Є ще 15 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб виділення ферменту, який каталізує перетворення альдоксиму на нітрил і перетворення цього нітрилу на відповідний ціангідрин, який включає:

(а) виділення і солюбізацію мікросом з рослинної тканини, яка продукує ціаногенні глікозиди,

(б) направлення солюбілізованих мікросом у колонку, яка заповнена ДЕАЕ-сефарозою, промивання колонки і збір прогону та промивних фракцій,

(в) ідентифікацію фракцій, які містять фермент,

(г) додавання Triton X-114 до фракцій, отриманих на етапі (в) і центрифугування до утворення двох фаз, де нижня фаза містить фермент.

2. Фермент цитохром Р450II-монооксигеназа, який каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення цього нітрилу на відповідний ціангідрин, який має молекулярну масу 55 кДа, що встановлено за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE), та N-кінцеву послідовність, наведену в SEQ ID NO: 3, і отриманий з використанням способу за п. 1.

3. Фермент за п. 2, який відрізняється тим, що має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 2.

4. Молекула ДНК, яка кодує фермент за пунктом 2 або 3.

5. Молекула ДНК за п. 4, яка відрізняється тим, що вона кодує фермент рослини, вибраної з групи, яка включає види Sorghum, Trifoiium, Linum, Taxus, Triglochin, Mannihot, Amygdalus, Prunus та хрестоцвіті рослини.

6. Молекула ДНК за п. 4, яка відрізняється тим, що кодує (цитохром Р450ох) монооксигеназу рослини Sorghum bicolor.

7. Спосіб виділення молекули кДНК, яка кодує фермент, який каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення цього нітрилу на відповідний ціангідрин, який включає:

(а) виділення ферменту з використанням способу за п. 1,

(б) необов'язково визначення повної або часткової амінокислотної послідовності ферменту, отриманого на етапі (а), та конструювання олігонуклеотидів,

(в) зондування бібліотеки кДНК рослинної тканини, яка продукує ціаногенні глікозиди за допомогою вироблених до ферменту антитіл або олігонуклеотидів, специфічних для ДНК, яка кодує 4-15 амінокислот вказаної послідовності ферменту, і

(г) виділення клонів з кДНК бібліотеки,

де ці клони включають молекулу кДНК, яка кодує фермент, який каталізує перетворення альдоксиму на нітрил і перетворення цього нітрилу на відповідний ціангідрин.

8. Спосіб отримання трансгенної рослини, яка включає стабільно інтегровану в її геном ДНК, яка кодує фермент, який каталізує перетворення альдоксиму на нітрил і перетвореня цього нітрилу на відповідний ціангідрин, що включає:

(а) введення у рослинну клітину або тканину, яка може бути регенерована до цілої рослини, ДНК, що включає ген, який експресується у цій рослині, який кодує монооксигеназу за будь-яким з пп. 2-3, або молекули ДНК за будь-яким з пп. 4-6, і

(б) відбір трансгенних рослин, які містять вказані ДНК.

9. Спосіб отримання трансгенної рослини, яка виявляє знижену експресію ферменту, який каталізує перетворення альдоксиму на нітрил і перетворення цього нітрилу на відповідний ціангідрин, який включає:

(а) введення у рослинну клітину або тканину, яка може бути регенерована до цілої рослини, ДНК, за будь-яким з пп. 4-6, яка кодує смислову РНК, антисмислову РНК або рибозим, експресія яких зменшує експресію ферменту за будь-яким з пп. 2-3, і

(б) відбір трансгенних рослин.

