Рекомбінантний, очищений, модифікований генноінженерно білок, продукований бактеріями е.coli, імітуючий коровий білок вірусу імунодефіциту людини першого типу ( gag віл-1)

Аналогом рекомбінантного білка є структурні корові білки віруса имунодефіциту людини першого типу p17, p24 і p15, загальною молекулярною масою 70370Д. (L. Rathner, W. Haseltine. R. Patarca et al. Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III // Nature, 1985, v.313, p.277 - 284). Прототипами винаходу є білки ВІЛ, які продукуються E.Coli під контролем плазмидних векторів. (Л.Л. Суханова, В.А. Гольцов, А.Ю. Звонарев и др. Синтез антигенно активных полипептидов вируса СПИД человека типа 1 в бактериальной клетке // Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии / Под ред. Ф.В. Семенова. - Тарту, 1989. - Т.1. - С.113 - 119). (Y.V.J. Kolbe, F. Jaeger, P. Lepage et al. Isolation of recombinant partial GAG gene product p-18 (HlV-1) from E. coli // J. Chromatography, 1989, p.99 - 112). В основу винаходу покладено завдання створити генно-інженерними методами злитний білок GAG-1, який би мав основні імунодомінантні епітопи притаманні нативним білкам p17, p24 і p15 ВІЛ-1 і був придатний для використання в ІФА тест-системах, які виявляють антитіла до вірусу імунодефіциту людини. Суть винаходу полягає в одержанні в E.Coli, під контролем плазмідного експресуючого вектора pSN1724 злитного рекомбінантного білка загальною формулою N-бета-Gal-p17-p24-p15-COOH, який має основні імунодомІнантнІ епітопи притаманні нативним білкам p17, p24 і p15 ВІЛ-1. Плазмидний вектор pSN1724 розміром 5,3т.п.н., має маркер ампіцилін-резістентності і, після трансформування в E.Coli (штам pop 2136), під контролем промотора фага лямбда Pr, забезпечує конститутивний синтез несекретуємого білка, який нагромаджується в цитоплазмі клітин бактерій в пізній логарифмічній, або ранній стаціонарній фазі росту культури. Культивування бактерій проводять при 32 - 39 градусах на середі LB з добавкою ампіциліна (50мкг/мл) на протязі 6 - 8 годин. Після закінчення культивування клітини осаджують центрифугуванням при 8000об/хв. 10 хвилин при 4 градусах, надосадову рідину одкидають, а осад суспендують в TE розчині (0,01М Тріс-HCI, pH 8,0, ЕДТА 0,001М). Суспензію клітин руйнують лізоцимом, ультразвуком, обробляють ДНКазою до зникнення в'язкості розчину, перемішують в емульгаторі 5 хвилин і центрифугують при 12000об/хв. 30 хвилин. Останні дві операції проводять ще 5 раз, кожен раз ресуспендуючи осад в розчині TE. Осад, який являє собою "тільця включення" розчиняють в воді, додають Тріс-HCl до 20мМ, pH 8,01 сечовину до 8 М і інкубують ніч при 4 градуса х для р уйнування "тілець включення" і вилучення з них розчиненого білка GAG-1. Подальшу очистку білка проводять сорбуючи його на SP-целюлозі і елюючи його підвищеними концентраціями NaCl. Кінцевий цільовий продукт являє собою очищений, злитний рекомбінантний білок молекулярною масою 70376Д, який виявляється однією мажорною смугою при електрофорезі в поліакриламідному гелі і в імуноблоті з сироваткою ВІЛ інфікованого пацієнта, містить в собі 623 амінокислотних залишків, які відповідають нуклеотідним послідовностям cro-laci-lacZ-p17-p24-p15. Амінокислотна послідовність рекомбінантного білка pGAG ВІЛ-1, 623 амінокислоти. Молекулярна маса рекомбінантного білка 70376Д. Ізоелектрична точка рекомбінантного білка PI = 8,54.