Рекомбінантний білок gm-csf для збільшення продукції гранулоцитів і макрофагів у пацієнтів, вектор і кднк, що його кодують

Настоящее изобретение относится к белку, обладающему способностью стимулировать рост и диффе ренцировку первичных кроветворных прогениторных клеток-предшественников, в частности к гранулоцитарному макрофагальному колониестимулирующему фактору (GM-CSF). Изобретение обеспечивает способ получе ния белка GM-CSF путем технологии рекомбинантной ДНК, векто ры, содержащие ген для экспрессии указанного белка, и белок GMCSF полученный таким образом. Найдено, что многие различные типы клеток крови происхо дят из гематопоэтических стволовы х клеток. Стволовые клетки выполняют две функ ции: (1) они репродуци руют сами себя, в результа те че го поддерживается популя ция стволовых клеток в организме, и (2) они обеспечивают по томство клеток, предназначенных для диффе ренцировки в один из видов зрелых клеток крови. Клетка, которая вступает в диффе ренцировку по конкретному кроветворному пути, называется клеткой-предшественником. Клетки-предшественники для Т-лимфо цитов, В-лим фоцитов, гра нуло цитов, эри троцитов, тромбоцитов и эозинофилов, так же, как и более ранние предшественники, которые могут индивидуально давать начало некоторым типам зрелых клеток, были экспериментально изуче ны как in vivo , так и in vitro (Dexter T.M., 1983, J. Patology 141, 415-433). Было определено in vitro, что пролиферация и/или диффе ренциация предшественника каждого ти па клеток зависит о т определенных "факто ров", которые происхо дят из различных источников. Например, поздние предшественники эритроцитов тре буют факто ра, называемого эритропоэтином. Факто ры, требующие ся для выживания, пролиферации и диффе ренцировки миелоидных предшественников, перехо дящи х в форму зрелых нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и зрелых макрофагов, на зывают факторами стимуля ции колоний (CSF). Активность CSF экстенсивно изучалась на мышах. Большинство органов взрослых мышей продуцирует активность CSF. Однако композиции, содержащие активность CSF, которые были получе ны из различных тканей и различными методами, различаются по своим биохимическим характеристикам. Так, неизвестна структур ная взаимосвязь между различными факторами. Более того, активность CSF действует на более чем одной стадии развития гранулоцита и макрофага, и не известно даже, единственный ли фактор является ответственным за все наблюдаемые активности или же на каждой стадии действуют различные факторы (Burgess А. и Metcalf D. 1980 Blood 56, 947-957). Человеческая активность CSF была получена из плаценты, некоторых тканей плода, макрофагов и стимулированных Т-клеток. Линия Т-клеток (Мо), которая продуцирует одну или несколько мощных активностей CSF, была получена от пациента с Т-клеточным вариантом волосато-клеточного лейкоза (лейкемический ретикулоэндотелиоз) (Golde et al, 1978, Blood, 52, 1068-1072). Способность активности CSF сти мулировать образование грануло цитов и макрофагов указывает на то, что фармацевтические композиции, обладающие активностью CSF, являются клинически полезными в ситуа циях, когда требуется повышенное продуцирование таких типов (миелоидных) клеток. Действительно, показано, что некоторые пациенты с крайне высокими уровнями, по-видимому, нормальных циркулирующи х грануло цитов имеют опухо ли, которые сверхпродуцируют CSF. И только при хирургическом удалении опухо ли количество гранулоцитов быстро возвращается к нормальному уровню, четко подтверждая, что CSF может быть полезным при регули ровании количеств циркулирующих грануло цитов (Hocking, W., Goodman J., и Golde D., Blood, 61, 600 (1983)). В частности, композиции CSF являются клинически полезными для лечения миелосупрессии, вызванной хемотерапевтическим лечением рака или его лечением с помощью облучения. Кроме того, композиции CSF являются полезными при лечении сильных инфекций, потому что CSF может увеличивать и/или активировать пул грануло цитов и/или моноцитов. Имеются разные четко различающиеся типы известных активностей CSF, включая гранулоцитарныйCSF (G-CSF), макрофа-гальный-CSF (M-CSF), гранулоцитарный-макрофагальный-CSF (GM-CSF) и мультиCSF. Настоящее изобретение в частности относится к GM-CSF. Белки CSF известных для различных животных источников. Однако настоящее изобретение, в частности, о тносится к GM-CSF приматов, более конкретно к GM-CSF че ловека и к GM-CSF че ловекообразной обезьяны. Биологическая и биохимическая характеристика композиций, обладающи х активностью GM-CSF, и изучение этих композиций в клинических условиях было затруднено до настоящего времени недостаточным количеством и загрязненностью композиций GM-CSF человека и/или других приматов. Следуе т иметь в виду необходимость идентифици ровать белок или белки, ответственные за активность GM-CSF. Кроме того, желательно иметь приматный, в частности че ловеческий источник такого GM-CSF, который может легко обеспечить потребность в таких белках, причем в таких количествах и та кой чистоты, которые достаточны для биологической и биохимической характеристи ки и для использования их в качестве те рапевтических агентов. Разработанные ранее методики молекулярного клонирования делают возможным клонирование нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок, и получе ние такого белка в достаточном количестве, используя подходящую систему хо зяин-вектор (Т. Маниатис "Мо лекулярное клонирование - Лабораторное руководство", Колд Сп ринг Харбор Лаборатори, Колд Спринг Хар бор, Н.Й. 1982 г.). Затем белок может быть извлечен по известным методикам выделения и очистки. Методы клонирова-ния, используемые до настоящего времени, могут быть сгруппированы в три основные категории: (1) способы, основанные на знании структуры белка, например, его аминокислотной последовательности; (2) способы, основанные на идентификации белка, экспрессированного клонированным геном, с использованием специфического к такому белку анти тела; и (3) способы, основанные на идентификации видов РНК, которые могут быть транслированы для получе ния белка или активности, кодируемых интересующим ге ном. Каждый из этих классов способов становится трудным для применения, когда интересующий бе лок, такой как белок GM-CSF, доступен в очень малом количестве. Следовательно, если трудно получить адек ватное количество очищенного белка, то трудно и определить аминокислотную последовательность или даже частичные последовательности белка. Подобным образом, идентификацию экспрессированного белка связывающим антителом желательно проводить, используя поликлональную антисыворотку с вы соким титром. Такая антисыворотка не может быть получе на при отсутствии достаточных количеств чистого белка (антигена). Альтернативная попытка связана с моноклональным антителом, но требуе мое антитело также может быть получе но с большим трудом при отсутствии подхо дящего анти гена и такое моноклональное анти тело может не взаимодействовать с белком в том виде, в котором он был экспрессирован доступ ной рекомбинантной системой хозяин-вектор. Наконец, трансляция видов РНК для получения идентифицируемого белка или активности требует, чтобы искомая РНК находи лась в источнике РНК в достаточном избытке, чтобы получить достоверный белок или сигнальную активность. Относительный избыток РНК, кодирующей конкретный белок, обычно коррелирует с избытком белка, поэтому редкий белок обычно кодируется редкой РНК. В качестве исходного материала для очистки человеческих GM-CSF, а также и для идентификации соответствующи х матричных РНК использовали моноклеточную линию. Однако и при таком относительно хо рошем источнике активности GM-CSF оказалось очень трудно выделить белок даже для структур ных исследований. Для того что бы решить проблемы, присущие клонированию нуклеотидной последовательности, кодирующей редкий белок, такой, как GM-CSF, с помощью описанных вы ше способов, разработан новый способ. Этот способ требуе т только того, что бы генный продукт или его активность могли быть досто верно измерены. Подхо дящие способы определения GM-CSF описаны в примере 2 ниже. Во втором аспекте разработан способ очистки, который пригоден для выделения и очистки белка GM-CSF как из рекомбинантных, так и природных источников, с уровнем очистки и активности намного более высоким, чем был возможен ранее. В его первом аспекте настоящее изобретение решает проблемы известного уровня техники и обеспечивает источник белка, обладающего активностью GM-CSF, при использовании технологии с рекомбинантной ДНК. В соответствии с настоящим изобретением используется новая методика клонирования, которая нуждается только в определении активности GM-CSF, что бы клонировать кДНК, кодирующую бе лок, обладающий активностью GM-CSF. Итак, настоящее изобретение обеспечивает кДНК, кодирующую бе лок, обладающий активностью GM-CSF (т.е. GM-CSF/кДНК), рекомбинантный вектор, содержащий такую GMCSF/кДНК, и способ получе ния белка GM-CSF, путем экспрессии указанной GM-CSF/кДНК при культивировании микроорганизма или клеточной линии. Поскольку белок GM-CSF продуцируется из клона в соответствии с настоящим изобретением, мы можем быть уверены, что это белок, который обладает активностью GM-CSF. Далее изобретение заключается в способе получе ния и изоляции вектора трансформации, содержащего GM-CSF/кДНК; указанный способ включает: получе ние РНК из клетки, продуци рующей GM-CSF, получе ние полиаденилированной матричной РНК из указанной РНК, получе ние однонитевой кДНК из указанной матричной РНК, превращение однонитевой кДНК в двунитевую кДНК, встраивание двунитевой кДНК в векторы трансформации и трансформирование бактерий указанным вектором для образования колоний, отбор пулов из 200-500 колоний каждый и изоляции плазмидной ДНК из каждого пула, трансфекцию плазмидной ДНК в подхо дящую клетку-хо зяина для экспрессии белка GM-CSF, культивирование трансфи цированных клеток и испытание супернатанта на активность GM-CSF; и отбор GM-CSF-положительных пулов и скринирование колоний, использованных для образования пула, чтобы идентифици ровать колонии, обладающие активностью GM-CSF. Белки GM-CSF настоя щего изобретения - это гор моны роста и ди фференцировки для клеток миелоидной систе мы. Например, указывалось на их клиническое использование при лечении мие-лосуп рессии, особенно (симптоматической) гранулоцито пении после хе мотерапевтического лечения рака или после его ле чения облучением. На фиг. 1 представлены последовательности ДНК, которые кодируют белок GM-CSF в соответствии с настоящим изобретением. Последовательность ДНК, представленная полностью, кодирует один вариант человеческого GM-CSF, упоминаемый как GM-CSF-Thr. Др угой аллель кодирует идентичный продукт с тем исключением, что Thr в положении 100 заменен Ile. (GM-CSF-Ilе). Изменения, показанные выше для человеческой последовательности, представляют собой различия в последовательности ДНК, кодирующей GM-CSF гиббона (GM-CSF обезьяны гиббона) (GM-CSF-G). Также показаны выведенные последовательности аминокислот. На фиг. 2 схе матически представлено получение плазмиды pTPL из плазмиды pAdD26SVpA (3). На фиг. 3 схематически представлено продолжение фиг. 2 и иллюстрируется получе ние плазмиды р91023 из плазмиды pTPL. На фиг. 4 схе матически представлено продолжение фиг. 3 и по казана плазмида р91023 (В). На фиг. 6 схе матически представлен вектор pTALC-185R. На фиг. 7 схе матически представлен вектор AJ-14. Детальное описание способа. Следующие определения приведены для облегчения понимания настоящей заявки. В той мере, в которой определения отличаются от значений, применяемых в уровне техники, нижеследующие определения даны для контроля. Амплификация означает процесс, при котором клетки продуци руют копии генов внутри их хромосомной ДНК. GM-CSF представляет собой биологическую активность, определенную путем анализа, описанного здесь. Белок GM-CSF представляет собой белок приматов, который проявляет активность GM-CSF. Для целей настоящего изобретения термин белок GM-CSF включает модифицированный белок GM-CSF, аллальные вариации белка GM-CSF и белок GM-CSF с предшествующим Met-остатком. Направление "вниз" означает направление к 3'-концу нуклеотидной последовательности. Энхан сер представляет собой нуклеотидную последовательность, которая усиливает транскрипцию гена независимо