Фармацевтична композиція, що містить пептид та заміщений b-циклодекстрин, для лікування системного червоного вовчака

1. Фармацевтична композиція, яка містить водний носій; від 0,1мг/мл до 20мг/мл композиції фармацевтично прийнятної солі пептиду, що має структурну формулу NH2-Gly Туr Туr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gl y-COOH (SEQ ID NO: 1); і заміщений β-циклодекстрин в кількості, ефективній для розчинення пептиду у водному носії, при цьому фармацевтична композиція має рН від 4 до 2. 9. Фармацевтична композиція за п.1, де концентрація солі пептиду складає щонайменше 0,5мг/мл. 3. Фармацевтична композиція за п.2, де концентрація солі пептиду складає від 0,5мг/мл до 10мг/мл. 4. Фармацевтична композиція за п.3, де концентрація солі пептиду складає від 0,5мг/мл до 2,5мг/мл. 5. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп.14, де композиція має рН від 6,5 до 8,5. 6. Фармацевтична композиція за п.5, де композиція має рН від 7,5 до 8,5. 7. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп.16, де фармацевтично прийнятною сіллю є ацетатна сіль. 8. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп.17, де заміщеним β-циклодекстрином є βциклодекстрин, заміщений гідроксипропілом, су 2 (19) 1 3 83816 4 20. Фармацевтична композиція за п.19, де концентрація ацетатної солі пептиду складає 0,5мг/мл. 21. Фармацевтична композиція за п.19, де концентрація ацетатної солі пептиду становить 1,0мг/мл. 22. Фармацевтична композиція за п.19, де концентрація ацетатної солі пептиду становить 2,5мг/мл. 23. Ліофілізована фармацевтична композиція, яка містить фармацевтично прийнятну сіль пептиду, що має структурн у формулу NH2-Gly Туr Туr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gl y-COOH (SEQ ID NO: 1); і гепта(сульфобутиловий ефір)-β-циклодекстрин або його сіль. 24. Упакована фармацевтична композиція, яка містить пакувальний матеріал і ліофілізовану фармацевтичну композицію за п.23. 25. Ліофілізована фармацевтична композиція за п.23, де вміст води у фармацевтичній композиції складає менше 5%. 26. Ліофілізована фармацевтична композиція за п.23, де вміст води у фармацевтичній композиції складає менше 4%. 27. Ліофілізована фармацевтична композиція за п.23, де вміст води у фармацевтичній композиції складає менше 3,5%. 28. Застосування фармацевтичної композиції за будь-яким з пп.1-27 для отримання лікарського засобу, призначеного для послаблення симптомів системного червоного вовчака (СЧВ) у людини. 29. Спосіб виробництва фармацевтичної композиції, що включає в себе стадії a) приготування розчину гепта(сульфобутиловий ефір)-β-циклодекстрину або солі гепта(сульфобутиловий ефір)-β-циклодекстрину у водному носії з концентрацією, що попередньо визначається; b) додавання кількості фармацевтично прийнятної солі пептиду, яка попередньо визначається, NH2Gly Туr Туr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gl y-COOH (SEQ ID NO: 1) до розчину зі стадії а); c) коректування рН розчину зі стадії b) аж до розчинення пептиду в розчині; і d) при необхідності доведення рН розчину зі стадії с) до рН 4-9, з отриманням, таким чином, фармацевтичної композиції. 30. Фармацевтична композиція за п.1, отримана способом за п.29. 31. Спосіб ліофілізації фармацевтичної композиції за п.12, що включає в себе стадії a) зниження температури фармацевтичної композиції до -40°С; b) підтримки температури при -40°С протягом періоду часу, що попередньо визначається; c) підвищення температури розчину до 20°С; d) підтримки температури при 20°С протягом періоду часу, що попередньо визначається; і e) зниження тиску на стадії d) до додавання прийнятного для ліофілізації і підтримки температури при 20°С протягом періоду часу, що попередньо визначається, з отриманням, таким чином, ліофілізованої фармацевтичної композиції. 32. Спосіб за п.31, в якому стадію а) здійснюють протягом 2 годин; стадію b) здійснюють протягом 3 годин; стадію с) здійснюють протягом 13 годин і при тиску 110 мкбар; стадію d) здійснюють протягом понад 13 годин і при тиску 110 мкбар; і стадію e) здійснюють протягом понад 5 годин і тиск знижують до 10 мкбар. 33. Ліофілізована фармацевтична композиція за п.23, отримана способом за п.32. 34. Спосіб ліофілізації фармацевтичної композиції за п.12, що включає в себе стадії a) зниження температури фармацевтичної композиції до -45°С; b) підтримки температури при -45°С протягом періоду часу, що попередньо визначається; c) підвищення температури розчину до -20°С; d) підвищення температури розчину до 25°С; і e) підтримки температури при 25°С протягом попередньо визначеного періоду часу з одержанням, таким чином, ліофілізованої фармацевтичної композиції. 35. Спосіб за п.34, в якому стадію а) здійснюють протягом 6 годин; стадію b) здійснюють протягом 3 годин; стадію с) здійснюють протягом понад 19 годин і при тиску 150мкбар; стадію d) здійснюють протягом понад 13 годин і при тиску 150мкбар; і стадію e) здійснюють протягом понад 8 годин і при тиску 150мкбар. 36. Ліофілізована фармацевтична композиція за п.23, отримана способом за п.35. Дана заявка містить перевагу в порівнянні з попередньою [заявкою на патент CШA №60/439950, поданою 14 січня 2003 року], повний зміст якої, таким чином, включений в даний опис у вигляді посилання. У описі даної заявки посилання на різні публікації подані за допомогою повного цитування. Описи вказаних публікацій в повному об'ємі включені при цьому в дану заявку у вигляді посилання, щоб більш повно описати стан рівня техніки, який відомий фахівцям на дату винаходу, описаного і заявленого в даному описі. Системний червоний вовчак (СЧВ) або вовчак, є послаблюючим здоров'я аутоімунним захворю ванням, що характеризується наявністю множини аутоантитіл, включаючи антитіла до днДНК, до ядерних антигенів і до рибонуклеопротеїдів. СЧВ уражає приблизно 1 з 2000 чоловік (в CШA 1 з 700 жінок). Захворювання головним чином уражає молодих жінок, при співвідношенні жінок до чоловіків, яке складає приблизно 9:1. Системний червоний вовчак може уражати майже будь-який орган або систему організму. Системний червоний вовчак може охоплювати періоди, коли виражено небагато симптомів, якщо вони взагалі виражені («ремісія»), і інші періоди, коли захворювання стає більш активним («спалах»). Найчастіше, коли люди згадують «вовчак», 5 83816 вони відносять його до системної форми захворювання. Кортикостероїди є головною опорою при лікуванні системних аутоімунних захворювань. Прояви СЧВ, які загрожують життю і приводять до важкої інвалідності, лікують високими дозами глюкокортикоїдів (1-2мг/кг/добу). Небажані ефекти хронічного введення глюкокортикоїдів включають в себе множину помітних несприятливих е фектів, таких як кушингоїдний габітус, ожиріння центральної дії, гіпертонія, інфекція, ламкість капілярів, гірсутизм, посилений остеопороз, катаракти, цукровий діабет, міопатія і психоз. Крім токсичності кортикостероїдів згода пацієнтів на схему дозування також являє собою серйозну проблему. Для боротьби з активним захворюванням також використовують цитотоксичні агенти, що знижують частоту спалахів захворювання і зменшують потребу в стероїдах. Небажані побічні ефекти останніх включають в себе пригноблення кісткового мозку, підвищену частоту інфекцій опортуністичними організмами, необоротну недостатність функції яєчників, алопецію і підвищений ризик злоякісних новоутворень. СЧВ є запальним захворюванням, для якого до цього часу не існує визначеного способу лікування або засобу. Захворювання приводить до гострих і