Спосіб лікування раку кровотворної системи із застосуванням фородезину у комбінації з ритуксимабом

Реферат: UA 104579 C2 (12) UA 104579 C2 Винахід стосується способу лікування раку кровотворної системи у суб′єкта, що включає введення суб′єктові ефективної кількості Фородезину та введення суб′єктові ефективної кількості Ритуксимабу. UA 104579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Ця заявка стосується лікування раку кровотворної системи, наприклад, раку крові, з застосуванням способів, до яких належать введення пурин-нуклеозидфосфорилази (PNP) інгібітор. Зокрема, описуються способи лікування хронічного лімфоцитарного лейкозу (CLL) та гострого лімфоцитарного лейкозу (ALL). Споріднені заявки Ця заявка заявляє пріоритет заявки США під реєстраційним номером 61/012,762, поданої 10 грудня 2007 р., зміст якої включено шляхом посилання. Рівень техніки У наш час рак займає друге місце серед причин смерті у Сполучених Штатах Америки. Рак було діагностовано у 8 000 000 осіб у США. У 1995 р. спричинив 23,3% усіх смертей у Сполучених Штатах Америки (див., наприклад, U.S. Dept. of Health and Human Services, National Center for Health Statistics, Health United States 1996-97 and Injury Chartbook 117 (1997)). Нині рак піддають лікуванню з застосуванням одного з трьох нижчезазначених типів терапії або їх комбінації: хірургія; опромінення; та хіміотерапія. Хірургія передбачає видалення великого об’єму ураженої тканини. Хоча хірургія часом є ефективною для видалення пухлин, які знаходяться у деяких місцях, наприклад, у молочній залозі, товстій кишці та шкірі, вона не може застосовуватися ні для лікування від пухлин, розташованих в інших місцях, таких, як хребет, ні для лікування від дисемінованих неопластичних станів, таких, як лейкоз. Променева терапія передбачає піддавання живої тканини іонізуючому опроміненню, яке спричинює відмирання або пошкодження клітин, які зазнали такого опромінення. Побічні ефекти променевої терапії можуть бути гострими і тимчасовими, але деякі можуть бути незворотними. Хіміотерапія передбачає перешкоджання реплікації клітин або метаболізмові клітин. Найчастіше її застосовують для лікування раку молочної залози, легенів та яєчка. Однією з головних причин невдач цього способу лікування раку є розвиток резистентності ракових клітин до ліків, що становить серйозну проблему, яка може призводити до рецидиву хвороби або навіть смерті. Таким чином, існує потреба у більш ефективних способах лікування від раку. Короткий опис винаходу Авторами пропонується спосіб лікування раку кровотворної системи (наприклад, CLL та ALL) у суб’єкта. Спосіб включає етапи: (a) введення суб’єктові ефективної кількості інгібітора пурин-нуклеозидфосфорилази (PNP); та (b) введення суб’єктові ефективної кількості алкілуючого агента або агента проти CD20. У деяких варіантах втілення інгібітором PNP є Фородезин. В інших варіантах втілення алкілуючий агент є вибраним з-поміж похідної гірчиці, похідної нітрозосечовини, платинової сполуки та імідазол-карбоксамідної сполуки. У деяких варіантах втілення алкілуючим агентом є Бендамустин. У деяких варіантах втілення агентом проти CD20 є Ритуксимаб. У деяких варіантах втілення інгібітор PNP та алкілуючий агент або агент проти CD20 вводять одночасно, а в інших варіантах втілення інгібітор PNP та алкілуючий агент або агент проти CD20 вводять послідовно. В останньому варіанті втілення алкілуючий агент або агент проти CD20 вводять один або кілька разів перед введенням інгібітора PNP. В іншому варіанті втілення спосіб лікування раку кровотворної системи у суб’єкта з резистентністю до одного або кількох хіміотерапевтичних засобів (наприклад, алкілуючого агента, такого, як Бендамустин, та аналога пурин-нуклеозиду, такого, як Флударабін) може включати етапи: (a) виявлення суб’єкта з резистентністю до одного або кількох хіміотерапевтичних засобів; та (b) введення суб’єктові інгібітора PNP. У конкретних варіантах втілення інгібітором PNP є Фородезин. В інших варіантах втілення спосіб лікування суб’єкта з раком кровотворної системи може включати етапи: (a) виявлення делеції p53 в одній або кількох ракових клітинах у зразку, взятому з організму суб’єкта; та (b) введення суб’єктові інгібітора PNP. У деяких варіантах втілення інгібітором PNP є Фородезин. У деяких варіантах втілення спосіб також може включати виявлення наявності делеції 17p та/або визначення, чи є одна або кілька ракових клітин у зразку резистентними до одного або кількох хіміотерапевтичних засобів (наприклад, алкілуючого агента та аналога пурин-нуклеозиду). Авторами також пропонується фармацевтична композиція, яка включає інгібітор PNP та алкілуючий агент або агент проти CD20. Авторами також пропонується комплект, який включає інгібітор PNP та алкілуючий агент або агент проти CD20. У деяких варіантах втілення комплект також може включати систему доставлення для інгібітора PNP, алкілуючого агента, агента проти CD20 або будь-якої їх комбінації. В іншому варіанті втілення комплект також може включати інструкції з лікування суб’єкта. 1 UA 104579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому варіанті втілення комплект включає інгібітор PNP. В одному варіанті втілення комплект також включає ярлик, на якому вказується, що вміст призначається для введення суб’єктові з резистентністю до алкілуючого агента. У деяких варіантах втілення комплект також включає ярлик, на якому вказується, що вміст призначається для введення суб’єктові з делецією p53. В останньому варіанті втілення комплект може включати ярлик, на якому вказується, що вміст призначається для введення з алкілуючим агентом або агентом проти CD20. У деяких варіантах втілення пропонується застосування інгібітора пуриннуклеозидфосфорилази (PNP) та алкілуючого агента для приготування медикаменту, призначеного для лікування раку кровотворної системи у тварини. У деяких варіантах втілення пропонується застосування інгібітора пуриннуклеозидфосфорилази (PNP) та агента проти CD20 для приготування медикаменту, призначеного для лікування раку кровотворної системи у тварини. У деяких варіантах втілення пропонується застосування інгібітора пуриннуклеозидфосфорилази (PNP) та алкілуючого агента для лікування раку кровотворної системи. У деяких варіантах втілення пропонується застосування інгібітора пуриннуклеозидфосфорилази (PNP) та агента проти CD20 для лікування раку кровотворної системи. Деталі одного або кількох варіантів втілення винаходу представлено на супровідних фігурах та подальшому описі. Інші особливості, цілі та переваги стануть зрозумілими з опису та фігур, а також формули винаходу. Опис фігур Фігура 1A та 1B детально показує цитотоксичний ефект Фородезину у клітинах CLL, які демонструють високий та низький рівень ZAP-70. Фігура 2 показує зв’язок між внутрішньоклітинним підвищенням рівня dGTP після лікування Фородезином та кількістю відмерлих клітин в результаті такого лікування. Фігура 3 детально показує значення