Текст

Даний винахід стосується генної інженерії рослин з застосуванням технології рекомбінантних ДНК взагалі, і, зокрема, до ферментів, що приймають участь у біосинтезі ціаногенних глікозидів, та генів, що кодують ці ферменти. Протеїни та гени згідно з винаходом використовують для підвищення поживної цінності або опірності рослин до паразитів. Ціаногенні глікозиди є основою вторинних рослинних метаболітів у понад 2000 видах рослин. У деяких випадках вони є джерелом HCN, які можуть зробити рослину отруйною, якщо її вживати як їжу. Наприклад, бульби ціаногенної маніоки (Manihot esculenta) є одним з найважливіших продуктів харчування у тропічних районах. Ціаногенні глікозиди, присутні у бульбах, можуть викликати ціанідне отруєння людини через недостатню обробку продуктів з маніоки. Серед інших видів рослин, у яких їхня потенційна отруйність при надмірному вживанні у їжу або використанні як кормів для тварин пояснюється ферментним продукуванням HCN - біла конюшина (Trifolium repens), сорго (Sorghum bicolor), льон (Linum usitatissimum), триглохінін (Triglochin maritima), квасоля ліма (Phaseolus lunatus), мигдаль (Amygdalus) та насіння абрикоса (Prunus), вишні та яблуні (Malus). Токсичні властивості можуть бути знижені шляхом блокування біосинтезу ціаногенних глікозидів у цих рослинах. Коло основних попередників природних ціаногенних глікозидів обмежується п'ятьма амінокислотами гідрофобних протеїнів: валіном, лейцином, ізолейцином, фенілаланіном та тирозином та однією непротеїновою амінокислотою, циклопентенілгліцином. Ці амінокислоти перетворюють за допомогою серії реакцій на ціангідрини, які зрештою зв'язуються з цукровим залишком. Амигдалін, наприклад, являє собою Ο-b-гентіобіозид, а пруназин - Ο-b-глюкозид (R)-манделонітрилу. Іншим прикладом ціаногенних глікозидів, що мають ароматичні аглікони, є епімерна пара ціаногенних глікозидів дуррин та таксифілін, які можна знайти у рослинах родів Sorghum та Taxus відповідно. р-гідроксиманделонітрил, наприклад, перетворюють на дуррин (b-D-глюкопіранозилокси-(S)-р-гідроксиманделонітрил) за допомогою уридиндифосфатглюкозної (UDPG) глікозилтрансферази. Вважають, що подібні глікозилтрансферази присутні у більшості рослин. Віціанін та лукумін також є прикладами подібних до амигдаліну похідних дисахаридів. Самбунігрин містить (S)-манделонітрил як аглікон і тому є епімерним до пруназину. Прикладами ціаногенних глікозидів, що мають аліфатичні аглікони, є лінамарин та лотавстралін, присутні у конюшині, льоні, маніоці та бобах. З детальним аналізом ціаногенних глікозидів та їх біосинтезу можна ознайомитися у роботі Conn, Naturwissenschaften 66:28-34, 1979, на яку нами робиться посилання. Шлях біосинтезу ціаногенного глюкозиду дуррину, що походить від тирозину, широко вивчався (Halkier et al, "Cyanogenic glucosides: the biosynthetic pathway and the enzyme system involved": "Cyanide compounds in biology", Wiley Chichester (Ciba Foundation Symposium 140), cтop.49-66, 1988; Halkier and Moller, Plant Physiol. 90:1552-1559, 1989; Halkier et al, The J. of Biol. Chem. 264:19487-19494, 1989; Halkier and Moller, Plant Physiol. 96:10-17, 1990, Halkier and Moller, The J. of Biol. Chem. 265:21114-21121, 1990; Halkier et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:487-491, 1991; Sibbesen et al: "Biochemistry and Biophysics of cytochrome P450. Structure and Function, Biotechnological and Ecological Aspects", Archakov, A.I. (ed.), 1991, Koch et al, 8th Int. Conf. on Cytochrome P450, Abstract Pll.053; and Sibbesen et al, 8th Int. Conf. on Cytochrome P450, Abstract PII.016). L-тирозин перетворюють на р-гідрокси-манделонітрил (попередник дуррину) з Nгідрокситирозином, Ν,Ν-дигідрокситирозином, (Ε)- та (Ζ)-р-гідроксифенілацетальдегідним оксимом та ргідроксифенілацетонітрилом як проміжними продуктами. У цьому шляху беруть участь дві монооксигенази цитохромів типу Р450. У маніоці використовують подібний шлях, у якому бере участь цитохром-Р450залежна монооксигеназа, для синтезу лінамарину та лотавстраліну з валіну та ізолейцину відповідно (Koch et al, Archives of Biochemistry and Biophysics, 292:141-150, 1992). Складний шлях від L-тирозину до ргідроксиманделонітрилу у Sorghum bicolor показав, що потрібні лише дві багатофункціональні цитохромР450-залежні монооксигенази. Перший фермент, позначений як P450TYR, перетворює тирозин на ргідроксифенілацетальдегідний оксим. Другий фермент, позначений як Р450ох, перетворює альдоксим на ргідроксиманделонітрил. З огляду на подібність шляхів біосинтезу ціаногенних глюкозидів у різних рослинах можна зробити загальний висновок, що вищезгаданий шлях включає дві багатофункціональні Р450-залежні монооксигенази, Р450I та Р450II, які перетворюють попередню амінокислоту на відповідний альдоксим, а альдоксим - на відповідний ціангідрин, відповідно. Р450I є специфічним ферментом, який визначає субстратн у специфічність а отже, і тип продукованого глюкозиду, тоді як від Р450II очікують меншої специфічності у перетворенні ряду різних за структурою альдоксимів на відповідний ціангідрин. Глюкозинолати є гідрофільними, нелеткими тіоглікозидами, які знаходяться у кількох послідовностях дводольних покритонасінних (Cronquist, "The Evolution and Classification of Flowering Plants", New York Botanical Garden, Bronx, 1988). Одночасне існування ціаногенних глюкозинолатів та глюкозидів є взаємно виключним. Найбільше економічне значення глюкозинолатів полягає у їхній присутності в усіх рослинах, які належать до Brassicaceae (ряду Capparales), численні культури яких протягом сторіч людство використовувало для приправ, закусок, салатів, як овочі, так само як і корми та фураж. Згодом рапс (головним чином, Brassica napus та Brassica campestris) став основною комерційною олійною культурою. Відомо близько 100 різних глюкозинолатів, які мають таку саму загальну стр уктур у, але відрізняються природою бокових ланцюгів. Глюкозинолати утворюються з протеїнових амінокислот або прямо, або після одноразового або багаторазового розтягування ланцюга (Underhill et al, Biochem. Soc. Symp. 38:303-326, 1973). N-гідрокси амінокислоти та альдоксими, які були визначені як проміжні продукти у біосинтезі ціаногенних глікозидів, також служать ефективними попередниками для біосинтезу глюкозинолатів (Kindl et al, Phyiochemistry 7:745-756, 1968; Matsuo et al, Phytochemistry 11:697-701, 1972; Underhill, Eur. J. Biochem. 2:61-63, 1967). Цитохром Р450l, що використовується у синтезі ціаногенного глікозиду, таким чином, функціонально дуже схожий на відповідний біосинтетичний фермент у синтезі глюкозинолату і тому, найімовірніше, належить до тієї ж родини Р450-ферментів. Таким чином, авторами було виділено кДНК клон з Sinapis alba, що кодує Р450-фермент (SEQ ID NO:17) з 54% ідентичністю з P450TYR (CYP79) і каталізує перший етап у біосинтезі глюкозинолатів, яким є утворення альдоксиму з вихідної амінокислоти. Цей кДНК клон виявляє приблизно 90% ідентичність з EST-послідовністю Aribidopsis (T42902), що чітко вказує на те, що цей фермент цитохром Р450 значною мірою зберігається у видах, що містять глюкозинолат. Скорочення складного біосинтетичного шляху для ви щеописаних ціангідринів до каталітичної активності лише двох ферментів, цитохром Р450I та Р450II, дозволяє керувати ходом біосинтезу ціаногенних глікозидів у рослинах. Шля хом трансфекції послідовностей генів, що кодують одну або обидві монооксигенази, біосинтетичний шлях для ціаногенних глюкозидів може бути змінений, відновлений, або розпочатий заново. Зміна або введення біосинтетичного шляху для ціаногенних глікозидів у рослинах відомими спеціалістам способами є дуже цікавими, оскільки ціаногенний глікозид може бути отруйним для комах, акарид та нематод. Отже, зміна, введення або відновлення біосинтетичного шляху для ціаногенних глікозидів у рослинах або окремих тканинах рослин дозволяє зробити рослини неїстівними для комах, акарид або нематод і, таким чином, допомагає зменшити ушкодження врожаю, викликане паразитами. У поєднанні з іншими інсектицидними складовими, такими як ендотоксини Bacillus thuringiensis, можна досягти ще більшого зменшення шкоди для врожаю, якої завдають паразити. У альтернативному варіанті, послідовності генів, що кодують монооксигенази згідно з винаходом, використовують для конструювання плазмід ДНК, які після трансфекції у рослини, такі як маніока, сорго або ячмінь, що містять ціаногенні глікозиди, видаляють ціаногенні глікозиди, які за нормальних умов продукуються у диких рослинах. Це може бути досягнуто шляхом експресії антисмислових або смислових РНК або рибозимів, як описано в ЕР-458367-А1, ΕΡ-240208-Α2, US-5,231,020, WO89/05852 та WO90/11682, що інгібуює експресію монооксигеназ згідно з винаходом. Це є дуже цікавим, оскільки, незважаючи на численні спроби, ще досі не вдалося традиційними способами вирощування рослин повністю видалити ціаногенні глікозиди, наприклад, з маніоки або сорго. З іншого боку, було продемонстровано, що підвищена кількість ціаногенних глікозидів в епідермальних клітинах культури ячменю підвищує чутливість до нападів збудників борошнистої роси - грибків Erysiphe graminis (Pourmohensi, PhD thesis, Gottingen, 1989; Ibenthal et al, Angew. Bot. 67:97-106, 1993). Подібний ефект спостерігали у ціаногенному каучуковому дереві Hevea brasiliensis після ураження грибком Microcyclus ulei (Lieberei et al, Plant Phys. 90:3-36, 1989) та у льоні, ураженому Colletotrichum lini (Ludtke et al, Biochem. Z. 324:433-442, 1953). У цих прикладах кількісна опірність вищезазначених та інших рослини, коли ціаногенні глікозиди роблять рослину більш чутливою до нападів мікроорганізмів, може бути підвищена шляхом, що запобігає продукуванню ціаногенних глікозидів у таких рослинах. У ячмені ціаногенні глікозиди розташовані в епідермальних клітинах. Експресію антисмислових, смислових або рибозимних послідовностей, таким чином, краще, але не обов'язково стимулювати специфічним до епідермісу промотором. Присутність ціаногенних глікозидів у рослинах навіть у незначних кількостях також може викликати проблеми з харчуванням через утворення небажаних канцерогенів, як це було продемонстровано на прикладі ячменю. Ячмінний солод, наприклад, містить у малих кількостях ціаногенний глюкозид епігетеродендрин, який у процесі виробництва спиртів з зернових культур може перетворитися на етилкарбамат, який вважають канцерогеном. Останнім часом проводяться пробні досліди щодо обмеження максимально допустимої концентрації етилкарбамату у харчових продукта х, напоях та спиртах, отриманих шляхом ферментації (Food Chemical News 29:33.35, 1988). У WO95/16041 описано молекулу ДНК, що кодує цито хром Р450I-монооксигеназу, яка каталізує перетворення амінокислоти на відповідну N-гідроксиамінокислоту, Ν,Ν-дигідроксиамінокислоту та перетворення Ν,Ν-дигідроксиамінокислоти на відповідний альдоксим. Вихідну амінокислоту вибирають з групи, яка складається з тирозину, фенілаланіну, триптофану, валіну, лейцину, ізолейцину та циклопентенілгліцину. Молекули ДНК відповідають або природним генам, або їх функціональним гомологам, які виникли в результаті мутації, делеції, зрізання і т. ін., але продовжують кодувати цитохром Р450I-монооксигеназу, здатну каталізувати більше однієї реакції шляху біосинтезу ціаногенних глікозидів. Монооксигенази в оптимальному варіанті містять єдиний каталітичний центр. Крім того, у WO95/16041 описані молекули ДНК, що кодують цитохром Р450II-монооксигенази, такі як Р450ОХ Sorghum bicolor(L) Moench. Вони каталізують перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення нітрилу на відповідний ціангідрин. Каталіз перетворення тирозину на р-гідрокси-фенілацетонітрил двома багатофункціональними Р450-ферментами пояснює, чому спрямовуються в одне русло всі проміжні продукти цього перетворення, за винятком (Z)-р-гідроксифенілацетальдоксиму. В