хронічних ускладнень. Єдиними способами лікування є паліативні способи, призначені для зняття гострих симптомів і запобігання хронічним ускладненням, часто з сильними побічними ефектами. Тому існує незадоволена потреба в даній галузі, і лікарі і пацієнти були б раді новим способам лікування, які потенційно могли б усун ути або зменшити небажані прояви хвороби. Пептиди на основі визначаючої комплементарність області моноклонального анти-ДНКантитіла 16/6Id людини, здатні імуномодулювати пов'язані з СЧВ відповіді, описані [в міжнародній публікації PCT №W002/067848 А2], повний зміст якої, таким чином, включений в даний опис у вигляді посилання. Зокрема, виявлено, що область CDR1 інгібує проліферативну відповідь лімфоцитів периферичної крові (PBL) пацієнтів з СЧВ на антиДНК16/6Іd-мАт людини і послаблює прояви хвороби у мишей, уражених спонтанним або експериментальним СЧВ. CDR1 людини, сполука 1, показана на Фіг.1, є синтетичним пептидом з 19 амінокислот на основі визначаючої комплементарність області 1 (CDRl) анти-днДНК-мАт людини, яка названа 16/6Id [Waisman, A., et al. «Modulation of murine systemic lupus erythematosus with peptides based on complementarity determining regions of pathogenic anti-DNA monoclonal antibodies». Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1997), 94 (4): 4620-4625]. У експериментальних моделях СЧВ - миші Balb/c і схильні до СЧВ миші, тобто миші (NZBxNZW) Fl - лікування або пептидами на основі mCDR, або сполукою 1 значуще знижувало пов'язані з СЧВ показники, особливо відкладення імунних комплексів (ICD) в нирці, протеїнурію і лейкопенію. Лікування не надавало впливу на 16/6 Idспецифічну гуморальну відповідь [Waisman, A., et al. "Modulation of murine systemic lupus 6 erythematosus with pathogenic anti-DNA monoclonal antibodies". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1997), 94 (4): 620; Eilat, E, et al., "Prevention of systemic lupus erythematosus-like disease in (NZBxNZW) Fl mice by treating with CDR- and CDR3- based peptides of pathogenic autoantibody" J. Clin. Immunol. (2000), 20: 268; Eilat, E., et al., "The mechanism by which a peptide based on complementarity determining region-1 of pathogenic anti-DNA antibody ameliorates experimental SLE" (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 1148]. Вказані пептиди, подібно до багатьох пептидів, не дуже добре розчинні. Тому бажані композиції, які поліпшують розчинність пептидів. Даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить водний носій; від 0,1мг/мл до 20мг/мл композиції фармацевтично прийнятної солі пептиду, що має структурну формулу NH2-GIy Туr Туr Trp Ser Тгр Не Arg GIn Pro Pro GIy Lys GIy GIu GIu Trp He GIy-COOH (SEQ ID NO: 1); і заміщений β-циклодекстрин в кількості, ефективній для розчинення пептиду у водному носії, де композиція має рН від 4 до 9. Даний винахід також відноситься до фармацевтичної композиції, що містить водний носій; від 0,1мг/мл до 20мг/мл композиції ацетатної солі пептиду, що має стр уктурн у формулу NH2-GIy Туr Туr Trp Ser Trp Не Arg GIn Pro Pro GIy Lys GIy GIu GIu Trp lle GIy-COOH (SEQ ID NO: 1); і від 70мг/мл до 170мг/мл композиції гепта(сульфобутиловий ефір)-(3-циклодекстрину, в якій пептид і гепта(сульфобутиловий ефір)-(3циклодексттшн розчинені у водному носії; і де розчин має рН від 6,5 до 8,5. Даний винахід також відноситься до способу ослаблення симптомів системного вовчака (СЧВ) у людини, що включає в себе введення людині будь-яких з вказаних вище фармацевтичних композицій в кількості, ефективній для ослаблення симптомів СЧВ у людини. Даний винахід також відноситься до способу виробництва вказаної вище фармацевтичної композиції, що включає в себе стадії: a) приготування розчину заміщеного βциклодекстрину у водному носії в попередньо визначеній концентрації; b) додання кількості фармацевтично прийнятної солі пептиду, що попередньо визначається, NH2-GIy Туr Туr Trp Ser Тrр llе Arg GIn Pro Pro GIy Lys GIy GIu GIu Тrр llе GIy-COOH (SEQ ID NO: 1) до розчину зі стадії а); c) коректування рН розчину зі стадії b) аж до розчинення пептиду в розчині; і d) при необхідності доведення рН розчину зі стадії с) до рН4-9, з отриманням, таким чином, фармацевтичної композиції. Даний винахід також відноситься де способу ліофілізації описаної вище фармацевтичної композиції, що включає в себе стадії: a) зниження температури фармацевтичної композиції до -40°C; 7 83816 b) підтримки температури на рівні -40°C протягом періоду часу, що попередньо визначається; c) підвищення температури розчину до 20°C; d) підтримки температури на рівні 20°C протягом періоду часу, що попередньо визначається; і є) пониження тиску до 10мкбар, з отриманням, таким чином, ліофілізованої фармацевтичної композиції. Даний винахід також відноситься до способу ліофілізації вказаної вище фармацевтичної композиції, що включає в себе стадії: a) зниження температури фармацевтичної композиції до -45°С; b) підтримки температури на рівні -45°C протягом періоду часу, що попередньо визначається; c) підвищення температури розчину до -20°C; d) підвищення температури до 25°C; і e) підтримки температури на рівні 25°C протягом періоду часу, що попередньо визначається, з отриманням, таким чином, ліофілізованої фармацевтичної композиції. Фіг.1. CDR1 людини (сполука 1) у вигляді ацетатної солі - показані молекулярна і структурна формули hCDR1, амінокислотна послідовність і фізичні параметри. Фіг.2. Секреція IL-2 з клітин, взятих від мишей, оброблених розчином сполуки 1 і каптизолу, після того як потім клітини були активовані розчином сполуки 1 в PBS. - - Сполука 1 (RS) 50мкг/мишу -▲- Сполука 1 (RS) 200мкг/мишу -□- DP 50мкг/мишу -∆- DP 200мкг/мишу -o- 12% каптизол в ампулах. Фіг.3. Секреція IFN-g з клітин, взятих від мишей, оброблених розчином сполуки 1, після того, як клітини були потім активовані розчином сполуки 1 в EM-1 (2,5´106клітин/ямку). -♦- Плацебо -·- Сполука 1 50мкг/мишу (лікувальна доза) -∆- Сполука 1100мкг/мишу (лікувальна доза) -X- Сполука 1 200мкг/мишу (лікувальна доза). Фіг.4. Секреція IFN-g з клітин, взятих від мишей, оброблених розчином сполуки 1, після того, як клітини були потім активовані розчином сполуки 1 в EM-1 (5´106клітин/ямку). -à- Плацебо -□- Сполука 1 25мкг/мишу -∆- Сполука 1 50мкг/мишу -X- Сполука 1 100мкг/мишу -*- Сполука 1 200мкг/мишу. Фіг.5. Ан ти-днДНК-антитіла у мишей (NZBxNZW) F1 після 10 ін'єкцій сполуки 1 в каптизолі [OD= оптична густина; сполука 1 (C)= сполука 1, розчинена в каптизолі]. -□- Плацебо -à- Сполука 1 50мкг/мишу -o- Сполука 1 25мкг/мишу. Фіг.6. Зрізи нирок від мишей (NZBxNZW) F1, що показують інтенсивність відкладень імунних комплексів. Зрізи у верхньому ряду отримані від миші, обробленої каптизолом, зрізи середнього ряду від миші, обробленої 50мкг/мишу сполуки 1, і зрізи нижнього ряду від миші, обробленої 8 25мкг/мишу сполуки 1. Збільшення: ліві: ´100, праві: ´400. FITC-імуногістологія. Даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить водний носій; від 0,1мг/мл до 20мг/мл композиції фармацевтично прийнятної солі пептиду, що має структурну формулу NH2-GIy Туr Туr Trp Ser Тrр Не Arg GIn Pro Pro GIy Lys GIy GIu GIu Trp lle GIy-COOH (SEQ ID NO: 1); і заміщений (3-циклодекстрин в кількості, ефективній для розчинення пептиду у водному носії, при цьому композиція має рН від 4 до 9. У одному варіанті концентрація ацетатної солі пептиду складає щонайменше 0,5мг/мл. У одному варіанті концентрація солі пептиду складає від 0,5мг/мл до 10мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 