випадків CLL з делецією p53 з високою реакцією на Фородезин. Фігура 4 показує дані для випадків лікування CLL Фородезином з низькою або відсутньою чутливістю до лікування Бендамустином або Флударабіном. Фігура 5A та 5B показує дані комбінованих показників для Фородезину/Бендамустину та Фородезину/Флударабіну. Фігура 6 детально показує дані комбінованих показників для Фородезину/Ритуксимабу. Детальний опис Як описується авторами, лікування фородезином викликало залежне від часу та дози відмирання клітин у первинних клітинах CLL. Цитотоксична реакція, вища за 60%, при 2 мкM фородезину та 20 мкM dGuo спостерігалася у 48% випадків, і лише у 9% випадків цитотоксичність була нижчою за 40%. Не спостерігалося розбіжностей у реакції стосовно генетичних відхилень, таких, як делеції 17pl3 (TP53) та 11q22-q23 (ATM), генетичних відхилень, набутих при запущених хворобах і пов’язаних з резистентністю до ліків і у пацієнтів CLL з коротким терміном виживання. Випадки CLL зі змінами у p53 або 11q виявляли високу чутливість до фородезину (середня цитотоксичність 60,1% через 48 годин), з доброю цитотоксичною реакцією, яка досягалася у стійких до хіміотерапії пацієнтів з CLL. Комбінація фородезину з клінічними антилейкозними режимами посилювала in vitro цитотоксичні реакції, з сильним синергетичним ефектом, який спостерігався при комбінації фородезину з низькими дозами бендамустину, моноклонального антитіла проти CD20 ритуксимабу або циклофосфаміду. Натомість антагоністичний ефект спостерігався при флударабіні. Таким чином, фородезин являє собою новий хіміотерапевтичний засіб, здатний викликати апоптоз клітин CLL в обхід шляху ATM/p53. Відповідно, у деяких варіантах пропонуються способи лікування раку кровотворної системи у суб’єкта, які включають етапи введення суб’єктові ефективної кількості інгібітора пуриннуклеозидфосфорилази (PNP); та введення суб’єктові ефективної кількості алкілуючого агента або агента проти CD20. У деяких варіантах втілення інгібітором PNP є Фородезин. У деяких варіантах втілення алкілуючий агент є вибраним з-поміж похідної гірчиці, похідної нітрозосечовини, платинової сполуки та імідазол-карбоксамідної сполуки. У деяких варіантах втілення алкілуючим агентом є похідна гірчиці. У деяких варіантах втілення алкілуючим агентом є Бендамустин. У деяких варіантах втілення агентом проти CD20 є Ритуксимаб. У деяких варіантах втілення інгібітор PNP та алкілуючий агент або агент проти CD20 вводять одночасно. 2 UA 104579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах втілення інгібітор PNP та алкілуючий агент або агент проти CD20 вводять послідовно. У деяких варіантах втілення алкілуючий агент або агент проти CD20 вводять один або кілька разів перед введенням інгібітора PNP. У деяких варіантах втілення рак кровотворної системи є вибраним з-поміж хронічного лімфоцитарного лейкозу та гострого лімфобластного лейкозу. У деяких варіантах втілення рак кровотворної системи є хронічним лімфоцитарним лейкозом. У деяких варіантах втілення рак кровотворної системи є гострим лімфобластним лейкозом. У деяких варіантах втілення суб’єктові вводять ефективну кількість алкілуючого агента. У деяких варіантах втілення суб’єктові вводять ефективну кількість агента проти CD20. У деяких варіантах втілення способів ці способи включають введення суб’єктові ефективної кількості інгібітора PNP, ефективної кількості алкілуючого агента та ефективної кількості агента проти CD20. У деяких варіантах втілення інгібітор PNP, алкілуючий агент та агент проти CD20 вводять одночасно. У деяких варіантах втілення інгібітор PNP, алкілуючий агент та агент проти CD20 вводять послідовно. У деяких варіантах втілення алкілуючий агент та агенти проти CD20 вводять один або кілька разів перед введенням інгібітора PNP. У деяких варіантах втілення пропонуються способи лікування раку кровотворної системи у суб’єкта з резистентністю до одного або кількох хіміотерапевтичних засобів, які включають етапи виявлення суб’єкта з резистентністю до одного або кількох хіміотерапевтичних засобів; та введення суб’єктові інгібітора PNP. У деяких варіантах втілення суб’єкт є резистентним до одного або кількох хіміотерапевтичних засобів, вибраних з групи, до якої належать алкілуючий агент та аналог пурин-нуклеозиду. У деяких варіантах втілення алкілуючим агентом є Бендамустин. У деяких варіантах втілення аналогом пурин-нуклеозиду є Флударабін. У деяких варіантах втілення пропонуються способи лікування суб’єкта з раком кровотворної системи, які включають етапи виявлення делеції p53 в одній або кількох ракових клітинах у зразку, взятому з організму суб’єкта; та введення суб’єктові інгібітора PNP. У деяких варіантах втілення способи також можуть включати виявлення наявності делеції 17p. У деяких варіантах втілення способи також можуть включати визначення, чи є одна або кілька ракових клітин у зразку резистентними до одного або кількох хіміотерапевтичних засобів. У деяких варіантах втілення ракова клітина або клітини є резистентними до одного або кількох хіміотерапевтичних засобів, вибраних з групи, до якої належать алкілуючий агент та аналог пурин-нуклеозиду. У деяких варіантах пропонуються фармацевтичні композиції, які включають інгібітор PNP та алкілуючий агент або агент проти CD20. У деяких варіантах втілення композиція включає Фородезин та Бендамустин. У деяких варіантах втілення композиція включає Фородезин та Ритуксимаб. У деяких варіантах втілення композиція включає інгібітор PNP, алкілуючий агент та агент проти CD20. У деяких варіантах втілення композиція включає Фородезин, Бендамустин та Ритуксимаб. У деяких варіантах пропонуються комплекти, які включають інгібітор PNP та алкілуючий агент або агент проти CD20. У деяких варіантах втілення комплекти також можуть включати систему доставлення для інгібітора PNP, алкілуючого агента, агента проти CD20 або будь-якої їх комбінації. У деяких варіантах втілення комплекти також можуть включати інструкції з лікування суб’єкта. У деяких варіантах втілення комплекти включають інгібітор PNP та алкілуючий агент. У деяких варіантах втілення комплекти включають інгібітор PNP та агент проти CD20. У деяких варіантах втілення комплекти включають Фородезин та Бендамустин. У деяких варіантах втілення комплекти включають Фородезин та Ритуксимаб. У деяких варіантах втілення комплекти включають інгібітор PNP, алкілуючий агент та агент проти CD20. У деяких варіантах втілення комплекти включають Фородезин, Бендамустин та Ритуксимаб. У деяких варіантах пропонуються комплекти, які включають інгібітор PNP. 3 UA 104579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У деяких варіантах втілення комплекти включають ярлик, на якому вказується, що вміст призначається для введення суб’єктові з резистентністю до алкілуючого агента. У деяких варіантах втілення комплекти також включають ярлик, на якому вказується, що вміст призначається для введення суб’єктові з делецією p53. У деяких варіантах втілення