Поліпептид фактора vii та його застосування для лікування випадків кровотечі або посилення нормальної системи кровоспинення

Поліпептид фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1 або її 5. варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Val у позиції 158 SEQ ID NO:1, заміщена амінокислотою, вибраною з групи, що включає Ser, Thr, Asn, Gln, Asp та Glu, та/або у якому амінокислота, що відповідає Glu у позиції 296 SEQ ID NO:1, 6. заміщена амінокислотою, вибраною з групи, що включає Arg, Lys та Val, та/або у якому амінокислота, що відповідає Met у позиції 298 SEQ ID NO:1, заміщена амінокислотою, вибраною з групи, що включає Lys, Arg, Gln та Asn, та/або у 7. якому амінокислота, що відповідає Lys у позиції 337 SEQ ID NO:1, заміщена амінокислотою, вибраною з групи, що включає Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp та Glu, причому співвідношення між активністю зазначеного варіанту поліпептиду 8. фактора VII та активністю природного поліпептиду фактора VII, показаного на SEQ ID NO:1 становить принаймні приблизно 1,25, як визначено тестуванням "аналіз гідролізу in vitro". 2 (19) 1 3 може бути кодована послідовностями. 81601 нуклеїновокислотними 10. Поліпептид фактора VII за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид фактора VII є фактором VII людини. 11. Поліпептид фактора VII за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид фактора VII є фактором VIIa людини. 12. Поліпептид фактора VII за п. 1, який відрізняється тим, що він є поліпептидом фактора VII, незалежно вибраним із групи, що складається з [V158T/M298Q]-FVII, [V158D/E296V]FVII, [V158D/M298Q]-FVII. 13. Поліпептид фактора VII за п. 1, який відрізняється тим, що він являє собою [V158D/E296V/M298Q]-FVII. 22. Поліпептид фактора VII за п. 1, який відрізняється тим, що він являє собою 23. [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII. 14. 15. Нуклеїновокислотна послідовність, яка включає нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид фактора VII за будь-яким з пп. 1-15. 24. 16. Нуклеїновокислотна послідовність за п. 16, яка відрізняється тим, що вона являє собою вектор. 17. Рекомбінантна клітина-хазяїн, яка включає нуклеїновокислотну послідовність, визначену у п. 16. 18. Рекомбінантна клітина-хазяїн за п. 18, яка відрізняється тим, що вона взята у ссавця. 19. Рекомбінантна клітина-хазяїн за п. 19, яка відрізняється тим, що клітину вибирають із групи, що складається з CHO-клітин, BHK-клітин або HEK-клітин. 20. Спосіб вироблення поліпептиду фактора VII за будь-яким з пп. 1-15, що включає культивування клітини за будь-яким з пп. 18-20 у відповідному середовищі для вирощування за умов, які дозволяють забезпечувати експресію нуклеїновокислотної послідовності та виділення одержаного в результаті поліпептиду з 25. культурального середовища. 21. Фармацевтична композиція, яка містить поліпептид фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1 або її 4 варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Val у позиції 158 SEQ ID NO:1, заміщена амінокислотою, вибраною з групи, що включає Ser, Thr, Asn, Gln, Asp та Glu, та/або у якому амінокислота, що відповідає Glu у позиції 296 SEQ ID NO:1, заміщена амінокислотою, вибраною з групи, що включає Arg, Lys та Val, та/або у якому амінокислота, що відповідає Met у позиції 298 SEQ ID NO:1, заміщена амінокислотою, вибраною з групи, що включає Lys, Arg, Gln та Asn, та/або у якому амінокислота, що відповідає Lys у позиції 337 SEQ ID NO:1, заміщена амінокислотою, вибраною з групи, що включає Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp та Glu, причому співвідношення між активністю зазначеного варіанту поліпептиду фактора VII та активністю природного поліпептиду фактора VII, показаного на SEQ ID NO:1 становить принаймні приблизно 1,25, як визначено тестуванням "аналіз гідролізу in vitro". Фармацевтична композиція, яка містить поліпептид фактора VII за будь-яким з пп. 1-15. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 22 або 23, яка додатково містить фармацевтично прийнятний носій. Застосування поліпептиду фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1 або її варіант, у якому амінокислота, що відповідає Val у позиції 158 SEQ ID NO:1, заміщена амінокислотою, вибраною з групи, що включає Ser, Thr, Asn, Gln, Asp та Glu, та/або у якому амінокислота, що відповідає Glu у позиції 296 SEQ ID NO:1, заміщена амінокислотою, вибраною з групи, що включає Arg, Lys та Val, та/або у якому амінокислота, що відповідає Met у позиції 298 SEQ ID NO:1, заміщена амінокислотою, вибраною з групи, що включає Lys, Arg, Gln та Asn, та/або у якому амінокислота, що відповідає Lys у позиції 337 SEQ ID NO:1, заміщена амінокислотою, вибраною з групи, що включає Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp та Glu, причому співвідношення між активністю зазначеного варіанту поліпептиду фактора VII та активністю природного поліпептиду фактора VII, показаного на SEQ ID NO:1 становить принаймні приблизно 1,25, як визначено тестуванням "аналіз гідролізу in vitro", для виготовлення лікарського засобу для лікування випадків кровотечі або для посилення нормальної системи кровоспинення. Застосування поліпептиду фактора VII за будь-яким з пп. 1-15, для виготовлення лікарського засобу для лікування випадків кровотечі або для посилення нормальної системи кровоспинення. 26. Даний винахід стосується нових варіантів фактора коагуляції VII людини, які мають коагулянтну активність, а також нуклеїновокислотних послідовностей, які кодують такі варіанти, векторів та клітин-хазяїв, які включають та експресують нуклеїнову кислоту, 5 фармацевтичних композицій, застосування та способів лікування. Коагуляція крові є процесом, який складається зі складної взаємодії різних компонентів (або факторів) крові, що зрештою викликає утворення фібринового згустку. Взагалі, компоненти крові, які беруть участь у процесі, названому "каскадом" коагуляції, є ферментно неактивними білками (проферментами або зимогенами), які перетворюються на протеолітичні ферменти під дією активатора (який сам є активованим коагулювальним фактором). Фактори коагуляції, які зазнали такого перетворення, мають спільну назву "активних факторів" і позначаються додаванням літери "а" до назви фактора коагуляції (наприклад, Фактор VIIa). Початок кровоспинного процесу опосередковується утворенням комплексу між тканинним фактором, відкритим в результаті пошкодження стінки судини, та Фактором VIIa. Цей комплекс потім перетворює Фактори IX та X на їхні активні форми. Фактор Ха перетворює обмежену кількість протромбіну на тромбін на клітині, що несе тканинний фактор. Тромбін активує тромбоцити і Фактори V та VIII до Факторів Va та Villa, обидва з яких є кофакторами у подальшому процесі, який веде до повного викиду тромбіну. Цей процес включає утворення Фактора Ха Фактором ІХа (у комплексі з фактором Villa) і відбувається на поверхні активованих тромбоцитів. Тромбін зрештою перетворює фібриноген на фібрин, що в результаті веде до утворення фібринового згустку. В останні роки було виявлено, що Фактор VII та тканинний фактор є основними ініціаторами коагуляції крові. Фактор VII є слідовим глікопротеїном плазми, який циркулює в крові як одноланцюговий зимоген. Цей зимоген є каталітично неактивним. Одноланцюговий Фактор VII може бути перетворений на дволанцюговий Фактор VIIa Фактором Ха, Фактором ХІІа, Фактором ІХа, Фактором VIIa або тромбіном in vitro. Фактор Ха вважають головним фізіологічним активатором Фактора VII. Як і деякі інші білки плазми, які беруть участь у гемостазі, Фактор VII залежить від вітаміну К, що забезпечує його активність, яка вимагається для гамма-карбоксилювання різних залишків глутамінової кислоти, які накопичуються поблизу амінного кінця білка. Ці гаммакарбоксильовані глутамінові кислоти потрібні для викликаної іонами металів взаємодії Фактора VII з фосфоліпідами. Перетворення Фактора VII зимогену на активовану дволанцюгову молекулу відбувається шляхом розщеплення внутрішнього пептидного зв'язку Arg152-lle153. У присутності тканинного фактора, фосфоліпідів та іонів кальцію дволанцюговий Фактор VIIa швидко активує Фактор X або Фактор IX шляхом обмеженого протеолізу. Часто буває потрібним стимулювання або поліпшення каскаду коагуляції в суб'єкта. Фактор VIIa застосовують для контролювання порушень кровотечі, викликаних різними причинами, такими як дефіцит коагулювального фактора (наприклад, гемофілія А та В або дефіцит факторів коагуляції 81601 6 XI або VII) або інгібіторів коагулювального фактора. Фактор VIIa також застосовують для контролювання надмірної кровотечі, яка трапляється у суб'єктів з нормально функціонуючим каскадом згортання крові (без дефіциту коагулювального фактора або інгібіторів будь-якого з факторів коагуляції). Така кровотеча може бути викликана, наприклад, недостатньою функцією тромбоцитів, тромбоцитопенією або псевдогемофілією. Кровотеча також є основною проблемою, пов'язаною з хірургічними втручанням та іншими формами пошкодження тканин. Європейський патент № 200,421 (ZymoGenetics) стосується нуклеотидної послідовності, що кодує Фактор VII людини, та рекомбінантної експресії Фактора VII у клітинах ссавців. Робота Dickinson et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 14379-14384) стосується варіантів Фактора VII, в яких амінокислоти Lys157, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 або Lys337] кожна поодинці є заміщеними Ala. Робота Iwanaga et al. [Thromb. Haemost. (додаток — серпень 1999 p.), 466, реферат 1474)] стосується варіантів FVIIa, в яких залишки 316-320 є делегованими або залишки 311-322 є заміщеними відповідними залишками трипсину. Однак, все одно існує потреба у варіантах Фактора VIIa, які мають коагулянтну активність, варіантах з високою активністю, які можуть вводитись у відносно низьких дозах, та варіантах, які не створюють небажаних побічних ефектів, таких як системна активація системи коагуляції та кровотеча, відповідно, пов'язані з традиційними засобами терапії. Винахід забезпечує поліпептиди фактора коагуляції VIIa з коагулянтною активністю. У першому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому принаймні амінокислота, яка відповідає Lys у позиції 157 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою; за умови, що цей варіант не є FVII(Ala157). У другому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Lys у позиції 337 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою; за умови, що цей варіант не є FVII(Ala337). У третьому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Asp у позиції 334 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою; за умови, що цей варіант не є FVII(Ala334). В іншому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Ser у позиції 336 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою; за умови, що цей варіант не є FVII(Ala336). 