0,5мг/мл до 2,5мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 2,5мг/мл до 5мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 5мг/мл до 7мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 7мг/мл до 8,5мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 8,5мг/мл до 10мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 9мг/мл до 10мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 10мг/мл до 15мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 15мг/мл до 20мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду становить 1,0мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду становить 2,5мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду становить 5мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду становить 10мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду становить 15мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі складає від 0,1мг/мл до 0,5мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі складає від 0,1мг/мл до 0,2мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі складає від 0,2мг/мл до 0,3мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі складає від 0,3мг/мл до 0,4мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі складає від 0,4мг/мл до 0,5мг/мл. У наступному варіанті композиція має рН від 6,5 до 8,5. У наступному варіанті композиція має рН від 7,5 до 8,5. У наступному варіанті композиція має рН від 4 до 5. У наступному варіанті композиція має рН від 5 до 6. У наступному варіанті композиція має рН від 6 до 7. У наступному варіанті композиція має рН від 7 до 8. 9 83816 У наступному варіанті композиція має рН від 8 до 9. У іншому варіанті фармацевтично прийнятною сіллю є ацетатна сіль. У іншому варіанті заміщеним βциклодекстрином є β-циклодекстрин, заміщений гідроксипропілом, сульфобутиловим ефіром або сульфопропіловим ефіром. У наступному варіанті заміщеним βциклодекстрином є β-циклодекстрин, заміщений сульфобутиловим ефіром. У наступному варіанті фармацевтично прийнятною сіллю є ацетатна сіль і заміщений {3циклодекстрином є гепта(сульфобутиловий ефір)β-циклодекстрин. У іншому варіанті композиція, крім того, містить фармацевтично прийнятний буфер в такій кількості і такого типу, які підходять для отримання рН фармацевтичної композиції в діапазоні 4-9. Буфером може бути ацетатний буфер, цитратний буфер або карбонат натрію. Даний винахід також відноситься до фармацевтичної композиції, що містить водний носій; від 0,1мг/мл до 20мг/мл композиції ацетатної солі пептиду, що має стр уктурн у формулу NH2-GIy Туr Туr Trp Ser Тrр llе Arg GIn Pro Pro GIy Lys GIy GIu GIu Trp lle GIy-COOH (SEQ ID NO: 1); і від 70мг/мл до 170мг/мл композиції гепта(сульфобутиловий ефір)-β-циклодекстрину, в якій пептид і гепта(сульфобутиловий ефір)-βциклодекстрин розчинені у водному носії; і де композиція має рН від 6,5 до 8,5. У одному варіанті концентрація ацетатної солі пептиду складає щонайменше 0,5мг/мл. У одному варіанті концентрація ацетатної солі пептиду складає від 0,5мг/мл до 10мг/мл. У наступному варіанті концентрація ацетатної солі пептиду складає від 0,5мг/мл до 2,5мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі складає від 0,1мг/мл до 0,5мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі складає від 0,1мг/мл до 0,2мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі складає від 0,2мг/мл до 0,3мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі складає від 0,3мг/мл до 0,4мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі складає від 0,4мг/мл до 0,5мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 5мг/мл до 7мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 7мг/мл до 8,5мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 8,5мг/мл до 10мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 9мг/мл до 10мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 10мг/мл до 15мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду складає від 15мг/мл до 20мг/мл. У наступному варіанті концентрація ацетатної солі пептиду становить 1,0мг/мл. У наступному варіанті концентрація ацетатної солі пептиду становить 2,5мг/мл. 10 У іншому варіанті концентрація солі пептиду становить 5мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду становить 10мг/мл. У іншому варіанті концентрація солі пептиду становить 15мг/мл. У іншому варіанті концентрація гепта(сульфобутиловий е фір)-β-циклодекстрину становить 120мг/мл, і рН композиції складає від 7,5 до 8,5. Даний винахід також відноситься до способу ослаблення симптомів системного червоного вовчака (СЧВ) у людини, що включає в себе введення людині будь-якої з вказаних вище фармацевтичних композицій в кількості, ефективній для ослаблення симптомів СЧВ у людини. Даний винахід також відноситься до вказаних вище фармацевтичних композицій для застосування при лікуванні СЧВ у людини. Даний винахід також відноситься до способу виробництва будь-якої з вказаних вище фармацевтичних композицій, що включає в себе стадії: a) приготування розчину заміщеного βциклодекстрину у водному носії в концентрації, що попередньо визначається; b) додання кількості фармацевтично прийнятної солі пептиду, що попередньо визначається, NH2-GIy Туr Туr Trp Ser Trp lle Arg GIn Pro Pro GIy Lys GIy GIu GIu Trp lle GIy-COOH (SEQ ID NO: 1) до розчину зі стадії а); c) коректування рН розчину зі стадії b) аж до розчинення пептиду в розчині; і d) при необхідності доведення рН розчину зі стадії с) до рН4-9, з отриманням, таким чином, фармацевтичної композиції. У одному варіанті способу отримана в результаті кінцева концентрація заміщеного Βциклодекстрину в фармацевтичній композиції складає від 70мг/мл до 170мг/мл. У одному варіанті способу концентрацією заміщеного β-циклодекстрину, яка попередньо визначається, є така концентрація, що приводить до кінцевої концентрації заміщеного βциклодекстрину в фармацевтичній композиції від 80мг/мл до 170мг/мл. У одному варіанті способу концентрацією заміщеного β-циклодекстрину, яка попередньо визначається, є така концентрація, що приводить до кінцевої концентрації заміщеного βциклодекстрину в фармацевтичній композиції від 90мг/мл до 170мг/мл. У одному варіанті способу концентрацією заміщеного β-циклодекстрину, яка попередньо визначається, є така концентрація, що приводить до кінцевої концентрації заміщеного βциклодекстрину в фармацевтичній композиції від 100мг/мл до 170мг/мл. У одному варіанті способу концентрацією заміщеного β-циклодекстрину, яка попередньо визначається, є така концентрація, що приводить до кінцевої концентрації заміщеного βциклодекстрину в фармацевтичній композиції від 110мг/мл до 170мг/мл. У одному варіанті способу концентрацією заміщеного β-циклодекстрину, яка попередньо ви 11 83816 значається, є така концентрація, що приводить до кінцевої концентрації заміщеного βциклодекстрину в фармацевтичній композиції від 120мг/мл до 170мг/мл. У одному варіанті способу концентрацією заміщеного β-циклодекстрину, яка попередньо визначається, є така концентрація, що приводить до кінцевої концентрації заміщеного βциклодекстрину в фармацевтичній композиції від 130мг/мл до 170мг/мл. У одному варіанті способу концентрацією заміщеного β-циклодекстрину, яка попередньо визначається, є така концентрація, що приводить до кінцевої концентрації заміщеного βциклодекстрину в фармацевтичній композиції від 140мг/мл до 170мг/мл. У одному варіанті способу концентрацією заміщеного β-циклодекстрину, яка попередньо визначається, є така концентрація, що