комплекти також включають ярлик, на якому вказується, що вміст призначається для введення з алкілуючим агентом або агентом проти CD20. На відміну від інших нуклеозидних аналогів, фородезин не включається до ДНК. Лікування фородезином веде до підвищення dGTP у клітинах CLL, і це підвищення є пов’язаним з цитотоксичністю клітин, вказуючи на те, що рівень dGTP, досягнутий після лікування Фородезином, є сурогатним маркером, який свідчить про цитотоксичну реакцію. Сприйнятливість CLL до фородезину може бути зумовлена високою активністю dCK, яка спостерігається у цих клітинах, активністю, яка позитивно регулюється фосфорилуванням dCK на Ser-74. Значна позитивна кореляція спостерігалася між співвідношенням фосфо-dCK/dCK та викликаним фородезином апоптозом. dCK також каталізує фосфорилування, яке вимагається для активації деяких антилейкозних нуклеозидних аналогів, таких, як флударабін, гемцитабін або кладрибін. Антагоністичний ефект, який спостерігався між фородезином та флударабіном, може пояснюватися зниженням рівня dGTP, що спостерігається після комбінування флударабіну з фородезином. Ці результати свідчать, що фосфорилування dCK та наступне підвищення dGTP відіграють важливу роль як перші етапи викликання апоптозу фородезином у клітинах CLL. Було запропоновано кілька механізмів опосередкованого dGTP відмирання клітин. Наприклад, накопичені дезоксинуклеозиди можуть фосфорилуватися у мітохондріях дезоксигуанозинкіназою та тимідинкіназою, що призводить до ненормального накопичення dNTP, які можуть втручатися у синтез та відновлення мітохондріальної ДНК, підвищуючи чутливість до мітохондріального пошкодження, активацію та апоптоз p53. Дисбаланс у мітохондріальному dGTP також може впливати на синтез та/або інактивацію мітохондріального ATP протиокиснювальних ферментів мітохондріального ланцюга перенесення електронів, що веде до вироблення ROS. Мітохондріальний геном є високочутливим до пошкодження через окиснювальний стрес, що може швидко викликати апоптоз. Як описано авторами, фородезин активує мітохондріальний апоптичний шлях через вироблення ROS та втрату ΔΨm, що призводить до залежного та незалежного від каспази апоптозу. ROS виробляються через мітохондріальне перенесення електронів і при сильному окиснювальному стресі підвищення рівня O2 , OH або H2O2 провокує втрату ΔΨm та відмирання клітин. Ці явища, викликані фородезином, усувалися шляхом попередньої інкубації клітин CLL з Tiron та NAC, специфічними акцепторами O2 , що підтверджує роль окиснювального стресу, що передує активації мітохондріального апоптичного шляху. Фосфорилування та активація p53 викликається реакцією на пошкодження ДНК, а також деякими стресовими сигналами. Надмірне вироблення супероксиду та наступне викликання пошкодження ДНК можуть викликати апоптоз шляхом активації опосередкованого ROS мітохондріального шляху та активації p53. У цьому сенсі вироблення ROS, викликане фородезином, може діяти як попередній регулятор активації p53. Авторами описуються результати, які демонструють стабілізацію p53 у випадках CLL з p53 дикого типу, а також те, що фородезин активує мітохондріальний апоптичний шлях у випадках зі змінами p53, вказуючи на те, що фородезин діє через інший і/або додатковий механізм, незалежний від p53. Окиснювальний стрес та вироблення ROS також призводить до активації фактора транскрипції E2F-1, який регулює як залежний, так і незалежний від p53 апоптоз через інші шляхи. E2F-1 підвищує фосфорилування p53 у залишках, які також фосфорилуються у відповідь на пошкодження ДНК, але також може викликати відмирання клітин шляхом активації гомолога p53 p73 через p53-незалежний апоптичний шлях. Яким чином вироблення ROS може регулювати активацію E2F-1, p53 та/або p73 і відмирання клітин, і досі залишається малозрозумілим. Ранньою подією мітохондріального апоптичного шляху є утворення апоптосоми та активація каспази-9, яка розщеплює й активує каспазу-3, а також каспазу-8. Фородезин викликав пов’язану з часом активацію каспази-9 та -3, а також прокаспази-8 одночасно з активацією каспази-9. У свою чергу каспаза-8 викликає розщеплення білка BID до його проапоптичної зрізаної форми, яка активує мітохондріальний апоптичний шлях. Вибіркове інгібування каспази8 зменшує втрату ΔΨm, викликану фородезином, але вплив на відмирання клітин згодом уповільнюється, що вказує на те, що каспаза-8/BID веде до петлі посилення мітохондріального апоптичного шляху. Сама по собі активація каспази-9 може бути недостатньою для викликання апоптозу, тому активація каспази-8/BID разом зі зниженням інгібіторів апоптозу XIAP та 4 UA 104579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сурвівіну підвищує активність каспази-9 та –3 і, таким чином, посилює апоптоз, викликаний фородезином. Група білків BCL-2 контролює схильність до апоптичного відмирання клітин. Баланс між сприяючими виживанню, такими, як BCL-2 та MCL-1, і проапоптичними представниками BCL-2 (BAX, BAK та лише BH3-білки BIM, PUMA, NOXA, BAD, BID, BMF, BIK та HRK) контролює результати багатьох сигнальних шляхів смерті. У пацієнтів з CLL високий рівень BCL-2 та MCL-1 корелюється з прогресуванням хвороби, поганою виживаністю та неможливістю досягнення повної реакції на терапію з застосуванням алкілуючих агентів, нуклеозидних аналогів та ритуксимабу. Фородезин викликає накопичення білка BIM та зниження рівня MCL-1 без змін рівня BCL-2. У клітинах CLL BIM є пов’язаним з MCL-1, тому зниження рівня MCL-1 робить клітини CLL сприйнятливими до цього лише BH3-білка. BIM, а також зрізаний Bid, мають подвійну функцію і як інгібітори антиапоптичних представників BCL-2 і прямих активаторів проапоптичних BAX та BAK. У цьому сенсі підвищення рівня BIM, разом з активацією Bid, веде до активації BAX та BAK і разом зі зниженням MCL-1 долається решта антиапоптичної здатності BCL-2. Представлені авторами результати показують, що ступінь зниження MCL-1 разом з підвищенням BIM, що забезпечується фородезином, значною мірою корелюється з викликанням апоптозу, і базовий рівень MCL-1 та BIM може визначати чутливість клітин CLL до фородезину. Було продемонстровано активацію мітохондріального апоптичного шляху, незалежного від стану p53. Повідомлялося, що індукція p73, транскрипційної мішені p53, здатна долати резистентність до апоптозу клітин CLL без функціонального p53. У відповідь на кілька хіміотерапевтичних медикаментів проапоптична форма p73, TAp73, трансактивує кілька генівмішеней p53, які контролюють блокування клітинного циклу та апоптоз у спосіб, залежний, а також незалежний від стану p53. Було виявлено, що фородезин індукує p53, а також TAp73 у клітинах CLL з функціональним p53, але цікавим є те, що рівень мРНК p73 та білка також підвищується у клітинах CLL з делецією p53. Окиснювальний стрес та вироблення ROS веде до активації TAp73, а також E2F1, обидва з яких є білками, задіяними в активації мітохондріального апоптичного шляху через p53-залежні та незалежні механізми. Таким