фігура №22). 5'TTGAATTCTTCTTC AAC AGAATGTAATTC 3' Приклад 23: Конструювання плазмід рРВ174', щоб розширити частину 5' гена apxl, що кодує рРВ189 і рРВ190 (ген Actinobacillus ріеигорпешпопротеїн гемолізин І (Actinobacilhb піае архIII делецільований). Перший приклад де 17 77935 18 леції в АрхIII (плазміда рРВ174'): Genbank=X68815], і з такими олігонуклеотидами: Ген архIII (Actinobacillus pleuropneumoniae) був РВ306 (31 mer) (SEQ ID №46) клонований таким чином, щоб мала місце делеція 5'TTTATCGATTCTGATT77TCCTTCGATCGTC 3' ділянки амінокислот з великим вмістом гліцину (що PB307 (32 mer) (SEQ ID №44) бере участь у фіксації іона кальцію), який знахо5'TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC 3' диться між амінокислотами 733 і 860. щоб розширити частину 3' гена архІll, що кодує Провели реакцію PCR з ДНК геномо протеїн гемолізин III (Actinobacilltis Actinobacillus pleuropneumoniae (Серотип 8) [Μ. pleuropneumoniae), у формі фрагменту Clal-BamHI. Smits 1992. № доступу послідовності в Після очищення, продукт PCR (518 pb) розщепили Genbank=X68815], отриманої за технологією, що за допомогою Clal і BamHI, щоб ізолювати фрагописана в прикладах 2 і 3. і з такими олігонуклеомент Clal-BamHI (506 pb) (фрагмент В). Фрагменти гидами: А і В зшили разом із вектором pVR1012 (приклад РВ278 (30 mer) (SEQ ID №41) 7), попередньо розщепленим за допомогою Sall і 5'TTTGTCGACATGAGTACTTGGTC AAGC ATG 3' BamHI, і одержали плазміду рРВ189 (7496 pb) (ФіРВ279 (29 mer) (SEQ ID №42) гура №24). 5'TTTATCGATTCTTCTACTGAATGTAATTC 3' Третій приклад делеції в АрхІИ (плазміда щоб розширити частину 5' гена архIII, що корРВ190): дує протеїн гемолізин III (Actinobacillus Ген архlll (Actinobacillus pleuropneumoniae) був pleuropneumoniae) у формі фрагменту Sall-Clal. клонований таким чином, щоб мала місце делеція Після очищення, продукт PCR (2216 pb) розщепиділянки амінокислот з великим вмістом гліцину (що ли за допомогою Sall і Clal, щоб ізолювати фрагбере участь у фіксації іона кальцію), який знахомент Sall-Clal (2205 pb) (фрагмент А). Провели диться між амінокислотами 718 і 876. реакцію PCR з ДНК геному Actinobacillus Провели реакцію PCR з ДНК геному pleuropneumoniae (Серотип 8) [Μ. Smits 1992. № Actinobacillus pleuropneumoniae (Серотип 8) [Μ. доступ у послідовності в Genbank=X68815], і з таSmits 1992. № доступу послідовності в кими олігонуклеотидами: Genbank=X68815], отриманої за технологією, що РВ280 (33 mer) (SEQ ID №43) описана в прикладах 2 і 3. і з такими олігонуклети5'TTTATCGATTTATGTTTATCGTTCCACTTCAGG 3' дами: PS307 (32 mer) (SEQ ID №44) РВ278 (30 mer) (SEQ ID №41) 5'TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC 3' 5'TTTGTCGACATGAGTACTTGGTC AAGC ATG 3' щоб розширити частину 3' гена архІll, що кодує РВ304 (33 mer) (SEQ ID №47) протеїн гемолізин III (Actinobacillus 5'TTTATCGATACCTGATTGCGTTAATTC ATAATC 3' pleuropneumoniae), у формі фрагменту Clal-BamHI. щоб розширити частину 5' гена архlll, що кодує Після очищення, продукт PCR (596 pb) розщепили протеїн гемолізин III (Actinobacillus за допомогою СlаІ і BamHI, щоб ізолювати фрагpleuropneumoniae), у формі фрагменту Sall-Clal. мент Clal-BamHI (583 pb) (фрагмент В). Фрагменти Після очищення, продукт PCR (2172 pb) розщепиА і В зшили разом із вектором pVR1012 (приклад ли за допомогою Sall і Clal, щоб ізолювати фраг7), попередньо розщепленим за допомогою Sall і мент Sall-Clal (2161 pb) (фрагмент А). BamHI, і одержали плазміду РРВ174' (7658 pb) Провели реакцію PCR з ДНК геному (Фігура №23). Actinobacillus pleuropneumoniae) (Серотип 8) [Μ. Другий приклад делеції в Ар хІll (плазміда Smits 1992. № доступу послідовності в рРВ189): Genbank=X68815], і з такими олігонуклеотидами: Ген архІll (Actinobacillus pleuropneumoniae) був РВЗО5 (31 mer) (SEQ ID №48) клонований таким чином, щоб мала місце делеція 5'TTTATCGATAAATCTAGTGATTTAGATAAAC 3' ділянки амінокислот із великим