приводить до кінцевої концентрації заміщеного βциклодекстрину в фармацевтичній композиції від 150мг/мл до 170мг/мл. У одному варіанті способу концентрацією заміщеного β-циклодекстрину, яка попередньо визначається, є така концентрація, що приводить до кінцевої концентрації заміщеного βциклодекстрину в фармацевтичній композиції від 160мг/мл до 170мг/мл. У одному варіанті способу концентрацією заміщеного β-циклодекстрину, яка попередньо визначається, є така концентрація, що приводить до кінцевої концентрації заміщеного βциклодекстрину в фармацевтичній композиції, що становить 120мг/мл. У іншому варіанті кількістю пептиду, яка попередньо визначається, є така кількість, яка приводить до кінцевої концентрації пептиду в фармацевтичній композиції, що складає щонайменше 0,1мг/мл. У іншому варіанті кількістю пептиду, яка попередньо визначається, є така кількість, яка приводить до кінцевої концентрації пептиду в фармацевтичній композиції, що складає щонайменше 0,5мг/мл. У іншому варіанті кількістю пептиду, яка попередньо визначається, є така кількість, яка приводить до кінцевої концентрації пептиду в фармацевтичній композиції, що становить 2,5мг/мл, 2,0мг/мл, 1,0мг/мл, 0,5мг/мл або 0,1мг/мл. У іншому варіанті кількістю пептиду, яка попередньо визначається, є така кількість, яка приводить до кінцевої концентрації пептиду в фармацевтичній композиції, що становить 5мг/мл, 10мг/мл або 15мг/мл. У іншому варіанті способу стадія b) додатково включає в себе перемішування розчину протягом 1 години. У іншому варіанті на стадії с) рН коректують, використовуючи 1,0н HCl або NaOH. У іншому варіанті спосіб додатково включає в себе фільтрування розчину зі стадії d) через фільтр з ацетату целюлози. У іншому варіанті вказаного вище способу концентрацією заміщеного β-циклодекстрину, яка попередньо визначається, є така концентрація, що 12 приводить до кінцевої концентрації заміщеного βциклодекстрину в фармацевтичній композиції, що становить 120мг/мл; кількістю пептиду, що попередньо визначається, є така кількість, яка приводить до кінцевої концентрації пептиду в фармацевтичній композиції, що становить 2,5мг/мл, 2,0мг/мл, 1,0мг/мл, 0,5мг/мл або 0,1мг/мл; стадія b) додатково включає в себе перемішування розчину протягом 1 години; і на стадії с) рН коректують, використовуючи 1,0н HCl або NaOH, і спосіб додатково включає в себе фільтрування розчину зі стадії d) через фільтр з ацетату целюлози. Даний винахід також відноситься до композиції, отриманої вказаним вище способом. Даний винахід також відноситься до способу ліофілізації вказаної вище фармацевтичної композиції, що включає в себе стадії: a) зниження температури фармацевтичної композиції до -40°C; b) підтримки температури при -40°C протягом періоду часу, що попередньо визначається; c) підвищення температури розчину до 20°C; d) підтримки температури при 20°C протягом періоду часу, що попередньо визначається; і e) підтримки температури при 25°C протягом періоду часу, що попередньо визначається, з отриманням, таким чином, ліофілізованої фармацевтичної композиції. У одному варіанті способу стадію а) здійснюють протягом 2 годин У іншому варіанті стадію b) здійснюють протягом 3 годин. У наступному варіанті стадію с) здійснюють протягом 13 годин. У наступному варіанті стадію с) здійснюють при тиску 110мкбар. У наступному варіанті стадію d) здійснюють протягом 13 годин. У наступному варіанті стадію d) здійснюють при тиску 110мкбар. У наступному варіанті на стадії e) тиск знижують до 10мкбар. У наступному варіанті стадію e) здійснюють протягом 5 годин. У іншому варіанті способу стадію а) здійснюють протягом 2 годин; стадію b) здійснюють протягом 3 годин; стадію с) здійснюють протягом 13 годин і при тиску 110мкбар; стадію d) здійснюють протягом 13 годин і при тиску 110мкбар; і стадію e) здійснюють протягом 5 годин і тиск знижують до 10мкбар. Даний винахід також відноситься до ліофілізованої фармацевтичної композиції, отриманої вказаним вище способом. Даний винахід також відноситься до способу ліофілізації вказаної вище фармацевтичної композиції, що включає в себе стадії a) зниження температури фармацевтичної композиції до -45°C; b) підтримки температури при -45°С протягом періоду часу, що попередньо визначається; 13 83816 c) підвищення температури розчину до -20°C; d) підвищення температури розчину до 25°C; і e) підтримки температури при 25°C протягом періоду часу, що попередньо визначається, з отриманням, таким чином, ліофілізованої фармацевтичної композиції. У одному варіанті стадію а) здійснюють протягом 6 годин. У іншому варіанті стадію b) здійснюють протягом 3 годин. У іншому варіанті стадію с) здійснюють протягом 19 годин. У іншому варіанті стадію с) здійснюють при тиску 150мкбар. У іншому варіанті стадію d) здійснюють протягом 13 годин. У іншому варіанті стадію d) здійснюють при тиску 150мкбар. У іншому варіанті стадію e) здійснюють протягом 8 годин. У іншому варіанті стадію e) здійснюють при тиску 150мкбар. У іншому варіанті способу стадію а) здійснюють протягом 6 годин; стадію b) здійснюють протягом 3 годин; стадію с) здійснюють протягом 19 годин і при тиску 150мкбар; стадію d) здійснюють протягом 13 годин і при тиску 150мкбар; і стадію є) здійснюють протягом 8 годин і при тиску 150мкбар. Даний винахід також відноситься до ліофілізованої фармацевтичної композиції, отриманої будьяким з вказаних вище способів. У одному варіанті вказаної вище ліофілізованої фармацевтичної композиції вміст води в композиції складає менше за 5%. У іншому варіанті вміст води в композиції складає менше за 4,0%. У іншому варіанті вміст води в композиції складає менше за 3,5%. Даний винахід також відноситься до ліофілізованої фармацевтичної композиції, що містить фармацевтично прийнятну сіль пептиду, що має структурну формулу NH2-GIy Туr Туr Trp Ser Тrр llе Arg GIn Pro Pro GIy Lys GIy GIu GIu Trp lle GIy-COOH (SEQ ID NO:1); і заміщений β-циклодекстрин. Даний винахід також відноситься до упакованої фармацевтичної композиції, що складається з пакувального матеріалу; і кількості вказаної вище ліофілізованої фармацевтичної композиції, що попередньо визначається. Препарати згідно з даним винаходом можуть бути введені парентерально, місцево або ректально. Звичайно, вони можуть бути введені в формі, прийнятній для кожного шляху введення. Наприклад, їх можна вводити за допомогою ін'єкцій, інгаляцій, мазей, супозиторіїв і т.д., введення може бути шля хом ін'єкцій, інфузій або інгаляцій; місцево за допомогою примочки або мазі; і ректальне за допомогою супозиторіїв. 