субстрат алгоритму, запропонованого для виділення Р450ОХ, покладено порядок виділення P450TYR (CYP79, Sibbesen et aI, Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 9740-9744, 1994) з сорго. При такому підході діетиламіноетилсефарозна іонообмінна колонка служить для зв'язування Р450-ферментів, причому жовті пігменти у пробі не зв'язуються. Видалення пігментів служить для досягнення подвійної мети. Воно є передумовою для зв'язування Р450-ферментів з наступними колонками і дозволяє оцінити вміст Р450 шляхом спектрометрії (зв'язування монооксиду вуглецю та субстрату). Даний винахід показує, що Р450ОХ, навпаки, виявляє низьку спорідненість до зв'язування з діетиламіноетилсефарозною колонкою і значною мірою відновлюється у погонній та промивальній фракціях. Для відділення активності Р450ОХ від жовтих пігментів за допомогою фази на основі тритону Х-114 застосовують процедуру розділення. При оптимальному використанні від 0,6 до 1% тритону Х-114 виявляють, що Р450ОХ розподіляється по обох фазах, на відміну від P450TYR, який відновлюється у багатій на детергент верхній фазі. Зі збільшенням концентрації тритону Х-114 до 6% більша частина Р450ОХ відновлюється з бідної на детергент нижньої фази, тоді як жовті пігменти перебувають у верхній фазі. Недолік використання 6% тритону Х-114 полягає у посиленні перетворення Р450ОХ на його денатуровану Р420-форму. Цей факт використовується у даному винаході для очищення на ранній стадії Р450II-монооксигенази, такої як Р450ОХ, з метою клонування генів, що кодують монооксигенази, та стабільної трансформації рослини з генами, що кодують монооксигеназу. Виділення Р450ОХ та визначення часткових амінокислотних послідовностей дозволяє конструювати олігонуклеотидні зонди й виділяти кДНК, що кодують Ρ450ОХ. Однак у даному разі клонування здійснювали за іншим принципом. Винахід стосується, насамперед, молекул ДНК, що кодують цито хром Р450II-монооксигенази, які каталізують перетворення альдоксиму на нітрил, та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин. В оптимальному варіанті альдоксим є продуктом перетворення амінокислоти, вибраної з групи, яка складається з тирозину, фенілаланіну, триптофану, валіну, лейцину, ізолейцину та циклопентенілгліцину або амінокислоти, вибраної з групи, що складається з L-тирозину, L-валіну та Lізолейцину, каталізованих Р450I-монооксигеназою, як описано у WO95/16041. Молекули ДНК згідно з винаходом відповідають або природним генам, або їхнім гомологам, які виникли в результаті мутації, делеції, зрізання і т. ін., але продовжують кодувати цитохром Р450II-монооксигеназу, яка каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та наступне перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин. Монооксигенази згідно з винаходом каталізують більше однієї реакції шляху біосинтезу ціаногенних глікозидів і в оптимальному варіанті містять єдиний каталітичний центр. Ферменти цитохрому Р450II можуть бути присутні у більшості живих організмів. Молекули ДНК згідно з даним винаходом, що кодують Р450II-монооксигенази, структурно та функціонально є подібними до молекул ДНК, які одержують з різних рослин, які продукують ціаногенні глікозиди. В оптимальному варіанті винаходу молекули ДНК гібридизують з фрагментом молекули ДНК з нуклеотидною послідовністю, представленою у SEQ ID NO:1. Вищезгаданий фрагмент має довжину понад 10 нуклеотидів, а в оптимальному варіанті - понад 15, 20, 25, 30 або 50 нуклеотидів. Чинники, які впливають на стабільність гібридів, визначають суворість дотримання умов гібридизації і можуть вимірюватися залежністю від температури плавлення Tm утворених гібридів. Розрахунки Tm описані у багатьох працях. Наприклад, Коллер зі співавторами (Keller et al) описує у роботі "DNA Probes: Background, Applications, Procedures", Масmillаn Publishers Ltd, 1993, на сторінках з 8 по 10, чинники, на які слід зважати при розрахунках значень Tm для реакцій гібридизації. Молекули ДНК згідно з даним винаходом гібридизують з фрагментом SEQ ID NO:1 при температурі, на 30°С нижчій за розраховану T m гібриду, який має бути утворений. В оптимальному варіанті їх гібридизують при температурах, на 25, 20, 15, 10, або 5°С нижчих за розраховану T m. Для маніпуляції генами з використанням технології рекомбінантних ДНК молекула ДНК згідно з винаходом, крім гена, що кодує монооксигеназу, може включати ДНК, яка дозволяє здійснювати реплікацію та відбір ДНК згідно з винаходом у мікроорганізмах, таких як Е. coli, Bacillus, Agrobacterium, Streptomyces або у дріжджах. Вона також може включати ДНК, яка дозволяє експресувати й відбирати гени монооксигенази у гомологічних або гетерологічних рослинах. Такі послідовності включають, крім інших, гени, використання кодонів яких було пристосоване до використання кодонів гетерологічних рослин, як описано у WO93/07278; генів, які забезпечують резистентність до неоміцину, канаміцину, метотрексату, гігроміцину, блеоміцину, стрептоміцину або гентаміцину, до аміноетилцистеїну, гліофосфату, сульфонілсечовини або фосфінотрицину; до маркерних генів, таких як галактозидаза; до її природного промотора та сигналів термінації транскрипції; до промоторних елементів, таких як 35S та 19S CaMV промотори, або тканинно-специфічних рослинних промоторів, таких як промотори, специфічні до коріння (описані, наприклад, в ЕР-452269-А2, WO91/13992, US-5,023,179), зеленого листя, таких як фосфоенолпіруваткарбоксилаза (РЕРС) кукурудзи, серцевини або пилку (описані, наприклад, у WO93/07278) або індукованих рослинних промоторів (ЕР-332104); а також до гетерологічних сигналів закінчення транскрипції. Даний винахід також стосується Р450ІІ-монооксигеназ, які каталізують перетворення альдоксиму на нітрил і перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин. В оптимальному варіанті винаходу монооксигенази очищають і використовують для створення моноклональних або поліклональних антитіл, які специфічно зв'язуються з монооксигеназами. Зокрема, цитохром Р450ОХ, що має молекулярну масу 55кДа, як визначено електрофорезом з додецилсульфатом натрію в поліакриламідному гелі (SDS-PAGE), виділяють з Sorghum bicolor (L.) Moench. Його амінокислотну послідовність представлено у SEQ ID NО:2. Каталітичні властивості Ρ450ОХ нагадують активність цитохрому Р450, яку спостерігають у мікросомах з печінки щура (DeMaster et al, J. Org. Chem. 5074-5075, 1992). Характеристика цитохрому Р450ОХ та інших членів родини цитохромів Р450ОХ полягає у тому, що дегідратація альдоксиму до відповідного нітрилу залежить від присутності відновленого нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфату (N ADPH), але цю залежність у деяких випадках можна подолати шляхом додавання дитіоніту натрію або інших відновників. З усіх відомих послідовностей для ферментів цитохромів Р450 цитохром Р450ОХ виявляє найвищу ідентичність амінокислотної послідовності (44%) до ферменту авокадо CYP71A1 і меншу за 40% ідентичність до усі х інши х членів родини CYP71. Авокадо не продукують ціаногенні глікозиди, a CYP71A1 не каталізують перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин. Таким чином, згідно з даним винаходом може бути визначена родина цитохром Р450ІІмонооксигеназ, члени якої каталізують перетворення альдоксиму на відповідний ціангідрин і мають 40% або вищу ідентичність амінокислотної послідовності до-послідовності цитохрому Ρ450ОХ. В оптимальному варіанті ідентичність амінокислотної послідовності до цитохрому Ρ450ОХ є ви щою за 50% або вищою за 55%. Було запропоновано позначити Ρ450ОХ перший член нової CYP71 підродини (CYP71E1), оскільки він груп ується з іншими CYP71 послідовностями у дендрограмах, на яких показано порядок послідовностей у графічному виконанні. Взагалі, згідно з положеннями номенклатурного комітету, цито хром Р450, щоб його можна було віднести до нової CYP родини, повинен мати менш, ніж 40% ідентичність до послідовності на амінокислотному рівні, а послідовності, які є ідентичними більше, ніж на 55%, відносять до однієї підродини. При визначенні порядку послідовностей розглядають не лише ідентичність послідовностей, але й подібність послідовностей, наприклад, однаковий загальний заряд або схожу гідрофобність/гідрофільність окремих амінокислот. За такого порядку Ρ450ОХ груп ується з іншими CYP7-послідовностями і, таким чином, має бути включеним до CYP71-родини, незважаючи на те, що він виявляє менш, ніж 40% ідентичність до усіх інши х членів CYP71-родини, за винятком CYP71A1 з авокадо. Оскільки він виявляє низьку ідентичність послідовності до інших членів родини, то він має бути віднесений до нової підродини. Усі інші члени CYP71родини належать до неціаногенних видів і їхня функція невідома. Каталітичні властивості раніше ідентифікованих Р450, що належать до CYP71-родини, залишаються нез'ясованими. Вважають, що вони беруть участь у гідроксилюванні терпенів. Про жоден з них не згадується, що він використовує оксими як субстрат, або що він є багато функціональним і перетворює альдоксими на нітрили та ціангідрини. Інший варіант втілення даного винаходу пов'язаний зі способом приготування кДНК, що кодує цитохром Р450ІІ-монооксигеназу, яка каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин. Він включає (а) виділення та розчинення мікросом з рослинної тканини, які продукують ціаногенний глікозид, (б) очищення цитохром Р450-монооксигенази, (в) вироблення антитіл проти очищеної монооксигенази, (г) зондування бібліотеки експресії кДНК рослинної тканини, що продукує ціаногенний глікозид, вищезгаданим антитілом, і (д) виділення клонів, які експресують монооксигеназу. Мікросоми можуть бути виділені з тканин рослин, які виявляють високу активність ферментативної системи, що відповідає за біосинтез ціаногенного глікозиду. Ці тканини можуть бути різними у різних видів рослин. Оптимальним джерелом мікросом є щойно ізольовані паростки, зібрані протягом 1 до 20 днів, краще - від 2 до 10 днів, і найкраще - від 2 до 4 днів після проростання. Кращими вважають етіольовані сіянці рослин, що продукують ціаногенні глікозиди, але можна використовува ти й сіянці, пророщені при світлі. Після виділення мікросоми розчиняють у буфері, що містить один або кілька детергентів. Оптимальними детергентами є RENEX 690 (J. Lorentzen A/S, Kvistgard, Denmark), відновлені тритон X-100 (RTX-100), тритон Х-114 та CHAPS. Цитохром Р450-монооксигенази можуть бути очищені з застосуванням стандартних те хнологій очищення протеїнів, таких як ультрацентрифугування, фракціоноване осадження, діаліз, електрофорез додецилсульфатом натрію в поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) та колонкова хроматографія. Серед інших можливих колонок - іоннообмінні колонки, такі як діетиламіноетилсефарозна (ДЕАЕ), колонки з реактивами, такі як колонка з агарозою марки Cibacron yellow 3, колонка з агарозою марки Cibacron blue та колонка з агарозою марки Reactive red 120, та фільтраційні колонки, такі як колонка з гелем марки Sephacryl S-1000. Вміст цитохрому Р450 в окремих фракціях визначають по різниці спектрів монооксиду вуглецю. Особливою проблемою під час виділення Р450ОХ, що також утруднює визначення кількості Р450ОХ, є його взаємне змішування з жовтими пігментами під час початкових етапів очищення замість зв'язування на іонообмінній колонці, яку зазвичай використовують для очищення Р450-ферментів, наприклад, P450TYR. Присутність жовтих пігментів перешкоджає зв'язуванню Р450ОХ з багатьма різними матеріалами на колонці і, таким чином, являє головну перешкоду на шляху до подальшого очищення. Щоправда, відокремлення Р450ОХ від жовтих пігментів може бути здійснене при температурі, що викликає розділення фаз тритону Х-114. Цей спосіб був оптимізований щодо відновлення Р450ОХ та видалення пігментів шляхом підвищення кількості тритону Х-114. При 6%, що у шість-десять разів перевищує рівень, використовуваний