чином, підвищення ROS, викликане фородезином, може забезпечувати сигнал, який активує E2F-1 і/або підвищує TAp73. Група FOXO факторів транскрипції регулює експресію багатьох генів, задіяних в апоптозі, і може бути активована через збільшення окиснювального стресу. FOXO1 та FOXO3a є транскрипційними мішенями E2F-1 і виявилися суттєвими для викликаного ROS апоптозу, а також є факторами транскрипції експресії BIM у кровотворних клітинах. Крім того, після кількох апоптичних подразників, Акцептори ROS блокують індукцію FOXO3a та BIM. Було описано, що експресія FOXO1a та BIM і наступний апоптоз регулюються p73 у пухлинних клітинах без p53. Після лікування Фородезином було продемонстровано мічену білком та мРНК підвищувальну регуляцію p73 та BIM незалежно від стану p53, а також підвищення рівня FOXO1 та FOXO3a, яке було виявлено ще раніше. Експресія регульованих FOXO генів-мішеней може контролюватися будь-яким з представників FOXO, що свідчить про надлишковий механізм дії, як показує транскрипційна регуляція BIM під впливом як FOXO1A, так і FOXO3A. Таким чином, описані авторами результати свідчать про механізм, задіяний у викликаному фородезином відмиранні клітин у клітинах CLL незалежно від стану p53, виявляючи, що різні запрограмовані шляхи відмирання клітин можуть співіснувати в одній клітині і можуть вибірково викликатися різними подразниками. Ці результати свідчать, що фородезин як окремий агент або у комбінації з бендамустином або ритуксимабом є високоефективним для лікування CLL. Таким чином, фородезин, доступний у формі композиції, наприклад, для перорального та внутрішньовенного введення з низькими профілями токсичності, є оптимальним засобом лікування для пацієнтів з невтішними прогнозами (наприклад, 17p-), пацієнтів зі стійкою хворобою, та/або як оптимальний засіб лікування для літніх пацієнтів. Було розпочато багатоцентрове відкрите клінічне випробування І фази для фородезину у пацієнтів з рецидивним CLL. A. Способи лікування раку кровотворної системи Авторами пропонуються способи лікування у суб’єкта раку кровотворної системи, наприклад, раку крові. Прикладами цих типів раку є, наприклад, гострий мієлоїдний лейкоз, хронічний мієлоїдний лейкоз, гострий лімфобластний лейкоз (ALL), хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL), мієлопроліферативні хвороби, множинна мієлома та мієлодиспластичний синдром, лімфома Ходжкіна, неходжкінська лімфома (злоякісна лімфома) та Макроглобулінемія Вальденстрема. У деяких варіантах втілення раком кровотворної системи є CLL. В інших варіантах втілення раком кровотворної системи є ALL. Суб’єктами можуть бути як ссавці, так і відмінні від ссавців тварини. До ссавців належать, наприклад, людина; інші примати, наприклад, людиноподібні та інші мавпи; велика рогата 5 UA 104579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 худоба; коні; вівці; щури; миші; свині та кози. До відмінних від ссавців тварин належать, наприклад, типи та птахи. В одному варіанті втілення спосіб включає введення суб’єктові інгібітора пуриннуклеозидфосфорилази (PNP) та алкілуючого агента або агента проти CD20. У деяких варіантах втілення вводять інгібітор PNP та алкілуючий агент. В іншому варіанті втілення вводять інгібітор PNP та агент проти CD20. У ще одному варіанті втілення інгібітор PNP вводять після виявлення суб’єкта з резистентністю до одного або кількох хіміотерапевтичних засобів (наприклад, Бендамустину або Флударабіну). В іншому варіанті втілення інгібітор PNP вводять після виявлення у суб’єкта делеції p53. Без прив’язування до конкретної теорії, інгібітор PNP може викликати підвищення 2'дезоксигуанозин (dGuo) у плазмі та накопичення внутрішньоклітинного дезоксигуанозин трифосфату (dGTP), що викликає відмирання клітин. Необмежувальними прикладами інгібіторів PNP можуть бути ті, що описуються у патентах США №№ 4,985,433; 4,985,434, 5,008,265; 5,008,270; 5,565,463 та 5,721,240, виданих BioCryst Pharmaceuticals, Inc., зміст яких включено до цього опису шляхом посилання. У деяких варіантах втілення інгібітором PNP є Фородезин або його сіль, включаючи сіль з HCl: Без прив’язування до конкретної теорії, алкілуючий агент означає хіміотерапевтичну сполуку, яка хімічно модифікує ДНК і порушує його функцію. Деякі алкілуючі агенти викликають утворення перехресних зв’язків між нуклеотидами на одному ланцюгу або на комплементарному ланцюгу молекули дволанцюгової ДНК, а інші викликають невідповідність пар основ між ланцюгами ДНК. Алкілуючим агентом може бути похідна гірчиці, похідна нітрозосечовини, платинова сполука або імідазол-карбоксамідна сполука. Прикладами алкілуючих агентів є Бендамустин, Бусульфан, Карбоплатин, Кармустин, Цисплатин, Хлорамбуцил, Циклофосфамід, Дакарбазин, Гексаметилмеламін, Іфосфамід, Ломустин, Хлорметин, Мелфалан, Мітотан, Мітоміцин, Піпоброман, Прокарбазин, Стрептозоцин, Тіотепа та Триетиленмеламін. У деяких випадках алкілуючим агентом може бути Бендамустин або його сіль, включаючи сіль з HCl: Агентом проти CD20 може бути будь-який агент, який є спрямованим (наприклад, вибірково зв’язується) на білок клітинної поверхні B-клітин CD20. У деяких варіантах втілення агентом проти CD20 є антитіло, специфічне до CD20. Без прив’язування до конкретної теорії вважається, що ці агенти можуть діяти через один з трьох механізмів: (1) комплементзалежну цитотоксичність; (2) антитілозалежну клітинно-опосередковану цитотоксичність; та (3) викликання апоптозу. Прикладами агентів проти CD20 є Ритуксимаб, Ірбітумомаб, Трастузумаб, Гемтузумаб та Алемтузумаб. У деяких варіантах втілення агентом проти CD20 є Ритуксимаб. Інгібітор PNP, алкілуючий агент, та/або агент проти CD20 можуть вводитися будь-яким шляхом, наприклад, інтраопераційним, інтратекальним, інтрадискальним, перидискальним, епідуральним (включаючи перирадикулярний та трансфорамінальний), за допомогою будь-якої комбінації інтрадискального, епідурального та перидурального, периспінального, внутрішньовенного, внутрішньом’язового, підшкірного, перорального, інтраназального, інгаляційного, крізьшкірного та парентерального шляхів. Інгібітор PNP, алкілуючий агент та/або агент проти CD20 можуть бути рецептовані з фармацевтично прийнятним носієм, вибраним залежно від вибраного шляху введення та стандартної фармацевтичної практики. Інгібітор PNP, алкілуючий агент та/або агент проти CD20 можуть бути рецептовані у дозовані форми згідно зі стандартною практикою у галузі 6 UA 104579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приготування фармацевтичних композицій. Див. Alphonso Gennaro, ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA. Прийнятними дозованими формами можуть бути, наприклад, таблетки, капсули, розчини, парентеральні розчини, пастилки, супозиторії або суспензії. Для парентерального введення, інгібітор PNP, алкілуючий агент та/або агент проти CD20 можуть бути змішані з прийнятним носієм або розріджувачем, таким, як вода, олія (зокрема, рослинна олія), етанол, сольовий