7 В іншому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Val у позиції 158 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою; за умови, що цей варіант не є FVII(Ala158). В іншому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Glu у позиції 296 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою; за умови, що цей варіант не є FVII(Ala296). В іншому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Met у позиції 298 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою; за умови, що цей варіант не є FVII(Ala298). В іншому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII з послідовністю SEQ 10 N0:1, у якому одна амінокислота, незалежно вибрана з групи, що складається з Lys у позиції 157, Lys у позиції 337, Asp у позиції 334, Ser у позиції 336, Val у позиції 158, Glu у позиції 296 та Met у позиції 298 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою; за умови, що цей варіант не є FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) або FVII(Ala298). В іншому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII з послідовністю SEQ ID N0:1, у якому дві амінокислоти, незалежно вибрані з групи, що складається з Lys у позиції 157, Lys у позиції 337, Asp у позиції 334, Ser у позиції 336, Val у позиції 158, Glu у позиції 296 та Met у позиції 298 SEQ ID N0:1, є заміщеними іншими амінокислотами. В іншому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII з послідовністю SEQ ID N0:1, у якому три амінокислоти, незалежно вибрані з групи, що складається з Lys у позиції 157, Lys у позиції 337, Asp у позиції 334, Ser у позиції 336, Val у позиції 158, Glu у позиції 296 та Met у позиції 298 SEQ ID N0:1, є заміщеними іншими амінокислотами. В іншому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII з послідовністю SEQ ID N0:1, у якому чотири амінокислоти, незалежно вибрані з групи, що складається з Lys у позиції 157, Lys у позиції 337, Asp у позиції 334, Ser у позиції 336, Val у позиції 158, Glu у позиції 296 та Met у позиції 298 SEQ ID N0:1, є заміщеними іншими амінокислотами. В іншому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII з послідовністю SEQ ID N0:1, у якому п'ять амінокислот, незалежно вибраних із групи, що складається з Lys у позиції 157, Lys у позиції 337, Asp у позиції 334, Ser у позиції" 336, Val у позиції 158, Glu у позиції 296 та Met у позиції 298 SEQ IDN0:1, є заміщеними іншими амінокислотами. 81601 8 В іншому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII з послідовністю SEQ ID N0:1, у якому шість амінокислот, незалежно вибраних із групи, що складається з Lys у позиції 157, Lys у позиції 337, Asp у позиції 334, Ser у позиції 336, Val у позиції 158, Glu у позиції 296 та Met у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеними іншими амінокислотами. В іншому аспекті винахід забезпечує поліпептид Фактора VII з послідовністю SEQ ID NO: 1, у якому амінокислоти, які складаються з Lys у позиції 157, Lys у позиції 337, Asp у позиції 334, Ser у позиції 336, Val у позиції 158, Glu у позиції 296 та Met у позиції 298 SEQ ID N0:1, є заміщеними іншими амінокислотами. В іншому аспекті винахід забезпечує варіант фактора коагуляції VII, у якому один або кілька Lys-залишків у позиції 157 і Lys-залишків у позиції 337 і Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 і Val-залишків у позиції 158 і Gluзалишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями і, необов'язково, в якому один або кілька амінокислотних залишків у решті позицій у протеазному домені є заміщеним іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями; за умови, що цей варіант не є FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) або FVII(Ala298). Вжитий авторами термін "FVII(Ala157)" означає варіант фактора коагуляції VII з послідовністю SEQ ID N0:1, у якому Lys у позиції 157 SEQ ID ΝΟΊ є заміщеним аланіном. Цей термін, наприклад, не включає варіанти фактора коагуляції VII, у яких дві або більше амінокислот у позиціях SEQ ID N0:1 є заміщеними іншими амінокислотами. Вжитий авторами термін "FVII(Ala337)" означає варіант фактора коагуляції VII з послідовністю SEQ ID N0:1, у якому Lys у позиції 337 SEQ ID N0:1 є заміщеним аланіном. Цей термін, наприклад, не включає варіанти фактора коагуляції VII, у яких дві або більше амінокислот у позиціях SEQ ID N0:1 є заміщеними іншими амінокислотами. Вжитий авторами термін "FVII(Ala334)" означає варіант фактора коагуляції VII з послідовністю SEQ ID N0:1, у якому Asp у позиції 334 SEQ ID N0:1 є заміщеним аланіном. Цей термін, наприклад, не включає варіанти фактора коагуляції VII, у яких дві або більше амінокислот у позиціях SEQ ID N0:1 є заміщеними іншими амінокислотами. Вжитий авторами термін "FVII(Ala336)" означає варіант фактора коагуляції VII з послідовністю SEQ ID N0:1, у якому Ser у позиції 336 SEQ ID N0:1 є заміщеним аланіном. Цей термін, наприклад, не включає варіанти фактора коагуляції VII, у яких дві або більше амінокислот у позиціях SEQ ID N0:1 є заміщеними іншими амінокислотами. 9 Вжитий авторами термін "FVII(Ala158)" означає варіант фактора коагуляції VII з послідовністю SEQ ID N0:1, у якому Val у позиції 158 SEQ ID N0:1 є заміщеним аланіном. Цей термін, наприклад, не включає варіанти фактора коагуляції VII, у яких дві або більше амінокислот у позиціях SEQ ID N0:1 є заміщеними іншими амінокислотами. Вжитий авторами термін "FVII(Ala296)" означає варіант фактора коагуляції VII з послідовністю SEQ ID N0:1, у якому Glu у позиції 296 SEQ ID N0:1 є заміщеним аланіном. Цей термін, наприклад, не включає варіанти фактора коагуляції VII, у яких дві або більше амінокислот у позиціях SEQ IDN0:1 є заміщеними іншими амінокислотами. Вжитий авторами термін "FVII(Ala298)" означає варіант фактора коагуляції" VII з послідовністю SEQ ID N0:1, у якому Met у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним аланіном. Цей термін, наприклад, не включає варіанти фактора коагуляції VII, у яких дві або більше амінокислот у позиціях SEQ ID N0:1 є заміщеними іншими амінокислотами. В іншому аспекті винахід стосується нуклеїновокислотної послідовності, яка кодує поліпептид Фактора VII згідно з винаходом. В іншому аспекті винахід забезпечує нуклеїновокислотну послідовність, яка включає нуклеотидну послідовність, яка кодує варіант Фактора VII. В іншому аспекті винахід забезпечує рекомбінантний вектор, який включає нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує варіант FVIIa. В іншому аспекті винахід забезпечує рекомбінантну клітину-хазяїн, яка включає нуклеїновокислотну послідовність або вектор. В іншому аспекті винахід забезпечує трансгенну тварину, що містить і експресує нуклеїновокислотну послідовність. В іншому аспекті винахід забезпечує трансгенну рослину, що містить і експресує нуклеїновокислотну послідовність. В іншому аспекті винахід стосується способу вироблення поліпептиду Фактора VII згідно з винаходом, причому спосіб включає культивування клітин, які включають нуклеїновокислотну послідовність, у відповідному середовищі для вирощування за умов, які дозволяють забезпечувати експресію нуклеїновокислотної' послідовності та видобування одержаного в результаті поліпептиду з культурального середовища. В іншому аспекті винахід забезпечує спосіб вироблення варіанта Фактора VII згідно з винаходом, причому спосіб включає культивування клітин, які включають нуклеїновокислотну послідовність, у відповідному середовищі для вирощування за умов, які дозволяють забезпечувати експресію нуклеїновокислотної послідовності та видобування одержаного в результаті поліпептиду з культурального середовища. 81601 10 В іншому аспекті винахід стосується способу вироблення поліпептиду Фактора VII, причому спосіб включає видобування поліпептиду з молока, виробленого трансгенною твариною. В іншому аспекті винахід забезпечує спосіб вироблення варіанта Фактора VII, причому спосіб включає видобування цього варіанта з молока, виробленого трансгенною твариною. В іншому аспекті винахід стосується способу вироблення поліпептиду Фактора VII, причому спосіб включає культивування клітин трансгенної рослини, яка включає нуклеїновокислотну послідовність, та видобування поліпептиду з одержаної в результаті рослини. В іншому аспекті винахід забезпечує спосіб вироблення варіанта Фактора VII, причому спосіб включає культивування клітин трансгенної рослини, яка включає нуклеїновокислотну послідовність, та видобування цього варіанта з одержаної в результаті рослини. В іншому аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Lys у позиції 157 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, та, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій. В іншому аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Lys у позиції 337 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, та, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій. В іншому аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Asp у позиції 334 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, та, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій. В іншому аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Ser у позиції 336 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, та, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій. В іншому аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Val у позиції 158 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, та, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій. В іншому аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Glu у 11 позиції 296 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, та, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій. В іншому аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає поліпептид Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Met у позиції 298 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, та, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій. В іншому аспекті винахід забезпечує фармацевтичну композицію, яка включає варіант фактора коагуляції VII, у якому один або кілька Lys-залишків у позиції 157 і Lys-залишків у позиції 337 і Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 і Val-залишків у позиції 158 і Gluзалишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями і, необов'язково, в якому один або кілька амінокислотних залишків у решті позицій у протеазному домені є заміщеним іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями, та, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій. В іншому аспекті винахід стосується застосування поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Lys у позиції 157 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, для одержання медикаменту для лікування від нападів кровотечі або для зміцнення нормальної кровоспинної системи. В іншому аспекті винахід стосується застосування поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Lys у позиції 337 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, для одержання медикаменту для лікування від нападів кровотечі або для зміцнення нормальної кровоспинної системи. В іншому аспекті винахід стосується застосування поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Asp у позиції 334 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, для одержання медикаменту для лікування від нападів кровотечі або для зміцнення нормальної кровоспинної системи. В іншому аспекті винахід стосується застосування поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Ser у позиції 336 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, для одержання медикаменту для лікування від нападів кровотечі або для зміцнення нормальної кровоспинної системи. 