для інших Р450, приблизно 80% активної частини Р450ОХ надходить до прозорої нижньої фази. Крім видалення жовтих пігментів, більшого очищення на цьому етапі досягти майже не вдається. Однак при застосуванні Р450ОХ, який містить нижню фазу, на колонці з Cibacron blue, градієнтне елюювання солі надавало майже однорідний Р450ОХ, про що свідчила присутність основної забарвленої по Кумасі смуги з явною молекулярною масою 55кДа у ти х фракціях, які при відновленні виявляли активність Р450ОХ. Виділений Р450ОХ давав спектр монооксиду вуглецю з піком абсорбції 450нм, але відносно велика частина виділеного ферменту була присутня у формі денатурованого Р420. Безперервне перетворення Р450ОХ на денатуровану форму Р420 заважало кількісно визначити загальний вміст та специфічну активність Р450ОХ на різних етапах процесів виділення. До того ж, специфічна активність Р450ОХ залежить від інгібуючого впливу, який справляють різні використовувані детергенти. Загальний вміст Р450 у фракціях, таким чином, має вважатися визначеним напівкількісно. Очищені протеїни використовують для виявлення антитіл, наприклад, у мишей, кіз, баранів, кролів або курчат після введення. Від 5 до 50мкг протеїну вводять кілька разів протягом приблизно 14-денних періодів. В оптимальному варіанті винаходу вводять від 10 до 20мкг від 2 до 6 разів протягом 14-денних періодів, ін'єкції здійснюють у присутності або за відсутності ад'ювантів. Імуноглобуліни очищають від антисироваток, і селезінку використовують для гібридного злиття, як описано у роботі Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988, на яку авторами робиться посилання. Антитіла, що специфічно зв'язуються з цитохром Р450ІІ-монооксигеназою, також використовують у вирощуванні рослин для виявлення рослин, які у змінених кількостях продукують цитохром Р450-монооксигенази, а, отже, й ціаногенні глікозиди. Ці способи приготування бібліотек кДНК рослинних тканин широко описані у роботі Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, на суттєву частину якої, що стосується бібліотек кДНК, авторами робиться посилання. ПоліА+ РНК виділяють з рослинної тканини, яка виявляє високу активність ферментативної системи, що відповідає за біосинтез ціаногенних глікозидів. Ці тканини можуть бути різними у різних видах рослин. Оптимальною тканиною для виділення поліА+ РНК є тканина зі щойно ізольованих паростків, зібраних протягом від 1 до 20 днів, краще від 2 до 10 днів і найкраще - від 2 до 4 днів після проростання. Одержані бібліотеки кДНК зондують антитілами, які специфічно зв'язують цитохром Р450ІІ-монооксигеназу, і виділяють клони, що експресують монооксигеназу. Альтернативний спосіб приготування кДНК, що кодує цито хром Р450ІІ-монооксигеназу, включає (а) виділення й розчинення мікросом з рослинної тканини, що продукує ціаногенні глікозиди, (б) очищення цитохром Р450ІІ-монооксигенази, (в) одержання повної або часткової протеїнової послідовності монооксигенази, (г) конструювання олігонуклеотидів, які визначають ДНК, що кодує від 4 до 15 амінокислот вищезгаданої протеїнової послідовності монооксигенази (д) зондування бібліотек кДНК рослинної тканини, що продукує ціаногенний глікозид з вищезгаданими олігонуклеотидами, або молекул ДНК, одержаних від ампліфікації кДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (PCR) з використанням вищезгаданих олігонуклеотидів, і (е) виділення клонів, які кодують цитохром Р450ІІ-монооксигеназу. Амінокислотні послідовності внутрішніх пептидів, що виникли в результаті розщеплення протеазою, можуть бути одержані стандартними способами, такими як розщеплення за Едманом. Олігонуклеотиди, які визначають ДНК, що кодує часткові протеїнові послідовності монооксигенази згідно з винаходом, одержують шляхом зворотної трансляції частин протеїнової послідовності згідно з генетичним кодом. Протеїнові послідовності, які кодуються ДНК послідовностями низького виродження, є оптимальними для зворотної трансляції. Вони мають довжину від 4 до 15, краще - від 5 до 10 амінокислот. У разі необхідності кодони, які використовують в олігонуклеотидах, можуть бути пристосовані для використання кодонів рослинного походження (Murray et al, Nucleic Acids Research 17:477-498, 1989). Одержані олігонуклеотиди використовують для зондування бібліотеки кДНК, як описано у роботі Sambrook еt al, (Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) для клонів, які здатні до спарювання основ з вищезгаданими олігонуклеотидами. Або ж олігонуклеотиди використовують у полімеразній ланцюговій реакції, методологія якої відома спеціалістам, з рослинною кДНК як матрицею для ампліфікації. У цьому випадку одержані продукти ампліфікації використовують для зондування бібліотек кДНК. Виділяють клони, що кодують цитохром Р450ІІ-монооксигенази. Альтернативний спосіб клонування генів базується на створенні бібліотеки генів, що складається з векторів експресії. Таким чином, аналогічно до вищеописаних способів, геномні ДНК, краще - кДНК, спочатку виділяють з клітин або тканин, здатних до експресії Р450ІІ-монооксигенази, а потім сплайсують у відповідний вектор експресії. Бібліотеки генів, утворені таким чином, після цього можуть бути піддані скринінгові з застосуванням відповідних засобів, в оптимальному варіанті - антитіл. Відбирають клони, що включають як інсерт потрібний ген або принаймні частину гена. Як альтернатива, молекули кДНК, що кодують цитохром Р450-монооксигеназу, яка каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин, можуть бути одержані шляхом (а) створення вироджених олігонуклеотидів, що охоплюють від 3 до 10 амінокислот збережених ділянок цитохромів А-типу, (б) використання вироджених олігонуклеотидів для ампліфікації одного або кількох специфічних до цитохромів фрагментів ДНК з застосуванням полімеразної ланцюгової реакції, (в) скринінг бібліотеки кДНК за допомогою специфічних до цитохромів фрагментів для одержання кДНК повної довжини, (г) експресії кДНК повної довжини у мікробі-хазіїні, (д) ідентифікація хазяїв, що екс пресують цитохром Р450-монооксигеназу, яка каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин, і (е) очищення клонованоїДНК вищезгаданого хазяїна. Повну ДНК з бібліотеки ДНК, в оптимальному варіанті - з бібліотеки кДНК, використовують як матрицю у полімеразній ланцюговій реакції (PCR) з одним або кількома праймерами, що представляють збережені ділянки цитохромів А-типу (Durst et al, Drug Metabolism and Drug Interactions 12: 189-206, 1995), які вважають похідними від спільного попередника - рослинного цитохрому Р450. На основі порядку послідовностей цитохромів Р450 Α-типу можуть бути визначені три добре збережені ділянки на амінокислотному рівні: ділянка 1 (VI)KEX(L/F)R, ділянка 2 FXPERF та ділянка 3 PFGXGRRXC XG. Можуть бути сконструйовані праймери, що містять вироджений інозин (І), кожен з яких включає від 3 до 10, в оптимальному варіанті - приблизно 5 або 6 амінокислот двох відповідних ділянок. Полімеразну ланцюгову реакцію (PCR), наприклад, здійснюють у три послідовні етапи. Етап 1 з використанням праймера, який включає спільну ділянку FXPERF, та стандартного Т7 праймера, який включає Т7 промотор у векторі бібліотеки, ампліфікує кДНК, які походять від мРНК, що кодують цитохром Р450 Α-типу. Др угий етап полімеразної ланцюгової реакції (PCR) з використанням праймерів, що включають дві спільні ділянки, та ампліфікованих ДНК з етапу 1 як матриці, в оптимальному варіанті ампліфікує фрагмент з 100п.н., який після цього лігують у pBluescript і секвенують. Ген-специфічні праймери створюють на основі одержаної ДНК послідовності. їх використовують на етапі 3 у поєднанні з праймером, комплементарним з полі-А хвостом (праймером dT+V) та ДНК толімеразної ланцюгової реакції (PCR) з етапу 1 як матрицею для ампліфікації, фрагменту ДНК приблизно у 500п.н., , який використовують як ген-специфічний зонд для виділення кДНК повної довжини. Така полімеразна ланцюгова реакція характерна не лише для виділення Р450ОХ, а є спільною для виділення цитохрому Р450 А-типу. Одержані цитохроми Р450 Α-типу мають бути гетерологічно експресовані для визначення їхньої функції. Клони кДНК або продукти полімеразної ланцюгової реакції (PCR), приготовані як описано вище, або їхні фрагменти можуть бути використані як зонди гібридизації у процесі ідентифікації подальших ДНК послідовностей, що кодують протеїновий продукт, який виявляє активність Р450ІІ-монооксигенази з гомологічного або гетерологічного органічного джерела, такого як грибки або гетерологічні рослини. Придатним джерелом є тканина з рослин, що містять ціаногенні глікозиди. Вищезгадані клони або продукти полімеразної ланцюгової реакції (PCR) також можуть бути використані як маркер поліморфізму рестрикційних фрагментів (RFLP) для визначення, наприклад, розташування гена цитохром Р450-монооксигенази або тісно зв'язаної особливості у рослинному геномі, або для вирощування за допомогою маркера [ЕР-А 306139; WO89/07647]. Застосовуючи способи, описані вище, можна виділити різні гени, які кодують Р450ІІ-монооксигеназу. Вищезгадані гени використовують згідно зі способом продукування очищеної рекомбінантної цитохром Р450ІІ-монооксигенази, яка каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин; цей спосіб включає (а) конструювання гена, що кодує вищезгадану монооксигеназу, яка має бути експресована в організміхазяїні, такому як бактерії, дріжджі або клітини комах, (б) перетворення вищезгаданого організму-хазяїна обробленим за допомогою інженерії геном, і (в) виділення протеїну з організму-хазяїна або супернатанту культури. В оптимальному варіанті винаходу цей спосіб використовують для одержання очищеного рекомбінантного цитохрому Р450ОХ або цитохрому Р450ОХ, який було змінено традиційними способами генної технології. В оптимальному варіанті зміни ведуть до посиленої експресії рекомбінантного протеїну або до зміненої субстратної специфічності. Молекули ДНК згідно з винаходом використовують для одержання трансгенних рослини, резистентних до комах або акарид. Конкретні приклади, які не є вичерпними, подані у Таблиці В WO95/16041 (стор.45), так само, як і нематоди, описані нижче. Для зручності лише вищезгадана Таблиця не повторюється у цьому описі, але вона згадується авторами шляхом посилання на опис з WO95/16041. В оптимальному варіанті трансгенні рослини є резистентними до Coleoptera та Lepidoptera, таких як блощиця довговуса західна (Diabrotica virgifera virgifera), блощиця довговуса північна (Diabrotica longicornis barberi), блощиця довговуса південна (Diabrotica undecimpunctata howardi), совка бавовняна, метелик кукурудзяний, блощиця кукурудзяна, рожевий коробочковий черв'як та совка. Нематоди є основними тваринними паразитами рослин, що завдають сільському господарству втрат у світовому масштабі, які оцінюються у $100 мільярдів щороку. Деякі нематоди викликають у місцях живлення зміни рослинних клітин і живляться на одному місці протягом кількох годин або значно довше. Серед них види, які належать до родів Meloidogyne Globodera, Heterodera, Rotylenchulus, Tyienchulus, Naccobus, Xiphinema, Longidorus, Paralongidorus, Cryphodera; Trophotylenchulus, Hemicycliophora, Criconemella, Verutus та Heliocotylenchus. Роди, які живляться протягом більш обмеженого часу на одному місці, включають Pratylenchus, Hadopholus, Hirschmanniella, Trichodorus, Paratrichodorus, Ditylenchus, Aphelenchoides, Scutellonema та Belonolaimus. Трансгенні рослини включають ДНК, що кодує нові монооксигенази, які каталізують перетворення вищезгаданого альдоксиму на нітрил та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин. До того ж, трансгенні рослини можуть включати монооксигеназні гени, генетично зв'язані з генами резистентності до гербіцидів. Трансгенні рослини в оптимальному варіанті є однодольними або дводольними рослинами. Конкретні варіанти