от положения самого энхансера по отношению к гену или от ориентации его последовательности. Ген представляет собой деоксирибонуклеотидную последовательность , кодирующую дан ный белок. Для целей настоящей заявки ген не должен включать нетранслируе мые боковые области, та кие как сигналы начала транскрипции РНК, сайты полиаденилирования, промоторы и энхан серы. Лигирование представляет собой процесс образования фосфоди/сложно/эфирной связи между 5'- и 3'-концами двух нитей ДНК. Оно может быть осуществлено несколькими хорошо известными ферментативными методами, включая лигирование по тупым концам Т4 лигазой. Ориентация относится к порядку нуклеотидов в последовательности ДНК. Обратная ориентация последовательности ДНК представляет собой последовательность, у которой порядок последовательности от 5' к 3' по отношению к другой последовательности является обратным при сравнении с соответствующим местом в ДНК, из которой последовательность была получена. Такие указанные точки (места) могут включать направление транскрипции других определенных последовательностей ДНК в источнике ДНК или в источнике репликации реплицируемых векторов, содержащи х последовательность. Транскрипция означает синтез РНК на ДНК-матрице. Трансфор мация означает изменение генотипа клеток в результа те поглощения клеткой экзогенной ДНК. Трансфор мация может быть детектирована в некоторых случаях по изменению фенотипа клетки. Трансфор мированные клетки называются трансформанта ми. Претрансформация клеток указывается в отношении родительских клеток. Трансляция означает синтез полипептида на матричной РНК. Активность фактора стимуляции колоний (GM-CSF) может происхо дить из многих клеточных источников, включая кондиционированную среду от периферических моноядерных клеток крови, ткани легких, плаценты, костного мозга, мочи от анемичных пациентов, сыворотки, нормальных и неопласти ческих клеток линии Т-лимфо цитов и моноядерных фа гоцитов. Одной из клеточных линий, которая продуци рует GM-CSF, является Мо-клеточная линия, депонированная и доступная публике из АТСС под кодовым номером СР 8066. GM-CSF, продуци рованный этой клеточной линией, известен как гранулоцитарный-макрофагальныйCSF (или GM-CSF) и, разумеется, как человеческий GM-CSF. Источником GM-CSF гиббона является линия Т-клеток, обозначенная ИСД М А-144, де понированная 29 сентября 1983 г. и доступная для публики из АТСС под кодовым номером НВ 9370. Для того, что бы изолировать клон GM-CSF в соответствии с настоящим изобретением, была использована новая процедура, которая требует только техники определения активности GM-CSF. Сначала идентифицируют клетку, которая продуци рует активность GM-CSF, такую как Т-лимфоцитные клетки (или другие источники, такие, как представлены выше). За тем собирают мРНК клетки. Предпочти тельно используют Т-лимфо цитные клетки. В таком случае отделяют связанную с мембраной мРНК, которая содержит мРНК для лимфо кина, от свободной мРНК в клетках. Это отделение, как полагают, обога щает собранную мРНК в 5-10 раз последовательностями для лимфо кина и таким образом сокращает усилия, вкладываемые в иденти фикацию целевого клона GM-CSF. За тем получают полиаденилированную матричную РНК хроматографией на олиго-dТ-целлюлозе. Готовят банк кДНК из мРНК, используя вектор, подхо дящий для трансфекции в хозяина для экспрессии целевого белка, обладающего активностью GM-CSF. Сначала получают нить кДНК с использованием стандартных методик, применяя получен ную выше мРНК. Затем превращают гибрид РНК/кДНК в двунитевую форму кДНК. Затем кДНК может быть вставлена в подходящий вектор. Предпочти тельная система хозяин-вектор для изоляции клона GM-CSF основана на экспрессии GMCSF кДНК в подходящем векторе трансфор мации. Подходящий вектор трансформации может обеспечить временное введение ДНК в клетки млекопитающи х. (Mellon, P., V.Parker Y.Gluzman, T.Maniatis 1981, Cell, 27, 279-288). Для изоляции целевых трансформантов GM-CSF не требуется, чтобы все клетки популяции стабильно содержали экзогенные гены, которые экспрессируют целевой продукт GM-CSF. Возможно временное вхождение экзогенных ге нов в субпопуляцию клеток, так что субпопуляция будет экспрессировать целевой продукт в те чение нескольких дней. Поскольку вектор трансформации не нуждается в селектируемом маркере, для трансфекции ДНК и системы экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, экзогенная ДНК может быть потеряна при росте клеток в течение 1-2 недель. Однако через 2-3 дня после трансфекции подходящих клеток млекопитающи х, как было обнаружено, целевые продукты могут быть синте зированы и могут быть детектированы. Выбор системы хозяин-вектор основан на развитии клеточных линий CV-1 обезьян, трансформированных молекулой ДНК SV-40, дефектной по ориджину рейлинации SV-40 Gluzman У., Cell, 23, 175-182, 1981). Трансформированные CV-1 клетки обезьян, содержащие дефектную SV 40 ДНК, обозначенные COS (CV-1, ori-дефектный, SV-40), не содержат полной копии генома SV-40, но продуци руют высокие уровни большого Т антигена и разрешают репликацию ДНК SV-40. Они также эффективно поддерживают репли кацию SV-40, содержащих де леции в ранней области, и бактериальных плазмид, которые содержат источник репликации SV-40 (Myers,R.M. and Tjian, R. 1980, PNAS 77, 6491-6495). Следовательно, такая система обеспечивает средство амплификации трансфицированной экзогенной ДНК через SV-40 опосредованную репликацию ДНК, чтобы повысить уровень мРНК и белка, экспрессированного из экзогенной ДНК. Oднако также являются полезными другие подобные системы. Векторы, использованные для экспрессии GM-CSF, обычно содержат различные элементы, та кие как энхансеры, промоторы, интроны, сайты полиаденилирования, 3'- некодирующие области и активато ры трансляции, как будет описано ниже. Здесь векторы могут включать энхансеры. Усилители функционально отличаются от промоторов, но очевидно работают совместно с промоторами. Их функция на клеточном уровне еще недостаточно понятна, но их уникальной характерной чертой является способность активировать или делать возможной транскрипцию независимо от положения или ориентации. Промоторы должны быть расположены вверх от гена, тогда как энхансеры могут находиться вверх, т.е. к 5' от промотора, внутри гена как интрон, или вниз от гена между геном и сайтом полиаденилирования. Обращенные промоторы не являются функциональными, а обращен ные усилители являются. Энхансеры являются цис-активными, т.е. они действуют на промоторы, только если они находятся в одной и той же нити ДНК. Общую дискуссию об усилителях смотри у Khoury et al.. Cell, 33, 313-314 (1983). Предпочти тельные усилители для использования в клетках млекопитающи х получают из ви русов животных, та ких, как SV-40, ви рус полиомы, вирус бычьей папилломы, ретровирус и аденовирус. Идеально, усилитель должен быть из вируса, для которого клетка-хозяин является пермиссивной, т.е. который обычно заражает клетки хозяина. Вирусные усилители могут быть легко получе ны из общедоступ ных ви русов. Усиливающие области для некоторых вирусов, а именно вируса саркомы Рауса и SV-40, хорошо известны. Смотри Luciw et al., Cell 33, 705-716 (1983) . Из традиционной молекулярной биологии известно расположение этих областей на основе опубликованных карт рестрикции для указанных вирусов и в случае необходимости можно модифицировать свиты, чтобы сделать возможным сращива ние усилителя с вектором, как желательно. Например, смотри Кауфман и др., J.Mol. Biol., 159, 601-621 (1982) и Moll. Cell Biol. 2 (11), 13041319 (1982). Альтернативно усили тель может быть синтезирован из данных последовательностей; размеры вирусных усили телей (обычно менее примерно 150 пар оснований) являются достаточно маленькими, чтобы это могло быть осуществлено на практике. Другим элементом, который должен присутствовать в векторе, является сайт полиаденилированного сращивания (или присоединения) с полиаденилатом. Он представляет собой последовательность ДНК, расположенную вниз от транслируемых областей гена и далее вниз от которой останавливается транскрипция и при добавлении адениновых нуклеотидов формируется полиадениновый хвост на 3' конце матричной РНК. Полиаденилирование является важным для стабилизации матричной РНК против разложения в клетке, при котором снижается уровень матричной РНК и, следовательно, уровень белкового продукта. Эукариотные сайты полиаденилирования хорошо известны. У эукариотных генов имеется консенсусная последовательность: гексануклеотид 5'-AAU AAA-3' найден в 11-30 нуклеотидах от точки, в которой начинается полиаденилирование. Последовательности ДНК, содержащие сайты полиаденилирования, могут быть получе ны из вирусов в соответствии с опубликованными сообще ниями. Типичные последовательности полиаденилирования могут быть получе ны из бета-глобина мыши и поздней или ранней областей генов SV-40, но предпочти тельными являются вирусные сайты полиаденилирования. Поскольку эти последовательности являются известными, они могут быть синтезированы in vitro и связаны в вектор традиционным способом. Последовательность, которая отделяет сайт полиаденилирования от трансляционного стоп-кодона, является предпочти тельно нетранслируемой последовательностью ДНК, такой, как непромотированный эукариотический ген. Поскольку та кие последовательности и гены не обеспечены промотором, они не будут экспрессироваться. Последовательность должна простираться на значительное расстояние, порядка примерно 1000 оснований от стоп-кодона до сайта полиаденилирования. Такая 3'-нетранслируе мая последовательность обычно в результате приводит к повышению выхода продукта. Вектор может заканчиваться примерно через 30 пар оснований от основной последовательности полиаденилирования, но предпочтительно сохранить 3'-последовательности, найденные вниз по ходу от сайта полиаденилирования, в окружении их дикого типа. Эти последовательности обычно имеют протяженность примерно на 200-600 пар оснований вниз от сайта полиаденилирования. Наличие интронов в нетранслируемом транскрибируемом участке вектора может увеличить выход продукта. Такие интроны могут быть получе ны из других источников, чем клетки хозяина или источники генов. Например, гибридный интрон, состоящий из 5'-сайта сплайсинга второго интрона трехчастного лидера аденовируса и 3'-сайта сплайсинга гена иммуноглобулина, вставленного вниз от сайта старта транскрипции в основной поздний промотор аденовируса, приводит в результате к увеличению выхода продук та. В предпочтительном варианте вектора клонирования GM-CSF и экспрессии имеется ген активатора трансляции. Активаторы трансляции являются генами, которые кодируют или белок или продукты РНК, которые влияют на трансляцию целевой мРНК. Лучшим примером является аденовирус-ассоциированный (VA) ген (VA1), который считывается в короткие типы РНК, которые взаимодействуют с последовательностями в 5' нетранслируе мой области основных поздних мРНК аденовируса (Thimmappaya et al., 1982, Cell, 3, 543). Необходимые последовательности трансляционной активации с помощью VA РНК ле жат внутри трехчастного лидера поздней мРНК аденовируса. Трехчастный лидер аденовируса собран вместе из несоприкасающихся областей генома аденовируса и находится на 5'-конце основных поздних транскриптов аденовируса. VA РНК может воздействовать на активацию трансляции мРНК, которые содержат последовательность трехчастного лидера. Итак, предпочти тельный вектор клонирования кДНК и экспрессии содержит соединенную форму тре хчастного ли дера и гены VA аденовируса. Эти векторы могут быть синтезированы по методикам, хорошо известным специалистам в данной области. Компоненты векто ров, такие как усилители, промоторы и т.