розчин, водна декстроза (глюкоза) та подібні цукрові розчини, гліцерин або гліколь, такий, як пропіленгліколь або поліетиленгліколь. Розчини для парентерального введення в оптимальному варіанті містять водорозчинну сіль інгібітора PNP, алкілуючий агент та/або агент проти CD20. Також можуть додаватися стабілізатори, антиоксиданти та консерванти. Прийнятними антиоксидантами є сульфіт, аскорбінова кислота, лимонна кислота та її солі та натрієва сіль EDTA. Прийнятними консервантами є бензалконій хлорид, метил- або пропілпарабен та хлорбутанол. Композиція для парентерального введення може набувати форми водного або неводного розчину, дисперсії, суспензії або емульсії. Для перорального введення інгібітор PNP, алкілуючий агент та/або агент проти CD20 може комбінуватися з одним або кількома твердими неактивними інгредієнтами для виготовлення таблеток, капсул, пігулок, порошків, гранул або інших прийнятних дозованих форм для перорального введення. Наприклад, інгібітор PNP, алкілуючий агент та/або агент проти CD20 можуть комбінуватися з принаймні одним формоутворювачем, таким, як наповнювачі, зв’язувальні речовини, гігроскопічні речовини, дезінтегратори, уповільнювачі розчинення, прискорювачі абсорбції, зволожувачі, абсорбенти або мастила. Конкретна доза інгібітора PNP, алкілуючого агента та/або агента проти CD20, звичайно, визначається конкретними обставинами для індивідуального пацієнта, включаючи розмір, масу, вік та стать пацієнта, характер та стадію захворювання, що підлягає лікуванню, та агресивність хвороби, а також шляхом введення сполуки. Дози та режим введення сполук, наприклад, фородезину, бендамустину та ритуксимабу, передбачають введення окремо або у комбінації, наприклад, згідно з дозами та режимом, вказаними у затверджених Управлінням з санітарного нагляду за якістю харчових продуктів і медикаментів США (FDA) інструкціях із застосування. У деяких варіантах втілення інгібітор PNP та алкілуючий агент або агент проти CD20 вводять одночасно, а в інших варіантах втілення інгібітор PNP та алкілуючий агент або агент проти CD20 вводять послідовно. В одному варіанті втілення алкілуючий агент або агент проти CD20 вводять один або кілька разів перед введенням інгібітора PNP (наприклад, двічі, тричі, чотири рази, п’ять разів, 10 разів або 20 разів). В іншому варіанті втілення інгібітор PNP може вводитись один або кілька разів перед введенням алкілуючого агента або агента проти CD20 (наприклад, двічі, тричі, чотири рази, п’ять разів, 10 разів або 20 разів). У деяких варіантах втілення лікування раку кровотворної системи у суб’єкта може включати визначення суб’єкта з резистентністю до одного або кількох хіміотерапевтичних засобів. Однією з головних причин невдалого лікування раку є розвиток резистентності ракових клітин до ліків. Це є дуже серйозною проблемою, що може призводити до рецидивів хвороби або навіть смерті. В одному варіанті втілення суб’єкт з резистентністю до одного або кількох хіміотерапевтичних засобів може бути визначений з застосуванням відомих спеціалістам способів. Суб’єкт може бути резистентним до будь-яких відомих хіміотерапевтичних засобів. У деяких варіантах втілення суб’єкт може бути резистентним до алкілуючого агента (наприклад, Бендамустину) та/або аналога пурин-нуклеозиду (наприклад, Флударабіну). Після визначення резистентного до хіміотерапії суб’єкта цьому суб’єктові вводять інгібітор PNP. У деяких варіантах втілення інгібітором PNP є Фородезин HCl. В іншому варіанті втілення лікування раку кровотворної системи у суб’єкта може включати виявлення наявності делеції p53, наприклад, делеції 17p, в одній або кількох ракових клітинах у зразку, взятому з організму суб’єкта. Делеція 17p є ознакою, що допомагає розпізнати суб’єкта з раком кровотворної системи, який може демонструвати іншу біологічну та клінічну поведінку. Наприклад, зміни p53 можуть призводити до резистентності до ліків та скорочення періоду виживання. В одному варіанті втілення суб’єктові з делецією p53 вводять інгібітор PNP. У деяких варіантах втілення інгібітором PNP є Фородезин HCl. Способи лікування, які обговорювалися вище, включають як монотерапію, так і комбіновану терапію. У контексті комбінованої терапії винахід передбачає введення двох або більшої кількості хіміотерапевтичних засобів, зокрема, інгібітора PNP та алкілуючого агента або інгібітора PNP та агента проти CD20. Деякі з цих сполук вже було затверджено для застосування у лікуванні одного або кількох ракових показань. Інші перебувають на різних стадіях доклінічних та клінічних досліджень. 7 UA 104579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах втілення введення інгібітор PNP та алкілуючий агент або агент проти CD20 можуть створювати синергетичний ефект. Цей ефект може бути продемонстрований через розвиток комбінаційного індексу (CI). У деяких варіантах втілення цей індекс розраховують залежно від частки уражених клітин згідно з процедурою Chou et al., Advance Enz. Regul., 22, 27-55 (1985). Цей тест є загальновідомим і передбачає оцінку коефіцієнтної взаємодії для різних пропорцій відмирання клітин. Наприклад, якщо результатом лікування медикаментом A є 30% відмирання клітин, а результатом лікування медикаментом B – 50% відмирання клітин, то мало б очікуватися що комбінація двох медикаментів в результаті забезпечуватиме 65% відмирання клітин. Відповідно, якщо співвідношення прогнозованого відмирання клітин з фактично виміряним після застосування комбінації медикаментів є меншим за одиницю, це означає, що спостерігається синергетичний ефект. Якщо ж це співвідношення є більшим за одиницю, це означає, що спостерігається антагоністичний. В одному варіанті втілення комбінація Фородезину та Бендамустину демонструє синергетичний ефект, а комбінація Фородезину та Флударабіну демонструє антагоністичний ефект (див. Приклад 5). B. Фармацевтичні композиції Авторами пропонуються фармацевтичні композиції, які включають інгібітор PNP та алкілуючий агент або інгібітор PNP та агент проти CD20. У деяких варіантах втілення інгібітор PNP може включати Фородезин (BCX-1777). У деяких варіантах втілення алкілуючий агент може включати Бендамустин. В інших варіантах втілення агентом проти CD20 є Ритуксимаб. Фармацевтичні композиції, які забезпечуються даним винаходом, містять інгібітор PNP та алкілуючий агент або інгібітор PNP та агент проти CD20 у кількості, яка є корисною для лікування різних видів раку кровотворної системи, та фармацевтично прийнятний носій. До фармацевтичних носіїв, прийнятних для введення сполук, які забезпечуються даним винаходом, належать будь-які носії, відомі спеціалістам у даній галузі як прийнятні для конкретного режиму введення. Композиції в одному варіанті втілення можуть бути рецептовані у прийнятні фармацевтичні композиції, такі, як розчини, суспензії, таблетки, дисперговані таблетки, пігулки, капсули, порошки, композиції уповільненого вивільнення або еліксири для перорального введення, або