подано у Таблиці А з WO95/16041 (стор.33-44). Для зручності лише вищезгадана Таблиця не повторюється у цьому описі, але вона згадується авторами з посиланням на опис із WO95/16041. В оптимальному варіанті їх вибирають з групи, що складається з кукурудзи, рису, пшениці, ячменю, сорго, бавовни, сої, соняшника, злакових трав, олійного рапсу, цукрового буряка, брокколі, цвітної капусти, качанної капусти, огірків, цукрової кукурудзи, редьки дайкон, benas, салату, дині, перцю, гарбуза столового, томатів та кавуна. Рослини отримують способом, який включає (а) введення у рослинну клітину або рослину тканину, яка може бути регенерована до цілої рослини, ДНК, що включає ген, який може бути експресований у цій рослині, що кодує монооксигеназу згідно з винаходом, (б) відбір трансгенних рослин. Подібним чином молекули ДНК згідно з винаходом використовують для одержання трансгенних рослин, що експресують антисмислові або смислові РНК або рибозими, призначені для генів ендогенної Р450ІІмонооксигенази. Експресія цих молекул у трансгенних рослинах послаблює експресію цитохром Р450ІІмонооксигенази. Такі рослини виявляють поліпшену стійкість до хвороб або поживну цінність завдяки зниженій експресії ціаногенних глікозидів. Такі рослини можуть бути одержані способом, який включає (а) введення у рослинну клітину або тканину, яка може бути регенерована до цілої рослини, ДНК, що кодує смислову РНК, антисмислову РНК або рибозим, експресія якого послаблює експресію цитохром Р450ІІ-монооксигенази, і (б) відбір трансгенних рослин. Існує багато е фективних способів введення ДНК у рослинні клітини, які базуються на використанні векторів перенесення генів або на способах прямого перенесення генів. Згідно з одним з можливих способів інсерції генної послідовності до клітини застосовують інфікування рослинної клітини бактерією Agrobacterium tumefaciens та/або Agrobacterium rhizogenes, яку було перетворено вищезгаданою послідовністю гена. Трансгенні рослинні клітини після цього культивують у відповідному відомому спеціалістам культуральному середовищі для формування з них паростків та коріння, а зрештою, і цілої рослини. До даного винаходу належить так зване перетворення листових дисків з використанням Agrobacterium (Horsch et al, Science 227:1229-1231, 1985). Стерильні листові диски з придатних рослин інкубують з клітинами Agrobacterium, що включають одну з химерних генних послідовностей згідно з винаходом, а потім переносять у або на відповідне живильне середовище. Особливо придатними, а отже, й оптимальними у межах даного винаходу є LS-середовища, затвердлі після додавання агару й збагачені одним або кількома традиційними регуляторами росту рослин, головним чином, вибраними з групи ауксинів, що складається з aнафтилоцтової кислоти, піклораму, 2,4,5-трихлорфеноксиоцтової кислоти, 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти, індол-3-бутирової кислоти, індол-3-молочної кислоти, індол-3-сукцинової кислоти, індол-3-оцтової кислоти та р-хлорфеноксиоцтової кислоти, і з групи цитокінінів, що складається з кінетину, 6-бензиладеніну, 2-ізопентеніладеніну та зеатину. Оптимальна концентрація ауксинів та цитокінінів становить від 0,1мг/л до 10мг/л. Після інкубування протягом кількох днів, в оптимальному варіанті - після інкубування протягом 2-3 днів при температурі від 20°С до 40°С, краще - від 23°С до 35°С і найкраще - при 25°С і при дифузному освітленні листові диски переносять до відповідного середовища для пророщення. Особливо придатним для відбору трансформантів є LS-середовище, що не містить ауксину, але містить цитокінін і до якого було додано селективну речовину. Культури тримають при світлі й переносять до нового середовища з відповідними інтервалами, в оптимальному варіанті - з інтервалами в один тиждень. Зелені паростки, що розвиваються, відрізають і культивують далі у середовищі, яке викликає формування у паростків коріння. Особливу перевагу згідно з даним винаходом віддають LS-середовищу, яке не містить ауксину або цитокініну, але до якого було додано селективну речовину для відбору трансформантів. Крім опосередкованого Agrobacterium перетворення, згідно з даним винаходом можливе застосування способів прямого перетворення для інсерції генної послідовності згідно з винаходом у рослинний матеріал. Наприклад, генетичний матеріал, що міститься у векторі, може бути вставлений прямо у рослинну клітину, наприклад, з застосуванням суто фізичних процедур, наприклад, шляхом мікроін'єкції з використанням мікропіпеток тонкого волочіння (Neuhaus et al, Theoretical and Applied Genetics 74:363-373, 1987), електропорації (D'Halluin et al, The Plant Cell 4:1495-1505, 1992; WO92/09696) або, в оптимальному варіанті, бомбардування клітин мікрочастинками, вкритими перетворюючою ДНК (Microprojectile Bombardment"; Wang et al. Plant Molecular Biology 11:433-439, 1988; Gordon-Kamm et al, The Plant Cell 2:603618, 1990; McCabe et al, Bio/Technology 11:596-598, 1993; Christou et, Plant Physiol. 87:671-674, 1988; Koziel et aІ, Biotechnology 11: 194-200, 1993). Крім того, рослинний матеріал, який має бути перетворений, необов'язково піддають попередній обробці осмотично активною речовиною, такою як цукроза, сорбіт, поліетиленгліколь, глюкоза або маніт. Серед інших можливих способів прямого перенесення генетичного матеріалу у рослинну клітину обробка протопластів з застосуванням процедур, які змінюють плазматичну мембрану, наприклад, обробка поліетиленгліколем, теплова обробка або електропорація, або поєднання цих процедур (Shillito et al, Biotechnology 3:1099-1103, 1985). Ще один спосіб прямого введення генетичного матеріалу у рослинні клітини, який базується на суто хімічних процедурах і який дозволяє здійснювати перетворення дуже ефективно і швидко, описано у роботі Negrutiu et al, Plant Molecular Biology 8:363-373, 1987. Також придатним для перетворення рослинного матеріалу є пряме перенесення генів з застосуванням котрансформації (Schocher et al, Biotechnology 4:1093-1096, 1986). Поданий вище як приклад перелік можливих способів перетворення не претендує на повноту і аж ніяк не вичерпує предмету винаходу. Описані вище генетичні властивості, надані шляхом інженерії трансгенному насінню та рослинам, передаються через статеве розмноження або вегетативний ріст і можуть, таким чином, зберігатися й передаватися потомству. Взагалі, для вищезгаданого збереження й передачі застосовують традиційні сільськогосподарські методики, розроблені спеціально для конкретних цілей, таких як оранка, сівба або збір врожаю. Можуть бути застосовані також спеціальні технології, такі як гідропоніка або вирощування у теплицях. Оскільки вирощувані культури є вразливими до нападів та шкоди, якої завдають комахи або інфекції, а також до бур'янів, то вживають заходи для контролю над бур'янами, хворобами рослин, комахами, нематодами та іншими негативними чинниками з метою поліпшення врожайності. Серед них механічні заходи, такі як обробка грунту або видалення бур'янів та інфікованих рослин, а також застосування агрохімікатів, таких як гербіциди, фунгіциди, гаметоциди, нематициди, регулятори росту, агенти визрівання та інсектициди. Корисні генетичні властивості трансгенних рослин та насіння згідно з винаходом можуть також використовува тися у вирощуванні рослин, яке має на меті розвиток рослин з такими поліпшеними властивостями, як стійкість до паразитів, гербіцидів або стресів, підвищена поживна цінність, підвищена врожайність або поліпшена структура, що зменшує втрати від полягання або осипання. Різні етапи розведення характеризуються чітко визначеним втручанням людини, таким як відбір ліній для схрещування, спрямування запилення батьківських ліній або відбір відповідного потомства. Залежно від потрібних властивостей вживають різні заходи вирощування. Подібні технології спеціалістам добре відомі і включають, крім інших, гібридизацію, інбридинг, зворотне схрещування, багатолінійне розведення, змішування сортів, міжвидове схрещування, анеуплоїдні технології і т. ін. Способи гібридизації також включають стерилізацію рослин для одержання чоловічих або жіночих стерильних рослин механічними, хімічними або біохімічними засобами. Перехресне запилення чоловічих стерильних рослин пилком різних ліній гарантує, що геном чоловічих стерильних і жіночих фертильних рослин рівномірно набуває властивостей обох батьківських ліній. Таким чином, трансгенне насіння та рослини згідно з винаходом використовують для вирощування поліпшених рослинних ліній, які, наприклад, підвищують ефективність традиційних способів, таких як обробка гербіцидами або пестицидами, або дозволяють обходитися без вищезгаданих способів завдяки своїм зміненим генетичним властивостям. Як альтернатива, можуть бути одержані нові культури з поліпшеною стійкістю до стресів, які завдяки їхньому оптимізованому генетичному "обладнанню", дають врожай кращої якості, ніж продукти, не здатні переносити несприятливі умови розвитку. У виробництві насіння якість та рівномірність проростання насіння є суттєвими характеристиками продуктів, тоді як якість та рівномірність проростання насіння, що збирається й продається фермерами, значення не має. Оскільки важко тримати культуру окремо від інших культур та насіння бур'янів, контролювати хвороби насіння та одержувати насіння з добрим проростанням, виробниками, що мають досвід у вирощуванні, зберіганні й продажу чистого насіння, були розроблені досить широкі й чітко означені методи виробництва насіння. Таким чином, серед фермерів є звичною купівля сертифікованого насіння, яке відповідає конкретним стандартам якості, замість використання насіння, зібраного з власного врожаю. Матеріал для розведення, який має використовуватися як насіння, зазвичай обробляють захисним покриттям, яке включає гербіциди, інсектициди, фунгіциди, бактерициди, нематициди, молюскіциди або їхні суміші. Традиційно застосовувані захисні покриття включають такі сполуки, як каптан, карбоксин, тирам (TMTDÒ ), металаксил (ApronÒ ) та піриміфосметил (ActellicÒ ). Якщо потрібно, ці сполуки розробляють разом з іншими носіями, поверхнево-активними речовинами або ад'ювантами що полегшують нанесення, які традиційно застосовують у розробці для забезпечення, захисту від шкоди, якої завдають бактерії, грибкові та тваринні паразити. Захисні покриття наносять шляхом просочування матеріалу для розведення рідкою композицією або шляхом вкривання комбінованою вологою або сухою композицією. Можливі й інші способи застосування, такі як обробка, спрямована на паростки або плоди. Ще один аспект даного винаходу полягає у забезпеченні нових сільськогосподарських способів, таких як наведені вище способи, які характеризуються використанням трансгенних рослин, матеріалу трансгенних рослин або трансгенного насіння згідно з даним винаходом. Нижчеподані приклади далі описують матеріали та способи, застосовувані при втіленні винаходу, та наслідки цього застосування. Вони пропонуються для ілюстрації, і їх перелік не повинен розглядатися вичерпним для заявленого винаходу. Приклади Приклад 1: Приготування мікросом Усі етапи, пов'язані з приготуванням мікросом, здійснюють при 4°С, якщо не вказано іншої. Усі буфери дегазують при перемішуванні in vacuo й продувають аргоном. Насіння Sorghum bicolor (L.) Moench (гібрид SS1000 від AgriPro, Техас, США) пророщують у темряві протягом 40год. при 28°С на металевих ситах, вкритих марлею. Мікросоми приготовляють з приблизно 3-сантиметрових етіольованих сіянців. Сіянці збирають і гомогенізують з використанням ступки та пестика у 2 об'ємах (об'єм/маса) 250мМ цукрози, 100мМ Тrісіnе (рН 7,9), 2мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА) та 2мМ дитіотреїтолу (ДТТ). Перед гомогенізацією додають прлівінілполіпіролідон (0,1г/г сирої маси). Гомогенат фільтрують крізь 22мкм нейлонову тканину і центрифугують протягом 