81601 12 В іншому аспекті винахід стосується застосування поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому принаймні амінокислота, яка відповідає Val у позиції 158 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, для одержання медикаменту для лікування від нападів кровотечі або для зміцнення нормальної кровоспинної системи. В іншому аспекті винахід стосується застосування поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Glu у позиції 296 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, для одержання медикаменту для лікування від нападів кровотечі або для зміцнення нормальної кровоспинної системи. В іншому аспекті винахід стосується застосування поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Met у позиції 298 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, для одержання медикаменту для лікування від нападів кровотечі або для зміцнення нормальної кровоспинної системи. В іншому аспекті винахід передбачає застосування варіанта фактора коагуляції VII, у якому один або кілька Lys-залишків у позиції 157 і Lys-залишків у позиції 337 і Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 і Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Metзалишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями і, необов'язково, в якому один або кілька амінокислотних залишків у решті позицій у протеазному домені є заміщеним іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями, для одержання медикаменту для лікування від нападів кровотечі або для зміцнення нормальної кровоспинної системи. В іншому аспекті винахід стосується способу лікування від нападів кровотечі у суб'єкта або зміцнення нормальної кровоспинної системи, причому спосіб включає введення терапевтично або профілактично ефективної кількості поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Lys у позиції 157 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, суб'єктові, який цього потребує. В іншому аспекті винахід стосується способу лікування від нападів кровотечі у суб'єкта або зміцнення нормальної кровоспинної системи, причому спосіб включає введення терапевтично або профілактично ефективної кількості поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Lys у позиції 337 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, суб'єктові, який цього потребує. 13 В іншому аспекті винахід стосується способу лікування від нападів кровотечі у суб'єкта або зміцнення нормальної кровоспинної системи, причому спосіб включає введення терапевтично або профілактично ефективної кількості поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Asp у позиції 334 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, суб'єктові, який цього потребує. В іншому аспекті винахід стосується способу лікування від нападів кровотечі у суб'єкта або зміцнення нормальної кровоспинної системи, причому спосіб включає введення терапевтично або профілактично ефективної кількості поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Ser у позиції 336 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, суб'єктові, який цього потребує. В іншому аспекті винахід стосується способу лікування від нападів кровотечі у суб'єкта або зміцнення нормальної кровоспинної системи, причому спосіб включає введення терапевтично або профілактично ефективної кількості поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Val у позиції 158 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, суб'єктові, який цього потребує. В іншому аспекті винахід стосується способу лікування від нападів кровотечі у суб'єкта або зміцнення нормальної кровоспинної системи, причому спосіб включає введення терапевтично або профілактично ефективної кількості поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Glu у позиції 296 SEQ ID N0:1, є заміщеноюіншою амінокислотою, суб'єктові, який цього потребує. В іншому аспекті винахід стосується способу лікування від нападів кровотечі у суб'єкта або зміцнення нормальної кровоспинної системи, причому спосіб включає введення терапевтично або профілактично ефективної кількості поліпептиду Фактора VII, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 або її варіант, у якому амінокислота, яка відповідає Met у позиції 298 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою, суб'єктові, який цього потребує. В іншому аспекті винахід забезпечує спосіб лікування від нападів кровотечі у суб'єкта або зміцнення нормальної кровоспинної системи, причому спосіб включає введення терапевтично або профілактично ефективної кількості варіанта фактора коагуляції VII, у якому один або кілька Lys-залишків у позиції 157 і Lys-залишків у позиції 337 і Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 і Val-залишків у позиції 158 і Gluзалишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції 298 SEQ ID ΝΟ.Ί є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями і, необов'язково, в якому один або кілька амінокислотних залишків у решті позицій у 81601 14 протеазному домені є заміщеним іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями, суб'єктові, який цього потребує. В іншому аспекті винахід забезпечує фармацевтичну композицію, яка включає варіант фактора коагуляції VII, у якому один або кілька Lys-залишків у позиції 157 та Lys-залишків у позиції 337 і Asp-залишків у позиції 334 і Serзалишків у позиції 336 і Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями і, необов'язково, в якому один або кілька амінокислотних залишків у решті позицій у протеазному домені є заміщеним іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями; за умови, що цей варіант не є FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) або FVII(Ala298), та, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій. В іншому аспекті винахід забезпечує застосування варіанта фактора коагуляції VII, у якому один або кілька Lys-залишків у позиції 157 і Lys-залишків у позиції 337 і Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 і Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Metзалишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями і, необов'язково, в якому один або кілька амінокислотних залишків у решті позицій у протеазному домені є заміщеним іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями; за умови, що цей варіант не є FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) або FVII(Ala298), для одержання медикаменту для лікування від нападів кровотечі або для зміцнення нормальної кровоспинної системи. В іншому аспекті винахід забезпечує спосіб лікування або профілактики порушення кровотечі у суб'єкта або зміцнення нормальної кровоспинної системи, причому спосіб включає введення терапевтично або профілактично ефективної кількості варіанта фактора коагуляції VII, у якому один або кілька Lys-залишків у позиції 157 і Lysзалишків у позиції 337 і Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 і Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями і, необов'язково, в якому один або кілька амінокислотних залишків у решті позицій у протеазному домені є заміщеним іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями, за умови, що цей варіант не є FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), 15 FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) або FVII(Ala298), суб'єктові, який цього потребує. В одному варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому амінокислота, яка відповідає Lys у позиції 157 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому амінокислота, яка відповідає Lys у позиції 337 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому амінокислота, яка відповідає Asp у позиції 334 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому амінокислота, яка відповідає Ser у позиції 336 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому амінокислота, яка відповідає Val у позиції 158 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому амінокислота, яка відповідає Glu у позиції 296 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому амінокислота, яка відповідає Met у позиції 298 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому принаймні одна амінокислота у решті позицій у протеазному домені є заміщеною іншою амінокислотою. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому щонайбільше 20 додаткових амінокислот у решті позицій у протеазному домені є заміщеними іншими амінокислотами. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому принаймні одна амінокислота, яка відповідає амінокислоті у позиції, вибраній з-поміж 159-170 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому принаймні одна амінокислота, яка відповідає амінокислоті у позиції, вибраній з-поміж 290-312 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому принаймні одна амінокислота, яка відповідає амінокислоті у позиції, вибраній з-поміж 330-339 SEQ ID N0:1, є заміщеною іншою амінокислотою. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому вищезгаданий Lys у позиції 157 SEQ ID N0:1 є заміщеним амінокислотою, вибраною з групи, що складається з Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp та Glu. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому вищезгаданий Lys у позиції 337 SEQ ID N0:1 є заміщеним амінокислотою, вибраною з групи, що 81601 16 складається з Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp та Glu. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому вищезгаданий Asp у позиції 334 SEQ ID N0:1 є заміщеним амінокислотою, вибраною з групи, що складається з Gly та Glu. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому вищезгаданий Ser у позиції 336 SEQ ID N0:1 є заміщеним амінокислотою, вибраною з групи, що складається з Gly та Glu. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому вищезгаданий Val у позиції 158 SEQ ID N0:1 є заміщеним амінокислотою, вибраною з групи, що складається з Ser, Thr, Asn, Gin, Asp та Glu. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому вищезгаданий Glu у позиції 296 SEQ ID N0:1 є заміщеним амінокислотою, вибраною з групи, що складається з Arg, Lys та Val. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому вищезгаданий Met у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним амінокислотою, вибраною з групи, що складається з Lys, Arg, Gin та Asn. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому амінокислота є заміщеною іншою амінокислотою, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому вищезгаданий поліпептид Фактора VII є Фактором VII людини. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, у якому вищезгаданий поліпептид Фактора VII є Фактором VIIa людини. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, незалежно вибраним з групи, що складається з [E296VJ-FVII, [M298QJ-FVII та [S336GJ-FVII. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є поліпептидом, незалежно вибраним з групи, що складається з [V158T/M298Q]-FVII, [E296V/M298QJ-FVII, [V158D/E296VJ-FVII, [V158D/M298QJ-FVII та [V158D/M298KJ-FVII. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є [V158D/E296V/M298Q]FVI I. В іншому варіанті втілення винаходу поліпептид Фактора VII є [V158D/E296V/M298Q/K337AJ-FVII. В іншому варіанті втілення варіанти Фактора VII є варіантами, в яких один або кілька Lysзалишків у позиції 157 і Lys-залишків у позиції 337 і Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 і Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями і, необов'язково, в якому один або кілька 17 амінокислотних залишків у решті позицій у протеазному домені є заміщеним іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями, за умови, що цей варіант не є FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) або FVII(Ala298). В одному варіанті втілення варіанти Фактора VII є варіантами, в яких один або кілька Lysзалишків у позиції 157 і Lys-залишків у позиції 337 і Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 і Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями; за умови, що цей варіант не є FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) або FVII(Ala298). В іншому варіанті втілення один або кілька Lys-залишків у позиції 157 і Lys-залишків у позиції 337 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення один або кілька Lys-залишків у позиції 157 і Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення Lys-залишок у позиції 157 і один або кілька з Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Metзалишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення один або кілька Lys-залишків у позиції 157 і Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення Lys-залишок у позиції 157 і один або кілька з Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення один або кілька Lys-залишків у позиції 337 і Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення Lys-залишок у позиції 337 та один або кілька Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Metзалишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути 81601 18 кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення один або кілька Lys-залишків у позиції 337 і Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення Lys-залишок у позиції 337 і один або кілька з Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення один або кілька з Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції 298 і один або кілька з Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення Lys-залишок у позиції 157 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення Lys-залишок у позиції 337 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення один або кілька з Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції 298 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення один або кілька з Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336 SEQ ID N0:1 є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В іншому варіанті втілення Lys-залишок у позиції 157 є заміщеним Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp або Glu; і/або Lys-залишок у позиції 337 є заміщеним Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp або Glu; і/або Val-залишок у позиції 158 є заміщеним Ser, Thr, Asn, Gin, Asp або Glu; і/або Glu-залишок у позиції 296 є заміщеним Arg, Lys або Val; і/або Met-залишок у позиції 298 є заміщеним Arg, Lys, Gin або Asn; і/або Asp-залишок у позиції 334 є заміщеним Glu; і/або Ser-залишок у позиції 336 є заміщеним Gly. В іншому варіанті втілення Lys-залишок у позиції 157 або Lys-залишок у позиції 337 або Aspзалишок у позиції 334 або Ser-залишок у позиції 336 є єдиним заміщеним амінокислотним залишком. В іншому варіанті втілення Val-залишок у позиції 158 і Glu-залишок у позиції 296 і Metзалишок у позиції 298 є єдиними заміщеними амінокислотними залишками. 19 В іншому варіанті втілення співвідношення між активністю варіанта згідно з винаходом та активністю природного поліпептиду Фактора VII, показаного у SEQ ID N0:1, дорівнює приблизно 1,25 при випробуванні шляхом описаного авторами "аналізу гідролізу in vitro". В іншому варіанті втілення це співвідношення становить щонайменше приблизно 2,0; в іншому варіанті втілення — щонайменше приблизно 4,0. В іншому варіанті втілення Gin-залишок у позиції 312 у протеазному домені не є заміщеним. В іншому варіанті втілення рекомбінантна клітина-хазяїн є взятою у ссавця. В іншому варіанті втілення клітину вибирають із групи, що складається з СНО-клітин, ВНК-клітин або НЕКклітин. В іншому варіанті втілення щонайбільше 20 додаткових амінокислотних залишків у решті позицій у протеазному домені (позиції 153-406) є заміщеними. В одному варіанті втілення щонайбільше 15 додаткових амінокислотних залишків є заміщеними; в іншому варіанті втілення щонайбільше 10 амінокислотних залишків є заміщеними; в іншому варіанті втілення щонайбільше 5 амінокислотних залишків є заміщеними. В іншому варіанті втілення один або кілька з амінокислотних залишків у позиціях 157, 337, 158, 296, 298, 334, або 336 є єдиними заміщеними амінокислотними залишками. В іншому варіанті втілення один або обидва Lys-залишки у позиції 157 та у позиції 337 є заміщеними нейтральним амінокислотним залишком, або один із залишків є заміщеним негативно зарядженим амінокислотним залишком, або один Lys-залишок є заміщеним нейтральним амінокислотним залишком, і один Lys-залишок є заміщеним негативно зарядженим амінокислотним залишком. В іншому варіанті втілення один або обидва Asp-залишки у позиції 334 і Ser-залишок у позиції 336 є заміщеними амінокислотним залишком, здатним утворювати водневі зв'язки і/або здатним утворювати соляний місток, або один або обидва з залишків є заміщеним(и) малим амінокислотним залишком. В іншому варіанті втілення Lys-залишок у позиції 157 і/або Lys-залишок у позиції 337 є єдиними заміщеними амінокислотними залишками. В одному варіанті втілення Lysзалишок у позиції 157 є заміщеним. В іншому варіанті втілення Lys-залишок у позиції 337 є заміщеним. В іншому варіанті втілення Val-залишок у позиції 158 і/або Met-залишок у позиції 298 є єдиними заміщеними амінокислотними залишками. В іншому варіанті втілення Asp-залишок у позиції 334 і/або Ser-залишок у позиції 336 є єдиними заміщеними амінокислотними залишками. В іншому варіанті втілення Lys-залишок у позиції 157 є заміщеним амінокислотним залишком, вибраним з-поміж Val, Leu, lie, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, 81601 20 Asp та Gin. В іншому варіанті втілення Lysзалишок у позиції 157 є заміщеним амінокислотним залишком, вибраним із групи, що складається з Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp та Glu. В іншому варіанті втілення Lys-залишок у позиції 337 є заміщеним амінокислотним залишком, вибраним з-поміж Val, Leu, lie, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, Asp або Gin. В іншому варіанті втілення Lysзалишок у позиції 337 є заміщеним Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp або Glu. В іншому варіанті втілення Val-залишок у позиції 158 є заміщеним амінокислотним залишком, вибраним з-поміж Leu, He, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp та Gin. В іншому варіанті втілення Valзалишок у позиції 158 є заміщеним амінокислотним залишком, вибраним із групи, що складається з Ser, Thr, Asn, Gin, Asp та Glu. В іншому варіанті втілення Glu-залишок у позиції 296 є заміщеним амінокислотним залишком, вибраним з-поміж Val, Leu, lie, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Asp або Gin. В іншому варіанті втілення залишок є заміщеним Arg, Lys або Val. В іншому варіанті втілення Met-залишок у позиції 298 є заміщеним амінокислотним залишком, вибраним з-поміж Val, Leu, He, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Glu, Asp або Gin. В іншому варіанті втілення залишок є заміщеним by Lys, Arg, Gin або Asn. В іншому варіанті втілення Asp-залишок у позиції 334 є заміщеним Gly та Glu. В іншому варіанті втілення Ser-залишок у позиції 336 є заміщеним Gly та Glu. В іншому варіанті втілення винаходу співвідношення між активністю варіанта та активністю природного поліпептиду Фактора VII, показаного у SEQ ID N0:1, дорівнює приблизно 1,25 при випробуванні шляхом описаного авторами "аналізу гідролізу in vitro" (Приклад 11). В іншому варіанті втілення це співвідношення становить щонайменше приблизно 2,0; у ще одному варіанті втілення — щонайменше приблизно 4,0. В іншому аспекті винахід забезпечує варіанти FVIIa, які мають підвищену незалежну від тканинного фактора активність порівняно з природним FVIIa. В одному варіанті втілення підвищена активність не супроводжується змінами у специфічності до субстрату. В одному варіанті втілення зв'язування варіантів з тканинним фактором не погіршується (порівняно з FVIIa дикого типу); в іншому варіанті втілення варіанти мають принаймні таку саму активність, що й Фактор VIIa дикого типу при зв'язуванні з тканинним фактором. В іншому варіанті втілення варіанти Фактора VII, крім уже здійсненого заміщення амінокислот у позиціях 157, 158, 296, 298, 334, 336 або 337 та будь-якого необов'язкового заміщення амінокислот у будь-якій іншій позиції у протеазному домені, також мають деякі амінокислотні залишки, заміщені в N-кінцевому 21 81601 домені Gla (залишки 1-37). В одному варіанті втілення один або кілька з амінокислотних залишків у позиціях 10 та 32 (див. SEQ ID N0:1) Фактора VII є заміщеним(и) іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. В одному варіанті втілення амінокислотний залишок Pro у позиції 10 є заміщеним Gin, Arg, His, Gin, Asn