вмістом гліцину PB307 (32 mer) (SEQ ID №44) (що бере участь у фіксації іона кальцію), який зна5'TTGGA7CCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC 3' ходиться між амінокислотами 705 і 886. щоб розширити частину 3' гена архІll, що кодує Провели реакцію PCR з ДНК геному протеїн гемолізин III (Actinobacillus Actinobacillus pleuropneumoniae (Серотип 8) pleuropneumoniae), у формі фрагменту Clal і [M.Smis 1992. № доступу послідовності в BamHI. Після очищення, продукт PCR (548 pb) Genbank=X68815], отриманої за технологією, опирозщепили за допомогою Clal і BamHI, щоб ізолюсаної в прикладах 2 і 3, і з такими олігонуклеотивати фрагмент Clal-BamHI (536 pb) (фрагмент В). дами: Фрагменти А і В зшили разом із вектором pVR1012 РВ278 (30 mer) (SEQ ID №41) (приклад 7), попередньо розщепленим за допомо5'TTTGTCGACATGAGTACTTGGTC AAGC ATG 3' гою Sall і BamHI, і одержали плазміду рРВ190 PB303 (32 mer) (SEQ ID №45) (7565 pb). (Фігура №25). 5'TTTATCGATTTCTTCACGTTTACC AACAGCA 3' Приклад 24: Одержання і очищення плазмід щоб розширити частину 5' гена архІll, що кодує Для одержання плазмід, призначених для вакпротеїн гемолізин III (Actinobacillus цинації тварин, можна використовувати будь-яку pleuropneumoniae), у формі фрагменту Sall-Clal. технологію, що дозволяє одержати суспензію Після очищення, продукт PCR (2133 pb) розщепиочищених плазмід, у більшій мірі, у надскрученій ли за допомогою Sall і Clal, щоб ізолювати фрагформі. Ці технології добре відомі фахівцям. Можна мент Sall-Clal (2122 pb) (фрагмент А). назвати, зокрема техніку лужного лізису з наступПровели реакцію PCR з ДНК геному ним дворазовим центрифугуванням у градієнті Actinobacillus pleuropneumoniae (Серотип 8) [Μ. хлорид) цезію і в присутності броміду етидію, як Smits 1992. № доступу послідовності в описано J.Sambrook і ін. [Molecular Cloning: A 19 77935 20 Laboratory Manual. 2-е вид. Cold Spring Harbor Особливі компоненти, такі як ліпосоми, катіонLaboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989]. ні ліпіди, також можуть бути використані для одеМожна також звернутися до матеріалів заявок РСТ ржання вакцин. WO 95/21250 і РСТ WO 96/02658, у яких описані Приклад 26: Вакцинація свиней методики одержання в промисловому масштабі Свиней вакцинують дозами 100мкг, 250мкг або плазмід для вакцинації. Для одержання вакцин 500мкг на кожну плазміду. (див. приклад 17), готують суспензію очищених Ін'єкції можна проводити за допомогою голки плазмід таким чином, щоб одержати висококонцевнутрішньом'язово. У цьому випадкл, вакцинні нтровані розчини (>2мг/мл). придатні для зберідози вводять в об'ємі 2мл. гання. Для цього готують суспензію плазмід або в Ін'єкції можна проводити внутрішньошкірно, ультрачистій воді, або в буфері ТЕ (Tris-HCl 10мМ; використовуючи рідиннострумінник (без голки) EDTA 1мМ, рН 8,0). ін'єкційний апарат і вводячи дози 0,2мл в 5 точках Приклад 25: Одержання асоційованих вакцин (0,04мл у кожній точці і (наприклад, апарат Різні плазміди, необхідні для одержання асо«PIGJET»). У цьому випадку, вакцини вводять в ційованої вакцини, змішують у їхніх концентроваоб'ємах 0,2 або 0,4мл, що відповідає, одному або них розчинах (приклад 16). Суміші готують таким двом введенням. Якщо два послідовних введення чином, щоб кінцева концентрація кожної плазміди здійснюють за допомогою апарата PIGJET, ці ввевідповідала ефективній дозі кожної плазміди. У дення здійснюють таким чином, щоб обидві ін'єкякості розчинів для доведення кінцевої концентраційні зони були віддалені одна від другої на відції вакцини можна використовувати або розчин станьбіля 1-2 сантиметрів. 0,9% NaCI, або буфер PBS. 21 77935 22 23 77935 24 25 77935 26 27 77935 28 29 77935 30 31 77935 32 33 77935 34 35 77935 36 37 77935 38 39 77935 40 41 77935 42 43 Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко 77935 Підписне 44 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601