10 хвилин при 16500 x g. Супернатант центрифугують протягом 1 години при 165000 x g. Мікросомний осад ресуспендують і гомогенізують в ізоляційному буфері з використанням гомогенізатора Potter-Elvehjern з тефлоновим пестиком. Після повторного центрифугування та повторної гомогенізації гомогенат заморожують у рідкому азоті і зберігають при -80°С до використання. Приклад 2: Ферментні аналізи: Визначення загальної кількості цитохрому Р450. Визначення загальної кількості цитохрому Р450 здійснюють шляхом спектроскопії з використанням коефіцієнту екстинкції 91мМ1 сm -1 для аддукту між відновленим цитохромом Р450 та монооксидом вуглецю (А450-490) (Omura et al, J. Вiol. Chem. 239:2370-2378,1964). Приклад 3: Очищення цитохрому Р450ОХ Усі етапи, пов'язані з очищенням ферменту, здійснюють при 4°С, якщо не вказано іншої. Буфер А: 8,9% гліцерин 10мМ КН2РО4/К 2НРО4 (рН 7,9) 0,2мМ ЕДТА 2,0мМ DTT 1,0% (об'єм/об'єм) Renex 690 0,05% RTX-100 Буфер С: 8,9% гліцерин 40мМ КΗ2ΡO4/К 2ΗΡΟ4 (рΗ 7,9) 5,0мМ ЕДТА 2,0мМ DTT 1,0% (маса/об'єм) CHAPS Буфери дегазують тричі при перемішуванні in vacuo, перш ніж додати детергент та DTT. Між дегазаціями буфер продувають аргоном. Здатність різних фракцій колонки метаболізувати радіомічений ргідроксифенілацетальдоксим контролюють протягом усього процесу очищення для виявлення присутності Р450ОХ у фракціях. Мікросоми (400мг протеїну у 20мл) розводять до 100мл буфером, який складається з 8,9% гліцерину, 10мМ КН2РО4/К2НРО4 (рН 7,9), 0,2мМ ЕДТА, 2мМ DTT, після чого при постійному перемішуванні поволі додають 100мл 10мМ КН2РО4/К2НРО 4 (рН 7,9), 8,9% гліцерин, 0,2мМ ЕДТА, 2мМ DTT, 0,1% RTX-100 (об'єм/об'єм), 2% Rersex. Після подальшого перемішування протягом 30хв. та подальшого ультрацентрифугування При 150000 x g протягом 35 хвилин приблизно 190мл супернатанту наносять при швидкості потоку 100мл/год на 5х5см колонці FF/S-100 з діетиламіноетилсефарозою (20/80 сирого об'єму, Pharmacia) врівноваженої у буфері А. Діетиламіноетилсефарозну іонообмінну смолу розводять S-100Sepharose гель-фільтраційним матеріалом у співвідношенні 1:4 для уникнення надмірних концентрацій ферментів цитохрому Р450 при зв'язуванні, що може призвести до необоротної агрегації. Колонку після цього промивають 150мл буферу А. Р450ОХ слабо зв'язується з колонкою, і його виділяють головним чином у фракціях для змивання та промивання, які містять жовтий пігмент. Комбінують фракції (приблизно 200мл), що містять Р450ОХ, які розпізнають за їхньою абсорбцією при 420нм, їхніми спектрами зв'язування CO та їхньою здатністю метаболізувати оксим в експериментах з відновлення (див. Приклад 4). Їх використовують для подальшого очищення або заморожують. У змішані фракції Р450ОХ під час постійного перемішування додають краплинами у відповідній кількості суміші гліцерину та тритону Х-114 до досягнення концентрації 30% (об'єм/об'єм) гліцерину та 6% Triton X114 шляхом додавання по краплях у відповідних кількостях суміші гліцерину та Triton X-114. Перемішування триває протягом 20хв, після чого протягом 25 хвилин здійснюють центрифугування при 24500 х g, 25°С (температура, при якій відбувається розподіл фаз Triton X-114) без зупинок. Утворюють дві фази: жовту верхню фазу та прозору нижню фазу. Нижню фазу, яка містить основну частину активності цитохрому Р450ОХ, розводять у 2,5 рази до приблизно 350мл буфером С і наносять при швидкості потоку 70мл/год на 1,9х5см колонку з агарозою марки Cibacrorublue 3GA, врівноваженої у буфері С. Колонку промивають 50мл буферу С і цито хром Р450ОХ, що залишається, піддають елюції приблизно 60мл лінійного градієнту 0-1,5Μ КСІ у буфері С. Десять фракцій, які при електрофорезі додецилсульфату натрію в поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) виявляють присутність єдиної поліпептидної смуги на ділянці 50-60кДа, змішують і діалізують в атмосфері азоту протягом 24год проти 1л 8,9% гліцерину, 10мМ КН2РО4 /К2НРО4 (рН 7,9), 5мМ ЕДТА, 2мМ DTT (буфер для діалізу) для зниження вмісту солей та детергентів. Ферментний препарат заморожують у рідкому азоті й зберігають при -80°С. Приклад 4: Визначення характеристик цитохрому Р450ОХ, одержаного шляхом виділення з мікросом сорго 4.1. Визначення молекулярної маси та амінокислотної послідовності Молекулярна маса Р450ОХ, як визначено за допомогою електрофорезу з додецилсульфатом натрію в поліакриламідному гелі (SDS-PAGE), становить 55кДа. Протеїновусмугу, що відповідає Р450ох, виділеному з колонки з агарозою марки Cibacron blue 3GA, вирізають з 8-25% SDS-поліакриламідного гелю й піддають електроелюції. Електроелюйований протеїн обробляють ендопротеїназою Glu-C (секвенування протеази V8, 18год, 23°С) згідно з вказівками виробника (Boehringer Mannheim) з використанням приблизного масового співвідношення 1:100 між протеїназою та протеїном. Електроелюйований протеїн та зразок обробленого протеїну піддають SDS-PAGE, і протеїн та фрагменти переносять на мембрани ProBlott (Applied Biosystems). Забарвлені по Кумасі ділянки мембрани вирізають і піддають N-кінцевому амінокислотному секвенуванню на секвенаторі Applied Biosystems, модель 470А, оснащеному системним фенілтіогідантоїнамінокислотним аналізатором моделі 120А. N-кінцеве амінокислотне секвенування дало дві послідовності, які могли читатися незалежно одна від одної завдяки їхній різниці щодо відносного вмісту. Пошук за допомогою бази даних (BLAST) показав, що· послідовність -GLVKEGVDMEEGTL відрізняється лише в одній позиції від N-кінцевої послідовності В субодиниці АТРази вакуолей ячменю (Hordeum vulgare), яка являє собою MGLVKEGAD MEEGTL (інвентарний номер L11862). В-субодиниця ячменю має молекулярну масу, яка відповідає теоретичній 54кДа (20). Присутність В-субодиниці АТРази вакуолей як забруднюючої домішки у препараті Р450ОХ виявляли шляхом Вестерн-блотингу, який показав єдину смугу у 55кДа при використанні моноклонального антитіла, виробленого проти В-субодиниці АТРази вакуолей з коріння вівса (Dr. Heven Sze). В-субодиниця може бути видалена з препарату Р450ОХ шля хом іммобілізації на вкритих антитілами мікротитрувальних лунках. Такий підхід дозволяє напевно визначити N - кінцеву амінокислотну послідовність Р450ОХ як ATTATPQLLGGSVPEQ і, крім того, дає послідовність фрагмента пептиду внутрішнього Р450ОХ, MDRLVADLDRAAA. Спроби видалити залишкову кількість В-субодиниці АТРази вакуолей призводили до утворення спектрів різниці монооксиду вуглецю, у яких значно зростав 420нм компонент, що представляє неактивну денатуровану форму Р420 цитохрому Р450ОХ, та до втрати або значного зниження здатності до відновлення активності Р450ОХ в одержаних фракціях. Це відображає характерну для Р450ОХ нестійкість. Всубодиниця АТРази вакуолей, очевидно, не має ніяких каталітичних властивостей, пов'язаних з Ρ450ОХ. Таким чином, присутність В-субодиниці як забруднюючої домішки враховували при вивченні метаболічних перетворень за допомогою Р450ОХ, про яке сказано нижче. N-кінцева послідовність: --ATTATPQLLGGSVPEQ-- (SEQ ID NO: 3) Внутрішня послідовність: --MDRLVADLDRAAA- (SEQ ID NO: 4) 4.2. Виділення NADPH-P450-OKCMflopeflVKTa3H NАОРН-Р450-оксидоредуктазу зв'язують з DEAE-сефарозою на колонці марки FF/S-100-Sepharose й піддають елюції шляхом додавання буфер у А з 0,5Μ КСІ. Редуктазу після цього очищають до гомогенності на колонці марки 2',5'-ADP-Sepharose 4В (Pharmacia), як було описано раніше у роботі Halkier and Moller, Plant Physiol. 96:10-17, 1990, і концентрують до приблизно 15 одиниць/мл. 4.3. Приготування розчинної уридиндифосфатглюкозної (UDPG) глюкозилтрансферази Глюкозилтрансферазу частково очищають шляхом фракціонування сульфатом амонію супернатанту після центрифугування, одержаного під час приготування мікросом. Глюкозилтрансферазну фракцію осаджують 40%-60% (NH4)2SO4 і розчиняють у 5мл 50мМ трицину (рН 7,9), 2мМ DTT і діалізують проти 2л того ж самого буферу протягом доби. 4.4. Відновлення активності цитохрому Р450ОХ Відновлення ферментативної активності мікросомного цитохрому Р450 здійснюють шляхом введення цитохрому Р450 й відповідної NADPH цитохром Р450-оксидоредуктази у ліпідні міцели. Може використовува тися суміш ліпідів, але у разі цитохрому Ρ450ОХ дилауроїлфосфатидилхолін (DLPC) забезпечує найкращу ферментну активність. Кількість правильно сформованих комплексів цитохрому Р450ОХ та NADPH цитохром Р450-оксидоредуктази є фактором, що обмежує швидкість. Надмірні кількості оксидоредуктази та концентрованих ферментних розчинів використовують для забезпечення достатньої кількості активних комплексів. Функціонально відновлений фермент одержують з використанням таких компонентів: Цитохром 20мкг/мл у буфері для діалізу Ρ450ОХ: NADPH 100мкг/мл у 50мМ калійцитохром Р450- фосфа тному буфері (pH 7,9) оксидоредуктаза з Sorghum bicolor Ліпід: 10мг/мл дилауроїлфосфатидилхоліну, обробленого ультразвуком у 50мМ трицині (рН7,9) NADPH: 25мг/мл у Н 2О 14 С-оксим, 0,01мкКi/мкл, 394мКі/ммоль ферментативно одержаного з [U14 C]-L-тирозину з використанням відновленого P450TYR і очищеного шляхом РХВР 5мкл суспензії ліпіду змішують в посудині Епендорфа з 5мкл NADPH цитохром Р450-оксидоредуктази (0,075од.), 10мкл розчину цитохрому Р450ОХ (приблизно 0,4пмоль) та 0,5мкл 14С-оксиму (0,014мкКі/мкл, 394мКі/ммоль). Остаточний об'єм доводять до 30мкл з використанням 50мМ трицину (рН 7,9) і викликають ферментативну реакцію додаванням 1мкл розчину NADPH. Контрольні проби приготовляють, виключаючи NADPH цитохром Р450-оксидоредуктазу або NADPH з реакційної суміші. Посудини інкубують при постійному обережному збовтуванні при 30°С протягом 1год. Після інкубування реакційні суміші наносять на вкриті силікагелем пластинки для тонкошарової хроматографії (TIC) (Силікагель 60 F254, Merck) і проявляють з використанням суміші етилацетат/толуол (1:5 об'єм/об'єм) як рухомої фази. Пластинки поміщають на фосфорні (люмінофорні) екрани і зберігають протягом доби, й одержані в результаті продукти, р-гідроксифенілацетонітрил та р-гідроксибензальдегід, візуалізують з використанням люмінофорного фотоприймача STORM 840 від Molecular Dynamics. Далі вставлений у ліпідні міцели цитохром Р450ОХ каталізує перетворення ргідроксифенілацетальдегідоксиму на р-гідроксиманделонітрил, який дисоціює до р-гідроксибензальдегіду та HCN. Це показує, що цитохром Р450ОХ є багатофункціональними протеїном, що каталізує як перетворення р-гідроксифенілацетальдегідоксиму на р-гідроксифенілацетонітрил, так і перетворення ргідроксифенілацетонітрилу на р-гідроксиманделонітрил. Активність Р450ОХ повністю залежить від присутності NADPH-P450-оксидоредуктази та NADPH. Дитіоніт натрію (10мМ) не сприяє перетворенню р гідроксифенілацетальдоксиму. Якщо фермент не піддають діалізу перед відновленням, це викликає відносне збільшення накопичення р-гідроксифенілацетонітрилу порівняно з р-гідроксибензальдегідом. 4.5. Відтворення повного шляху синтезу дуррину з ви хідної амінокислоти тирозину in vitro Остаточні реакційні суміші містять: 3мкл виділеного, рекомбінантного P450-TYR (6пмоль, гетерологічно експресованого в Е.соІі й виділеного, як описано у Halkier et al, Arch. Biochem. Biophys. 