стерильні розчини або суспензії для парентерального введення, а також у формі крізьшкірних пластирів та сухих порошкових інгаляторів (див., наприклад, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition 1985, 126). Концентрація інгібітора PNP та алкілуючого агента або інгібітора PNP та агента проти CD20 у фармацевтичній композиції залежить від швидкості абсорбції, інактивації та екскреції сполук, фізико-хімічних характеристик сполук, схеми застосування та кількості, яка має вводитись, а також інших чинників, відомих спеціалістам у даній галузі. Наприклад, доставлена кількість є достатньою для лікування хронічного лімфоцитарного лейкозу, як описано авторами. Фармацевтична композиція може вводитися за один раз або може бути розділена на кілька менших доз, які призначаються для введення з певними інтервалами часу. Слід розуміти, що точна доза та тривалість лікування залежать від хвороби, яка підлягає лікуванню, і може визначатися емпірично з застосуванням відомих протоколів випробування або шляхом екстраполяції даних in vivo або in vitro випробувань. Слід зазначити, що значення концентрації та дози також можуть змінюватися залежно від тяжкості стану, який підлягає лікуванню. Також слід розуміти, що для будь-якого конкретного суб’єкта конкретні режими дозування з часом мають регулюватися згідно з індивідуальною потребою та професійною точкою зору особи, яка вводить або спостерігає за введенням композицій, і що вказані авторами межі концентрації подаються лише для прикладу і не є обмежувальними для обсягу або практичного втілення заявлених композицій. Фармацевтичні композиції передбачаються для введення людині та тваринам у дозованих лікарських формах, таких, як таблетки, капсули, пігулки, порошки, гранули, стерильні парентеральні розчини або суспензії, а також пероральні розчини або суспензії та емульсії “олія у воді”, які містять відповідну кількість сполук або їх фармацевтично прийнятних похідних. Терапевтично активні фармацевтичні сполуки та їх похідні в одному варіанті втілення рецептують і вводять у дозованих лікарських формах або багаторазових дозованих формах. У контексті даного опису дозовані лікарські форми означають фізично окремі одиниці, придатні для введення людині та тваринам, і окремо упаковані у спосіб, відомий спеціалістам у даній галузі. Кожна одинична доза містить задану кількість терапевтично активної сполуки, достатню для створення потрібного терапевтичного ефекту, разом з необхідним фармацевтичним носієм, наповнювачем або розріджувачем. Прикладами дозованих лікарських форм є ампули та шприці, а також окремо упаковані таблетки або капсули. Дозовані лікарські форми можуть вводитися частками або кратними дозами. Багаторазова дозована форма являє собою кілька ідентичних 8 UA 104579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дозованих лікарських форм, упакованих в одне вмістище, для введення окремими дозованими лікарськими формами. Прикладами багаторазових дозованих форм є флакони, пляшки з таблетками або капсулами або пляшки об’ємом у пінту або галон. Таким чином, багаторазова дозована форма являє собою певну кількість одиничних доз, які не є відокремленими в упаковці. Придатні для введення рідкі фармацевтичні композиції приготовляють, наприклад, шляхом розчинення, диспергування або змішування в інший спосіб активної сполуки, як визначено вище, та необов’язкових фармацевтичних ад’ювантів у носії, такому, як, наприклад, вода, сольовий розчин, водна декстроза, гліцерин, гліколі, етанол і т. ін., для утворення розчину або суспензії. У разі потреби призначена для введення фармацевтична композиція також може включати малу кількість нетоксичних допоміжних речовин, таких, як зволожувачі, емульгатори, солюбілізатори, pH буферні агенти і т. ін., наприклад, ацетат, цитрат натрію, похідні циклодекстрину, сорбітанмонолаурат, триетаноламін, ацетат натрію, олеат триетаноламіну та інші подібні агенти. Конкретні способи приготування дозованих форм є відомими або стануть зрозумілими спеціалістам у даній галузі; див., наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Edition, 1975. Можуть бути виготовлені дозовані форми або композиції, які містять інгібітор PNP та алкілуючий агент або інгібітор PNP та агент проти CD20 у межах від 0,005% до 100% та решту, яку складає нетоксичний носій. Способи виготовлення цих композицій є відомими спеціалістам у даній галузі. Передбачені композиції можуть містити 0,001%-100% активного інгредієнта, в одному варіанті втілення - 0,1-95%, в іншому варіанті втілення - 75-85%. C. Комплекти Авторами також пропонується комплекти. Зазвичай комплект включає інгібітор PNP та алкілуючий агент або інгібітор PNP та агент проти CD20. У деяких варіантах втілення комплект може включати одну або кілька систем доставлення, наприклад, для інгібітора PNP, алкілуючого агента, агента проти CD20 або будь-якої їх комбінації, а також інструкції з користування комплектом (наприклад, інструкції з лікування суб’єкта). У деяких варіантах втілення комплект може включати інгібітор PNP та/або алкілуючий агент. В іншому варіанті втілення комплект може включати інгібітор PNP та/або агент проти CD20. У деяких варіантах втілення комплект може включати інгібітор PNP та ярлик, на якому вказується, що вміст призначається для введення суб’єктові з резистентністю до алкілуючих агентів, таких, як Бендамустин. В іншому варіанті втілення комплект може включати інгібітор PNP та ярлик, на якому вказується, що вміст призначається для введення суб’єктові з делецією p53 (наприклад, делецією 17p). В іншому варіанті втілення комплект може включати інгібітор PNP та ярлик, на якому вказується, що вміст призначається для введення з алкілуючим агентом або агентом проти CD20. D. Визначення У контексті даного опису форми однини також передбачають посилання на форми множини, якщо прямо не вказується іншого. Вираз "ефективна кількість", вжитий для опису кількості сполуку згідно зі способом, означає кількість сполуки, яка дозволяє досягати потрібного фармакологічного ефекту або іншого ефекту, наприклад, кількість, яка інгібує ненормальний ріст або проліферацію, або викликає апоптоз ракових клітин, що в результаті забезпечує корисний ефект. Термін "лікування" означає викликання терапевтично сприятливого ефекту, такого, як послаблення існуючих симптомів, запобігання додатковим симптомам, послаблення або уникнення метаболічних причин, які лежать в основі симптомів, затримка або запобігання подальшому розвиткові порушення та/або зменшення тяжкості симптомів, які мають або можуть розвинутися. Приклади high low Приклад 1: Цитотоксичність Фородезину у CLL - ZAP-70 порівняно з ZAP-70 Клітини з 16 пацієнтів з CLL з високим рівнем ZAP-70 (>20%) і з 13 пацієнти з CLL з низьким рівнем ZAP-70 (85% клітин, аналіз FISH) обробляли при 2 мкMфородезину + 20 мкM dGuo, 25 мкM Бендамустину або 1 мкг/мл Флударабіну протягом 48 годин. Результати показали, що у випадках CLL з делецією p53 