14 Вирази «парентеральне введення» і «введений парентерально» в значенні, що використовується в даному описі, означають способи введення, відмінні від ентерального і місцевого введення, звичайно за допомогою ін'єкції, і включають в себе, без обмеження, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, інтратекальну, внутрішньокапсулярну, вн утрішньоочну, вн утрішньосерцеву, інтрадермальну, внутрішньочеревинну, через трахею, підшкірну, під кутикулу, вн утрішньосуглобову, підкапсулярну, субарахноїдальну, інтраспінальну і внутрішньогрудну ін'єкцію і інфузію. Вирази «системне введення» і «введений системно», «периферичне введення» і «введений периферично» в значенні, що використовується в даному описі, означають введення сполуки, лікарського засобу або іншої речовини, відмінне від прямого введення в центральну нервову систему, так що вона надходить в систему пацієнта і, таким чином, зазнає метаболізму і інших подібних процесів, наприклад, підшкірне введення. Подробиці способів загального приготування композицій і інформацію про додаткові ексципієнти можна знайти в [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition]. Даний винахід буде більш зрозумілим на основі докладного опису експериментів, який йде далі. Однак фахівець в даній галузі без великих зусиль зрозуміє, що конкретні способи, які обговорюються, і результати є тільки ілюстративними для винаходу, який більш повно описаний в формулі винаходу, яка йде далі. Приклад 1: Розробка композиції для сполуки 1 Пептид hCDR1 людини (сполука 1) описаний [в міжнародній публікації PCT №WOO2/067848, опублікованої 6 вересня 2002], і може бути отриманий способами, добре відомими в даній галузі [див., наприклад, Peptides: Synthesis, Structure and Applications, ed. By B. Gutte, Academic Press, 1995; Peptide Synthesis Protocols, ed. By M. Pennington and B. Dunn, Humana Press, 1994; Schnolzer, M. et al., "In situ neutralization in Boc-chemistry solid phase synthesis. Rapid, High yield assembly of difficult sequences". Int. J. Pept. Protein Res. (1992) 40: 180193]. Сполука 1 є синтетичним поліпептидом, що складається з 19 амінокислот. її отримують у вигляді ацетатної солі. Визначена розчинність пептиду у воді, яка складає менше 0,5мг/мл. На Фіг.1 показана сполука 1 у вигляді ацетатної солі. Щоб розробити композицію з концентрацією пептиду, що перевищує 2мг/мл, переважно до 10мг/мл, проводили експерименти з декількома підсилювачами розчинності. Попередні експерименти показали, що концентрацію 2мг/мл не легко досягнути. Щоб розробити композицію для підшкірної ін'єкції також бажано, щоб значення рН було в межах від 4 до 9, і щоб розчин був ізоосмотичним. На основі всебічного огляду літератури було прийнято декілька основних підходів, щоб отримати композицію з максимальною розчинністю. Розглядалися наступні фактори: - коректування рН і буфери - розчинники 15 83816 - співрозчинники - солюбілізуючі агенти Способи Сполуку 1 розчиняли у вибраному розчині підсилювача розчинності або окремо, або в комбінації з іншими ексципієнтами, і розчини перемішували щонайменше протягом години. При необхідності коректували рН. Розчини досліджували візуально, щоб оцінити розчинність, і відправляли для аналітичного визначення. У разі декількох вибраних композицій також тестували біологічну активність. Результати У таблиці 1 представлений тип підсилювачів розчинності, що використовуються для розробки композиції. У таблицях 2 і 3 підсумовані експерименти, які здійснювали з різними підсилювачами розчинність. У таблиці 2 підсумований початковий скринінг, здійснюваний з концентраціями пептиду в діапазоні від 5 до 10мг/мл. Експеримент, який проводили з більш високою концентрацією пептиду, потім повторювали з більш низькими дозами (див. таблицю 3). Початкові тести показали, що сполука 1 краще розчинна в межах необхідних рівнів рН, як кислих, так і основних, але менш стабільна в діапазоні основних значень рН. Відповідно, тестували декілька буферів і агентів для коректування рН, включаючи ацетатний буфер, цитратний буфер і карбонат натрію. Жоден з початково тестованих буферів не давав необхідного рівня розчинності пептиду. Тільки вище рН9,2 і нижче рН3,0 спостерігалися рівні розчинності 2мг/мл. Однак на початковій стадії були вибрані композиції з ацетатним буфером і цитратним буфером (з манітом як агентом тонічності) для початкових токсикологічних досліджень. Вказані композиції тестували відносно біологічної активності, і було доведено, що вони активні. Тестували неводні розчинники (див. таблицю 1), такі як етанол, гліцерин, пропіленгліколь, кремофор і їх комбінації, але вони не збільшували розчинності сполуки 1. Розчин 30% DMA (диметилацетаміду) давав розчинність в необхідних межах (5-9мг/мл), але не підходив для фармацевтичної композиції через свій профіль токсичності. Поліпшену розчинність також спостерігали при використанні 30% (мас/мас.) ПЕГ 400 (5-9мг/мл). Вказану останню композицію вибрали для токсикологічних досліджень, але показано, що вона є неактивною в біологічному аналізі і може бути причиною деяких несприятливих ефектів при дослідженні токсичності на мишах. Таким чином, було вирішено більше не займатися даною композицією. Враховуючи попередні експерименти, неводні розчинники не використовували в даних композиціях. Тестували декілька амінокислот (див. таблицю 1), включаючи L-аргінін, L-глутамінову кислоту, Lгліцин і L-лізин, щоб підвищити розчинність білка. Розчинність пептиду в L-аргініні була на необхідному рівні, але кінцеве значення рН було вищим за 9. Спроба знизити рН або використати НСІ-сіль аргініну приводила до випадання пептиду в осад. Також тестували сироватковий альбумін людини, і він підвищував розчинність пептиду при низьких концентраціях пептиду (1мг/мл) (див. таблицю 3). 16 Однак внаслідок своєї потенційної імуногенності і низької розчинності пептиду його не використовували в подальших експериментах. Наповнювачі (див. таблицю 1), включаючи маніт, сорбіт і декстран, тестували окремо і в комбінації з іншими ексципієнтами, але вони не підвищували розчинності пептиду в розчині. Співрозчинники (див. таблицю 1), включаючи полісорбат 20 і полісорбат 80, тестували окремо і в комбінації з іншими ексципієнтами. Хоч більш низькі концентрації полісорбатів (аж до 6%) не збільшували розчинності пептиду, більш високі концентрації (до 10% - див. таблицю 2) підвищували розчинність пептиду до 2мг/мл. Однак вважали, що такі високі концентрації полісорбатів є невідповідними для фармацевтичних композицій. Також тестували два типи циклодекстринів, обидва з яких схвалені для застосування в парентеральних продуктах, що продаються: гідроксипропіл-β-циклодекстрин і сульфобутиловий ефір-βциклодекстрин (каптизол). Обидва помітно збільшували розчинність пептиду (концентрації на рівні 10мг/мл для гідроксипропіл-β-циклодекстрину і 2,5 для каптизолу). Тестували біологічну активність двох композицій циклодекстрину і виявили, що вони рівні по активності пептиду, взятому окремо. Captisol® (каптизол) є комерційно доступним поліаніонним похідним циклодекстрину, в якому сіль сульфонату натрію відділена від гідрофобної порожнини спейсерною групою простого бутилового ефіру або простого сульфобутилового ефіру (SBE). Каптизол є торговою маркою препарату гепта-заміщеного сульфобутиловим ефіром βциклодекстрину (SBE7-β-CD) CyDex Inc (www.captisol.com). Структура каптизолу дозволяє молекулам лікарського засобу увійти в гідрофобну порожнину, таким чином ізолюючи молекулу лікарського засобу від водного розчинника. Оскільки зовнішня поверхня каптизолу є гідрофільною, то розчинність готової молекули лікарського засобу при цьому підвищується. Застосування циклодекстринів для підвищення розчинності молекул лікарських засобів описане в [патентах США №№5134127 і 5376645], повний зміст яких включений, таким чином, у вигляді посилання. Згідно з літературними даними, каптизол CyDex Inc. є безпечним при парентеральному введенні і не виявляє нефротоксичності, пов'язаної з бета-циклодекстрином. У порівнянні з бетациклодекстрином каптизол виявляє порівнянні або більш високі властивості комплексоутворення і більш високу розчинність у воді ви ще 90 грам/100мл - 50-кратної підвищення. Висновок Виявлено, що декілька підсилювачів розчинності підходять для необхідного діапазону розчинності: DMA, ПЕГ-400, диметилацетамід, поліетиленгліколь, поліоксильоване касторова масло, Nметил-2-піролідинон, 1-етеніл-2-піролідинон, полісорбат 20, полісорбат 80, гідроксипропіл-βциклодекстрин