Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продукований бактеріями е.coli, імітуючий білок оболонки вірусу імунодефіциту людини першого типу (env biл-1)

Винахід відноситься до розділу генної інженерії і може бути використаним в біотехнології і медицині для конструювання тест-систем і наукової праці. Аналогом рекомбінантного білка є структурні білки оболонки віруса имунодефіциту людини першого типу. (L. Rathner, W. Haseltine, R. Patarca et al. Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III // Nature, 1985, v.313, p.277 - 284). Прототипами винаходу є білки ВІЛ, які продукуються E.Coli під контролем плазмідних векторів. (Л.Л. Суханова, В.А. Гольцов, А.Ю. Звонарев и др. Синтез антигенно активных полипептидов вируса СПИД человека типа 1 в бактериальной клетке. // Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии / Под ред. Ф.В. Семенова. - Тарту, 1989. - Т.1. - С.113 - 119). Y.V.J. Kolbe, F. Jaeger, P. Lepage et al Isolatlon of recombinant partial GAG gene product p-18 (HlV-1) from E. Coli // J. Chromatography, 1989, p.99 - 112). В основу винаходу покладено завдання створити генно-інженерними методами злитний білок Env-1, який би мав основні імунодомінантні епітопи притаманні нативним білкам gp120, gp41 ВІЛ-1 і був придатним для використання в ІФА тест-системах, які виявляють антитіла до віруса імунодефіциту людини. Суть винаходу полягає в одержанні під контролем плазмідного експресуючого вектора pK41 злитного рекомбінантного білка N-бета-Gal-p120-p41-COOH, який має основні імунодомінантні епітопи притаманні нативним білкам gp120 і gp41 ВІЛ-1. Плазмідний вектор p41 розміром 4,9т.п.н., має маркер ампіцилін-резістентності і, після трансформування в E.Coli (штам Y1090), під контролем промотора фага лямбда Pr, забезпечує конститутивний синтез несекретуємого білка, який нагромаджується в цитоплазмі клітин бактерій в пізній логарифмічній, або ранній стаціонарній фазі росту культури. Культивування бактерій проводять при 32 - 39 градусах на середі LB з добавкою ампіциліна (50мкг/мл) на протязі 6 - 8 годин. Після закінчення культивування клітини осаджують центрифугуванням при 8000об/хв. 10 хвилин при 4 градусах, надосадову рідину відкидають, а осад суспендують в TE розчині (0,01М Тріс-HCl pH 8,0, ЕДТА 0,001М). Суспензію клітин руйнують лізоцимом, ультразвуком, обробляють ДНКазою до зникнення в'язкості розчину, перемішують в емульгаторі 5 хвилин і центрифугують при 12000об/хв. 30 хвилин. Останні дві операції проводять ще 5 раз, кожен раз, кожен раз ресуспендуючи осад в розчині TE. Осад, який являє собою "тільця включення" розчиняють в воді, додають Tpіc-HCl до 20мМ, pH 8,01 сечовину до 8 М і інкубують ніч при 4 градуса х для р уйнування "тілець включення" і вилучення з них розчиненого білка Env-1. Подальшу очистк у білка проводять сорбуючи його на ДЕАЕ-целюлозі і елюючи його підвищеними концентраціями NaCl. Кінцевий цільовий продукт являє собою очищений, злитний рекомбінантний білок молекулярною масою 65443Д, який виявляється однією мажорною смугою при електрофорезі в поліакриламідному гелі і в імуноблоті з сироваткою ВІЛ інфікованого пацієнта, містить в собі 531 амінокислотних залишка, ізоелектричну точку 9,38 і відповідає загальній формулі N-бета-Gal-p120-p41-COOH. (див. фіг.1). Амінокислотна послідовність рекомбінантного білка pEnv-1 ВІЛ-1, 531 амінокислота. Молекулярна маса рекомбінантного білка 65443Д. Ізоелектрична точка рекомбінантного білка PI = 9,38.