п., могут быть получе ны из природных источников или синтезированы, как описано выше. В основном, если найдено, что компоненты в ДНК доступны в большом количестве, а именно, такие компоненты, как определяющие вирусные функции, или если они могут быть синтезированы, например, сайты полиаденилирования, тогда при соответствующем использовании рестрикционных ферментов могут быть получены большие количества вектора при простом культивировании организма-источника, переваривании его ДНК соответствующей эндонуклеазой, отделении фрагментов ДНК, идентификации ДНК, содержащей интересующий элемент, и его извлечении. Обычно вектор трансфор мации должен быть введен в малом количестве и затем связан в подходящий автономно реплицирующий ся синтетический вектор, та кой как прокариотическая плазмида или фаг. В большинстве случаев может быть использована плазмида рВР322 (смотри Кауфман и др., выше). Синтезированный вектор используют для клонирования ли-гированных векторов трансфор мации обычным образом, а именно путем трансфекции возможного прокариотического организма, репликации синте тического векто ра с большим числом копий и извлечения синтезированного вектора после лизиса клеток и отделения вектора от фрагментов клеток. Векторы, содержащие кДНК, приготовленную из клетки, которая продуцирует GM-CSF активность, затем трансфицируют в Е. coli и помещают на чашки Петри приблизительно 2000 колоний на чашку. Колонии переносят на нитроцеллюлозный фильтр и фильтр переносят на новую пластину, которую хранят как первый оригинал. После выращивания этих колоний делают реплики и сравнивают с оригиналом, тща тельно отмечая, что бы секции фильтров реплик могли быть идентифицированы с соответствующим участком пластины оригинала. Каждый фильтр-реп лику разрезают на секции, содержащие заранее определенное число, предпочти тельно 200-500 колоний на секцию. Ко лонии с каждой секции соскабливают в сре ду, та кую как Lбульон, бакте рии собирают центрифуги рова нием и отделяют плаз миду ДНК. Плаз миду ДНК каждой секции трансфи цируют в подхо дяще го хо зяина для экспрессии белка. Предпочти тельным вектором здесь является мутант плаз миды pBR322 Е.соlі , в ко тором были де лети рованы последова тельности , являющие ся вредными для эукариотных кле ток (смотри Кауфман и др., вы ше). И спользование это го мутанта устраняет необхо димость в делеции оста тка плазмиды перед трансфек цией. После вы ращивания трансфи цирован ных кле ток среды проверяют на активность GM-CSF. По ложительная проба показывает, что ко лония, со держащая GM-CSF/кДНК, на ходи тся на конкретной секции на филь тре. Для определения, какой из клонов на секции исходного первого оригинала фильтра содержит GMCSF/кДНК, каждый клон на секции фильтра пересаживают и выращивают. За тем культуры помещают на матрицу. Пулы получают от каждого горизонтального ряда и вертикальной колонки матрицы. Готовят образцы ДНК из каждого пула культуры и трансфи цируют в клетку-хо зяина для экспрессии. Супернатанты для каждого пула проверяют на активность GM-CSF. Одна вертикальная колонка пула и горизонтальный ряд пула должны продуцировать активность GM-CSF. Клон, общий для эти х пулов, будет содержать GMCSF/кДНК. Если матрица содержит больше одного положительного клона, больше чем одна колонка и ряд должны быть положительными. В таком случае может быть необходимым дальнейший скрининг малого количества клонов. GM-CSF/кДНК, вырезанная из клонов рестрикционными ферментами, может быть просеквенирована обычными методами. Можно легко оценить, что описанная здесь процедура может быть использована для получе ния GM-CSF/кДНК из любого источника. Полная последовательность GM-CSF/кДНК в соответствии с изобретением представлена на фиг. 1 вместе с предсказанной аминокислотной последовательностью транслированного белка GM-CSF. Последовательность ДНК, кодирующая белок, проявляющий активность GM-CSF, в соответствии с настоящим изобретением, такая как представлена на фиг. 1, может быть модифи цирована с помощью традиционных методик для получения вариантов в конечном белке GM-CSF, который еще обладает активностью GM-CSF в описанных здесь ниже пробах. Так, например, одна, две, три, четыре или пять аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами. В бельгийском патенте № 898016, приведенном здесь в качестве уровня техники, описана одна такая типичная методика для замены цистеина, например, серином. В соответствии с настоящим изобретением GM-CSF/кДНК включает природный GM-CSF/кДНК ген, которому предшествуе т ATG кодон, и GM-CSF/кДНК, кодирующую аллельные вариации белка GM-CSF. Один аллель представлен на фиг. 1. Другой аллель, который мы обнаружили, имеет тимидиновый остаток в положении 365 вместо цитозинового остатка, показанного на фиг. 1. Белок GM-CSF настоящего изобретения включает 1-метиониновое производное белка GM-CSF (Met-GM-CSF) и аллельные вариации белка GM-CSF. Зре лый белок GM-CSF, представленный последовательностью на фиг. 1, начинается с последовательности Ala.Pro.Ala.Arg. ..., начало которой обозначено стрелкой после нуклеотида номер 59 на фиг.1. Met-GM-CSF- будет начинаться с последовательности Met.Ala.Pro.Ala.Arg.... Аллельная вариация, представленная на фиг. 1, имеет Thr у аминокислотного остатка номер 100 (начиная от А1а после стрелки) и может быть упомянута как GM-CSF (Thr). Другая вариация имеет Ilе остаток у положения 100 и может быть упомянута как GM-CSF (Ile). Очи щенный белок GM-CSF настоящего изобретения проявляет удельную активность по крайней мере 107 единиц/мг белка и предпочтительно по крайней мере 4×107 единиц/мг при пробе с человеческими клетками костного мозга. Систе мы вектор-хозяин для экспрессии GM-CSF могут быть прокариотическими или эукариотическими, но сложность GM-CSF может сделать предпочти тельной систему экспрессии млекопитающих. Экспрессия легко осуществляется при трансформации прокариотических или эукариотических клеток подходящим вектором GM-CSF. Последовательность ДНК, получен ная по описанной выше процедуре, может быть экспрессирована непосредственно в клетках млекопитающи х под контролем подходящего про-мотора. Гетерологичные промоторы, хорошо известные специалистам в данной области, также могут быть использованы. Для экспрессии GM-CSF в прокариотических или дрожжевых клетках должна быть удалена лидерная последовательность (или секретор ная последовательность). Положение кодона для N-конца зрелого белка GM-CSF показано на фиг. 1. Это может быть определено с использованием стандартных методик, известных специалистам в данной области. Как толь ко получают це левой GM-CSF/кДНК клон, используют известные и подхо дящие средства для экспрессии белка GM-CSF, а именно, вставку в подхо дящий вектор и трансфекцию вектора в подхо дящую клетку-хозяин, отбор трансформированных клеток и культивирование эти х трансфор мантов для экспрессии GM-CSF активности. Подхо дящи ми клетками-хо зяевами являются бакте рии, например, Е. coli, дрожжи, клетки млекопитающи х, например СНО, и насекомых. Полученный таким образом белок GM-CSF может иметь метиониновую гр уп пу у N-терминала белка (здесь называемого Met-GM-CSF). Зре лый белок, полученный из прокариотических или эукариоти-ческих клеток, иначе, должен быть идентичным по аминокислотной последовательности, но эукариотический продукт может быть гли козилированным в той же са мой степени или в др угой, чем природный продукт. Различные методы получения белка GM-CSF в соответствии с соглашением показаны в приведенных ниже примерах. Др угие способы или материалы, например, векторы, будут легко оценены специалистами в данной области на основе примеров и последующего описа ния. Белок GM-CSF, экспрессированный в соответствующих прокариотных или эукариотных клетках, может быть извлечен с помощью методик очистки и разделения, известных специалистам в данной области. Однако, как указано, настоящее изобретение также обеспечивает способ очистки, пригодный для белка GM-CSF как из рекомбинантного, так и природного источников, с помощью которого белок GM-CSF может быть получен с вы сокой степенью чистоты и активности. Настоящее изобретение разрешает проблемы известного уровня техники и обеспечивает способ очистки белка, обладающего активностью GM-CSF. Белок GM-CSF в соответствии с настоящим изобретением обладает удельной активностью, по крайнеймере, 1×107 единиц/мг белка, предпочти тельно, по крайней мере, 2×107 единиц/мг белка и более предпочтительно, по крайней мере, примерно 4×107 единиц/мг белка при исследовании с человеческим костным мозгом. В соответствии с настоящим изобретением способ очистки белка GM-CSF состоит из осаждения белка сульфа том аммония при 80% насыщении с образованием осадка, содержащего белок GM-CSF; повторного суспендирования осадка в буфер ном растворе при рН в интервале от примерно 6 до примерно 8, нанесения буферного раствора, содержащего GM-CSF, на хроматографическую колонку, элюирования буферным раствором, содержащим хло ристый натрий, и сбора фракций, обладающи х активностью GM-CSF; объединения активных фракций, нанесения их на колонку С4 с обращенной фазой и элюирования 0-90% градиентом ацетонитрила для сбора активной фракции. Фиг. 5 иллюстрирует СДС-ПАГЭ анализ очищенного белка GM-CSF. Белок GM-CSF, очи щаемый в соответствии со способом изобретения, может происхо дить из любого природного источника, описанного выше в качестве исходного источника для технологии рекомбинантной ДНК, например, Мо клеточной линии или UCD MLA-144 клеточной линии гиббона. Альтернативно белок GM-CSF может быть получен с использованием методик рекомбинантной ДНК изобретения. GM-CSF из любого источника может быть очищен по способу настоящего изобретения. Кондиционированную сре ду из любого источника белка GM-CSF предпочтительно концентрируют ультрафильтрацией до концентрации белка, по крайней мере, около 0,1 мг белка/мл. Затем белок осаждают путем добавления сульфа та аммония до 80% насыще ния. Полученный осадок повторно суспендируют в водном растворе, проявляющем буферные свойства, при рН в интервале от примерно 6 до примерно 8. Примерами подхо дящих буферов являются Трис-НСl, HEPES, цитрат натрия и т.п. Раствор фракционируют хро матографией на колонке. Подходящими материалами для использования при колоночной хроматографии являются октилсефароза, ДЕАЕ-ультрагель, АсА44-уль-трагель, АсА-54 ультрагель и т.п. Один или несколько из этих материалов могут быть использованы последовательно для получе ния более высокой чистоты. Колоночные фракции собирают и проверяют на активность GM-CSF. Ак тивные фракции объединяют и разбавляют трифторуксусной кислотой (ТФУК), гептафтормасляной кислотой (ГФМК) или т.п. и наносят на колонку С4 с обращен ной фазой. Активность GM-CSF затем элюируют, используя 0-90% ацетонитрильный градиент в ТФУК или ГФМК, предпочтительно при концентрации от 0,10% или 0,15% (объем/объем), соответственно, в зависимости от того, какая кислота была использована при нанесении объединенных фракций на колонку. Фракции, имеющие ак тивность GM-C SF, анали зируют элек трофорезом на полиакриламидном геле с СДС (13,5% гель, как описано Лэммли, Nature 227, 680 (1970)). До полнительные обработки с использованием указанных вы ше ма териалов для хро матографи ческих ко лонок могут до полнитель но очистить бе лок GM-CSF для го могенности. Очищенный белок GM-CSF, фракционированный на СДС-ПАГЭ, показывает гетерогенный белок GMCSF, имеющий кажущуюся мопекулярную массу в интервале от примерно 15000 до примерно 26000 дальтон. Такая кажущаяся гетерогенность размера имеется благодаря экстенсивному гликозилированию белка и представляет собой обычную ха рактеристику гликопротеинов. Фракционирование менее очищенных образцов из Мо клеток кондиционированной среды с помощью СДС-ПАГЭ (в невосстановительных условиях) и проверка белка, элюированного из геля, показывает наличие второго белка, обладающего активностью GM-CSF, имеющего кажущуюся молекулярную массу от примерно 28000 до 30000. Активность GM-CSF свя зывается и элюируется из октилсефа розы, ДЕАЕ ультрагеля и колонки С4 с обращенной фазой. Примерно 60% активности GM-CSF связывается Кон-А сефарозой (40% протекает через) и может быть элюировано альфа метилманнозидом. Мо лекулярно-массовый анализ рекомбинантного GM-CSF гель-фильтрацией при низком содержании соли показывает, что примерно 30% активности элюи руется с одной и той же молекулярной массой около 19000, а 70% материала находится в качестве димера, элюируется в положении, соответствующем молекулярной массе примерно 38000. Если в колонку добавляют 1 М хло ристого натрия, вся активность элюируется в виде ши рокого пика примерно при 19000. Очищенный GM-CSF является стабильным в течение, по крайней мере, 16 часов при инкубировании при 4°С (рН 7,4) в 4 М гуанидин гидрохлориде; в 10 мМ ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтаноле, и в 30% (объем/объем) этаноле. Активность GM-CSF также является стабильной в 0,1% трифторуксусной кислоте (ТФУК) (рН 2,0) и 0,1% ТФУК плюс 