спостерігалася висока реакція на Фородезин (див. ФІГ. 3). Приклад 4: Вплив Фородезину у випадках CLL з хіміотерапевтичною резистентністю Клітини з пацієнтів з CLL, у яких було виявлено низьку чутливість або відсутність чутливості до Бендамустину або Флударабіну, обробляли при 2 мкM фородезину та 10-20 мкM dGuo. Результати показали, ці клітини демонструють добру реакцію на обробку Фородезином (див. ФІГ. 4). Приклад 5: Вплив комбінацій Фородезину/Бендамустину та Фородезину/Флударабіну Клітини з пацієнтів з CLL обробляли при 2 мкM фородезину + 10-20 мкM dGuo і 10-25 мкM Бендамустину або 3,75-7,5 мкM Флударабіну протягом 48 годин. Комбінаційний індекс (CI) аналізували після 48 годин. Значення CI, нижче за 1, свідчить про синергетичний ефект (алгоритм Chour & Talalay), а значення CI, більше за 1, свідчить про антагоністичний ефект. Результати показали, що Фородезин/Бендамустин мають синергетичний ефект, а Фородезин/Флударабін мають антагоністичний ефект (див. ФІГ. 5A та 5B). Приклад 6: Вплив комбінації Фородезину/Ритуксимабу Клітини з 7 пацієнтів з CLL (3 з високим рівнем ZAP-70 (>35%) і 4 з делецією p53s) обробляли 2 мкM Фородезину HCl + 10-20 мкM dGuo та 25-50 мкM Ритуксимабу протягом 24-48 годин. Комбінаційний індекс (CI) аналізували після 48 годин. Клітини піддавали аналізові шляхом проточної цитометрії з застосуванням аналізів з забарвленням Annexin V-FITC та PIпроникності. Значення CI, менше за 1, свідчить про синергетичний ефект (алгоритм Chour & Talalay), а значення CI, більше за 1, свідчить про антагоністичний ефект. Результати показали, що комбінація Фородезину/Ритуксимабу має синергетичний ефект (див. ФІГ. 6). Приклад 7: Фородезин викликає p53-незалежний мітохондріальний апоптоз Як описано авторами, інгібітор пурин-нуклеозидфосфорилази фородезин викликає p53незалежний мітохондріальний апоптоз у клітинах хронічного лімфоцитарного лейкозу через знижувальну регуляцію Mcl-1 та індукцію p73 та Bim. Хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL) є клінічною гетерогенною формою, яка виникає + через моноклональне розширення довговічних CD5 IB-лімфоцитів з ненормальною регуляцією апоптозу та низькими показниками проліферації. Незважаючи на прогрес, досягнутий останнім часом, нові засоби терапії при лікуванні CLL не поліпшили загальну виживаність пацієнтів, і зрештою у багатьох пацієнтів розвинулася резистентність до ліків. Немутований профіль генів імуноглобулінів, висока експресія білка ZAP-70, висока експресія CD38 та наявність певних цитогенетичних відхилень (зокрема, делецій 17p13 (TP53) та 1 Iq22-q23 (ATM)) є пов’язаними з погіршенням загальної виживаності та скороченням часу до прогресування хвороби у пацієнтів з CLL. Хіміотерапевтичні протиракові медикаменти викликають апоптоз, як правило, або через реакцію на пошкодження ДНК та активацію p53 і/або безпосередньо через порушення мітохондріальної функції. Очевидно, шлях реакції на пошкодження ДНК відіграє ключову роль у викликаному медикаментом апоптозі CLL, оскільки клітини з пацієнтів з CLL з відхиленнями TP53 виявляють резистентність до традиційної хіміотерапії та короткий період виживання. Брак функції p53 через делецію p53 та мутація алеля, що залишився, збільшує резистентність пацієнта з CLL до хіміотерапії, створюючи "подвійний удар" під час набуття резистентності до ліків, що усуває транскрипційну та мітохондріальну апоптичну активність p53. Таким чином, нові ефективні способи мають викликати апоптоз через незалежні від пошкодження ДНК шляхи та/або пряму активацію апоптичних шляхів незалежно від p53. Ознакою клітин CLL є їхня стійкість до викликання апоптозу через білки групи Bcl-2, які є ключовими регуляторами апоптозу та виживання у клітинах CLL. Високий рівень антиапоптичних білків Bcl-2 та Mcl-1 є пов’язаним з агресивною хворобою та резистентністю до хіміотерапії у CLL. MCL-1 також відіграє важливу роль у подовженні періоду виживання клітин CLL, оскільки рівень MCL-1 обернено корелюється з in vitro та клінічною реакцією на різні медикаменти. Пурин-нуклеозидфосфорилаза (PNP) є ферментом у шляху реутилізації пурину, який фосфорилує аналоги пурину до їх відповідних основ та дезоксирибоза-фосфату. Фородезин або імуцилін H (BCX-1777) є ефективним перехідним аналогом інгібітора PNP, який 10 UA 104579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 продемонстрував інгібування проліферації T-клітин in vitro та in vivo; див. Bantia et al., Int Immunopharmacol, 1(6), 1199-210 (2001); Kicska et al.,. PNAS, 98(8), 4593-4598 (2001); Bantia et al, Int Immunopharmacol, 3(6), 879-887 (2003); та Gandhi et al, Semin Oncol, 34(6 Suppl 5), S8-12 (2007)). Фородезин продемонстрував низький профіль токсичності (Gandhi et al, Blood, 106(13), 4253-4260 (2005); та Korycka et al, Mini Rev Med Chem, 7(9), 976-983 (2007)) і досліджується у клінічних випробуваннях пацієнтів з T-клітинним пролімфоцитарним лейкозом, шкірною Tклітинною лімфомою та B-клітинним гострим лімфобластним лейкозом (Galmarini et al, IDrugs, 9(10), 712-722 (2006)). Крім того, фородезин створює ex vivo цитотоксичний ефект у клітинах CLL (Balakrishnan et al, Blood, 108(7), 2392-2398 (2006)). Інгібування PNP в результаті веде до підвищення у плазмі рівня 2'дезоксигуанозину (dGuo) з наступним внутрішньоклітинним накопиченням дезоксигуанозин трифосфату (dGTP) у клітинах з високим рівнем активності дезоксинуклеозидкінази, що призводить до викликання апоптозу у T-лімфоцитах. Клітини CLL мають високу активність (dCK), який є первинним ферментом для перетворення dGuo на dGMP, який потім перетворюється на dGTP, через сприйнятливість клітин CLL до інгібування PNP. На відміну від інших аналогів пурин-нуклеозиду, таких, як флударабін або бендамустин, фородезин не включається до ДНК і являє собою новий клас вибіркових протипухлинних агентів з новим і повністю не з’ясованим механізмом дії. Як описано авторами, оцінювався цитотоксичний вплив Фородезину у первинних лейкозних клітинах 43-х пацієнтів з CLL, а також підвищення in vitro комбінації фородезину з медикаментами, які застосовують у клінічній практиці, такими, як флударабін, бендамустин та ритуксимаб. На основі цих результатів, фородезин виявляється високоефективним терапевтичним засобом у лікуванні пацієнтів з CLL незалежно від їх стану ZAP-70, CD38, p53 або цитогенетичних відхилень. Крім того, було виявлено, що фородезин викликає активацію мітохондріального апоптичного шляху шляхом зниження рівня білка Mcl-1 та індукції p73 та проапоптичного білка Bim. Цікавим є те, що не спостерігалося значних розбіжностей у цих апоптичних маркерах залежно від стану p53, що свідчить про спільний апоптичний шлях, незалежний опосередкованого p53 відмирання клітин. Фородезин викликає апоптоз у первинних клітинах пацієнтів з CLL незалежно від ZAP-70, CD38 та цитогенетичного статусу. Дослідження з підвищенням дози здійснювали для оцінки in vitro цитотоксичності Фородезину у первинних лейкозних лімфоцитах пацієнтів з