і сульфобутиловий ефір-βциклодекстрин (каптизол). Підтверджено, що з вказаних підсилювачів розчинності обидва циклодекстрини є кращими відносно розчинності, біологічної активності і стабільності. Відповідно було 17 83816 вирішено вибрати каптизол як підсилювач розчинності для застосування в композиціях згідно з прикладом 5 і дослідити обидві композиції на основі цикл о декстрину далі. Кінцева композиція для 18 клінічних досліджень згідно з прикладом 5 складається з 120мг/мл каптизолу у воді з необхідною кількістю пептиду (0,5, 1,0 або 2,5мг/мл) і HCl і NaOH для коректування рН. Таблиця 1 Підсилювачі розчинності, що в икористовуються для розробки композиції сполуки 1 Класифікація підсилюв ачів розчинності Розчинники Спів розчинники Солюбілізатори Напов нюв ачі Агенти для коректув ання рН Підсилювачі розчинності Кремофор EL, CMC, етанол, DMA, гліцерин, пропіленгліколь, ПЕГ 400, монотіогліцерин Полісорбат 20, полісорбат 80 Аргінін, HSA, гліцин, креатинін, глутамінов а кислот, лізин (ацетатна сіль і в ільна основ а), каптизол, гідроксипропіл-β-циклодекстрин Маніт, сорбіт , декстроза, лактоза, декстран Цитратний буфер, ацетатний буфер, карбонат натрію 19 83816 20 Продовження таблиці 2 21 83816 22 Продовження таблиці 3 Приклад 2: Протокол приготування розчину сполуки 1 в каптизолі Стандартні способи розчинення, такі як змішування сухої сполуки 1 і сухого каптизолу у воді або додання сполуки 1 до приготованого розчину каптизолу і води, не приводили до повного розчинення в необхідних концентраціях. Тестували декілька різних концентрацій як сполуки 1, так і каптизолу при різних рівнях рН. Однак наступний спосіб приготування розчину сполуки 1 в каптизолі приводив до повного розчинення в необхідних концернтраціях. Речовини: каптизол, сполуки 1 і вода. Спосіб: 1. Зважують відповідну кількість каптизолу, щоб отримати кінцеву концентрацію 120мг/мл. 2. Додають 80% кінцевих кількості води і перемішують протягом 10 хвилин з використанням магнітної мішалки. 3. Зважують сполуку 1, щоб отримати кінцеву концентрацію 2,5мг/мл, 2,0мг/мл, 1,0мг/мл, 0,5мг/мл або 0,1мг/мл. 4. Додають пептид до розчину каптизолу. Перемішують протягом 1 години. 5. Підвищують рН, щоб отримати прозорий розчин (в композиції 2,0мг/мл може бути необхідно підвищити рН трохи вище за 9). рН необхідно коректувати, використовуючи 1,0н HCl і 1,0н NaOH. Перемішують протягом 10 хвилин. 6. При необхідності коректують рН до діапазону від 7,5 до 8,5 (використовуючи або HCl, або NaOH, 1,0н). 7. Додають воду до кінцевого об'єму. 8. Фільтрують розчин через фільтр з ацетату целюлози з порами 0,2мкм. 9. Реєструють кінцеве значення рН. 10. Ділять на аліквоти і зберігають при прийнятній температурі. Приклад 3: Ліофілізація розчину сполуки 1 і каптизолу Даний спосіб ліофілізації відрізняється від інших способів ліофілізації тим, що процентний вміст сухого залишку в композиції вищий (12%), тоді як ліофілізовані продукти звичайно містять від 5 до 10% сухого залишку. Обладнання Як ліофільну сушарку використали ліофілізатор Edwards Lyoflex 0.6. Здійснювали IQ/OQ обладнання і перевіряли відносно відповідності за допомогою перевірки якості до розробки способу. Готували розчини сполуки 1 і каптизолу з концентраціями сполуки 1 0,5мг/мл, 1,0мг/мл і 2,5мг/мл. Завантажуваний об'єм доводили до 1мл (1,05г). Основні стадії способу: 1. Заморожування 2. Витримування (при низькій температурі) 3. Сушіння у вакуумі в дві стадії: 3.1. Первинне сушіння - нагрівання стелажу для сушіння до верхньої підтримуваної температури, контролювання температури стелажу на верхньому підтримуваному рівні. 3.2. Повторне сушіння - зниження тиску до мінімального значення при верхній підтримуваній температурі стелажу. Партії 1-3 Заморожування - заморожування проводили від кімнатної температури до -40°C протягом 2 годин. Стелажі підтримували при -40°C протягом 3 годин. Сушіння - сушіння здійснювали при тиску 110мкбар. Температуру стелажу збільшували до 20°C протягом 13 годин і підтримували при даній температурі ще протягом 13 годин. Загальний час процесу становив 31 годину. Результати: Результати за вмістом води: Партія No.1: 3,8% Партія No.2: 4,0% і Партія No.3: 4,9% Партії 4 і 5 Оскільки результати за вмістом води при використанні способів, що приводять до отримання партій 1, 2 і 3, були вищим, ніж необхідне значення, було вирішено додати стадію сушіння при тій же самій температурі і при низькому тиску. Сушіння - сушіння здійснювали при тиску 110мкбар. Температуру стелажу збільшували до 20°C протягом 13 годин і підтримували при даній тем 23 83816 пературі ще протягом 13 годин (партія 4) або 8 годин (партія 5). Тиск знижували до 10мкбар додаткове протягом 5 годин. Загальний час процесу становив 36 годин. Результати: Результати за вмістом води: Партія 4: Плацебо: 3,0%, 1мг/мл: 3,9%. Партія 5: Плацебо: 4,1%. 24 Висновок Як показано, розроблений задовільний спосіб ліофілізації сполуки 1 з каптизолом. Внаслідок високого процентного вмісту сухого залишку і тому конденсованої ліофілізованої маси розроблений спосіб є більш тривалим, ніж наявні сучасні цикли ліофілізації пептидів, і має додаткову стадію повторного сушіння. У таблиці 4 підсумований розроблений спосіб. Таблиця 4 Стадія Зав антаження Заморожув ання Витримування при низькій температурі Перв инне сушіння: Нагрів ання до 20°C Витримув ання при 20°C Повторне сушіння: Витримув ання при 20°C Зберігання при Час процесу Приклад 4 Дослідження біологічної активності in-vivo ліофілізованого розчину сполуки (DP, 1мг/флакон, 12% каптизол) Біологічну активність перевіряли по інгібуванню секреції IL-2 з специфічних по відношенню до стандартного зразка (RS) сполуки 1 Т-клітин після підшкірної (п/ш) обробки ліофілізованим розчином сполуки, тобто лікарським продуктом (DP) при двох концентраціях. Результати обробки порівнюють з результатами обробки мишей сполукою 1 (RS) в фосфатно-сольовому буфері (PBS). Результати показані в таблиці нижче і на Фіг.2. План експерименту: 1. Імунізація 0 день (Сполука 1 RS, емульгована з CFA, у всі чотири подушечки лапи) 2. Обробка Приклад 5: Оцінка оптимальної дози для обробки У подальшому описі використали наступні скорочення: Сполука 1 (пептид) з каптизолом 5°C 2 години до -40°C 3 години до -40°C 13 годин тиск 110мкбар 13 годин тиск 110мкбар 5 годин тиск 10мкбар -20°C 36 годин (п/ш в задню частину шиї, 0 день в 200мкл розчину) 3. Активація in-vitro: 10 день a) сполукою 1 RS в концентраціях 0; 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 25; 50 і 100мкг/мл b) пептидом із зворотним порядком амінокислот відносно сполуки 1 (негативний контроль). c) Con A (позитивний контроль). 4. Інкубація культури протягом 20 година при 37°C в інкубаторі у вологій атмосфері з 5% СО2. 