25% (объем/объем) ацетонитрила. Как указывалось ранее, белок GM-CSF в соответствии с настоящим изобретением используется при лечении миелосуп рессии, такой как (симптоматическая) гранулоцитопения, например, вызываемая химиотерапевтическим лечением рака или его лечением с помощью облучения. В дополнение к этому белки GMCSF изобретения, как указывалось, используются при лечении острой инфекции. Для такой цели обычно показана дозировка примерно 200-1000 мкг/пациента. Белок GM-CSF предпочтительно вводят пациенту внутривенно с подходящим фармакологическим носителем. Примерами таких носителей являются фармакологический физиологический раствор и человеческий сывороточный альбумин в физиологическом растворе. Кроме того, белки GM-CSF изобретения обладают другими активностями и применениями. Например, было показано, что мышиные GM-CSF активируют нейтрофилы. Следовательно, следует ожидать, что GM-CSF приматов согласно настоящему изобретению также будут активировать нейтрофилы. Поэтому фи зиологические функции GM-CSF могут быть многообразными. В костном мозге этот лимфо кин может стимулировать пролиферацию и диффе ренциацию эффекторных клеток для защиты хозяина, тогда как на периферии могут быть активированы новые и существующие клетки. В локализованном иммунологическом ответе GM-CSF может сохранять циркулирующие нейтрофилы внутри или вне площадей воспаления. Аномальная локализация и/или активация нейтрофилов может быть включена в патофи зиологию различных иммуноопосредованных болезней, таких как ревматоидный артрит. Изобретение будет более понятно при ссылке на следующие иллюстративные варианты, которые являются чисто примерными и не должны рассматриваться как ограничивающие область настоящего изобретения, описанную в фор муле изобретения. В примерах, если нет других указаний, температура дана в °С. Рестрикционные эндонуклеазы используются в условиях и по методике, рекомендуе мой их коммерческими поставщиками. Реакции лигирования проводят, как описано Маниатисом и др., выше, на стр. 2456, описание которых приведено здесь в качестве уровня техники; используется буфер ный раствор, описанный на стр. 246, и концентрация ДНК 1-100 мкг/мл при температуре 23°С для ДНК с тупыми концами и 16°С для ДНК с липкими концами. Проводят электрофорез в 0,5-1,5% агарозных гелях, содержащи х 90 мМ Трисбората, 10 мМ ЭДТА. Всю ра диомеченную ДНК метят 32P, какая бы методика метки не использовалась. "Быстрый преп" означает быстрое, маломасштабное продуцирование бактериофага или плазмиды ДНК, например, как описано Маниатисом и др., вы ше, стр. 365-373. Пример А. Стадия 1. Культивирование Мо клеточной линии. Мо клетки (АТСС CRL 8066) выращивают традиционным образом на Альфа (6% СO2) среде или на среде Искова (10% СO2), содержащей 20% фетальной сыворотки теленка (ФСТ), 2 мМ глюта мина, 100 Ед./мл стрепто мицина и 100 мкг/мл пенициллина. Клетки должны быть субкультивированы каждые 4-5 дней. Клетки подсчитывают и высевают в колбы Фальконе Т-175 в 100-150 мл среды при плотности 3-4×105 клеток/мл. Клетки должны удваиваться в 20% ФСТ каждые 4-7 дней. Скорость роста не является постоянной и клетки могут иногда казаться остановившимися в росте, затем проходят через вспышки роста. Мо клетки могут быть выращены на среде, не содержащей сыворотки. Выживание намного лучше, когда клетки не промывают при переносе из ФСТ на среду, не содержащую сыворотки. Оптимальная плотность на среде, не содержащей сыворотки (СНС), составляет 5×105 клеток/мл. Клетки будут расти медленно (или, по крайней мере, сохранять постоянное число) в те чение 3 дней в среде, не содержащей сыворотки, а затем должны быть подпитаны 20% ФСТ в течение, по крайней мере, 4 дней. Рост по такому графику (3 дня СНС, 4 дня 20% ФСТ) может повторяться, если требуется СНС среда, без какого-либо ущер ба для клеток в течение нескольких месяцев. Стадия 2. Проба на активность GM-CSF. А. Проба с костным мозгом. Получают све жий костный мозг. Отделяют спи кулы вы тяги ва нием через иглу 20, 22, а затем 25 калибра. Разбавляют 1:1 сте рильным фосфа тно-солевым буфером (ФСБ) (комнатная температура) и наслаивают на Фи колл-Пак (примерно 30 мл ВМ-ФСБ на 6 мл Фи колла). Пе ремеши вают при 1500 об/мин в те чение 40 минут при комнатной температуре. Удаляют жир и ФСБ слой и отб расывают. Отбирают пипеткой слой малой плотности. Про мывают 2 ра за ФСБ и счи тают. Ра сполагают клетки на пласти не в RPM1 (по лучен от G1BCD как RPM1 1640) плюс 10% H1FCS (инактивиро ванная теплом ФСТ) в те чение 3 ча сов для удале ния приклеивши хся кле ток. Среда для пластины (готовится свежая): 20% ФСТ 0,3% агара, растворенного в во де, охлажденного до 40° 2х Искова (1:1 объем/объем с агаром) 1% P/S конечная концентрация 100 Ед./мл стрептомицина, 100 мкг/мл пенициллина 10-4 М альфа-тиоглицерина в 2х Искова из 10-2 М исходного Агар, о хлажденный до 40°. Смешать с другими ингредиентами. Охлаждение на водяной бане до 37-38° и хранение при этой температуре. Через 3 часа отбирают пипеткой неприклеившиеся клетки. Перемешивают и подсчитывают. До бавляют 2.105 клеток/мл посевной среды и хра нят при поддержании контролируемой температуры водяной бани 37-38°С. Прибавляют образцы (например, среды от трансфицированных клеток, обычно 10 мкл образца) в первый ряд углублений пластины микротитратора в двойной повторности. Прибавляют 100 мкл суспензии клеток в каждое углубление. Прибавляют дополнительные 50 мкл суспензии клеток в каждое углубление в первом ряду. Тщательно смешивают и переносят 50 мкл раствора из первого ряда в сле дующий ряд и т.д. и продолжают разбавления 1:3 поперек пласти ны. Обертывают пластину парафильмом. Инкубируют 10-14 дней при 10% СО2, 37°С в полностью влажной атмосфе ре и подсчитывают колонии. Для подсчета колоний считают общее число колоний, которое выросло в каждом углублении. В каждой пробе несколько углублений засевают без включения образца (холостой) для получе ния базового числа колоний. Среднее число колоний, которые выросли в контрольных углублениях, вы читают из числа колоний, найденных в каждом углублении, содержащем образцы. Одна единица ФСТ представляет собой количество, которое будет сти мулировать образование одной колонии больше контрольного уровня на 105 клеток человеческого костного мозга (засеивается 105 клеток/мл), когда концентрация ФСТ является субнасыщенной. Субнасыщенная концентрация определяется разбавлением и сравнением числа колоний при различных разбавлениях для нахождения концентрации чуть ниже уровня насыщения. В этом анализе подсчитывают колонии, содержащие гранулоциты, моноциты или оба типа клеток. Типы клеток в колониях определяются отбором колоний и окрашиванием индивидуальных клеток. В. Проба с KG-1 клетками. KG-1 клетки (Blood, 56, № 3 /1980 /) вы ращи вают в сре де Искова + 10% ФСТ, пе реносят 2 раза в неделю и вы севают каждый пассаж при 2×105 клеток/мл. Кле тки используют для анали за только между пассажами 30-35. Исследова ние проводи тся так же, как описано выше для костного мозга , с тем исключением, что KG-1 кле тки высевают в агаро вую смесь в ко личестве 4×10 3 кле ток/мл. Число колоний, выросших в каждом углублении, определяют и вычитают контрольный показатель холостого опыта, как и в описанном выше опыте с костным мозгом. Одна KG-1 ФСТ единица/мл означает такую концентрацию ФСТ, которая будет стимулировать половину максимального числа (насыщение) KG-1 колоний для роста. Максимальное число получают при включении насыщающих количеств ФСТ в несколько углублений. Стадия 3. Конструирование вектора р91023/В/. Вектор трансформации представляет собой pAdD26SVpA/3/, описанный Кауфманом и др.. Моl. Cell Biol. 2/11/: 1304-1319 (1982). Он имеет структуру, представленную на рис. 2. Вкратце, эта плазмида содержит кДНК мышиного гена дигидрофолат ре дуктазы (ДГФР), который находится под транскрипционным контролем основного позднего промотора аденовируса 2 (Ad2), 5' сайт сращива ния включен в ДНК аденовируса, а 3' сайт сращива ния, происхо дящий из гена иммуноглобулина, находится между основным поздним промотором Ad2 и последовательностью, кодирующей ДГФР. Вниз в направлении считыва ния от последовательности, кодирующей ДГФР, находится ранний сайт полиаденилирования SV-40. Область прокариотического происхождения pAdD26SVpA/3/ получе на из pSVOd (Mellon P., Parker V., Glu zman Y. and Maniatis Т., 1982, 27: 279-288) и не содержит pBR322 последовательностей, известных как ингибирующие репликацию в клетках млекопитающи х (Lusky М., and Botchan M., 1981, Nature (London) 293: 79-81). pAdD26SVpA/3/ превращают в плазмиду pC VSVL2, как показано на рис. 2. pAdD26SVpA/3/ превращают в плазмиду pAdD26SVp A/3/ (d) путем делеции одного или двух Pst сайтов в pAdB26SVp A/3/. Для этого осуществляется частичное переваривание Pst 1 (используется недостаточность ферментной активности, что бы таким образом получить субпопуляцию линеаризированных плазмид, в которых отщеп лен только один Pst-сайт), затем проводят обработку по Кленову, лигирование с рециркуляризацией плазмиды, трансфор мацию Е.coli и скрининг на делецию Pst 1 сайта, ло кализованного у 3' последовательности полиаденилирования SV-40. Трехчастный лидер аденовируса и вирус-ассоциированные гены (VA ге ны) вставляют в pAdD26SVpA/3/ (d), как показано на рис. 2. Сначала pAdD26SVpA/3/ (d) расщепляют Pvu 11, чтобы получить ли нейную молекулу разрывом внутри 3' участка первого из трех элементов, составляющи х тре хчастный лидер. Затем pJAW 43 (Zain et al., 1979, Cell, 16, 851) переваривают Xho 1, обрабатывают по Кленову, переваривают Pvu 11 и изолируют фрагмент 140 пар оснований, содержащий вто рой и часть третьего лидеров, с помощью электрофореза на полиакриламидном геле (6% в Трис-боратном буфере; Ма ниатис и др. /1982/ выше). Фрагмент 140 пар оснований затем связывают с Pvu 11 переваренной pAdD26SVpA/3/ (d). Продукт связывания используют для трансформации Е.соlі до получе ния резистентности к тетрациклину и скринируют колонии, используя процедуру Грюнштейна-Хогнесса с применением 32Р-меченого зонда, гибридизующегося с фрагментом 140 пар оснований. Получают ДНК из положительно гибридизованных колоний, чтобы проверить, находится ли реконструированный Pvu 11 сайт на 5' или на 3' конце вставки ДНК размером 140 пар оснований во 2-м или 3-м лидерах послед них аденовируса. При правильной ориента ции Pvu 11 сайт находится на 5' стороне вставки 140 пар оснований. Эту плазмиду обозначают pTPL на фи г. 2. Ava 11 D фрагмент SV-40, содержащий энхансер SV-40, получают при переваривании ДНК SV-40 ферментом Ava 11, затуп лении концов фрагментом Кленова Pol 1, связывании Xho 1 линкеров с фрагмента ми, переваривании Xho 1 для открытия Xho 1 сайта и изоляции четвертого самого большо го (D) фрагмента гельэлектрофорезом. Затем этот фрагмент связывают с разрезанной Xho 1 pTPL, получая плазмиду pCVSVL2-TPL. Ориентация SV-40D фрагмента в pCVSVL2-TPL будет такой, при которой поздний промотор SV-40 находится в той же ориентации, как основной поздний промотор аденовируса. Для введения вирус-ассоциированных генов (VA) аденовируса в pCVSVL2-TPL сначала конструируют плазмиду из pBR322, которая содержит Hind 111 В фрагмент аденовируса ти па 2. ДНК аденовируса типа 2 переваривают Hind 111 и изолируют фрагмент В после гельэлектрофореза. Затем этот фрагмент вставляют в pBR322, которую заранее переварили Hind 111. После трансформации Е.