CLL. Для досягнення in vitro цитотоксичного ефекту додавали зовнішнє джерело dGuo разом з фородезином. Інкубація клітин CLL з фармакологічно досяжним рівнем фородезину (2-5-10 мкM) при підвищенні доз dGuo (10-20 або 30 мкM) протягом 48 годин викликала відмирання клітин (аналіз шляхом забарвлення Annexin-V+), тоді, як фородезин або dGuo окремо не викликали цитотоксичного ефекту. Не спостерігалося розбіжностей у відмиранні клітин при застосуванні вищих доз фородезину (навіть до 15 мкM). Натомість підвищення дози dGuo в результаті збільшувало викликання відмирання клітин, тому наступні дослідження здійснювали з застосуванням одиничної дози фородезину (2 мкM) разом з 10 або 20 мкM dGuo. Крім того, цитотоксичний вплив Фородезину та dGuo піддавали аналізові у первинних лейкемічних клітинах 43 пацієнтів з CLL. Спостерігалася середня цитотоксичність відносно контрольного зразка 44,2%±11,4 і 57,4% ±13,1 через 24 год і 48 год, відповідно. Цитотоксичний ефект був вищим за 60% у 21 випадку (48,8% від загальної кількості), 40-60% у 18 випадках (41,8% від загальної кількості) і нижчим за 40% лише у 4 випадках (9,4% від загальної кількості). Не спостерігалося розбіжностей у відмиранні клітин між застосуванням підданих кріоконсервації первинних зразків CLL (n=32, 58,3% ± 11 через 48 годин) та свіжих зразків CLL (n=10, 56,6% ± 6,4 через 48 годин). Цитотоксичність 2 мкM фородезину та dGuo (10-20 мкM) у PBMC здорових + донорів була відносно низькою порівняно з клітинами CLL, як у T-лімфоцитах (клітини CD3 ), так + і у B-лімфоцитах (клітини CD19 ). У пацієнтів з CLL рівень експресії білків ZAP-70 та/або CD38 є пов’язаним з гіршою загальною виживаністю та коротшим часом до прогресування хвороби (Hus et al., Ann Oncol, 17(4), 683-690 (2006)). Не спостерігалося значних розбіжностей між відмиранням клітин, викликаним фородезином у клітинах CLL з низьким рівнем ZAP-70 (17 пацієнти з CLL; 58,1% ±11 середньої цитотоксичності відносно контролю) та клітинах CLL, які експресують високий рівень ZAP-70 (22 пацієнти з CLL; 57,9 % ± 12 середньої цитотоксичності), а також у рівні експресії CD38 (CD38 низьк. 52,3 % ± 12 порівняно з CD38 висок. 62,1 % ± 12 середньої цитотоксичності). Крім того, найбільш часті цитогенетичні зміни у клітинах CLL, такі, як делеція 13q, делеція 11q та делеція 17p, пов’язані з in vitro та in vivo резистентністю до ліків та коротким терміном виживання пацієнтів з CLL, не корелювалися з викликаною фородезином цитотоксичністю, і в цих випадках також досягалася належна реакція. 11 UA 104579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також порівнювали цитотоксичну реакцію клітин CLL, оброблених фородезином, порівняно з цитотоксичністю при застосуванні флударабіну або бендамустину, двох головних хіміотерапевтичних засобів, які застосовують при CLL (Aivado et al, Semin Oncol, 29, (4 Suppl 13), 19-22 (2002); та Montserrat, Hematol J, 5, Suppl 1, S2-S9 (2004)). Первинні клітини CLL з 32 пацієнтів з CLL, 11 з яких з делецією p53s, інкубували при 2 мкM фородезину та 20 мкM dGuo, 10-25 мкM бендамустину та 1 мкг/мл флударабіну протягом 48 годин, окремо або у комбінації. При застосуванні окремих агентів середня цитотоксичність у CLL без делеції 17p становила 55,3±8, 50,6±11 і 49,2±18 для фородезину, флударабіну та бендамустину, відповідно. Досягнення делеції 17p, що веде до змін p53, є пов’язаним з in vitro та in vivo резистентністю до флударабіну у пацієнтів з CLL (Dohner et al., Blood, 85(6), 1580-1589 (1995); та Turgut et al., Leuk Lymphoma, 48(2), 311-320 (2007)). Показовим є те, що більшість пацієнтів з CLL з делецією 17p не виявляли реакції на фородезин, з середньою цитотоксичністю через 48 годин 60,1%±21 (2 мкM фородезину та 20 мкM dGuo). Натомість у цих випадках було виявлено нижчу реакцію на флударабін (25,1±13 середньої цитотоксичності) та бендамустин (36,2%±17 середньої цитотоксичності). Крім того, у 12 з 32 підданих аналізові зразків, взятих у пацієнтів з CLL, не спостерігали або спостерігали низьку in vitro реакцію (цитотоксичність, нижча за 35% відносно контролю) на 25 мкM бендамустину та/або 1 мкг/мл флударабіну, але у них виявлялася висока реакція на фородезин. У трьох випадках з делецією 17p з низькою або дуже низькою реакцією на бендамустин або флударабін було продемонстровано високу реакцію на фородезин (67%±20 середньої цитотоксичності), і лише два пацієнти з CLL продемонстрували низьку реакцію на фородезин. Комбінації фородезину з флударабіном, бендамустином та ритуксимабом. Досліджували комбінацію флударабіну з фородезином, призначену для лікування. Також досліджували комбінацію фородезину з бендамустином, алкілуючим агентом, а також пуриноподібним аналогом. Комбінації 2 мкM фородезину та dGuo (10-20 мкM) з флударабіном (0,5-1 мкг/мл) не збільшувала цитотоксичний ефект будь-якого медикаменту як окремого агента, і спостерігався негативний вплив на викликання відмирання клітин. Для оцінки комбінованого ефекту між двома медикаментами розраховували комбінаційний індекс або значення CI за допомогою алгоритму Chou and Talalay (Chou et al, Adv Enzyme Regul, 22, 27-55 (1984)) як відмітну ознаку для антагоністичного або синергетичного ефекту для комбінації двох різних медикаментів. Тобто, значення CI, вище за 1, свідчить про антагоністичний ефект, а значення CI, нижче за 1, свідчить про синергетичний ефект. Комбіновані дослідження, які здійснювали з флударабіном та фородезином, продемонстрували значення CI, вищі за 1, в усіх проаналізованих випадках CLL (48 годин), що свідчило про антагоністичний ефект між обома медикаментами. Середня цитотоксичність, яка досягалася при застосуванні комбінації фородезину та флударабіну, була нижчою за ту, що викликалася обома медикаментами. Фородезин також був ефективним у випадках CLL з низькою реакцією на бендамустин, але, на відміну від флударабіну, значне збільшення відмирання клітин спостерігалося при комбінації бендамустину та фородезину, і спостерігався сильний синергетичний ефект (CK1). Фородезин явно посилює цитотоксичну реакцію низької дози бендамустину (10 мкM, середня цитотоксичність 32,95%) з досягненням середнього цитотоксичного ефекту для комбінації двох медикаментів 70,5%. Також досліджували комбінацію Фородезину та Ритуксимабу, олюдненого моноклонального антитіла проти CD20. Через 24 години відмирання клітин, яке спостерігалося при застосуванні ритуксимабу (25-50 мкг/мл) як окремого агента, було низьким, і комбінація з фородезином явно поліпшувала цитотоксичний ефект обох медикаментів. Також було продемонстровано сильний синергетичний ефект між ритуксимабом та фородезином зі значеннями CI, наближеними до 0,5. Кореляція підвищення внутрішньоклітинного рівня dGTP та фосфорилування dCK у Ser-74 з викликаним фородезином відмиранням клітин. Внутрішньоклітинний рівень dGTP у первинних клітинах 26 пацієнтів з CLL, оброблених 2 мкM фородезину та 10 мкM dGuo, піддавали аналізові. Спостерігалася явна пряма кореляція (p