5. Вимірювання IL-2 з допомогою ELISA. Таблиця експериментальних гр уп: Група Імунізація Обробка А 50мкг сполуки 1 RS в PBS В 200мкг сполуки 1 RS в PBS 50мкг споC луки 1 RS 50мкг DP (партія 2) D 200мкг DP (партія 2) F Плацебо (12% каптизол) CFA повний ад'ювант Фрейнда Con A конканавалін А DP лікарський продукт DS лікарська речовина 25 83816 EM-1 збагачене середовище DCCM-I ЕМ-3 збагачене середовище RPMI-1640+ фетальна сироватка теляти FCS фетальна сироватка теляти IFN-g інтерферон гамма LN лімфатичний вузол PBS фосфатно-сольовий буфер RS стандартний зразок п/ш підшкірне TB трипановий синій TGF-β трансформуючий фактор росту бета WFI вода для ін'єкції Передмова Групу з 20 мишей імунізували 50мкг/мишу сполуки 1 RS. Імунізованих мишей розподіляли на п'ять груп обробки, які вказані далі: плацебо, 25, 50, 100 і 200мкг/мишу сполуки 1 DP (підшкірне введення). Через десять днів після імунізації і об 26 робки витягували LN і готували суспензію окремих клітин. Потім вимірювали секрецію in-vitro IFN-g і TGF-β культивованими клітками у відповідь на активацію декількома концентраціями сполуки 1 RS. План експерименту 1. Імунізація 0 день 2. Обробка сполукою 1 DP 0 день 3. Активація in-vitro клітин LN від оброблених мишей 10 день 4. Збір культурального середовища (для визначення IFN-g) 12 день 5. Збір культурального середовища (для визначення IGF-β) 13 день 6. ELISA відносно IFN-g 7. ELISA відносно TGF-β Таблиця 7 Експериментальні групи Експериментальна група A1 Обробка Режим Контроль Captisol® Мишей/групи 12% 4 А2 25мкг/мишу 4 A3 50мкг/мишу 4 А4 100мкг/мишу 4 А5 200мкг/мишу 4 Матеріали і реагенти Тварини Миші: 20 самиць мишей BALB/c, що поставляються центром розведення тварин Harlan, Rehovot. Вік під час імунізації (тиждень+день): 10 Середня маса мишей, включених в експеримент: 19,01г. Речовини Загальні реагенти 70% етанол отримували з 96% етанолу розбавленням очищеної H2O. Приготування розчинів сполуки 1 для імунізації Емульсію CFA-сполука І RS (500мкг/мл, 50мкг/мишу) готували таким чином: 1. 1,874мг сполуки 1 розчиняли в 1,87мл WFI, отримуючи розчин 1мг/мл. 2. Розчин перевіряли за допомогою рНіндикаторних смужок і виявили, що він має рН5. 3. 1,5мл розчину емульгували з 1,5мл CFA, отримуючи кінцеву концентрацію 500мкг/мл. Приготування розчинів для обробки Обробку проводили п/ш-ін'єкцією 200мкл розчину. Приготування розчину 12% каптизолу 1,2г каптизолу розчиняли в 10мл WFI, отримуючи розчин 12% каптизолу. Послідовність операцій при проведенні експерименту Зважування мишей Активація Клітин/ямка 2,5´106 5´10б 2,5´106 5´106 2,5´106 5´106 2,5´106 5´106 2,5´106 5´106 in-vitro Концентрація сполуки 1 RS Сполука 1 RS0-100мкг/мл Мишей зважували перед імунізацією. Середня маса мишей: 19,01±0,97г. Імунізація Імунізацію проводили ін'єкцією 100 мікролітрів емульсії (50 мікролітрів в кожну подушечку задньої лапи). Обробка Після стадії імунізації мишей обробляли п/шін'єкцією 200мкл з вказаних розчинів сполуки 1 DP або 12% каптизол в задню частину шиї. Культивування in-vitro Мишей забивали зміщенням шийних хребців. LN витягували із задніх кінцівок і переносили в стерильну чашку Петрі, що містить приблизно 5мл RPMI Клітини виділяли обережним продавлюванням тканини через стальну сітку з комірками 200 мікрометрів. Клітини збирали і центрифугували при 300g протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Суспензії окремих клітин готували з об'єднаних LN з кожної експериментальної групи. Суспензії 2,5 і 5,0 мільйонів клітин/мл/ямка культивували із сполукою 1 RS (0-100мкг/мл) в EM-1. Секрецію IFN-g і TGF-β як показника клітинної відповіді визначали за допомогою ELISA культурального середовища (48 годин для IFN-g і 72 години для TGF-β). 27 83816 28 Таблиця 8 Експериментальні групи in-vitro Експериментальна група АІ-2,5 А1-5 А2-2,5 А2-5 A3-2,5 АЗ-5 А4-2,5 А4-5 А5-2,5 А5-5 Обробка Режим Контроль 12% Captisol® DP 25мкг/мишу DP 50мкг/мишу DP 100мкг/мишу DP 200мкг/мишу Клітин/ямку 2,5´106 5´106 2,5´106 5´106 2,5´106 5´106 2,5´106 5´106 2,5´106 5´106 Активація in n-vitro Концентрації активуючої речов ини Сполука 1 RS 0; 3,125; 6,25; 12,5; 50 і 100мкг/мл Con A 2,5мкг/мл Приготування суспензій клітин Приготування суспензії клітин (5´106/мл) Суспензію 106X 10б клітин/мл розбавляли 1:2 доданням 5мл EM-1 до 5мл клітинної суспензії. Інкубація культур клітин LN в 48-ямкових планшетах Готували 3 планшети для культури тканини. У кожний планшет додавали наступне. Контроль фону (клітини, інкубовані з культурального середовища) 0,5мл суспензії клітин 0,5мл культурального середовища (EM-1) Позитивний контроль системи (клітини, стимульовані Con A) 0,5мл суспензії клітин 0,5мл Con A 5мкг/мл в EM-I (кінцева концентрація 2,5мкг/ямка) Клітини, інкубовані з активуючими розчинами сполуки 1 (зразки) 0,5мл суспензії клітин 0,5мл сполуки 1 RS 6,25 - 200мкг/мл (кінцева концентрація 3,125 - 100мкг/мл/ямка) Інкубація культур клітин LN в 96-ямкових планшетах Після приготування 48-ямкових планшетів готували 96-ямкові планшети, використовуючи 100мкл з суспензії клітин і 100мкл з активуючих розчинів. Планшети для культивування інкубували при 37°C в інкубаторі із зволоженням і 5% CO2 протягом 48 або 72 години. Збір надосадів Планшети, що культивуються, центрифугували при 300g протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Надосади (850мкл з кожної ямки) переносили або в дзеркальний планшет, або в пробірку. Потім надосад ділили на аліквоти для роботи (дві аліквоти по 200 і одна аліквота об'ємом 450мкл), щоб уникнути повторного заморожування/відтавання зразків. Кожну пробірку позначали відповідною докладною інформацією: 1. Код експерименту і час після інкубації. 2. Номер групи і зразка. 3. Активатор і концентрація. 4. Дата збору надосаду. Надосади зберігали при -20°C аж до використання в ELISA. 29 83816 30 Результати Таблиця 10 Зв едена інформація про групи Імунізація Експ.групи Доза імунізації А 50мкг/мишу Експериментальні групи: Обробка Підгрупа Режим A1 12% Captisol® контрль, плацебо А2 Сполука 1 25мкг/М A3 Сполука 1 50мкг/М А4 Сполука 1 100мкг/М А5 Сполука 1 200мкг/М Активація in-vitro Сполука 1 RS 3,125100мкг/мл Таблиця 11-А Кінцев і концентрації цитокіну Концентрація сполуки 1 3,125мкг/мл 6,25мкг/мл 12,5мкг/мл 25мкг/мл 50мкг/мл 100мкг/мл Con A Кінцев а концентрація цитокіну (пг/мл) (2,5 мільйони клітин/ямку) Плацебо 50мкг/М 100мкг/М 321,3 54,1 64,5 238,6 81,8 116,1 397,1 123,1 180,9 655,5 215,1 262,8 573,9 292,5 518,3 926,0 531,8 582,7 322,6 356,2 337,4 200мкг/М 103,9 126,1 129,0 240,3 378,1 524,1 BQL Таблиця 11-B Кінцев і концентрації цитокіну Концентрація сполуки 1 3,125мкг/мл 6,25мкг/мл 12,5мкг/мл 25мкг/мл 50мкг/мл 100мкг/мл Con A Кінцев а концентрація цитокіну (пг/мл) (5 мільйонів клітин/ямку) Плацебо 25мкг/М 50мкг/М 100мкг/М 522,3 BQL 76,2 90,8 634,8 BQL 109,2 157,8 962,8 41,9 179,5 257,1 967,4 70,0 277,9 421,7 1338,8 104,2 373,4 739,7 2010,2 185,2 547,0 995,5 6839,8 2995,3 4837,0 10126,8 Результати також представлені на Фіг.3-4. Результати спостереження Секреція IFN-g 1. У групі плацебо показана лінійна дозова залежність при активації сполукою 1 in-vitro. Даний графік схожий з графіком, отриманим для моделі ех-vivo при такій же дозі імунізації (50мкг/мишу) і культуральному середовищі (EM-1)2. Дозова залежність при активації сполукою 1 in vitro мала місце у всі х тестованих група х. 3. Значуще інгібування секреції IFN-g спостерігали при всіх дозах, що використовуються для обробки (середнє 95% інгібування при дозі обробки 25мкг/мишу). Може бути виявлена зворотна кореляція між дозою, яка служить для обробки, і % інгібування, в основному при використанні 5´106клітин/ямку. При використанні 2,5´106 клітин/ямку обробка тварин 50мкг/мишу давала більше інгібування, ніж 100 або 200мкг. Точка 25мкг пропущена (брак клітин). 4. Більше інгібування спостерігали при використанні 5´106клітин/ямку замість 2,5´106клітин/ямку. 5. На лінійному діапазоні кривої SD інгібування в % було низьким. 