соlі до резистентности к ампициллину скри-нируют рекомбинанты на вставку фрагмента Hind 111 В и определяют ориентацию вставки при переваривании рестрикционным ферментом; pBR322-Ad Hind 111 В содержит фрагмент Hind 111 В аденовируса типа 2 в ориентации, представленной на фиг. 3. Как показано на фиг. 3, VA ге ны обычно получают из плазмиды pBR322-Ad Hind 111 В при переваривании Hpal, добавлении EcoRl линкеров и переваривании EcoRl и извлечении фрагмента размером 1,4 кв. Фрагмент, имеющий EcoRl липкие концы, затем связывают по EcoRl сайту pTRL (которая была ранее переварена EcoRl). После трансформации Е. соїі НВ101 и отбора на резистентность к тетрациклину, колонии скринируют путем гибридизации на фильтре с специфическим зондом ДНК для VA генов. ДНК получают из положительно гибридизованных клонов и характеризуют перевариванием рестрикционными эндонуклеаза-ми. Получен ную плазмиду обозначают р91023. Удаляют оба EcoR1 сайта в р91023. р91023 разрезают полностью EcoR1, получая два фрагмента ДНК, один примерно 7 кв, а другой - примерно 1,3 кв, содержащие VA ге ны. Концы обоих фрагментов были заполнены с использованием фрагмента Кленова Pol I, а затем оба фрагмента, а именно 1,3 кв и 7 кв, связывали вместе. Плазмиду р91023/А/, со держащую VA ге ны, и подобную р91023, но с делецией 2 сайтов EcoR1, идентифицируют с помощью скрининга Грунштейна-Хогнесса с фрагментом VA гена и с помощью традиционного рестрикционного анализа. Затем удаляют единственный сайт Pst 1 в р91023/А/ и заменяют сайтом EcoR1. р91023/А/ разрезают полностью Pst 1, a затем обрабатывают фрагментом Кленова Роl І для генерации заполненных концов. EcoR1 линкеры связывают с затупленным Pst 1 сайтом р91023/А/. Линейную р91023/А/ с EcoR1 линкерами, присоединенными к тупому Pst 1 сайту, отделяют от неприсоединенных лин керов и переваривают полностью EcoR1, а затем повторно лигируют. Извлекают плазмиду р91023/В/ и идентифицируют, что бы иметь структуру, подобную р91023/А/, но с EcoR1 сайтом, расположенным на месте предыдущего Pst1 сайта. Стадия 4. Получе ние банка кДНК. Мо клетки индуцируют в течение 16-20 часов с помощью РНА и РМА для усиления продуци рования ими лимфо кина. Эти клетки высевают в количестве при 5×105 клеток/мл в среду Искова с 20% ФСТ, 0,3% (объем/объем) РНА и 5 нг/мл ТРА. Кле тки собирают центрифуги рованием. Осадок клеток снова суспендируют в 20 мл охлажденного на льду ги потонического буфера /RSB буфер: 0,01 М Трис-НСl-рН 7,4, 0,01 М КСl, 0,0015 М MgCl2, 1 мкг/мл циклогексимида, 50 единиц/мл PHK-sin и 5 мМ дитиотрейто ла/. Клеткам дают набухнуть на льду в течение 5 минут, за тем механически разрушают 10 движениями пести ка стеклянного гомогенизатора. Гомогенат центрифуги руют при низкой скорости (2000 об/мин в центрифуге Бекман J-6) для удаления ядер и нелизированных клеток. Надосадочный слой хранят на льду до те х пор, пока осадок ядер не суспендируют повторно в 10 мл RSB и снова не отцентрифуги руют с низкой скоростью. Этот второй надосадочный слой объединяют с первым и центрифуги руют объединенные супернатанты с низкой скоростью для удаления оста точного загрязнения ядрами и нелизированными клетками. Супернатант после этой операции доводят до 0,15 М КСl добавлением 2М КСl, а затем центрифугируют с вы сокой скоростью /25000 об/мин, Бекман SW ротор в течение 30 минут/, что бы получить осадок мембран. Мембранный осадок тщательно промывают холодным RSB, затем повторно суспендируют в 12 мл RSB, содержащего 2 М са харозы и 0,15 М КСl. Готовят два ступенчатых гра диента в центрифужных пробирках Бекман SW 41 путем наслаивания 6 мл мембранного раство ра в 2 М сахарозы на 2 мл RSB с 2,5 М сахарозы и 0,15 М КСl. Трубки заполняют доверху путем наслаивания сверху 2,5 мл RSB, содержащи х 1,3 М сахарозы и 0,15 М КСl. Эти градиенты центрифуги руют в те чение 4 часов при 27000 об/мин (Бекман, ротор SW 41) при 4oС. Мембранный слой (на границе фаз между 2,0 М и 1,3 М сахарозы) тщательно удаляют сбоку, используя иглу 18 калибра и шприц. Объединяют мембранные фракции из двух градиентов и разбавляют 1 объемом дистиллированной воды, затем смешивают с 0,5% Три тона Х-100 и 0,5% дезоксихолата натрия, затем экстрагируют равным объемом фенола. Водный слой повторно экстрагируют смесью 1:1 фенола и хлороформа и, наконец, равным объемом хлороформа. В заключении осаждают связанную с мембраной РНК добавлением хлористо го натрия до 0,25 М и 2,5 объемов хо лодного этанола и инкубируют всю ночь при -20°С. Осажденную РНК собирают центрифуги рованием (4000 об/мин в течение 10 минут в центрифуге Бекман J6) и повторно суспендируют в 1 мл дистиллированной воды. Из 2×109 клеток получают приблизительно 1 мг РНК. Матричную РНК (мРНК) изолируют из тотальной РНК хроматографией на колонке с 0,5 мл олиго-dТцеллюлозы. Кратко, РНК нагревают в течение 5 минут, быстро охлаждают на льду, за тем разбавляют в 5 раз при комнатной температуре связывающим буфером (0,5 М LiCl 0,01 М Трис-НСl, рН 7,4, 0,002 М ЭДТА, и 0,1% СДС). РНК в связывающем буфере переносят на колонку с олиго-dТ-целлюлозой, уравновешенную связывающим буфером, при комнатной температуре. Колонку промывают 5 мл связывающего буфера, и затем еще 5 мл 0,15 М LiCl 0,01 М Трис-НСl, рН 7,4, 0,002 М ЭДТА и 0,1% СДС. Наконец, элюируют мРНК 2 мл 0,01 М Трис-НСl, рН 7,4, 0,002 М ЭДТА и 0,1% СДС. мРНК осаждают добавлением хлористо го натрия до 0,25 М и 2,5 объемов этанола и инкубируют всю ночь при -2 0°С. Осажденную мРНК собирают центрифугированием (30000 об/мин в течение 30 минут в роторе SW 55 Бекмана). Пробирку тща тельно сливают и осадок мРНК повторно суспендируют в 50 мл воды. Повторно суспендированную мРНК доводят до 0,25 М NaCl, затем экстрагируют 1 раз смесью 1:1 фенола и хлороформа, затем 3 раза хлороформом. Осаждают мРНК добавлением 2,5 объемом этанола. Смесь замораживают и оттаивают несколько раз на бане сухой лед/этанол, затем центрифуги руют 15 минут в центрифуге Эппендорфа. Пробирку тща тельно сливают и осадок мРНК повторно суспендируют в 20 мкл дистиллированной воды. Конечный выход составляет примерно 30 мкг мРНК. Готовят первую нить кДНК, используя стандартные методики. Кратко, 10 мкг мембранной мРНК разбавляют в 100 мкл реакционной смеси синтеза кДНК, содержащей 300 мМ Трис, рН 8,4, 140 мМ КСl, 10 мМ МgСl2 10 мМ (b-меркаптоэтанола, 500 мМ каждого из dATP, dGTP, dCTP и dTTP, 5 мкг олиго-dТ-/фосфорилированного и со средним размером 12-18/ в качестве праймера, 150 32P dCTP (400 Сі/ммоль) и 20 единиц ингибитора рибонуклеазы PHK-sin. Реакцию инициируют до бавлением 100 единиц обратной транскриптазы и инкубируют 30 минут при 42 oС. Реакцию останавливают добавлением ЭДТА до 40 мМ и разлагают РНК инкубированием в течение 20 минут при 65oС в 0,2 М NaOH. Основания нейтрализуют добавлением 20 мкл Трис, рН 7,4. Реакционную смесь затем экстрагируют фенолом/хлороформом, снова экстрагируют 50 мкл 10 мМ Трис, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА (ТЕ) и объединяют водные фазы. Однонитевую кДНК превращают в двуни-тевую инкубированием в течение 12 часов при 16oС с 40 единицами фрагмента Кленова ДНК полимеразы 1 в 100 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ фосфата калия, рН 7,4, 2,3 мМ ДТТ, 2-меркаптоэтанола, 10 мМ МgСl2, 150 мМ каждого из четырех деоксинуклеотидтрифосфатов и 25 mСі 32 P dCTP. Реакцию прекращают экстракцией фенолом/хлороформом и удаляют невошедшие трифосфа ты пропусканием водной фазы через колонку с 1 мл сефадексом G-50. Вышедшие фракции объединяют и осаждают этанолом. Осадок кДНК промывают хо лодным этанолом, затем повторно суспендируют в 200 мкл раствора 20 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 80 мкмолей 5-аденозилметионина и 300 единиц EcoR1 метилазы в течение 60 минут при 37oС. Реакцию останавливают экстракцией фенолом/хлороформом и собирают метилированную кДНК осаждением этанолом. Осадок кДНК промывают 70% этанолом, затем повторно суспендируют в 200 мкл SI буфера (Ма ниатис и др.) и инкубируют с 200 единицами SI-нуклеазы при 30oС в течение 30 минут. Реакцию останавливают экстракцией фенолом/хлороформом и собирают кДНК осаждением этанолом. Двунитевую кДНК затуп ляют инкубированием в 100 мкл раствора 20 мМ Трис, рН 7,4, 50 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 500 mмолей всех четырех деоксинуклеотидтрифосфатов и 25 единиц фрагмента Кленова при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакцию останавливают экстракцией фенолом/хлороформом и собирают кДНК осаждением этанолом. Связывают кДНК в 50 млк Т4 лигазного буфера (Ма ниатис и др.) с 500 пкмолей или рмолей R1 линкеров, полученных от Нью Инглэнд Биолабс (последовательность pCGGAATTCCG), используя 2000 единиц Т4 лигазы в течение ночи при 16°С. Реакцию останавливают инкубированием при 70oС в течение 20 минут, затем разбавляют до 300 мкл так, чтобы конечная концентрация соли составляла 0,1 M NaCl, 10 мМ MgCl2, 50 мМ Трис-НСl, рН 7,4. Затем кДНК переваривают 2 минуты при 37°С 700 единицами EcoR1. Реакцию останавливают экстракцией фенолом/хлороформом и собирают кДНК осаждением этанолом. Осадок повторно суспендируют в 50 мкл ТЕ и пропускают через колонку 5 мл С1-4В. Вышедшие фракции собирают, объединяют и осаждают этанолом. Осажденную кДНК подвергают электрофорезу через 1% агарозный гель в Трис-ацетатном буфере в присутствии 1 мкг/мл этидийбромида. Изолируют из геля кДНК с размером в интервале 500-4000 пар оснований, используя стандартную методику со стеклянным порошком. Элюированную кДНК экстрагируют фенолом/хлороформом, осаждают этанолом и осадок (после промывки этанолом) повторно суспендируют в 60 мкл ТЕ. Конечный выход составляет 100-500 нг кДНК. Получе ние векто ра экспрессии р91023/В/ описано выше . Свя зывают перева ренный EcoR1 и обработан ный фосфа тазой вектор (500 нг) со 100 нг кДНК в 100 мкл реакционной смеси (стан дартная Т4 лигаз ная реакционная смесь) в те чение ночи при 16°С. Реак цию оста навли вают экстракцией фенолом/хло рофор мом, затем связанную кДНК собирают осажде нием этанолом после до бавления 5 мкг т-РН К в ка честве носите ля. Осажденную этанолом ДНК промывают 70% этанола, затем повторно суспендируют в 100 мкл ТЕ. Эту ДНК используют в ви де 4 мкл - аликвот для трансформации Е.coli MC1061 (4 мкл в 100 мкл трансформационной среды). Каждую из 25 трансформаций переносят в 150 мм чашки Петри с 1% агара, L-бульоном и 10 мкг/мл тетрациклина (Tet-пластины) и инкубируют всю ночь при 37°С. На каждой пластине вырастает приблизительно 2000 колоний, в результате получают около 50000 колоний. После достижения примерно 0,5 мм в диаметре колонии переносят на нитроцеллюлозные диски (137 мм), осто рожно размещая сухой фильтр на поверхности пластины, затем мягко отщепляют фильтр. Все колонии на пластине переносят на фильтр, который затем помещают (колонии сбоку /side up/) на свежую Tet-пластину. После выращивания колоний в течение нескольких часов готовят реплику каждого из фильтров, помещая свежий влажный фильтр точно на первоначальный фильтр, прижимая их друг к другу, отщепляя их, затем возвращая каждый фильтр на свежую Tet-пласти ну и инкубируя пластины всю ночь при 37oС. Каждую реплику тща тельно маркируют, что бы ее можно было сравнить с оригинальным фильтром. Стадия 5. Приготовление пула плазмидных ДНК. Каждый из 25 фильтров-реплик осторожно разрезают на восемь частей, используя скальпель и отмечая ориентацию каждой восьмой части относительно оригинального фильтра. Соскабливают колонии с каждой секции в 10 мл L-бульона. Бакте рии собирают центрифуги рованием (3000 об/мин, 10 минут, центрифуга Бекман J-6), повторно суспендируют в 0,6 мл 25% сахарозы, 50 М Трис-НСl, рН 8,0, превращают в протопласты добавлением 0,12 мл 5 мг/мл лизоцима и инкубируют на льду в течение 5-10 минут. Протопласты снова инкубируют при комнатной температуре 10 минут, затем добавляют 0,125 мл 0,5 М ЭДТА и лизируют при добавлении 0,12 мл 10% СДС в 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Лизат осто рожно смешивают, ин кубируют при комнатной температуре 15 минут, затем осаждают белок и хромосомную ДНК добавлением 0,3 мл 5 М NaCl. После инкубирования на льду в те чение 15 минут ли зат центрифуги руют на центрифуге Эппендорфа в те чение 30 минут на хо лоде. Осто рожно удаляют надосадочный слой, оставляя внизу вязкий осадок ДНК/белок и разбавляют, добавляя 2,5 мл воды. Смесь экстрагируют 1 мл фенола, разделяют слои центрифуги рованием (10К в течение 10 минут в роторе Сорволл SS-34) и переносят водный слой в новую пробирку. Осаждают ДНК до бавлением 0,5 мл 5 М NaCl и 7,5 мл холодного этанола, замораживают смесь несколько раз на бане сухой лед/этанол. Осадок собирают центрифуги рованием (10К, 15 минут в Сорволл SS-34), повторно суспендируют в 0,3 мл 0,3 М ацетата натрия и снова осаждают (в эп пендорфовской пробирке) добавлением 1 мл этанола. После 10-15 минут на бане, сухой ледэтанол, собирают осажденную ДНК центрифуги рованием (5 минут в центрифуге Эппендорфа), а полученный осадок снова суспендируют в 100 мкл стерильного ТЕ (10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). При типичной операции получают 5-10 мкг плазмидной ДНК. Каждое приготовление содержит ДНК из 200500 колоний на первоначальном фильтре. Всего приготовлено 200 образцов ДНК из 25 фильтров. Стадия 6. Изолирование клона CM-CSF. Каждым из образцов ДНК со ста дии 5 отдельно