або Lys; і/або амінокислотний залишок Lys у позиції 32 є заміщеним Glu, Gin або Asn. Стислий опис графічних матеріалів На Фігурі 1 показано повну амінокислотну послідовність природного Фактора коагуляції VII людини (SEQ ID N0:1). У даному описі амінокислоти є представленими з застосуванням вказаних у таблиці 1 скорочень, затверджених Комісією ІЮПАК-МБС з біохімічної номенклатури (CBN). Амінокислоти та їхні ізомери, представлені за назвою або нижчезазначеними скороченнями, мають природну L-форму, якщо не вказано іншого. Крім того, лівий та правий кінці амінокислотної послідовності пептиду відповідно є N- та Скінцями, якщо не вказано іншого. Таблиця 1 Скорочення для амінокислот Амінокислота Гліцин Пролін Аланін Валін Лейцин Ізолейцин Метіонін Цистеїн Фенілаланін Тирозин Триптофан Гістидин Лізин Аргінін Глутамін Аспарагін Глутамінова кислота Аспарагінова кислота Серин Треонін Трилітерний Однолітерний код код Gly G Pro Ρ Ala A Val V Leu L He 1 Met Μ Cys С Phe F Tyr Υ Trp W His Η Lys к Arg R Gin Q Asn N Glu Ε Asp D Ser Thr S Τ Було виявлено, що варіанти FVIIa, в яких принаймні один з амінокислотних залишків Lys157, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 або Lys337 (і необов'язково один або кілька додаткових залишків) є заміщеним іншим амінокислотним залишком, мають коагулянтну активність. Залишки розміщуються в зоні, яку вважають такою, що впливає на вставлення амінного кінця протеазного домену, а отже, і на утворення 22 каталітично активної конформації Фактора VIIa, яка залежить від соляного містка між кінцевою аміногрупою II153 та боковим ланцюгом Asp343. Ці заміщення можуть усувати електростатичне відштовхування, додавати водневі зв'язки або іншим чином сприяти вставленню амінного кінця. Завдяки більш високій активності, характерній для описаного варіанта Фактора VIIa, порівняно з природним FVIIa, достатньою може бути нижча доза для досягнення функціонально адекватної концентрації у місці дії, а отже, існує можливість введення нижчої дози суб'єктові, який страждає від нападів кровотечі або потребує зміцнення нормальної кровоспинної системи. Як було коротко сказано вище, авторами було висловлено припущення, що завдяки заміщенню одного або кількох Lys-залишків у позиції 157 і Lysзалишків у позиції 337 і Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції 298 і Asp-залишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336, Фактор VIIa спонтанно набуває більш активної конформації, яка зазвичай має викликатися тканинним фактором. Такі варіанти Фактора VIIa виявляють характерну активність, яка може бути терапевтично корисною у ситуаціях, коли прокоагулянтна активність є незалежною від тканинного фактора (утворення Фактора Ха на поверхні тромбоцитів), як, наприклад, при введенні високих доз NovoSeven®. Заміна додаткових амінокислотних залишків у протеазному домені, крім ефекту, який досягається шляхом заміни одного або кількох Lys-залишків у позиції 157 і Lys-залишків у позиції 337 і Val-залишків у позиції 158 і Glu-залишків у позиції 296 і Met-залишків у позиції' 298 і Aspзалишків у позиції 334 і Ser-залишків у позиції 336, може також сприяти утворенню активної конформації молекули. Однак вважається, що найбільш виражений ефект можна спостерігати, якщо вищезгадані мутації здійснювати поблизу (послідовно або у просторі) від цих семи залишків. Заміна кількох амінокислотних залишків в Nкінцевому домені Gla (залишки 1-37) Фактора VII може забезпечити білок зі значно вищою афінністю до мембранних фосфоліпідів, таких, як мембранні фосфоліпіди клітин, що несуть тканинний фактор, або тромбоцитів. Таким чином, вищезгадані варіанти Фактора VII, крім уже здійсненого заміщення амінокислот у позиціях 157, 158, 296, 298, 334, 336 або 337 та будь-якого необов'язкового заміщення амінокислот у будьякій іншій позиції у протеазному домені, також мають деякі амінокислотні залишки, заміщені в Nкінцевому домені Gla, отримуючи білок, який має підвищену активність, а також підвищену афінність до мембранних фосфоліпідів порівняно з природним Фактором VII. В оптимальному варіанті амінокислотні залишки у позиціях 10 та 32 (див. SEQ ID N0:1) Фактора VII можуть бути заміщені іншим амінокислотним залишком, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями. Прикладами оптимальних амінокислотних залишків для включення у вищезгадані позиції є: амінокислотний залишок Pro у позиції 10, заміщений Gin, Arg, His, Gin, Asn 23 або Lys; і/або амінокислотний залишок Lys у позиції 32, заміщений Glu, Gin або Asn. Для заміщення придатними є також інші залишки у Gla-домені на основі різної афінності фосфоліпідів та різних послідовностей залежних від вітаміну К білків плазми. У даному контексті трилітерні позначення амінокислот вжито в їх традиційному значенні. Якщо спеціально не вказано іншого, згадані авторами амінокислоти є L-амінокислотами. Термін "N-кінцевий GLA-домен" означає амінокислотну послідовність 1-37 фактора FVII. Термін "протеазний домен" означає амінокислотну послідовність 153-406 фактора FVII (важкий ланцюг фактора FVIIa). Трилітерне позначення "GLA" означає 4карбоксиглутамінову кислоту (γкарбоксиглутамат). Термін "нейтральний амінокислотний залишок" (при рН 6-8) охоплює амінокислоти, вибрані зпоміж Ala, Val, Leu, He, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin. Термін "мала амінокислота" охоплює амінокислоти вибрані з-поміж Gly, Glu та Ala. Термін "негативно заряджений амінокислотний залишок" (при рН 6-8) охоплює амінокислоти, вибрані з-поміж Asp та Glu. Вжитий авторами термін "поліпептид Фактора VII" означає будь-який білок, який включає амінокислотну послідовність 1-406 природного Фактора VII людини (SEQ ID NO: 1) або його варіанти. До них, крім інших, належать Фактор VII людини, Фактор VIIa людини та їх варіанти. Вжитий авторами термін "Фактор VII" охоплює молекулу неактивного одноланцюгового Фактора VII зимогена, а також молекулу активованого дволанцюгового Фактора VII (Фактор VIIa). Він включає білки, які мають амінокислотну послідовність 1-406 природного Фактора VII людини або Фактора VIIa. Він також включає білки з дещо зміненою амінокислотною послідовністю, наприклад, модифікований N-кінець, який включає N-кінцеві делеції або додавання амінокислот, якщо ці білки значною мірою зберігають активність Фактора VIIa. Вжитий авторами термін "фактор VIIa" або "FVIIa" означає продукт, який складається з активованої форми (фактор VIIa). "Фактор VII" або "Фактор VIIa", який охоплюється вищезгаданим визначенням, також включає природні алельні варіанти, які можуть існувати і траплятися у різних суб'єктів. Крім того, ступінь та місцезнаходження гліколізації або інших післятрансляційних змін можуть бути різними, залежно від вибраних клітини-хазяїв та характеристик оточення клітинихазяїна. Вжиті авторами терміни "варіант" або "варіанти" означають Фактор VII, який має послідовність SEQ ID N0:1, у якій одна або кілька амінокислот вихідного білка є заміщеними іншою амінокислотою, і/або у якій одна або кілька амінокислот вихідного білка є делетованими, і/або у якій одна або кілька амінокислот є вставленими у білок, і/або у якій одна або кілька амінокислот є доданими до вихідного білка. Таке додавання 81601 24 може відбуватися або на N-кінці, або на С-кінці вихідного білка або в обох місцях. "Варіант" або "варіанти", які охоплюються цим визначенням, мають активність FVII у їх активованій дволанцюговій молекулярній формі. В одному варіанті втілення варіант є на 65 % ідентичним послідовності SEQ ID N0:1. В одному варіанті втілення варіант є на 80 % ідентичним послідовності SEQ ID N0:1. В іншому варіанті втілення варіант є на 90 % ідентичним послідовності SEQ ID N0:1. В іншому варіанті втілення варіант є на 95 % ідентичним послідовності SEQ ID N0:1. Вжитий авторами термін "нуклеїновокислотна послідовність" означає будь-яку молекулу нуклеїнової кислоти, яка походить від кДНК, геномної ДНК, синтетичної ДНК, напівсинтетичної ДНК, РНК або має змішане походження. Термін "послідовність" означає фрагмент нуклеїнової кислоти, який може бути одноабо дволанцюговим, і в основі якого може лежати повна або часткова природна нуклеотидна послідовність, яка кодує потрібний поліпептид. Послідовність необов'язково може містити інші фрагменти нуклеїнової кислоти. Так само, термін "амінокислотний залишок, який може бути кодований нуклеїновокислотними послідовностями" охоплює амінокислотні залишки, які можуть бути кодовані визначеними вище нуклеїново кислотними послідовностями, тобто, такі амінокислоти, як Ala, Val, Leu, lie, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Туг, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp та Gin. Вжитий авторами термін "інша амінокислота" означає амінокислоту, яка відрізняється від амінокислоти, яка трапляється в цій позиції у природі. Він включає, крім інших, амінокислоти, які можуть бути кодовані нуклеїновокислотною послідовністю. В оптимальному варіанті інша амінокислота має природну L-форму і може бути кодована нуклеїновокислотною послідовністю. Одним з прикладів є L-цистеїн (Cys). У даному контексті, термін "лікування" охоплює як запобігання очікуваній кровотечі, наприклад, при хірургічному втручанні, так і регулювання кровотечі, яка вже відбувається, наприклад, при травмах, з метою стримування кровотечі або зведення її до мінімуму Профілактичне введення варіанта Фактора VIIa згідно з винаходом, таким чином, охоплюється терміном "лікування". Вжитий авторами термін "активність" означає здатність поліпептиду Фактора VII або його варіанта до перетворення його субстратного Фактора X на активний Фактор Ха. Активність поліпептиду Фактора VII вимірюють шляхом "аналізу протеолізу in vitro". Термін "характерна активність" також включає здатність до утворення тромбіну на поверхні активованих тромбоцитів за відсутності тканинного фактора. Термін "зміцнення нормальної' кровоспинної системи" означає збільшення здатності до утворення тромбіну. Вжитий авторами термін "порушення кровотечі" означає будь-яке дефект, уроджений, 25 набутий або викликаний, який має клітинне або молекулярне походження і виявляє себе у кровотечі. Прикладами є дефіцит коагулювального фактора (наприклад, гемофілія А та В або дефіцит факторів коагуляції XI або VII), інгібітори коагулювального фактора, недостатня функція тромбоцитів, тромбоцитопенія або псевдогемофілія. Термін "напади кровотечі" охоплює неконтрольовану і надмірну кровотечу, яка є основною проблемою, пов'язаною як з хірургічним втручанням, так і з іншими формами пошкодження тканин. Неконтрольована і надмірна кровотеча може траплятись у суб'єктів, що мають нормальну систему коагуляції, та суб'єктів, що мають порушення коагуляції або кровотечі. Дефіцит коагулювального фактора (гемофілія