200мкг/М 204,4 244,1 466,1 660,5 922,5 1006,2 7722,8 6. Технічна проблема, пов'язана з Соn А, виражена при використанні 2,5´106клітин/ямку. Секреція TGF-B 1. У групі плацебо не спостерігали дозової залежності при активації in vitro сполукою 1. Секретований рівень TGF-β був нижчим за межу визначення в ELISA у всі х інших гр упах обробки. Приклад 6: Оптимізації циклу сублімаційного сушіння у випадку сполуки 1 і каптизолу для ін'єкції (0, 0,5, 1,0 і 2,5мг/флакон) Мета Метою даного дослідження була оптимізація циклу сублімаційного сушіння сполуки 1 з каптизолом для ін'єкції, щоб поліпшити форму ліофілізованої маси і уникнути зминання і розтріскування. Відповідно, було вирішено поліпшити і оптимізувати цикл ліофілізації. Даний цикл перенесений в промислові ліофілізатори для виробництва партій для випробувань фази І. Оптимізація способу Готували партії пептиду з концентраціями 0,5мг/мл, 1,0мг/мл, 2,5мг/мл і плацебо і здійснювали декілька циклів сублімаційного сушіння. Як сублімаційну сушарку використовували ліофілізатор Edwards Lyoflex 0.6. 31 83816 Тестували розчинність, вміст води і зовнішній вигляд ліофілізованого матеріалу. Згідно з отриманими результатами, вибраний новий цикл ліофілізації сполуки 1. Внаслідок високого процентного вмісту сухого залишку (12%) і 32 через це конденсованої ліофілізованої маси новий спосіб є більш тривалим, ніж цикл ліофілізації в прикладі 3, і має додаткову стадію первинного сушіння. У таблиці 12 підсумовані відмінності між способами. Таблиця 12 Стадія Зав антаження Заморожув ання Витримування при низькій температурі Первинне сушіння: Стадія І Стадія II Витримування при 20°C (25°C) Повторне сушіння: Витримув ання при 20°C Зберігання при Час процесу Цикл ліофілізації для сполуки 1 і каптизолу з прикладу 3 5°С 2 години до -40°C 3 години до -40°C до 20°C 13 годин тиск 110мкбар 13 годин тиск 110мкбар 5 годин тиск 10мкбар 5°C 36 годин Приклад 7: Дія сполуки 1 (введеної в каптизолі) на симптоми вовчака у схильних до СЧВ самиць мишей (14ZBxNZW) F1 Пацієнтів, що беруть участь в клінічних випробуваннях, будуть лікувати сполукою 1, використовуючи як ексципієнт каптизол (натрієва сіль сульфобутиловий ефір-бета-циклодекстрину). З цих причин важливо визначити, чи буде обробка мишей (NZBxNZW) F1 композицією сполуки 1, що вводиться в каптизолі, надавати таку ж лікувальну дію на симптоми вовчака, яка спостерігається при обробці мишей такої ж лінії сполукою 1 в PBS. З цією метою самиць мишей (NZBxNZW) F1 (приблизно 8-місячного віку) ділили на 3 групи, які обробляли підшкірно один раз в тиждень протягом 10 тижнів або окремо каптизолом (n=8), або 25 або 50мкг/мишу сполуки 1 в каптизолі (n=9 і 10, відповідно). Вказані дози були вибрані тому, що попередні дослідження показали, що дози в даному діапазоні більш ефективні в ослабленні симптомів СЧВ, ніж більш високі тестовані дози (100 і 200мкг/мишу). Одн у і ту ж партію лікарської речовини використовували в даному дослідженні і в Новий цикл ліофілізації для сполуки 1 і каптизолу 5°C 6 годин до -45°С 3 години до -45°C до -20°C 19 годин тиск 150мкбар до 25°C 13 годин тиск 150мкбар 8 годин тиск 150мкбар 5°C 49 годин першому клінічному випробуванні фази І сполуки 1. У мишей проводили спостереження відносно анти-днДНК-антитіл і протеїнурії. Після забиття мишей визначали інтенсивність ICD в нирках. Як можна бачити на Фіг.5, не спостерігалося значущи х відмінностей між групами по рівнях днДНК-специфічних антитіл після 10 ін'єкційних обробок. У таблиці 13 також показано, що цілюща дія обробки сполукою 1 може спостерігатися, починаючи з 5-ої ін'єкції, і підтримується до 10-ої ін'єкції. Середні рівні протеїнурії в контрольній групі, обробленій каптизолом, були, відповідно, вищі, ніж в групах, оброблених сполукою 1. В таблиці 13 також показано, що спостерігалося зменшення інтенсивності ICD в нирках в обох гр упах, оброблених різними дозами сполуки 1. Мала місце загальна тенденція, яка свідчить, що більш низька доза (25мкг/мишу) була більш е фективна, ніж більш висока доза (50мкг/мишу) в зниженні клінічних симптомів СЧВ у даних мишей. Таблиця 13 Клінічні симптоми СЧВ у мишей (NZBxNZW) FL оброблених 25 або 50мкг/мишу сполуки 1 (в каптизолі) Група дослідження Captisol® Сполука 1 (50мкг/мишу) Сполука 1 (25мкг/миша) 5 1,81±1,22 (n=8) 0,75±0,3 (n=10) 0,16±0,05 (n=9) Середнє значення протеїнурії ±SEM (г/л) Кількість тижнів після початку обробки 7 8 10 5,74±3,13 4,5±2,92 4,4б±2,93 (n=8) (n=7) b (n=7) b 0,81±0,3 1,09±0,4 1,29±0,3 (n=10) (n=10) (n=10) 1,26±1,09 0,5±0,31 0,56±0,3 (n=9) (n=9) (n=9) ICDa (середнє ±SEM) 2,29±0,28 (n=7) 1,90±0,23 (n=10) 1,22с ±0,32 (n=9) a ICD= в ідкладення імунних комплексів . Шкала інтенсивності ICD: 0=немає; 1=помірне; 2=тяжке; 3=тяжке/дуже інтенсив не. b загибель однієї тварини з в исоким рів нем протеїнурії привела до більш низького середнього значення в групі. с р2) зі схожим розподілом у всіх групах лікування. Т-клітинна відповідь була відносно низькою, і неможливо було виявити зв'язки між лікувальною дозою сполуки 1 або концентрацією, що використовується в аналізі, і статусом респондера/не респондера, беручи до уваги, що вводили тільки однократну п/ш-доз у досліджуваного лікарського засобу. Також не спостерігалося ознак підвищеної частоти зустрічання статусу респондера з плином часу. Аналіз правцевого токсоїду (TTX), який служить як контроль безпеки, показує, що відповідь на TTX зберігалася протягом періоду дослідження у всіх групах лікування, свідчачи про те, що сполука 1 в каптизолі не змінює імунологічну відповідь на повторно введений антиген TTX. Отримані імунологічні дані є результатом введення тільки однократної дози досліджуваної лікарської сполуки 1. Результати визначення активності захворювання Не відмічено клінічно значущого впливу сполуки 1 на індекс SLEDAI (зміна >3, >12 пунктів) під час дослідження, за винятком одного суб'єкта в групі лікування дозою 0,5 мг, у якого реєстрували зміну індексу SLEDAI від 2 до 10 пунктів між початковим рівнем і 4 тижнем на основі аналізу сечі, що показує піурію. Дослідником не підтверджені вказані дані аналізу сечі як спалах вовчака по визначенню в протоколі, і було вирішено не змінювати лікування. Висновок Дане дослідження фази Ia показало, що однократна підшкірна ін'єктована доза сполуки 1, яка дорівнювала 0,5, 1 або 2,5мг, в 120мг каптизолу була безпечною і добре переносимою, і дало можливість для продовження дослідження з багаторазовими дозами в фазі Ib. Приклад 9: Клінічне дослідження фази Ib Двонаціональне, рандомізоване, подвійне сліпе, з чотирма варіантами, з плацебо-контролем, з використанням багаторазових доз дослідження фази І, що проводиться в декількох центрах, щоб 39 83816 оцінити переносимість і безпеку підшкірної ін'єкції сполуки 1 в каптизолі у суб'єктів з СЧВ. Дане дослідження здійснюється для того, щоб оцінити безпеку і переносимість багаторазового п/ш-введення сполуки 1 суб'єктам з СЧВ. Другою метою дослідження є оцінка імунологічних відповідей після багаторазового п/ш-введення сполуки 1 в каптизолі у суб'єктів з СЧВ. Сполуку 1 вводять в дозах 0,5, 1,0 або 2,5мг в каптизолі. Продукт, який проходить клінічне випробування, вводять через день (виключаючи вихідні дні), всього 12 п/ш-ін'єкцій, тобто 3 дози на 40 тиждень протягом 4 тижнів. Спостереження за суб'єктами проводять при запланованих візитах по графіку на 2, 4, 8 і 12 тижні після початку введення доз. Безпеку і переносимість оцінюють, використовуючи тести, схожі з тестами, описаними вище для фази Ia клінічного дослідження. Результати Дослідження фази Ib показує, що багаторазові підшкірно ін'єктовані дози сполуки 1, які дорівнюють 0,5, 1 або 2,5мг в 120мг каптизолу є безпечними і добре переносимими. 41 83816 42 43 Комп’ютерна в ерстка Т. Чепелев а 83816 Підписне 44 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601