трансфи ци-руют М6 COS клетки обезьяны, как описано ниже. М6 клетки выращивают рутинно в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ДМЕ, доступная из GlBCO), содержащей 10% инактивированной теплом фетальной сыворотки теленка (H1FCS), разделяют дважды в неделю при разбавлении 1:6. Через 24 часа после разделения М6 клетки готовы для трансфекции. За 24 часа до трансфекции высевают 1,2·108 М6 клеток (деление 1:6) в клеточный фактор (доступ ный от Nunc) в 1,5 л ДМЕ + 10% H1FCS. Непосредственно перед трансфекцией пластины отсасывают и дважды промывают 7 мл не содержащей сыворотки ДМЕ. ДНК растворяют в 0,1 М Трис (рН 7,3) и прибавляют к ДМЕ среде, содержащей 2 мМ глютамина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 Ед./мл пенициллина и 0,25 мг/мл ДЕАЕ Декстрана, доводя до 4 мл раствором Трис-ДНК. Прибавляют 4 мл среды, содержащей растворенную ДНК, на пластину, содержащую М6 COS клетки, и инкубируют в течение 12 часов. После инкубации клетки промывают один или два раза 7 мл SF ДМЕ. Затем прибавляют 5 мл ДМЕ с 10% H1FCS, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина и 0,1 мМ хло рокина и инкубируют клетки 2,5 часа. Через 2,5 часа промывают один раз SF ДМЕ и прибавляют 10 мл ДМЕ + 10% H1FCS/пластину. Через 30 часов отсасывают среду и вносят 4 мл/пластину ДМЕ + 10% H1FCS. Сбор проводят, удаляя кондиционированную сре ду после 24-26 часов дополнительной инкубации. Кондиционированную среду после каждой трансфекции проверяют на активность GM-CSF, используя KG-1 пробу. Для каждого образца, положительного на активность GM-CSF, должен быть идентифицирован клон на первоначальном основном фильтре, ответственный за активность GM-CSF. Например, для одной трансфекции, положительной на активность GM-CSF, пересаживают все колонии с секции первоначального основного фильтра, с которого происходит образец трансфекции ДНК. Некоторые из этих 320 колоний пересаживают в 3 мл L-бульона плюс 10 мкг/мл тетрациклина. Культуры выращивают в течение ночи. 320 колоний помещают на матрицу 18 х 18. Готовят пулы из каждого горизонтального ряда и вертикальной колонки матрицы (всего 36 пулов) (примечание: последний горизонтальный ряд имеет только 14 клонов). Готовят образцы ДНК из каждой объединенной в пул культуры, затем используют для трансфекции COS клеток. Проверяют надосадочные слои этих трансфекции, используя пробу KG-1 колонии. Из этой группы трансфекции получают два положительных образца: один - в вертикальной колонке, другой - в горизонтальном ряду. Общая культура этих пулов содержит клон GM-CSF. Изолируют 12 индивидуальных клонов из этой культуры и готовят "минипреп" ДНК из 10 мл культуры в L-бульоне, как описано выше. Образцы 10 мкг ДНК из этих препаратов переваривают EcoR1 и анализируют полученные в результате фрагменты ДНК с помощью электрофореза на агарозном геле. Девять из двенадцати клонов имеют одинаковую вставку приблизительно 750 пар оснований. ДНК четырех из этих клонов и три клона с другими вставками вводят в М6 COS клетки, как описано выше. Надосадочные слои от этих трансфекций проверяют, используя KG-1 пробу, а также пробу на GMCSF с костным мозгом. Четыре клона, каждый из которых содержит фрагмент 750 пар оснований, обеспечивают экспрессию в М6 COS клетках с высоким уровнем активности GM-CSF, как определено в любой пробе, тогда как другие три клона нет. Следовательно, кодирующая область для GM-CSF должна быть локализована внутри вставки 750 пар оснований. Последовательность ДНК, кодирующая GM-CSF, бы ла удалена из вектора трансфор мации в положительном клоне путем переваривания EcoR1 и была определена ее аминокислотная последовательность с использованием стандартных методов ди дезоксисеквенирования после субклонирования фрагментов в М13 векторы, полученная последовательность показана на фиг. 1. Плазмида, p91023/B/-GM-CSF, которая исходно показала направленную экспрессию GM-CSF в COS клетках, была обозначена pCSF-1. Эта плазмида была депонирована в Коллекции культур американского типа в штамме Е.coli-МС1061 под номером хранения АТСС 39754 2 июля 1984 года. Стадия 7. Экспрессия белка GM-CSF. М6 COS клетки обезьяны, трансформированные вектором р91023/В/, содержащим GM-CSF/кДНК, выделенную как на стадии 6, выращивают, как описано на стадии 6, для получения белка GM-CSF в культуральной среде. А именно, 1 мг этой ДНК (pCSF-1) растворяют в 1 мл 0,1 М Трис рН 7,3 и прибавляют к 600 мл ДМЕ, содержащей 2 мМ глютамин, 100 Ед./мл стрептомицина, 100 мкг/мл пенициллина /P/S/ и 0,25 мг/мл ДЕАЕ Декстрана /молекулярная масса 500000, получе но из Pharmacia/. 600 мл раствора ДНК ДЕАЕ Декстрана прибавляют к М6 COS клеткам в уста новку для культивирования клеток и инкубируют при 37 оС в те чение 12 часов. После инкубирования клетки промывают один раз 900 мл SF ДМЕ, затем инкубируют 2,5 ча са с 600 мл ДМЕ, содержащей 0,1 мМ хло рокин, 10% H1FCS, 2 мМ глютамин и P/S. После отсасывания среды, содержащей хлорокин, клетки промывают SF ДМЕ и помещают в 1500 мл ДМЕ с 10% H1FCS. Через 30 часов клетки промывают SF ДМЕ, среду заменяют 800 мл, SF ДМЕ и помещают трансфи цированные клетки в условия с температурой 37оС на 24 часа. Отработанную кондиционированную среду отсасывают и заменяют другими 800 мл SF ДМЕ. Клетки оставляют на 24 часа в этой среде, затем собирают отработанную среду. По возможности быстро после сбора концентрируют образец отработанной среды в 20 раз ультрафильтрацией под давлением, используя камеру Амикон на 2,5 л с УМ5 мембраной (5000 MW отрезок). Стадия 8. Очистка рекомбинантного GM-CSF. 200 мл концентрированной отработанной среды (из 4 л исходного материала - стадия 7) доводят до 30%-ного насыще ния сульфа том аммония путем добавления твердого сульфата аммония и удаляют осажденный белок центрифугированием. Надосадочный слой доводят до 80%-ного насыщения сульфатом аммония путем добавления твердого сульфа та аммония и осажденный белок собирают центрифугированием. Осадок повторно суспендируют в 5 мл 20 мМ цитрата натрия, рН 6,1, содержащего 1 М NaCl. Растворенный белок наносят на колонку 1,6 х 100 см Ультрагель АсА54, уравновешенную тем же самым буфером. Активность GM-CSF, элюированная с колонки, имеет кажущийся молекулярный вес 19 килодальтон. Наблюдали, что если проводить гель-фильтрацию с низкой ионной силой, активность GM-CSF элюируют с колонки в двух положениях с кажущи мися молекулярными массами примерно 19 килодальтон и 38 килодальтон, подтверждая, что GM-CSF может легко образовывать димеры. Объединяют активные фракции, доводят до 0,15% ТФУК (добавлением 10% ТФУК) и наносят на колонку Видак С4 (0,46 х 25 см), уравновешенную 0,1% ТФА. Колонку обрабатывают ли нейным градиентом 0-90% ацетонитрила (1 мл/мин, всего 340 мл) в 0,1% ТФУК. Активность GM-CSF элюируется между 39% и 43% ацетонитрила (фракции 16-20). Анализируют образец 20 мкл фракции 19 с помощью электрофореза на СДС-полиакриламидном геле (13,5% гель, как описано Леммли, Nature 227, 680 /1970/). Наблюдалась одна широкая полоса белка с кажущейся молекулярной массой 18-26 килодальтон. Столь широкий размер полосы для GM-CSF с постепенным ее сужением является общим признаком гликопротеинов и отражает экстенсивное, но переменное наращивание количества углеводов. Бе лок из фракции 19 подвергают разложению по Эдману, используя газофазный микросеквенатор Апплайд Биосистемс. Из приблизительно 20 мкг нанесенного белка получают последовательность первых 16 аминокислот (A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-P-W-E-H). Вы сокий выход этой единственной белковой последовательности хо рошо подтверждает, что белок GM-CSF во фракции 19 был очищен до гомогенности. Биопроба показывает, что фракция 19 имеет 3·107 единиц на единицу поглощения при 280 нм. Поскольку типичные белки в водном растворе дают коэффициенты экстинкции в интервале от 0,8 до 1,2 A280 единиц поглощения на миллиграмм белка, удельная активность очищенного GMCSF находится между примерно 1·107 и примерно 4·107 единиц/мг при испытании с использованием пробы с человеческим костным мозгом. Пример В. Клонирование GM-CSF гиббона. Стадия 1. Получе ние мРНК из Т-клеток гиббона. Образец линии Т-клеток гиббона, обозначенной UCD-MLA 144, культивируют в те чение нескольких недель в RPM1 1640 (полученной от G1BCO) с 20% фетальной сыворотки теленка (ФСТ) до тех пор, пока не будет получе но всего 1·109 клеток. Клетки индуцируют для продуцирования высоких уровней GM-CSF путем активации в течение 24 часов в присутствии 10 нг/мл 12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (ТФА) в RPM1 1640 плюс 1% ФСТ. Собирают выращенные клетки центрифугированием (1000 об/мин, 5 минут), промывают один раз фосфатно-солевым буферным раствором и снова собирают центрифуги рованием. Из этих клеток готовят связанную с мембраной полисомную мРНК, используя ту же самую процедуру, что описана в примере А для получе ния РНК Мо клеток. Стадия 2. Приготовление однонитевой кДНК. Разбавляют 6 мгк мембрансвязанной мРНК (из стадии 1) в 50 мкл реакционной смеси для синте за кДНК (смотри пример А -ста дия 4) и инициируют реакцию добавлением обратной транскрипта зы. После 30 минут инкубирования при 42oС реакцию останавливают добавлением ЭДТА до 50 мМ и разбавляют водой до 100 мкл. Смесь экстрагируют фенолом/хлороформом и снова экстрагируют хло роформом. Отделяют гибриды кДНК/РНК от непрореагировавших трифосфа тов хро матографией на колонке с Сефарозой CL-4B. Выведенные фракции объединяют и собирают гибриды осаждением этанолом. Конечный выход составляет 570 нг. Стадия 3. Приготовление двунитевой кДНК. Снова суспендируют осадок однонитевой кДНК (стадия 2) в 50 мл воды и проводят синтез второй нити в стандартной реакционной смеси с Е.соlі, полимеразой 1, Е.соlі лигазой и РНКазой Н. Реакционную смесь инкубируют в течение ночи при 16°С и затем инкубируют 1 час при 37oС. Реакцию останавливают добавлением ЭДТА и экстрагируют фе нолом/хлороформом. Отделяют кДНК от непрореагировавших трифосфатов хроматографией на колонке с Сефарозой CL-4B, выведенные фракции объединяют и собирают кДНК осаждением этанолом. Стадия 4. Получе ние рекомбинантной кДНК. Снова суспендируют осадок кДНК (стадия 3) в 75 мкл воды. Гомополимерные С-"хвосты" присоединяют к концам кДНК при добавлении 10 мкл раствора кДНК к 25 мкл стандартной реакционной смеси с концевой трансферазой и инкубируют при 30°С в течение 5 минут. Реакцию останавливают до бавлением ЭДТА до 40 мМ и тепловой инактивацией при 68°С в течение 10 минут. Отжигают 10 нг этой кДНК с "хвостами" с 50 нг поли G-pBR322 (получе на от NEN в 10 мкл 10 мМ Трис, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА и 100 мМ NaCl. Отожженную реакционную смесь инкубируют в те чение 10 минут при 68°С, а затем 2 часа при 57°С. Стадия 5. Трансформация бакте рий. Выращивают штамм Е.coli MC1061 в L-бульоне, охлаждают на льду, со бирают центрифуги рованием и обрабатывают CaCl2 для подготовки их к трансфор мации. Затем инкубируют 5 мкл реакционной смеси кДНК после отжига с 200 мкл обработанных CaCl 2 бактерий. Проводят 50 таких трансформаций, используя всю кДНК, и наносят на пластины с 1% агаром на L-бульоне, размером 15 см, содержащие 10 мкг/мл тетрациклина. На каждой пластине вырастает приблизительно 1000 колоний. Стадия 6. Посев реплик. 