А та В, дефіцит факторів коагуляції XI або VII) або інгібіторів коагулювального фактора може бути причиною порушення кровотечі. Надмірна кровотеча також трапляється у суб'єктів з нормально функціонуючим каскадом згортання крові (без дефіциту коагулювального фактора або інгібіторів будь-якого з факторів коагуляції) і може бути викликана недостатньою функцією тромбоцитів, тромбоцитопенією або псевдогемофілією. У таких випадках кровотечу можна порівняти з кровотечею, викликаною гемофілією, оскільки кровоспинна система, як і при гемофілії, відчуває брак або відхилення необхідних для згортання "сполук" (таких, як тромбоцити або білка фактора фон Віллебранда), що викликає велику кровотечу. У суб'єктів, які зазнали широкого пошкодження тканин у зв'язку з хірургічним втручанням або широкою травмою, нормальний кровоспинний механізм може бути перевантаженим через необхідність негайного гемостазу, і у них може траплятися кровотеча, незважаючи на нормальний кровоспинний механізм. Досягнення задовільного гемостазу також є проблемою, коли кровотеча відбувається в таких органах, як мозок, зона внутрішнього вуха та очі, з обмеженою можливістю хірургічного гемостазу. Така сама проблема може виникнути у процесі біопсії з різних органів (печінки, легенів, пухлинної тканини, шлунково-кишкового тракту), а також при лапароскопічному хірургічному втручанні. Спільними у цих ситуаціях є труднощі, пов'язані з забезпеченням гемостазу хірургічними засобами (шви, затискачі та ін.), які також трапляються при дифузній кровотечі (геморагічний гастрит та профузна маткова кровотеча). Гострі та профузні кровотечі також можуть траплятись при антикоагулянтній терапії в суб'єктів, у яких порушення гемостазу було викликане цією терапією. Такі суб'єкти можуть потребувати хірургічного втручання у випадку, коли треба швидко протидіяти антикоагулювальному впливові. Часто застосовуваною процедурою для суб'єктів з локалізованим раком передміхурової залози є радикальна ретролобкова простатектомія. Операція часто ускладнюється значною і часом надмірною втратою крові. Значна втрата крові під час простатектомії найчастіше буває пов'язаною з ускладненою анатомічною 81601 26 ситуацією, з різними густо васкуляризованими ділянками, які є важкодоступними для хірургічного гемостазу, що може призводити до дифузної кровотечі з великої площі. Іншою ситуацією, яка може викликати проблеми в разі незадовільного гемостазу, є ситуація, коли суб'єкти з нормальним кровоспинним механізмом отримують антикоагулянтну терапію для профілактики тромбоемболічної хвороби. Така терапія може включати застосування гепарину, інших форм протеогліканів, варфарину або інших форм антагоністів вітаміну К, а також аспірину та інших інгібіторів агрегації тромбоцитів. В одному варіанті втілення винаходу кровотеча є пов'язаною з гемофілією. В іншому варіанті втілення кровотеча є пов'язаною з гемофілією з набутими інгібіторами. В іншому варіанті втілення кровотеча є пов'язаною з тромбоцитопенією. В іншому варіанті втілення кровотеча є пов'язаною з псевдогемофілією. В іншому варіанті втілення кровотеча є пов'язаною з важким пошкодженням тканин. В іншому варіанті втілення кровотеча є пов'язаною з важкою травмою. В іншому варіанті втілення кровотеча є пов'язаною з хірургічним втручанням. В іншому варіанті втілення кровотеча є пов'язаною з лапароскопічним хірургічним втручанням. В іншому варіанті втілення кровотеча є пов'язаною з геморагічним гастритом. В іншому варіанті втілення кровотеча є профузною матковою кровотечею. В іншому варіанті втілення кровотеча трапляється в органах з обмеженою можливістю механічного гемостазу. В іншому варіанті втілення кровотеча трапляється у мозку, зоні внутрішнього вуха або очах. В іншому варіанті втілення кровотеча є пов'язаною з процесом біопсії. В іншому варіанті втілення кровотеча є пов'язаною з антикоагулянтною терапією. Вжитий авторами термін "суб'єкт" означає будь-яку тварину, зокрема, ссавців, таких як людина, і в відповідному випадку може вживатися нарівні з терміном "пацієнт". Вжитий авторами термін "придатне середовище для вирощування" означає середовище, яке містить поживні речовини та інші компоненти, які потрібні для вирощування клітин та експресії нуклеїновокислотної послідовності, що кодує варіант Фактора VII згідно з винаходом. Одержання варіантів Фактора VII Описані авторами варіанти Фактора VII одержують за допомогою рекомбінантних нуклеїнових кислот. Взагалі, клоновану нуклеїновокислотну послідовність Фактора VII дикого типу модифікують для кодування потрібного білка. Цю модифіковану послідовність після цього вставляють у вектор експресії, який, у свою чергу, трансформують або трансфікують у клітини-хазяї. Оптимальними клітинами-хазяями є вищі еукаріотні клітини, зокрема, культивовані клітини ссавців. Повні нуклеотидні та амінокислотні послідовності для Фактора VII людини є відомими (див. патент США 4,784,950, в якому описано клонування та експресію рекомбінантного Фактора VII людини). 27 Послідовність Фактора VII великої рогатої худоби описано в роботі [Takeya et al., J. Biol. Chem. 263:14868-14872 (1988)]. Зміни амінокислотних послідовностей здійснюють різними способами. Модифікація нуклеїновокислотної послідовності може відбуватися шляхом сайт-специфічного мутагенезу. Способи сайт-специфічного мутагенезу є добре відомими спеціалістам і описані, наприклад, у роботах [Zoller and Smith (DNA 3:479-488, 1984) або "Splicing by extension overlap", Horton et al., Gene 77. 1989. pp. 61-68]. Таким чином, застосовуючи нуклеотидні та амінокислотні послідовності Фактора VII, можна внести потрібні зміни. Так само, добре відомими спеціалістам є процедури одержання послідовності ДНК з застосуванням полімеразної ланцюгової реакції зі специфічними праймерами [пор. PCR Protocols. 1990, Academic Press, San Diego, California, USA)]. Нуклеїновокислотна послідовність, яка кодує варіант Фактора VII згідно з винаходом, може походити від геномної ДНК або кДНК, одержаної, наприклад, шляхом приготування бібліотеки геномної ДНК або кДНК та відбору послідовностей ДНК, які повністю або частково кодують поліпептид шляхом гібридизації з застосуванням синтетичних олігонуклеотидних зондів згідно зі стандартними методиками [пор. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989]. Нуклеїновокислотна послідовність, яка кодує варіант Фактора VII, також може бути одержана синтетично загальноприйнятими стандартними способами, наприклад, фосфоамідитним способом, описаним у [роботі Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 1869], або способом, описаним у роботі Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805. Згідно з фосфоамідитним способом, олігонуклеотиди синтезують, наприклад, в автоматичному синтезаторі ДНК, очищують, гібридизують, зшивають і клонують у придатні вектори. Крім того, нуклеїновокислотна послідовність може мати змішане походження від синтетичної та геномної ДНК, синтетичної та кДНК або геномної та кДНК і одержується шляхом зшивання фрагментів синтетичного, геномного або кДНК походження (у відповідному випадку), фрагментів, які відповідають різним частинам повної нуклеїновокислотної послідовності, згідно зі стандартними методиками. Нуклеїновокислотна послідовність в оптимальному варіанті є послідовністю ДНК. Послідовності ДНК для застосування при одержанні варіантів Фактора VII згідно з даним винаходом, як правило, кодують пре-прополіпептид на амінному кінці Фактора VII для забезпечення належної післятрансляційної обробки (наприклад, гамма-карбоксилювання залишків глутамінової кислоти) та секреції з клітини-хазяїна. Пре-про-поліпептид може бути поліпептидом Фактора VII або іншого залежного від вітаміну К білка плазми, такого, як Фактор IX, 81601 28 Фактор X, протромбін, протеїн С або протеїн S. Як стане зрозуміло спеціалістам, можуть бути здійснені додаткові модифікації в амінокислотній послідовності варіантів Фактора VII, якщо ці модифікації не дуже шкодять здатності білка діяти як коагулянт. Наприклад, варіанти Фактора VII також можуть бути модифіковані в сайт розщеплення активації для інгібування перетворення Фактора VII зимогена на його активовану дволанцюгову форму, яке в цілому описано у [патенті США 5,288,629]. Вектори експресії, які застосовують для експресії варіантів Фактора VIIa включають промотор, здатний спрямовувати транскрипцію клонованого гена або кДНК. Оптимальними промоторами для застосування в культивованих клітинах ссавців є вірусні промотори та клітинні промотори. До вірусних промоторів належать SV40 промотор [Subramani et al., Мої. Cell. Biol. 1:854-864, 1981] та CMV промотор [Boshart et al., QeJl 41:521-530, 1985]. Найкращим вірусним промотором є головний пізній промотор з аденовірусу 2 [Kaufman and Sharp, Мої. Cell. Biol. 2:1304-1319, 1982]. До клітинних промоторів належать промотор гена каппа миші [Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983] та VH промотор миші [Loh et al., С_еЦ 33:85-93, 1983]. Найкращим клітинним промотором є промотор металотіонеїн-І миші [Palmiter et al., Science 222:809-814, 1983]. Вектори експресії також можуть містити кілька місць зрощення РНК, розташованих за промотором і перед місцем вставлення самої послідовності Фактора VII. Оптимальні місця зрощення РНК можуть бути одержані з генів аденовірусу та/або імуноглобуліну. Вектори експресії також містять сигнал поліаденілування, розташований після місця вставлення. Найкращими сигналами поліаденілування є ранній або пізній сигнал поліаденілування з SV40 [Kaufman and Sharp, ibid.], сигнал поліаденілування з ділянки аденовірусу 5 ЕІЬ, термінатор гена гормону росту людини [DeNoto et al. Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981] або сигнал поліаденілування з гена Фактора VII людини або гена Фактора VII великої рогатої худоби. Вектори експресії також можуть містити некодуючу вірусну лідерну послідовність, таку, як трикомпонентний лідер аденовірусу 2, розташований між промотором та місцями зрощення РНК та енхансерні послідовності, такі, як енхансер SV40. Клоновані послідовності ДНК вводять у культивовані клітини ссавців, наприклад, шляхом опосередкованої фосфатом кальцію трансфекції [Wigler et al., Сll 14:725-732, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973] або електропорації [Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982]. Для розпізнання та відбору клітин, які експресують екзогенну ДНК, ген, який надає селектованого фенотипу (селектований маркер), як правило, вводять у клітини разом з потрібним геном або кДНК. До оптимальних селектованих маркерів належать гени, які надають резистентності до ліків, такі, як неоміцин, 29 гігроміцин та метотрексат. Селектованим маркером може бути ампліфікований селектований маркер. Оптимальним ампліфікованим селектованим маркером є послідовність дигідрофолатредуктази (DHFR). Селектовані маркери описано в роботі Thilly [Клітин ссавців Technology. Butterworth Publishers, Stoneham, MA, на яку авторами робиться посилання]. Спеціаліст у даній галузі легко зможе вибрати придатні селектовані маркери. Селектовані маркери можуть бути введені у клітину на окремій плазміді одночасно з потрібним геном або можуть бути введені на тій самій плазміді. Якщо їх вводять на тій самій плазміді, селектований маркер та потрібний ген можуть перебувати під контролем різних промоторів або одного промотора, причому останній порядок створює дицистронний сигнал. Послідовності цього типу спеціалістам відомі [наприклад, Levinson and Simonsen, U.S. 4,713,339]. Вигідним також може бути додавання до суміші, яку вводять у клітини, додаткової ДНК, відомої як "ДНК-носій". Після приймання клітинами ДНК їх вирощують у відповідному середовищі для вирощування, як правило, протягом 1-2 днів, для започаткування експресії потрібного гена. Середовищем, яке застосовують для культивування клітин, може бути будь-яке традиційне середовище, придатне для вирощування клітин-хазяїв, наприклад, мінімальні або комплексні середовища, які містять придатні додатки. Придатні середовища можна придбати через торгівлю або одержати згідно з опублікованими рецептами (наприклад, у каталогах Американського зібрання типових культур). Середовища одержують, застосовуючи відомі спеціалістам процедури (див., наприклад, посилання, що стосуються бактерій та дріжджів; [Bennett, J.W. and LaSure, L, editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991]. Середовища для вирощування, як правило, включають джерело вуглецю, джерело азоту, незамінні амінокислоти, незамінні цукри, вітаміни, солі, фосфоліпіди, білки та фактори росту. Для одержання гамма-карбоксильованих варіантів Фактора VII середовище має містити вітамін К, в оптимальному варіанті — у концентрації приблизно від 0,1 мг/мл до приблизно 5 мг/мл. Після цього застосовують барвник для відбору на ріст клітин, які стабільно експресують селектований маркер. Для клітин, які було трансфіковано ампліфікованим селектованим маркером, концентрацію барвника збільшують для відбору більшої кількості копій клонованих послідовностей, підвищуючи, таким чином, рівень експресії. Клони стабільно трансфікованих клітин після цього відбирають на експресію потрібного варіанта Фактора VII. До оптимальних ліній клітин ссавців належать лінії клітин СНО (АТСС CCL 61), COS-1 (АТСС CRL 1650), нирок новонародженого хом'яка (ВНК) та 293 (АТСС CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Оптимальною лінією клітин ВНК є лінія клітин tk ts13 BHK [Waechter and Baserga. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110. 1982], далі — клітини ВНК 570. Лінія клітин ВНК 81601 30 570 зберігається в Американському зібранні типових культур (АТСС), 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, під інвентарним номером АТСС CRL 10314. Лінія клітин tk ts13 ВНК також зберігається в АТСС під інвентарним номером CRL 1632. Крім того, можуть бути застосовані й різні інші лінії клітин, включаючи клітини Rat Hep І (гепатоаденома щура; АТСС CRL 1600), Rat Hep II (гепатоаденома щура; АТСС CRL 1548), ТСМК (АТСС CCL 139), легенів людини (АТСС НВ 8065), NCTC 1469 (АТСС CCL 9.1) та DUKX [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 774216-4220. 1980]. Для одержання варіантів Фактора VII згідно з винаходом застосовують технологію трансгенних тварин. В оптимальному варіанті одержують білки в молочних залозах самиці ссавця-хазяїна. Експресія в молочній залозі з наступною секрецією потрібного білка в молоко дозволяє долати багато труднощів, які трапляються при виділенні білків з інших джерел. Молоко легко збирається, може бути доступним у великій кількості і має добрі біохімічні характеристики. Крім того, у молоці в великій концентрації присутні основні білки (зазвичай приблизно від 1 до 15г/л). З комерційної точки зору безсумнівну перевагу віддають застосуванню як хазяїв видів, які дають високі надої молока. Хоча використовують і менших тварин, таких, як миші та щури (і їм віддають перевагу на етапі випробувань), перевагу віддають худобі, наприклад, свиням, козам, вівцям та великій рогатій худобі. Особливу перевагу віддають вівцям через такі чинники, як передісторія трансгенезу цього виду, вироблення молока, дешевизна та доступність обладнання для надоювання овечого молока [див., наприклад, WO 88/00239] для порівняння чинників, які впливають на вибір виду-хазяїна). Взагалі, бажано вибирати тварин-хазяїв, яких розводять для одержання молочних продуктів, таких, як східнофрисландська вівця, або впровадження молочного поголів'я шляхом пізнішого розведення трансгенної лінії. У будь-якому разі слід використовувати тварин, які напевно мають добре здоров'я. Для досягнення експресії у молочній залозі застосовують промотор транскрипції з гена білка молока. До генів білка молока належать гени, які кодують казеїни [див. патент США 5,304,489], бета-лактоглобулін, а-лактоальбумін та кислий білок молочної сироватки. Оптимальним є беталактоглобуліновий (BLG) промотор. У разі гена бета-лактоглобуліну вівці, як правило, застосовують ділянку з принаймні найближчих 406 п. н. 5'-бокової послідовності гена, хоча перевагу віддають більшим фрагментам 5'-бокової послідовності довжиною до приблизно 5 тис. п. н., таким, як фрагмент ДНК довжиною -4,25 тис. п. н., який включає 5'-боковий промотор та некодуючу частину гена бета-лактоглобуліну (див. Whitelaw et al., Biochem. J. 286: 31-39 (1992)). Придатними є також інші подібні фрагменти промотора ДНК інших видів. Інші ділянки гена бета-лактоглобуліну також можуть бути вставлені у послідовності, як і геномні ділянки гена, який має бути експресований. Серед спеціалістів вважається, що 31 послідовності, які не мають інтронів, наприклад, гірше експресуються порівняно з тими, що містять такі послідовності ДНК [див. Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836-840 (1988); Palmiteret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482 (1991); Whitelaw et al., Transaenic Res. 1:3-13 (1991); WO 89/01343; і WO 91/02318, на які авторами робиться посилання]. В цьому зв'язку перевагу, якщо можливо, традиційно віддають застосуванню геномних послідовностей, які містять усі або деякі природні інтрони гена, що кодує потрібний білок або поліпептид, і, таким чином, оптимальним є подальше включення принаймні деяких інтронів, наприклад, з гена бета-лактоглобуліну. Однією з таких ділянок є фрагмент ДНК, який забезпечує зрощення інтронів та поліаденілування РНК з З'некодуючої ділянки гена бета-лактоглобуліну вівці. При заміщенні природними З'-некодуючими послідовностями гена цей фрагмент беталактоглобуліну вівці може посилювати і стабілізувати рівень експресії потрібного білка або поліпептиду. В інших варіантах втілення ділянка, яка оточує ініціюючу ділянку ATG послідовності варіанта Фактора VII, є заміщеною відповідними послідовностями специфічного до молока білкового гена. Така заміна нібито забезпечує тканинноспецифічне ініціююче середовище для посилення експресії. Найзручніше повністю замінювати пре-про-та 5'-некодуючі послідовності варіанта Фактора VII послідовностями, наприклад, BLG-гена, хоча можуть бути замінені й менші ділянки. Для експресії варіантів Фактора VII у трансгенних тваринах фрагмент ДНК, що кодує варіант Фактора VII, функціонально з'єднують із додатковими фрагментами ДНК, які вимагаються для його експресії з метою вироблення експресійних одиниць. Такі додаткові фрагменти включають вищезгаданий промотор, а також послідовності, які забезпечують припинення транскрипції та поліаденілування мРНК. Експресійні одиниці також включають фрагмент ДНК, що кодує секреторну сигнальну послідовність, функціонально з'єднану з фрагментом, що кодує модифікований Фактор VII. Секреторна сигнальна послідовність може бути природною секреторною сигнальною послідовністю Фактора VII або може походити з іншого білка, такого як білок молока [див., наприклад, von Heijne, Nucl. Acids Res. 14:46834690 (1986) та Meade et al., U.S. 4,873,316, на які авторами робиться посилання]. Побудову експресійних одиниць для застосування у трансгенних тваринах здійснюють шляхом вставлення послідовності варіанта Фактора VII у плазміду або фаговий вектор, що містить додаткові фрагменти ДНК, хоча експресійна одиниця може бути побудована по суті будь-якою послідовністю зшивань. Особливо зручним є забезпечення вектора, який містить фрагмент ДНК, що кодує білок молока, і заміщення кодуючої послідовності білком молока послідовністю поліпептиду варіанта Фактора VII і, таким чином, створення злитого гена, який включає експресійні контрольні послідовності гена 81601 32 білка молока. У будь-якому разі, клонування експресійних одиниць у плазмідах або інших векторах сприяє ампліфікації послідовності варіанта Фактора VII. Ампліфікацію зазвичай здійснюють у клітинах-хазяях бактерій (наприклад, EL соІП. і, таким чином, вектори, як правило, одержують шляхом реплікації і з селектованого маркера, який функціонує у бактеріальних клітинах-хазяях. Експресійну одиницю після цього вводять у запліднені яйцеклітини (включаючи ембріони ранньої стадії) потрібних видів-хазяїв. Введення гетерологічної ДНК здійснюють одним з кількох шляхів, включаючи мікроін'єкцію [див., наприклад, патент США № 4,873,191], ретровірусну інфекцію [Jaenisch, Science 240:14681474 (1988)] або сайт-специфічну інтеграцію з застосуванням ембріональних стовбурових клітин (ES) [коментар Bradley et al., Bio/Technoloav 10: 534-539 (1992)]. Після цього яйцеклітини імплантують у яйцепроводи або матки псевдовагітних самиць і дають розвинутися до закінчення терміну. Потомство, яке несе введену ДНК у своїй лінії ембріонів, може передавати ДНК своєму потомству нормальним, менделевським шляхом, що дозволяє розводити трансгенне поголів'я. Загальні процедури розведення трансгенних тварин спеціалістам відомі [див., наприклад, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6:179-183 (1988); Wall et al., Biol. Rep rod. 32: 645651 (1985); Buhler et al., ВіоЯесппоІоду 8:140-143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfort et al., Bio/Technologv 9: 844-847 (1991); Wall et al., J. Cell. Siochem. 49: 113-120 (1992); U.S. 4,873,191; U.S. 4,873,316; WO 66/00239, WO 90/05188, WO 92/11757 та GB 87/00458]. Технології введення чужорідних послідовностей ДНК в організм ссавців та клітини їх ембріонів спочатку були розроблені на мишах [див., наприклад, Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384 (1980); Gordon and Ruddle, Science 214:1244-1246 (1981); Palmiter and Brinster, C_eJ| 41: 343-345 (1985); Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442 (1985) та Hogan et al. (ibid.)]