322: 369-377, 1995), 10мкл виділеного й діалізованого Ρ450ОХ (приблизно 0,4пмоль), 5мкл NADPH-P450-оксидоредуктази (0,075од.), 1мкл частково очищеної UDPG глюкозилтрансферази з сорго, 5мкл DLPC (10мг/мл у 50мМ Крі (рН 7)), 0,25мкл [U-14С]-тирозину (0,05мкКі/ммоль, 443мКі/ммоль, Amersham), 3мкл UDPG (33мг/мл у 50мМ Кр, (рН7)) та 3мкл кастаносперміну (2мМ у 50мМ Кр, (рН7)). Компоненти змішують повторним суспендуванням, і якщо необхідно, то остаточний об'єм доводять до 30мкл шляхом використання 50мМ Крі (рН7). Ферментативну реакцію розпочинають за допомогою 1мкл NADPH (25мг/мл). Дуррин також синтезують через відновлення Р450ОХ р-гідроксифенілацетальдегідоксимом (за винятком P450TYR та тирозину з реакційних сумішей, усі додаткові компоненти залишають незмінними). Ці проби містять або 0,5мкл [U-14С]-р-гідроксифенілацетальдегідоксиму (0,014мкКі/мкл, 394мКі/ммоль), або 3мкл неміченого р-гідроксифенілацетальдегідоксиму (20мМ) як субстрат для Ρ450ОХ. В останньому випадку радіоактивною міткою є 1мкл [U-14C]-(UDPG) (0,025мкКі/мкл, 287мКі/ммоль, Amersharn). Усі реакційні суміші приготовляють у двох примірниках. Після інкубування протягом 1год. при 30°С кожен набір реакційних сумішей наносять на пластинки для тонкошарової хроматографії. Перший набір реакційних сумішей аналізують з використанням етилацетату/толуолу як розчинника за прикладом 4.5. Другий набір реакційних сумішей аналізують з використанням системи розчинників, що складається з етилацетату/ацетону/дихлорметану/ метанолу/води (20/15/6/5/4, усі - за об'ємом) для досягнення відокремлення гідрофільного продукту дуррину від тирозину і від гідрофобних проміжних продуктів. Радіомічені субстрати та продукти візуалізують з використанням люмінофорного фотоприймача STORM 840. Змішане використання виділених P450-TYR та Р450ОХ в експериментах з відновлення за допомогою радіоміченого тирозину як субстрату в результаті приводить до продукування р-гідроксифенілацетонітрилу та р-гідроксибензальдегіду. Це показує, що P450-TYR та Ρ450ОХ здатні діяти спільно in vitro. Ргідроксифенілацетальдоксим, утворений P450-TYR, таким чином, ефективно використовують як субстрат для Р450ОХ. За відсутності NADPH-Р450-оксидоредуктази або за відсутності NADPH ніякої активності не спостерігалося. In vitro продук ування дуррину з використанням р-гідроксифенілацетальдоксиму як основи здійснювали шляхом відновлення Р450ОХ разом з частково очищеною розчинною UDPG-глюкозилтрансферазою у присутності NADPH та UDPG. Клон кДНК з сорго, що кодує UDPG-глюкозилтрансферазу, яка специфічно використовує р-гідроксиманделонітрил як субстрат, є відсутнім. Відповідно, у даному дослідженні сирий екстракт розчинної UDPG-глюкозилтрансферази з сорго використовували для глюкозилування ргідроксилманделонітрилу й для того, щоб показати відновлення in vitro повного шляху біосинтезу дуррину. Застосований радіомічений р-гідроксифенілацетальдоксим повністю метаболізували. Додавали кастаноспермін для інгібування активності глюкозидази, яка спостерігається при приготуванні UDPGглюкозилтрансферази. Крім системи тонкошарової хроматографії, застосованої раніше для відокремлення гідрофобних сполук, застосовують додаткову систему тонкошарової хроматографії для відокремлення таких гідрофільних сполук, як дуррин. Р-гідроксиманделонітрил, утворений при відновленні, частково був перетворений на дуррин, про що свідчило утворення радіоміченої сполуки, яка комігрує зі справжнім дуррином. Визначення цієї радіоміченої сполуки як дуррину було підтверджене її розпадом за відсутності кастаносперміну та утворенням комігруючого радіоміченого продукту, коли експеримент був повторений з радіоміченою UDPG замість радіоміченого р-гідроксифенілацетальдоксиму. Радіомічена UDPG неспецифічно містила ряд відносно гідрофільних сполук. Через нестійкість р-гідроксиманделонітрилу його перетворення на дуррин експериментальним шляхом виявлялося через зникнення р-гідроксибензальдегіду. Коли радіомічений р-гідроксифенілацетальдоксим використовували як субстрат, крім дуррину, утворювалося багато нерозпізнаних гідрофобних радіомічених сполук. Утворення цих сполук відбувається за відсутності UDPG, але вимагає присутності розчинного екстракту, який показує, що екстракт UDPGглюкозилтрансферази має додаткову ферментативну активність. Глюкозилування фенольної групи ргідроксиманделонітрилу веде до утворення р-глюкопіранозилоксиманделонітрилу. Не спостерігалося жодного радіоміченого продукту, що комігрує зі справжнім стандартом рглюкопіранозилоксиманделонітрилу. Активність глюкозидази, яку має екстрает UDPGглюкозилтрансферази, ефективно інгібується кастаносперміном. Після in vitro відновлення показник перетворень для P450-TYR (CYP79) становить 230хв-1 (Sibbesen et al, J. Biol. Chem. 270: 3506-3511, 1995). Часткове перетворення Р450ОХ на його денатуровану Р420-форму перешкоджає визначенню цього показника. З використанням мікросомної системи значення Кm та Vmax для продукування р-гідроксиманделонітрилу з тирозину, р-гідроксифенілацетальдоксиму та ргідроксифенілацетонітрилу становлять 0,03, 0,05 та 0,10мМ і 145, 400 та 50нмоль мг протеїн -1 год-1 відповідно (Meller et al, J. Biol. Chem. 254: 8575-8583, 1979). Повний шлях біосинтезу дуррину, починаючи від вихідної амінокислоти тирозину, був відновлений in vitro шля хом поєднання P450-TYR, P450 ОХ, NADPH-Р450-оксидоредуктази у DLPC міцелах з UDPGглюкозилтрансферазою, тирозином, NADPH, UDPG та кастаносперміном. Тирозин перетворюють за допомогою P450-TYR на р-гідроксифенілацетальдоксим, який далі перетворюється на ргідроксифенілацетонітрил та р-гідроксибензальдегід за допомогою Ρ450ОХ. Накопичується певна кількість ргідроксифенілацетонітрилу, тоді як весь утворений р-гідроксиманделонітрил перетворюється на дуррин та деякі нерозпізнані сполуки. У цій серії експериментів стехіометричне співвідношення між P450-TYR та Р450ОХ становить приблизно 15. Тому нічого дивного немає у виявленні накопичення ргідроксифенілацетальдоксиму у досліді з відновленням. Накопичення р-гідроксифенілацетонітрилу, що спостерігалося, є несподіваним, оскільки попередні експерименти з мікросомами сорго показали, що ргідроксифенілацетонітрил важко накопичити й відокремити. Часткова денатурація або інактивація виділеного Р450ОХ може пояснити, чому р-гідроксифенілацетонітрил накопичується в експериментах по відновленню з виділеним Ρ450ОХ. 4.6. Зв'язування субстрату Ідентифікація Р450ОХ як багатофункціонального ферменту, що перетворює ргідроксифенілацетальдоксим на р-гідроксиманделонітрил з р-гідроксифенілацетонітрилом як проміжною сполукою, спонукала до дослідження здатності Р450ОХ до зв'язування субстрату. Для ргідроксифенілацетальдоксиму було отримано зворотний спектр І типу з мінімальною абсорбцією 381нм та максимальною абсорбцією 418нм, що свідчи ть про зміну спіну з високого на низький після додавання субстрату. При інкубуванні амплітуда зростала й досягала стабільного максимуму через приблизно 45хв. При додаванні р-гідроксифенілацетонітрилу не було отримано спектра зв'язування субстрату. Р450ОХ виявився значно лабільнішим порівняно з іншими Р450-ферментами, виділеними з сорго. Виділений Р450 ОХ дає зворотний спектр зв'язування субстрату І типу при інкубуванні з ргідроксифенілацетальдоксимом. Коефіцієнт екстинкції Е420-390 , який відповідає повному переходові від одного стану спіну до іншого, становить 130мМ-1см -1. В отриманих спектрах зв'язування субстрату максимальні амплітуди є приблизно вдвічі більшими за теоретично розраховані, навіть якщо припустити повну зміну високого спіну на низький спін. Ця невідповідність показує, що концентрацію Р450ОХ було занижено при визначенні за 450нм піком у спектрі зв'язування монооксиду вуглецю. Або ж Р420 форма Р450ОХ здатна зв'язувати оксим і, таким чином, сприяє збільшенню утвореного спектру зв'язування субстрату. Остання ймовірність може пояснити, чому максимальні амплітуди можуть бути отримані лише після тривалої інкубації. Раніше вже повідомлялося про опосередковану Р450 дегідратацію альдоксимів до нітрилів з використанням мікросом печінки (DeMaster et al, J. Org. Chem. 5074-5075, 1992). Головна різниця між системою мікросом печінки та Р450ОХ полягає у тому, що перша вимагає суворого дотримання анаеробних умов, тоді як для останнього потрібні аеробні умови, він каталізує подальшу реакцію С-гідроксилування й метаболізує (e)-, а також (Z)-ізомер. За анаеробних умов мікросоми печінки дають слабкий спектр І типу. При додаванні NADPH або дитіоніту утворюється виразний Soret-пік 442-444нм. Звідси можна зробити висновок про те, що він представляє основні активні різновиди Р450 у стані Fe (II). Вивчення спектру Р450ОХ за анаеробних умов не виявляє утворення 442нм абсорбуючого комплексу, але присутність NADPH необхідна для каталітичної активності, яка показує, що Р450ОХ також має перебувати у стані Fe (II) для того, щоб бути посередником у реакції дегідратації. Приклад 5: Утворення зонду цитохрому Р450 А-типу Полімеразну ланцюгову реакцію (PCR) здійснювали на плазмідній ДНК, виділений з односпрямованої бібліотеки плазмідної кДНК (Invitrogen) з етіольованих сіянців Sorghum bicolor(L) Moench 1-2см заввишки з використанням значною мірою виродженого інозину (І), що містить праймери, які вибірково відбирають цитохроми Р450 Α-типу (Nelson and Durst, Drug Metabolism and Drug Interactions 12: 189-206 (1995)). Праймер 1 (смисловий ланцюг) з послідовністю 5'-GCGGAATTCTTYIIICCNGARMGNTT-3' (SEQ ID NО:5) охоплює узгоджену амінокислоту послідовність FXPERF (SEQ ID NО:6), у якій X є будь-якою амінокислотою. Праймер 2 (антисмисловий ланцюг) з послідовністю 5'-GCGGATCCIIIRC AIIINCKNCKNCC-3' (SEQ ID NО:7) охоплює узгоджену амінокислоту послідовність GRRXCXG (SEQ ID NО:8). Праймер 1 та праймер 2 мали на кінцях EcoRI та ВатНІ сайти відповідно, що гарантувало клонуваня лише продуктів полімеразної ланцюгової реакції (PCR), утворених від обох праймерів, у ферментованому EcoRI/BamHI pBluescript ІІ SK (Strategene). Полімеразна ланцюгова реакція (PCR) здійснювалася у два послідовні етапи. Етап 1 з використанням праймера 1 та стандартного Т7 праймера 5'-AATACGACTC ACTATAG-3' (SEQ ID NО:9) збагачує пул кДНК, що кодують цитохроми Р450 Α-типу. Етап 2, включаючи праймер 1 та праймер 2, утворював, головним чином, один ланцюг завдовжки приблизно у 100п.н., специфічний для цитохромів Р450 Α-типу. Полімеразну ланцюгову реакцію для етапу 1 здійснювали у загальному об'ємі 100мкл, що містив 5% ДМСО, 200мкМ дезоксинуклеозидтрифосфату (dNTP), 200пмоль праймера 1, 100пмоль стандартного Т7 праймера, 2,5 одиниці Taq ДНК полімерази у PCR буфері та 1мкл розведеної у 100 разів плазмідної ДНК з бібліотеки кДНК. PCR для етапу 2 здійснювали у загальному об'ємі 100мкл, що містив 5% ДМСО, 200мкМ dNTP, 200пмоль праймера 1 та праймера 2, 2,5 одиниці Taq ДНК полімерази у PCR та 1мкл продукту, отриманого в результаті PCR етапу 1. Протягом обох етапів PCR за одним циклом у 5хв. при 95°С ішли 35 циклів по 30сек. при 95°С, 1хв. при 50°С та 30сек. при 72°С. Приблизно 100п.н. продукту PCR етапу 2 вирізали з 2% агарозного гелю й повторно ампліфікували перед клонуванням у pBluescript. З 19 секвенованих клонів 10 мали дуже високу ідентичність послідовності на амінокислотному рівні з гідроксилазою коричної кислоти (CYP 74) і тому не піддавалися подальшому вивченню. Порівняння решти 9 послідовностей поділило їх на дві групи з 8 та 1 послідовності, які отримали позначення "12" та "7" відповідно. Ген-специфічний праймер послідовності "12", розташований між праймером 1 та праймером 2: 5'-GCGGATCCGACTACTACGGCTCGC3' (SEQ ID NО:10), та праймер 5’-GCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3' (SEQ ID NО:11), які мають на кінцях ВаmНІ, використовували для ампліфікації "12" ген-специфічного фрагменту з приблизно 500п.н. PCR-етапу 1 і клонували у pBluescript. Подібним чином одержували ген-специфічний фрагмент для "7" з використанням "7" ген-специфічного .праймера 5'-GCGGATCCGAC ATC AAGGGC AGCG-3' (SEQ ID NO:12) та праймера 5'-GCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3' (SEQ ID NO:11). Вставки мітили, Digoxigenin-11-dUTP (Boehringer Mannheim) шляхом ампліфікації за допомогою PCR стандартними Т7 та Т3 праймерами згідно з вказівками виробника і використовували для скринінгу бібліотек кДНК. Приклад 6: Скринінг бібліотек та секвенування ДНК Усі фільтрувальні гібридизації здійснювали з використанням DIG-системи (Boehringer Mannheim). Шари колоній приготовляли з використанням нейлонової мембрани (Boehringer Mannheim) і гібридизували протягом доби при 68°С у 5 xSSC (розчині хлориду й цитрату натрію), 0,1% N-лауроїлсаркозин, 0,02% додецилсульфату натрію (SDS). 