10 000 колоний из среды трансфор мации (каждую с помощью зубочистки) переносят на свежие пластины (500 на каждую пластину решетки) и выращивают всю ночь при 37°С. Затем колонии снимают с каждой пластины, прижимая сухой нитроцеллюлозный фильтр плотно к поверхности пластины. Для каждого из этих основных исходных фильтров готовят два фильтра-реплики. Основные исходные фильтры хранят при 4oС, а фильтры-реплики обрабатывают основанием и сушат, что бы подготовить их к гибридизации. Стадия 7. Приготовление 32Р-меченых зондов гибридизации. Изолируют вставку кДНК из pCSF-1 перевариванием рест-рикционным ферментом EcoR1 и электрофорезом на агарозном геле с Трис-ацетатом и этидинумбромидом. Полосу, со держащую фрагмент кДНК, вырезают из геля и очищают по методике со стеклянным порошком. Затем прибавляют к 1 мкл 10 х Т4 ДНК полимеразного буфера (0,33 М Трис-ацетат, рН 7,9, 0,66 М ацетат калия, 0,1 М ацетат магния и 10 мМ дитиотрейтол) 300 нг фрагмента кДНК и 3 единицам Т4 ДНК Полимеразы (Нью Инглэнд Биолабс) и разбавляют водой до 10 мкл. После инкубирования 5-10 минут при 37°С эту смесь объединяют с 1 мкл 10 х Т4 ДНК-полимеразного буфера; 1 мкл 2 мМ раствора каждого из dCTP, dTTP, dGTP; 10 мкл 32PdATP (10 mСі) мкл; 3000 Сі /ммоль/ и 3 единицами Тr ДНК-полимеразы. Реакционную смесь инкубируют в течение 20 минут при 37 oС. Затем прибавляют 1 мкл 2 мМ dATP и реакционную смесь инкубируют е ще дополнительные 10 минут при 37oС. Отделяют не включенные трифосфаты от меченной кДНК хроматографией на колонке с Сефадексом G100. Готовят вто рой зонд из синтетического олигонуклеотида, имеющего последовательность: АТС TGG CTG С АС AG, которая комплементарна аминоконцу области, кодирующей GM-CSF. Это т олигонуклеотид мечен по 32P dATP на его 5'-конце с использованием полинуклеотидкиназной реакции. Стадия 8. Изолирование клонов GM-CSF кДНК. В стандартной процедуре скрининга гибридизацией с Т4 меченной pCSF-1 кДНК связывалось 45 клонов. Из них приблизительно 20 также гибридизовалось с меченым олигонуклеотидным зондом. Кодирующую область одного из них секвенировали и данные показали некоторое число замен, часть из которых имеет следствием замену аминокислот в экспрессированном белке. Эти различия представлены на фиг. 1 выше последовательности ДНК для ге на человеческого GM-CSF, клонированного в примере А. Пример С. Клонирование GM-CSF из мРНК лимфо цита периферического кровотока. Стадия 1. Получе ние мРНК из лимфо цитов периферического кровотока. Лимфоциты периферического кровотока были получены из четырех побочных продуктов плазмафореза (получены от Ред Кромм) при фракционировании в градиенте Фиколл-Гипак. Малая плотность в RPM1 1640 в присутствии 5% фетальной сыворотки зародыша теленка, 0,17% фитогеммаглютинина и 10 нг/мл форбал миристат ацетата (РМА) при плотности 2·106 клеток/мл (всего получе но 6·109 клеток). Клетки собирают центрифугированием (1000 об/мин, 5 минут), один раз промывают фосфатно-солевым буфером (PBS) и снова собирают центрифуги рованием. Готовят цитоплазматическую РНК при осторожном лизисе, для которого клетки снова суспендируют в 50 мл холодного тритонового буфе ра для лизиса (140 мМ NaСl, 1,5 мМ МgСl2, 10 мМ Трис, рН 8,6, 0,5% Тритон Х-100) с 10 мМ ди тиотрейтолом (ДТТ) и 50 единицами/мл РНК sin (получе на от Биотек). Этот ли зат делят на 2 равные части и каждую часть наслаивают на 10 мл подушки из лизисного буфера, содержащего 20% сахарозы. Отделяют ядра клеток центрифугированием на хо лоде (4°С, 400 об/мин в течение 5 минут). Осторожно сливают вер хний слой (цитоплазматический экстракт) и прибавляют к нему до децилсульфат натрия (СДС) до конечной концентрации 1%. Этот раствор дважды экстрагируют равным объемом фенола/хлороформа (смесь 1:1) и осаждают РНК добавлением 2,5 объемов этанола. Осажденную РНК со бирают центрифугированием (15 минут при 4000 об/мин) и снова суспендируют в 0,01 М Трис, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 0,25 М NaCl (ТЕ буфер плюс 0,25 М NaCl) и снова осаждают добавлением 2,5 объемов хо лодного этанола. Наконец собирают РНК центрифугированием и снова суспендируют в 5 мл воды. Конечный выход 7,5 мг. Изолируют матричную РНК из всей цитоплазматической РНК селекцией на олиго-dТ-целлюлозе. Нагревают 2,5 мг общей РНК до 65oС в течение 5 минут. Прибавляют NaCl до 0,5 М и дают РНК остыть до комнатной температуры. Эту РНК пропускают через колонку с 1 мл олиго-dТ-целлюлозы, уравновешенную в ТЕ + 0,5 М NaCl (связующий буфер). Удаляют несвязанную РНК экстенсивным промыванием колонки связующим буфером. Связанную матричную РНК элюируют 3 мл воды и осаждают добавлением 0,2 мл 4 М NaCl и 2,5 объемов холодного этанола. Осажденную мРНК собирают центрифугированием (30 минут при 25000 об/мин). Конечный осадок (приблизительно 100 мгк) повторно суспендируют в 50 мкл воды. Стадия 2. Получе ние однонитевой кДНК. Разбавляют 20 мкг мРНК в 50 мкл реакции синтеза кДНК, содержащей 100 мМ Трис, рН 8,4, 140 мМ КСl, 10 мМ МgСl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 400 мкМ каждого из dATP, dGTP, dCTP и dTTP, 5 мкг олиго-dT (средний размер 12-18) в качестве праймера, 25 mCi 32PdCTP (400 mCi/ммоль) и 20 единиц ингибитора рибонуклеази РНК sin. Реакцию инициируют добавлением 60 единиц обратной транскриптазы при 37oС и инкубируют 30 минут при 42oС. Реакцию останавливают до бавлением ЭДТА до 40 мМ и экстрагируют равным объемом насыщенного водой фенола. Фенольную фа зу снова экстрагируют 50 мкл ТЕ буфера. Водные фазы объединяют. Отделяют гибриды кДНК/РНК от непрореагировавши х трифосфатов, пропуская объединенные водные фазы через колонку с 5 мл Сефарозы CL-4B (получе на от Сигмы), уравновешенную ТЕ. Фракции, которые собирают с колонки, объединяют, доводят до 250 мМ NaCI и осаждают н уклеиновые кислоты добавлением 2,5 объемов холодного этанола. Гибриды собирают центрифуги рованием в течение 30 минут при 40000 об/мин. Конечный осадок (2,5 мкг кДНК) снова суспендируют в 50 мкл воды. Стадия 3. Получе ние двунитевой кДНК. Синтезируют двунитевую кДНК при совместном действии фер ментов ДНК по лимеразы 1 Е.coli, ДНК лигазы Е.coli и РНКазы Н Е.coli. Реакционная смесь (50 мкл) содержит 20 мМ Трис, рН 8,0, 4 мМ МgСІ2, 1,2 мМ ЭДТА, 25 mМ Н АД, 100 mМ каждого из dАТР, dGTP, dCTP и dTTP, и 50 mСі 32PdCTP (3000 Сі/ммоль). Проводят реакцию при добавлении 3 единиц ДНК полимеразы 1, 0,5 единиц ДНК лигазы и 0,75 единиц РНКазы Н и инкубировании при 16 oС в течение 18 часов, затем 1 час при 37oС, а затем останавливают добавлением ЭДТА до 40 мМ и экстрагируют равным объемом фенола. Фенольную фазу снова экстрагируют 50 мкл ТЕ, объединяют водные фазы и отделяют кДНК от непрореагировавши х трифосфатов хроматографией на колонке с Сефарозой CL-4B, как описано выше для однонитевой кДНК. Основываясь на включенном 32P, однонитевая кДНК количественно превращается в двунитевую форму. Стадия 4. Получе ние рекомбинантной кДНК. Прибавляют гомополимерные С "хвосты" к концам кДНК при осто рожном нагревании 400 нг кДНК в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ CaCl2 и 9 единиц концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы, при 30oС в течение 5 минут. Реакцию прекращают добавлением ЭДТА до 40 мМ и нагревают до 68oС в течение 10 минут. Отжигают 200 нг этой кДНК с 500 нг G-удлиненной рАТ153 (получе на от Амершм) в 100 мкл 10 мМ Трис, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА и 100 мМ NaCl. Реакцию отжига проводят при 57°С в течение 2 часов после 3 минут предварительной инкубации при 68°С. Стадия 5. Трансформация бакте рий. Продукт реакции отжига кДНК используют непосредственно для трансформации штамма Е.coli MC1061. Используют све жую колонию бактериальных клеток для инокуляции 50 мл L-бульона и выращивают несколько часов до тех пор, пока оптическая плотность при 550 нм не достигнет 0,25. Клетки замораживают на льду и собирают центрифуги рованием (2000 об/мин в течение 10 минут). Осадок повторно суспендируют в 10 мл холодного 0,1 М СаСl2 и оставляют на льду на 10 минут. Клетки собирают центрифугированием (2000 об/мин в течение 5 мин) и повторно суспендируют в 2,5 мл 0,1 М СаСl2. Затем 10 мкл реакционной смеси отжига кДНК инкубируют с 200 мкл обработанных СаСl2 бактерий в течение 30 минут на льду, а затем 2 минуты при 37 oС, затем добавляют 0,8 мл L-бульона и наконец инкубируют 30 минут при 37oС. Осуществляют 20 из этих трансфор маций, используя всю подготовленную кДНК. Каждую трансформированную смесь наливают на пластины с 1% агаром в L-бульоне (15 см диаметр), содержащие 10 мкг/мл тетрациклина. Из 20 трансфор маций все 20 таких пластин были залиты и инкубированы всю ночь при 37oС. В среднем приблизительно 1500 бактериальных колоний выросло на каждой пластине, всего 30000 клонов. Стадия 6. Посев реплик. Первоначальные колонии, выросшие на каждой пластине, переносят на 137 мм нитроцеллюлозные фильтры прижиманием сухого фильтра к верхушкам колоний и снятием их с пласти ны. Готовят две идентичные реплики для каждого исходного фильтра по стандартной методике посева реплик, в которой каждый оригинальный фильтр осторожно помещают сбоку колонии на стерильный квадрат фильтровальной бумаги (Ватман 3 MM), оставляя на квадратном кусочке стекла. Новый предварительно увлажненный нитроцеллюлозный фильтр осторожно накладывают поверх основного фильтра, покрывают вто рым стерильным квадратом фильтровальной бумаги и полный сэндвич затем зажимают вместе с первым и вторым куском стекла. Нумеруют сэндвичные фильтры и через них асимметрично пробивают 3 отверстия малого диаметра, что бы можно было точно выровнять в будущем. Затем удаляют реплики с основы и помещают колонии сбоку на новые пластины с агаризованным L-бульоном, содержащие тетрациклин. Немедленно готовят вто рую реплику идентичным образом. Каждый основной фильтр возвращают на пластину и все пластины инкубируют при 37oС в течение нескольких часов до тех пор, пока бактериальные колонии не достигнут примерно 1 мм в диаметре. Основные исходные фильтры хранят при 4°С и готовят реплики для гибридизации, как описано ниже. Стадия 7. Приготовление фильтров для гибридизации. Каждый фильтр-реплику (стадия 6) помещают сбоку колонии на фильтровальную бумагу (Ватман 3 MM), смоченную в 0,5 М NaOH, 1,5 М NaCl в течение нескольких минут. Фильтры переносят для нейтрализации на фильтровальную бумагу, смоченную в 1 М Трис, рН 7,5, 1,5 М NaCl, в течение 2 минут, а затем переносят на вторую груп пу фильтров для нейтрализации в течение 5-10 минут. Наконец фильтры по мещают на фильтры, смоченные SSC-буфером (0,015 М цитрат натрия, 0,15 М NaCl, рН 7,4) в те чение 5 минут, сушат на воздухе и прогревают в вакууме при 80°С в течение 1-2 часов. Стадия 8. Изолирование клонов GM-CSF кДНК. Дубликатные фильтры зондируют с радиоактивно меченной вставкой кДНК в CSF-1, приготовленной, как описано выше в примере В. С кДНК гибридизовалось 20 колоний. Пересаживают 12 из них с основного фильтра и выращивают всю ночь в L-бульоне для дальнейшего анализа. Рестрикционным ферментом (Pst 1) расщепляли образцы ДНК (быстрый преп) из этих клонов, с получением 3 близких к полной длине фрагментов. Один из них был секвенирован. Последовательность области, кодирующей GM-CSF, этого клона идентична соответствующей последовательности pCSF-1 (а именно, имеет Т в по ложении 365-CSF/Ile/). Пример Д Очистка GM-CSF из линии Мо клеток. Инкубируют отработанную кондиционированную Мо среду, не содержащую сыворотки (40 л), при 55°С в течение 30 минут для инакти вации HTLV-11 вируса, ассоциированного с клеточной линией. Эту среду концентрируют ультрафильтрацией по давлениям, используя Pellicon Cassete с мембраной PTGC (1,5 кв. фута), которая отделяет молекулярную массу 10000. Затем белок концентрируют осаждением сульфатом аммония (80% насыще ния). Повторно суспендируют конечный осадок белка (800 мг) в 100 мл 20 мМ трис (оксиметил) аминометан-гидрохлорида (Трис-НСl), рН 7,4, и диализуют против то го же самого буфера (3 раза с 4 л загрузки каждый раз). Диализованный белок наносят на колонку 2,5 х 10 см с ДЕАЕ /диэтиламиноэтил/-ультрагелем, уравновешенным тем же буфером. Колонку промывают 800 мл 20 мМ Трис-НСl, рН 7,4, затем элюируют активность GM-CSF 800 мл 20 мМ Трис-НСl, рН 7,4, содержащего 0,12 М NaCl. Собирают фракции 10 мл и проверяют на GM-CSF. Объединяют активные фракции (3) и концентрируют в 6 раз (до 5 мл) ультрафильтрацией под давлением (мембрана Амикон УМ5, отделяющая молекулярную массу 5000). Концентрированный образец из ДЕАЕ колонки наносят на колонку 1,6 х 100 см с АсА44 ультрагелем /акриламид-агарозный ультрагель, обеспечивающий фракционирование от 10 до 130 килодальтон/, уравновешенным 20 мМ N-2-оксиэтилпиперазин-N-2-этансульфо новой кислотой (HEPES), рН 7,4, 50 мМ NaCl и 0,01% полиэтиленгликоль (ПЭГ-8000). Активность GM-CSF элюируют с колонки с кажущей ся молекулярной массой 30 килодальтон. Объединяют активные фракции и доводят 10%-ной ТФУК до получе ния ее конечной концентрации 0,15,% (объем/объем) и наносят на колонку 1 х 25 см с Видак С4 с обращенной фазой. Колонку обрабатывают линейным градиентом 0-90% ацетонитрила в 0,1% ТФУК (объем/объем) при скорости 4 мл/мин (всего 1000 мл). Активность GM-CSF элюируется приблизительно при 47% (объем/объем) ацетонитрила. Объединенные активные фракции доводят 0,15%-ной гептафтормасляной кислотой (ГФМК) до получе ния концентрации последней 0,05% и наносят на колонку (0,46 х 25 см) с Видак С4, уравновешенной 0,15%-ной (объем/объем) ГФМК. Колонку обрабатывают линейным градиентом 0-90% (объем/объем) ацетонитрила в 0,15% (объем/объем) ГФМК при скорости 1 мл/мин. (Всего 340 мл). Активность GM-CSF элюируется примерно при 53% (объем/объем) ацетонитрила. Было найдено, что активными являются фракции 37-44 (1 мл каждая). Концентрируют 0,15 мл фракции 40 в 4 раза (используя САВАНТ Спид Вак Концентратор) и прибавляют 40 мкл 2 х буфера для СДС-фореза (0,125 М Трис-НСl, рН 6,8, 4% СДС, 20% глицерина и 0,004% бромфе нолового го лубого). Эти образцы кипятят 2 минуты и на носят на 13,5% СДС-гель (Лэммли, и. Nature 227, 680 (1970) (см. фиг. 2) . Было определено, что фракция 40 имеет в 1 мл 110000 единиц активности GM-CSF, определяемой на костном мозге. Это соответствует примерно 3,0·107 единиц на единицу поглощения при 280 нм. Поскольку ти пичные белки имеют коэффи циенты экстинкции А280 в ин тервале между 0,8 и 1,2 еди-ниц/мг, очищенный GM-CSF имеет удельную активность в интервале от примерно 1·107 до примерно 4·107 единиц/мг в пробе с костным мозгом. 