. Ці технології згодом були пристосовані для більших тварин, включаючи різні види худоби [див., наприклад, WO 88/00239, WO 90/05188 та WO 92/11757; і Simons et al., Bio/Technology 6:179183 (1968)]. Отже, згідно з найефективнішим шляхом, який застосовують на даний час у розведенні трансгенних мишей або худоби, кілька сотень лінійних молекул потрібної ДНК вводять шляхом ін'єкції в один із пронуклеусів заплідненої яйцеклітини згідно з традиційними технологіями. Застосовують також введення ДНК у цитоплазму зиготи. Застосовують також вироблення у трансгенних рослинах. Експресія може бути викликана або спрямована на конкретний орган, такий як бульба [див. Hiatt, Nature_344:469-479 (1990); Edelbaum et at., J. Interferon Res. 12:449453 (1992); Sijmons et al., ВіоЯесппоІоду 8:217-221 (1990) та ЕР 0 255 378]. 33 Варіанти Фактора VII винаходу видобувають із середовища культури клітин або молока. Варіанти Фактора VII згідно з даним винаходом очищують, застосовуючи різні відомі спеціалістам процедури, включаючи, крім інших, хроматографію (наприклад, іонообмінну, афінну, гідрофобну, хроматофокусування та виключення за розміром), електрофоретичні процедури (наприклад, препаративне ізоелектрофокусування (IEF), диференційну розчинність (наприклад, осадження сульфатом амонію) або екстрагування [див., наприклад, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989]. В оптимальному варіанті їх очищують шляхом афінної хроматографії на колонці з антитілом проти Фактора VII. Особливу перевагу віддають застосуванню кальцій-залежних моноклональних антитіл, як описано в [роботі Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097-11108, M986) та Thim et al.. Biochemistry 27: 7765-7793. (1988)]. Додаткового очищення досягають традиційними хімічними засобами очищення, такими, як високоефективна рідинна хроматографія. Спеціалістам відомі й інші способи очищення, включаючи осадження цитратом барію, які можуть бути застосовані для очищення описаних авторами нових варіантів Фактора VII [див., наприклад, Scopes, R., Protein Purification. Springer-Verlag, N.Y., 1982]. З терапевтичної точки зору бажано, щоб варіанти Фактора VII згідно з винаходом були практично чистими. Таким чином, в оптимальному варіанті втілення винаходу варіанти Фактора VII згідно з винаходом очищують щонайменше до приблизно 90-95% гомогенності, ще краще — щонайменше до приблизно 98% гомогенності. Очищення визначають, наприклад, шляхом гельелектрофорезу та секвенування амінокінцевої амінокислоти. Варіант Фактора VII розщеплюють у його місці активації з метою перетворення на його дволанцюгову форму. Активацію здійснюють згідно з відомими спеціалістам процедурами, такими, як описані в роботі [Osterud, et al., Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, патенті США № 4,456,591; роботах Hedner and Kisiel. J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983) або Kisiel and Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983)]. В альтернативному варіанті, як описано в роботі Bjoern et al. [Research Disclosure, 269, September 1986, pp. 564-565], Фактор VII може бути активований шляхом його пропущення через іонообмінну хроматографічну колонку, наприклад, Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) або іншим способом. Одержаний в результаті активований варіант Фактора VII після цього включають до композиції і вводять, як описано нижче. Аналізи Винахід також пропонує аналізи, придатні для відбору оптимальних варіантів Фактора VIIa згідно з винаходом. Ці аналізи здійснюють як просте попереднє випробування in vitro. Таким чином, у Прикладі 11 описано просте випробування (під назвою "аналіз гідролізу in vitro") на активність варіантів Фактора VIIa згідно з 81601 34 винаходом. Згідно з ним, найбільш цікавими варіантами Фактора VIIa є варіанти, в яких співвідношення між активністю варіанта та активністю природного Фактора VII, показаного на Фіг. 1, перевищує 1,0, наприклад, становить щонайменше приблизно 1,25, в оптимальному варіанті — щонайменше приблизно 2,0, краще — щонайменше приблизно 3,0 або, найкраще — щонайменше приблизно 4,0 при випробуванні шляхом описаного авторами "аналізу гідролізу in vitro". Активність варіантів також вимірюють із застосуванням фізіологічного субстрату, такого як фактор X (аналіз протеолізу in vitro, див. Приклад 12), бажано у концентрації 100-1000 нМ, причому утворений фактор Ха вимірюють після додавання придатного хромогенного субстрату (наприклад, S2765). Крім того, аналіз активності здійснюють при фізіологічній температурі. Здатність варіантів FVIIa до утворення тромбіну також вимірюють шляхом аналізу, який охоплює всі відповідні фактори коагуляції та інгібітор у фізіологічних концентраціях (мінус фактор VIII у разі імітації умов гемофілії А) та активовані тромбоцити, як описано на [стор. 543 у роботі Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547, на яку авторами робиться посилання]. Введення та фармацевтичні композиції Варіанти Фактора VII згідно з даним винаходом застосовують для контролюванняпорушень кровотечі, які мають різні причини, наприклад, дефіцит коагулювального фактора (наприклад, гемофілія А та В або дефіцит факторів коагуляції XI або VII) або інгібіторів коагулювального фактора, або ж застосовують для контролювання надмірної кровотечі, яка трапляється у суб'єктів з нормально функціонуючим каскадом згортання крові (без дефіциту коагулювального фактора або інгібіторів будь-якого з факторів коагуляції). Кровотечі можуть бути спричинені недостатньою функцією тромбоцитів, тромбоцитопенією або псевдогемофілією. Вони також можуть спостерігатись у суб'єктів, у яких підвищена фібринолітична активність була викликана різними причинами. У суб'єктів, які зазнали широкого пошкодження тканин у зв'язку з хірургічним втручанням або широкою травмою, нормальний кровоспинний механізм може бути перевантажений через необхідність негайного гемостазу, і в них може траплятися кровотеча, незважаючи на нормальний кровоспинний механізм. Досягнення задовільного гемостазу також є проблемою, коли кровотеча відбувається в таких органах, як мозок, зона внутрішнього вуха та очі, і також може бути проблемою в разі дифузної кровотечі (геморагічний гастрит та профузна маткова кровотеча). Така сама проблема може виникнути у процесі біопсії з різних органів (печінки, легенів, пухлинної тканини, шлунково-кишкового тракту), а також при лапароскопічному хірургічному втручанні. Спільними в цих ситуаціях є труднощі, пов'язані з забезпеченням гемостазу хірургічними засобами (шви, затискачі та ін.), які також 35 трапляються при дифузній кровотечі (геморагічний гастрит та профузна маткова кровотеча). Гострі та профузні кровотечі також можуть траплятись при антикоагулянтній терапії у суб'єктів, у яких порушення гемостазу було викликане цією терапією. Такі суб'єкти можуть потребувати хірургічного втручання в випадку, коли треба швидко протидіяти антикоагулювальному впливу. Іншою ситуацією, яка може викликати проблеми у разі незадовільного гемостазу, є ситуація, коли суб'єкти з нормальним кровоспинним механізмом отримують антикоагулянтну терапію для профілактики тромбоемболічної хвороби. Така терапія може включати застосування гепарину, інших форм протеогліканів, варфарину або інших форм антагоністів вітаміну К, а також аспірину та інших інгібіторів агрегації тромбоцитів. Системна активація каскаду коагуляції може призводити до дисемінованої внутрішньосудинної коагуляції (DIG). Однак, такі ускладнення не спостерігаються у суб'єктів, які отримували високі дози рекомбінантного FVIIa завдяки локалізованому кровоспинному процесові на зразок викликаного комплексоутворенням між FVIIa та TF, відкритим у місці пошкодження стінки судини. Варіанти Фактора VII згідно з винаходом, таким чином, також можуть застосовуватись у їхній активованій формі для контролювання таких надмірних кровотеч, при нормальному кровоспинному механізмі. Для лікування, пов'язаного з навмисним втручанням, варіанти Фактора VII згідно з винаходом, як правило, вводять не більше, ніж приблизно за 24 години до здійснення втручання і не менше, ніж через 7 днів після нього. Введення коагулянту здійснюють різними описаними авторами шляхами. Доза варіантів Фактора VII становить від приблизно 0,05мг до 500мг/день, в оптимальному варіанті — від приблизно 1мг до 200мг/день, ще краще — від приблизно 10мг до приблизно 175мг/день для суб'єкта масою 70 кг як ударна та підтримувальна доза, залежно від маси суб'єкта та тяжкості стану. Фармацевтичні композиції призначені насамперед для парентерального введення з метою профілактичного та/або терапевтичного лікування. В оптимальному варіанті фармацевтичні композиції вводять парентерально, тобто, внутрішньовенно, підшкірно або внутрішньом'язово, або вводять шляхом безперервної або пульсуючої інфузії. Композиції для парентерального введення включають варіант Фактора VII згідно з винаходом у комбінації, в оптимальному варіанті — розчинений у фармацевтично прийнятному носії, в оптимальному варіанті — водному носії. Застосовують різні водні носії, такі, як вода, буферована вода, 0,4% соляний розчин, 0,3% гліцин і т. ін. Варіанти Фактора VII згідно з винаходом також можуть бути включені до ліпосомних композицій для доставления або спрямування на місця пошкодження. Ліпосомні композиції в цілому описано, наприклад, у [патентах U.S. 4,837,028, U.S. 4,501,728 та U.S. 81601 36 4,975,282]. Композиції стерилізують традиційними, загальновідомими способами стерилізації. Одержані в результаті водні розчини розфасовують для застосування або фільтрують за асептичних умов і ліофілізують, причому ліофілізовану композицію перед введенням комбінують зі стерильним водним розчином. Композиції можуть містити фармацевтично прийнятні додаткові речовини, які можуть бути необхідними для наближення до фізіологічних умов, наприклад, регулювання рівня рН, та засоби буферування, засоби регулювання тонусу і т. ін., наприклад, ацетат натрію, лактат натрію, хлорид натрію, хлорид калію, хлорид кальцію та ін. Концентрація варіанта Фактора VII у цих композиціях може бути різною в широких межах, тобто, від меншої за приблизно 0,5% за масою, зазвичай не менше приблизно 1% за масою, до 15 або 20% за масою, і визначається, головним чином, за об'ємом рідини, в'язкістю та ін., згідно з вибраним режимом введення. Таким чином, типова фармацевтична композиція для внутрішньовенної інфузії може містити 250 мл стерильного розчину Рінгера і 10 мг варіанта Фактора VII. Існуючі способи одержання композицій для парентерального введення є відомими або зрозумілими спеціалістам і детальніше описані, наприклад, у Remington's Pharmaceutical Sciences. 18th e