1 мкг образца очищенного GM-CSF подвергают разложению по Эдману, используя газофазный микросеквенатор нанесенных биосистем. Была определена последовательность остатков 3-5, являющаяся Ala Arg Ser. Пример Е. Котрансформация и амплификация последовательности GM-CSF в СНО клетках. Плазмиду p91023/B/-CSF вводят в ДГФР-дефицитные клетки CHO DUKХ-B11 (Chasin and Urlaub PNAS 77: 4216, 1980) путем слияния протопластов, как описано (Sandri-Goldin et al., Моl. Cell. Bio. 1, 743752, 1981). Рост и поддержание CHO клеток описаны (Кауфман и Шарп, J. Моl. Bio 150, 501-621 (1981). Для слияния протопластов вво дят p91023/B/-CSF-1 в Е.coli HB101 и выращивают бактерии в 50 мл м9 солей, содержащих 0,5% казаминовых кислот, 0,4% глюкозы, 0,012% MgSO4, 5 мкг/мл тиамина, и 10 мкг/мл тетрациклина, до поглощения 0,6 при 600 нм. Добавляют хло рамфе никол до 250 мкг/мл и инкубируют куль туру при 37oС дополнительно 16 часов для то го, что бы амплифицировать число копий плазмиды. Клетки центрифугируют при 3000 g в течение 10 минут при 4 oС и суспендируют в 2,5 мл охлажденной 20% сахаро зы в 50 мМ Трис-НСl, рН 8,0. Прибавляют лизоцим (0,5 мл 5 мг/мл раствора в 0,25 М Трис-НСl, рН 8,0) и смесь выдерживают на льду в те чение 5 минут. Прибавляют ЭДТА (1 мл 0,025 М ЭДТА, рН 8,0) и выдерживают на льду еще 5 минут, за тем медленно прибавляют 1,0 мл 0,05 М Трис-НСl, рН 8,0. Инкубируют суспензию в течение 15 минут при 37oС до те х пор, пока бактерии не превратятся в протопласты. За тем суспензию медленно разбавляют 20 мл предварительно подогретой среды, содержащей 10% сахарозы и 10 мМ MgCl2, и выдерживают 15 минут при 37oС. Раствор протопластов (приблизительно 109/мл) прибавляют к ДГФР дефицитным CHO ДUKХ-B11 клеткам в пластине с 6 углублениями (приблизительно 1 · 106 клеток/углубление) при соотношении примерно 1-2 · 104 протопластов) клетку, и протопласты осаждают на клетки при центрифуги ровании при 2000 об/мин в течение 8 минут в дисковом роторе вращающегося микротитратора центрифуги 1ЕС Мо дель К. После центрифуги рования удаляют надосадочный слой отсасыванием. Прибавляют 2 мл раствора полиэтиленгликоля 50 г РЕО-1450 (Baker Chem Со.) в 50 мл среды в каждое углуб ление пластины с 6 углублениями. Клетки снова центрифуги руют при 2000 об/мин в течение 90 секунд, удаляют раствор полиэтиленгликоля и пластины три раза промывают 4 мл среды/углубление. Затем клетки трипсинизируют, суспендируют в 10 мл среды, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, и центрифуги руют в конической пробирке при 500 об/мин в клинической центрифуге. Осадки клеток из 3 углублений объединяют и высевают в чашку 10 см для культуры ткани. К каждой пластине добавляют све жую среду, содержащую 100 мкг/мл канамицина, тимидина, аденоксина, дезоксиаденозина, пенициллина, стрептомицина и 10% диализованной фетальной сыворотки. Канамицин вводят для предотвращения роста любых бактерий, которые имеют способность превращать ся в протопласты. Через 2 дня клетки подкультивируют 1:15 в альфа-среде с 10% диализованной сыворотки теленка, пенициллином и стрептомицином, но без нуклеозидов. Затем клетки снова помещают в ту же самую селективную среду (ли шенную н уклеозидов) через 4-5 дней. Колонии появляются через 10-12 дней после субкульти вирования в селективной среде. Следовали двум схе мам отбора на метотрексате (МТХ) и амплификации. В первой схе ме изолируют единые независимо клонированные трансформанты на основе экспрессии ДГФР и выращивают последовательно каждый клон в условиях для амплификации числа копий вышеуказанной ДНК, а именно при увеличивающейся концентрации метотрексата. По второй схеме изолируют пул из множественных независимых трансформантов на основе ДГФР экспрессии и размножают вместе в условиях амплификации указанной выше ДНК, а именно при повышающи хся концентрациях метотрексата. Затем изолируют индивидуальные клоны из массы отобранной популяции и анализируют на экспрессию GM-CSF. Эти клоны, показывающие самые высокие уровни экспрессии, снова выращивают в условиях дальнейшей амплификации вышеуказанной ДНК (а именно рост в условиях повышающейся концентрации метотрексата в к ультуральной среде). В одном эксперименте семь ДГФР+ трансформантов объединяют в альфа-среду, ли шенную нуклеозидов. Эти клетки последовательно выращивают при постепенном увеличении концентраций МТХ, начиная с 0,02 М затем 0,1, 0,5 и 2,0 mМ МТХ. При анализе на активность GM-CSF в KG-1 пробе эти клетки продуцируют от 3000 до 12000 единиц/мл. Отобранную популяцию клонируют при 0,5 mМ.МТХ и в 2,0 mМ.МТХ. Клоны, получен ные в 0,5 mМ.МТХ (010, Д2 и В6) последовательно отбирают для роста в 2,0 mМ.МТХ. При испытании на активность GM-CSF в пробе на KG-1 клетках, клонированные клеточные линии продуци руют от 15000 до 300000 единиц/мл активности GM-CSF. GM-CSF, продуцированный согласно этому примеру, имеет аминокислотную последовательность, приведенную для GM-CSF-Thr на фиг. 1. Пример F. Экспрессия GM-CSF в Е.coli. GM-CSF экспрессируется в Е.coli из вектора pTALC-185R, схематическое описание которого приведено на фиг. 6. Последовательность, коди-рующая GM-CSF, начинается с синте тической последовательности ATG.ССА.ССА.ССТ.ССТ.ТСТ.ССА. ТСТ.С СА.ТСТ.ACT, которая определяет начальные 11 аминокислотных остатков зрелого GM-CSF. Остальная последовательность, кодирующая GM-CSF, в pTALC-185R является идентичной последовательности pCSF-1, после нуклеотидов 97-447 идет последовательность TAR.TAR.TAG. Сразу после триплетного терминатора имеется pUM-18 полилинкер. Ген резистентности к тетрациклину из рВР322 был вставлен в противоположной ориентации к гену GM-CSF, че рез 100 оснований вниз от pUC-18 полилинкера. Ген резистентности к тетрациклину несет свой собственный промотор. Далее в направлении против часовой стрелки имеется следующий ген для (b-лактамазы вслед за pUC-18 (CoLE1) источником репликации. Последним структур ным признаком плазмиды перед возвращением к последовательностям GM-CSF является PL промотор. Этот промотор по существу описан А. Скатцманом и М. Ро зенбергом (в "Лабораторном руководстве по молекулярному клонированию" (1982), Колд Спринг Харбор Лаборатори, с. 419). Экспрессия GM-CSF обеспечивается PL промотором после термической индукции в подхо дящем штамме-хозяине Е.coli. Родительский штамм, используемый для конструирования всех штаммов, представляет собой W 3110 laclоL8 (В. Brent and M. Ptashne PNAS 78 (1981) 4204-4208). Фрагмент ДНК ( нуклеотиды 34499 - 38214) интегрируют в хромосому W 3110 laclоL8 у lacZ локуса. Интеграцию осуществляют с использованием векто ра интеграции, состоящего из рВР325 последовательностей, несущи х гены для резистентности к хлорамфе николу и амипициллину, а также рВР322 источника репликации. (F. Bolivar, Gene; 4: (1978), с.121-136). Вставляют lДНК фрагмент в lacZ ген, который сам находится в плазмиде в качестве фрагмента, простирающего ся от сайта Bst Eil в Laсl до сайта Tthi11I вниз от lacZ. Интеграция lДНК в хромосомную копию lacZ достигается гомологической рекомбинацией и определяется как lac+, чувствительные к ампициллину, резистентные к хлорамфениколу колонии. Второй случай рекомбинации приводит к удалению всех экстра-плазмидных последовательностей и к тому, что интегрированный lДНК фрагмент скринируется на лактозных пластинах МакКонки. Во вто ром случае рекомбинации исходный lac+, ampS, cam P фе нотип изменяется на lac-, ampS, cam S фенотип. Получен ный в результате штамм назван GL 400 и является lp при 30oС и ls при 42oС. Этот фе нотип демонстрирует существование функциональной хромосомной копии Сl857 аллеля. GL 400 дает lon- при PL трансдукции из лизата, вы росшего на штамме SG20252 (lac Du169, ага 139 rpsl lоnD 100, Thr10). Thr10 заготавливают скринированием на TetS на селективной среде. /S. Maloy, W. Nunn, J. Bacterial 145 (1981) 1110-1112/. Готовый штамм-хозяин называется G1413 (lacloL8, Lac Z D (lС1, REX, N), lоnD 100). pTALC-185 R трансформируют в G1413. Культуру этого штамма выращивают всю ночь при 30oС в 5 мл индук ционной среды, со держащей 7 мкг/мл тетрациклина. Индукционная среда содержит, на 1 л: 20 г казамниновых кислот, 6г Na2HPO4 x x 7 H2O 3г КН2РO4 0,5 г NaCl 1г NH4Cl 1% глицерина 2 мг витамина B1 2 мг СаСl2 · 2Н2O 0,2 г МgСl2 · 6Н2 О Инокулируют 25 мл этой сре ды, содер жащей 7 мкг/мл тетрациклина, 125 мкл ночной куль туры и встряхивают при 30oС на во дяной бане до те х пор, по ка культура не дости гнет плотности 0,5 при A550). Затем быстро перехо дят на 40o водяную баню и встряхи вают е ще 2 часа, что бы дать возможность пройти син те зу GM-CSF. Со бирают урожай клеток и про веряют и х на со держание GM-CSF элек трофоре зом на СДС-полиакриламидном геле. В эти х условия х GM-CSF соста вляет приблизитель но до 5% от кле точного бе лка. Пример G. Экспрессия GM-CSF в Saccharomyces Cerevisiae. А. Вектор конструирования. Конструируют плазмиду, которая содержит ген фер мента биосинтеза урацила (URA3) в качестве гена селекции и 2 источника репликации. Эта плазмида происхо дит из У1р5 (Bot-stein et al., Gene, 8, с.с. 17-24 (1979)) с добавлением фрагмента, содержащего источник репликации из 2m плазмиды дрожжей. В. Изоляция гена для глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (GPDH). Изолировали из дрожжей два гена для GPDH (Holland and Holland Journal of Biological Chemistry 255, с. с. 2596-2605 (1980)). Олигонуклеотидный зонд, синтезированный на основании известной последовательности, используют для изоляции GPDH гена из плазмидной библиотеки дрожжевой геномной ДНК по стандартным методикам. Плазмида, содержащая целый GAP491 ген, была депонирована ранее (АТСС № 39777). С. Получе ние промотора глицеральдегид фосфат де гидрогеназы для экспрессии гетерологического гена. Конструируют плазмиду, которая имеет природное расположение GPDH промотора по отношению к началу целевого гетерологического структур ного гена. Это осуществляется при введении Крп 1 сайта в непосредственной близости к инициирующему метиониновому кодону GPDH структур ного гена. Затем вставляют промотор "cassette" в дрожжевой вектор экспрессии УOр1. Д. Изоляция гена для a-факто ра. Из дрожжей изолировали ген для фактора зрелого феромона (Kurjan and Herskowitz Cell, Vol. 30, с.с. 933-943 (1982)). Олигонуклеотидный зонд, синтезированный из этой последовательности, используют для изоляции гена из плазмидной библиотеки дрожжевой геномной ДНК по стандартным методикам. Е. Получе ние плазмиды экспрессии GM-CSF. Конструируют по стандартным методикам из описанных вы ше элементов и ге на человеческого GMCSF вектор экспрессии (AJ14, рис. 7). В этом векто ре удалили природную лидерную последовательность GM-CSF и вставили последовательность, кодирующую зрелый GM-CSF, вблизи пре-про последовательности фактора. Соединения между GPDH промотором, пре-про последовательностью фактора и последовательностью зрелого GM-CSF уточнены (ниже) и были подтверждены дезоксинуклеотидным секвенированием. AAATAAAC AAAATG.CGTTTTCCTTC A...ААА AGA GAG GCG GAA GCT.GCA CCC GCC CGC TCG ... F. Экспрессия GM-CSF. Плазмиду А 14 трансформируют в штамм Saccharomyces Cerevisiae. Культивируют клетки для продуци рования GM-CSF. Мы вы деляем в нашем изобретении следующие моменты. Фиг. 1 Фиг. 2 Фиг. 3 Фиг. 4 Фиг. 5 Фиг. 6 Фиг. 7 Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 – 72 – 89 (03122) 2 – 57 – 03