1% Blocking Reagent (Boehringer Mannheim). Фільтри промивали двічі протягом 15 хвилин у 0,1xSSC, 0,1% SDS при 65°С перед детектуванням. Одержували клони повної довжини для "12" та "7", про що свідчив аналіз послідовності. Секвенування здійснювали з використанням міченого Thermo Sequenase Fluorescent комплекту секвенування циклу праймера (7-deaza dGTP) (Amersham) і аналізували на ALF-Express (Pharmacia). Комп'ютерний аналіз послідовності здійснювали з використанням програми у GCG Wisconsin Sequence Analysis Package. КДНК послідовність повної довжини Р450ОХ і похідна амінокислотна послідовність кодуючої ділянки, отримані в результаті секвенування нуклеотиду "12", подані у SEQ ID NO: 1 та SEQ ID NO:2 відповідно. Приклад 7: Експресія в Е. Соlі Вектор експресії pSP19g10L (Barnes, Methods in Enzymology 272: 3-14, 1996) одержали у д-ра Генрі Барнза (Dr. Henry Barnes (Synthetic Genetics/Immune Complex Incorporation. San Diego, CA)). Ця плазміда містить lacZ промотор, злитий з короткою лідерною послідовністю гена 10 з T7 бактеріфага, g10L, яка була зафіксована як відмінна лідерна послідовність для експресії різних гетерологічних протеїнів (Olin et al., 1988). "7" та "12" були змінені шляхом PCR з використанням Рwо-полімерази (Boehringer Mannheim) для введення NdеІ-сайту у старт-кодоні й для зміни стоп-кодону до ochre стоп-кодону, після якого безпосередньо йде HindIII сайт. Для утворення експресійного клону для "7" використовували праймер 3 (смисловий ланцюг) 5’-CGCGGATCC ATATGGACGC ATC ATTAC T CCTCTCCGTCGCGCTC-3’ (SEQ ID NO:13) та праймер 4 (антисмисловий ланцюг) 5’-CGCAAGCTTATTACATCTCAACGGGGACCCT-3' (SEQ ID'NO:14). Праймер З вводить мовчазні мутації у кодони 3, 4 та 5 для зниження вмісту G/C навколо сайту ініціації трансляції та ВаmHI сайту безпосередньо перед NdeI сайтом. Одержаний PCR-фрагмент ферментували ВатНI та HindIII і лігували у ферментований ВаmHI та HindIII pBluescnpt і контролювали шляхом секвенування для виключення помилок PCR. Подібним чином "12" вводили у pBluescnpt з використанням праймера 5 (смисловий ланцюг) 5'-CGCGGATCC ATATGGC AACAAC AGCAACCCCGCAGCTCCTC-3' (SEQ ID NO:15) та праймера 6 (антисмисловий ланцюг) 5'-CGCAAGCTTATTATGCTGCGCGGC GGTTCTTGTATTTGG-3’ (SEQ ID NO:16). Праймер 5 вводить мовчазні мутації у кодони 2, 3, 4 та 5, а праймер 6 вводить мовчазні мутації в останні 2 кодони для зниження вмісту G/C. Вставки вирізали з використанням NdeI та HindIIl і лігували у ферментований NdeI та HindIII pSP19g10L. Експресійні плазміди перетворювали на JM109-клітини Е. соIі. Одиничні колонії вирощували протягом доби у LB-середовищі, що містило 100мг ампіциліну/мл при 37°С та 5мл вчорашньої культури, використовуваної для інокуляції 500мл ТВ-середовища, що містило 50мг/мл ампіциліну, 1мМ тіаміну, 1мМ ізопропіл-b-тіогалактопіранозиду та 1мМ 5-амінолевулінової кислоти. Клітини вирощували при, 28°С протягом 48 годин при 125об/хв. 1мл. Е. соIі перетворювали за допомогою експресійних послідовностей "7", "12"; i pSP19g10L осаджували центрифугуванням (2000г, 10хв), промивали й концентрували у 10 разів у 50мМ трицину рН 7,9 й інкубували з 14пКі [U-14C] р-гідроксифенілацетальдегідоксиму зі специфічною активністю 394мКі/ммоль при 30°С протягом 30хв. Інкубовані суміші екстрагували етилацетатом, нанесеним на пластинку для тонкошарової хроматографії (Силікагель 60 F254, Merck), проявляли з використанням суміші етилацетату/толуолу (1:5 об'єм/об'єм) як мобільної фази і візуалізували з використанням апарату STOR M 840 від Molecular Dynamics. E. соIі, перетворена послідовністю, що експресує "12", була здатна перетворювати ргідроксифенілацетальдегідоксим на р-гідроксифенілацетонітрил. CO різницеві спектри солюбілізованих сферобластів Е. соIі, які експресують Р450ОХ мали найвищий пік 417нм і найнижчий пік 457нм. Взагалі, СО-спектр з піком оптичної густини близько 420нм є показником цитохрому Р450 у нефункціональній конформації (Imai et at, Eur. J. Biochem. 1: 419-426,1964). Наявність найвищого піка 417нм свідчить про присутність більшої частини експресованого цитохрому Р450 у нефункціональній конформації. Явний зсув піка оптичної густини з 450нм до 457нм може бути зумовлений присутністю великої кількості цитохрому Р450 у неконформаційному стані. На основі піка 457нм було розраховано вихід 50нмоль Р450ОХ на 1 літр культури Е. соIі за 65 годин. 5мкл мембран, виділених, як описано у роботі Halkier et al, Archives of Biochemistry and Biophysics 322: 369-377, 1995, з Ε. coli, що експресує "12", було відновлено 0,225 одиницями NADPH-цитохром Р450редуктази, 50мкг NADPH, 42пСі р-гідроксифенілацетальдегідоксиму та 100мкг дилаурилфосфатидилхоліну в загальному об'ємі 100мкл 30мМ трицину, рН 7,9. Після інкубування при 30°С протягом 30 хвилин реакційну суміш наносили на пластинку для тонкошарової хроматографії й аналізували, як описано вище. Відновлення мембрани з Е. соIі, що експресує "12" вело до накопичення р-гідроксибензальдегіду, який є стабільним продуктом дисоціації р-гідроксиманделонітрилу, останнім проміжним продуктом біосинтезу ціаногенного глюкозиду дуррину. Це свідчить про те, що "12" є цитохромом Р450, який каталізує перетворення р-гідроксифенілацетальдегідоксиму на р-гідроксиманделонітрил. КДНК позначають як Ρ450ОХ. Клон, що включає описану кДНК Р450ОХ, був зданий на зберігання 10 січня 1997р. до Німецького зібрання мікроорганізмів та культур клітин (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig) під інвентарним номером DSM 11367. Коли радіомічений р-гідроксифенілацетальдоксим вводили до клітин Е. соIі, перетворених Р450ОХ, ргідроксифенілацетонітрил накопичувався у клітинах Е. соIі, що експресують Ρ450ОХ. Ε. соIі, що не містять ендогенних цитохромів Р450 або NADPH-цитохром Р450-редуктази, виявили підтримку каталітичної активності гетерологічно експресованих цитохромів Р450. Два розчинних флавопротеїди Е. соIі, флаводоксин та NADPH-флаводоксинредуктаза, передають відновлюючі еквіваленти рекомбінантним цитохромам Р450. Відновлення виділених мембран Е. соIі або очищеного рекомбінантного ферменту за допомогою NADPH-цитохром Р450-редуктази сорго веде до перетворення р-гідроксифенілацетальдоксиму на р-гідроксиманделонітрил, тоді як клітини Е. соIі, що експресують Р450ОХ, метаболізують ргідроксифенілацетальдоксим лише до р-гідроксифенілацетонітрилу. Нездатність Е. coli підтримувати перетворення р-гідроксифенілацетонітрилу на р-гідроксиманделонітрил є першим прикладом того, що система Е. соIі флаводоксин/NАDРН-флаводоксинредуктаза, не здатна підтримувати каталітичну активність реакції мікросомного цитохрому Р450. Попередні експерименти по відновленню з мембранною та розчинною фракціями клітин Е. соIі, що експресують Р450ОХ, показали, що система розчинний флаводоксин/NАDРН-флаводоксинредуктаза лише підтримує Р450ОХ у перетворенні ргідроксифенілацетальдоксиму на р-гідроксифенілацетонітрил і що інгібуючий фактор, який перешкоджає подальшій реакції гідроксилування, відсутній у розчинній фракції. Нездатність Е. соIі підтримувати повну активність Р450ОХ може відображати нетипову каталітичну реактивність Ρ450ОХ. У клітинах Е. соIі, перетворених за допомогою Р450ОХ або вектора експресії, накопичується сполука з дещо нижчою мобільністю, ніж у р-гідроксифенілацетальдоксиму. Це показує, що Е. соIі може метаболізувати ргідроксифенілацетальдоксим незалежно від присутності Ρ450ОХ. Приклад 8: Очищення рекомбінантного Р450ОХ (CYP71E1) Сферобласти з 2 І Е. соIі, що експресують Р450ОХ, піддавали розподілу фаз під впливом температури за допомогою 1% тритону Х-114, як було описано вище (Halkieret al, Archives of Biochemistry and Biophysics 322: 369-377, 1995). Верхню фазу, що містить Р450ОХ, розводили у 100 разів у 10мМ КР, рН 7,0, 0,05% відновленого тритону Х-100, 1мМ DTT, 0,5мМ фенілметилсульфонілфториду (PMSF), рН доводять до 7,0 оцтовою кислотою й подають на 16мл колонку швидкого потоку CM-Sepharose (Pharmacia), врівноважену у буфері D (10мМ КР, рН 7,0, 0,2% тритону Х-114, 0,05% відновленого тритону Х-100, 10% гліцерину, 1мМ DTT, 0,5% PMSF). Колонку промивали у буфері D і Р450ОХ елюювали 0-1Μ КСІ лінійним градієнтом (350мл) у буфері D. Комбіновані фракції, що містять Р450ОХ (43мл), використовували для експериментів з відновлення, а електроелюйований рекомбінантний Р450ОХ використовували для вироблення антитіла у курчат. Очищений рекомбінантний Р450ОХ, відновлений NADPH-цитохром Р450-редуктазою у DLPC каталізує перетворення р-гідроксифенілацетальдегідоксиму на р-гідроксиманделонітрил у присутності NADPH, як описано у прикладі 4, розділ 4.2 для очищення рослинних ферментів. Приклад 9: Експресія дуррину у трансгенних рослинах Arabidopsis та тютюні 9.1 Побудова векторних плазмід Утворювали три бінарні вектори для опосередкованого Agrobacterium tumefaciens перетворення, а саме - pPZP111.79, pPZP221.71E1 та pPZP111.79E1. Для побудови pPZP111.79 клон кДНК з P450TYR (WO95/16041; Koch et al, Arch Biochem Biophys 323:177186, 1995) спочатку вирізають за допомогою EcoRI і вводять у EcoRI сайт pRT101 (Kopfer et al, Nucleic Acids Research 15:5890, 1987) для функціонального приєднання кДНК до 35S-промотора та плазміди pRT101,79, що генерує сигнал поліаденілування CaMV. Перед введенням P450TYR кДНК частину полілінкера pRT101 видаляють шляхом ферментації за допомогою Sad та Xbal, після чого здійснюють релігування "тупих" кінців, отриманих способом Кленова, залишаючи, таким чином, лише EcoRI та Xhol сайти. P450TYR, включаючи 35S-промотор та сигнал поліаденілування CaMV, вирізають з pRT101,79 з використанням Sphl. Для утворення плазміди pPZP111,79 кінці "затуплюють" полімеразами Кленова, і отриманий фрагмент лігують у вирізану EcoRI плазміду pPZP111 (Hajdukiewicz et al, Plant МоI Biol 25: 989-994, 1994), кінці якої також були "затуплені" полімеразою Кленова й дефосфорильовані. Для побудови pPZP221.71 E1 клон кДНК Р450ОХ спочатку вирізають за допомогою Крпіта Xbal й лігують у КрnІ та Xbal сайти pRT101, утворюючи pRT101.71 E1. Після цього Р450ОХ, включаючи 35S-промотор та сигнал поліаденілування CaMV, вирізають з pRT101.71 Е1 за допомогою HindlII і лігують у HindIIl І сайт pPZP221 (Hajdukiewicz et al, Plant МоI Biol 25: 989-994, 1994), таким чином, утворюючи pPZP221.71 E1. Для створення pPZP111.79.71E1 клон кДНК Р450ОХ, включаючи 35S-промотор та сигнал поліаденілування CaMV, вирізають з pPZP221.71E1 з використанням HindlII, "затуплюють" полімеразою Кленова й лігують у SmaI сайт pPZP111,79. 9.2 Перетворення Arabidopsis thaliana Бінарні вектори pPZP111, pPZP221, pPZP-111.79, pPZP221.71E1 та pPZP111.79.71E1 вводять у штам Agrobacterium tumefaciens C58C1/pGV3850 шляхом електропорації, як описано у роботі Wenjun and Forde, Nucleic Acids Research 17: 8385, 1989. Arabidopsis thaliana, екотип Colombia, перетворюють шляхом вакуумної інфільтрації, практично так, як описано у роботі Bechtold et al, Molecular Biology and Genetics 316:1194-1199, 1993. Трансформанти відбирають на пластинках для мас-спектрометрії, що містять 50мкг/мл канаміцину для pPZP111-векторів, або 200мкг/мл сульфату гентаміцину для pPZP221-векторів. Через 4-6 тижнів після проростання рослини, резистентні до канаміцину або гентаміцину, переносять у грунт. 9.3 Перетворення Nicotiana tabacum cvXhanti Nicotiana tabacum cv Xhanti перетворюють практично згідно зі способом перетворення листових дисків, описаним у роботі Svab et al, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor, pp.55-60, 1995, з використанням Agrobacterium tumefaciens C58C1/pGV3850 перетворену за допомогою pPZP111.79, pPZP221.71E1 або pPZP111.79.71 E1. 100мкг/мл канаміцину використовують для відбору трансформантів за допомогою pPZP111,79-вектора, 100мкг/мл сульфату гентаміцину - для відбору трансформантів за допомогою pPZP221.71E1-вектора, і 50мкг/мл G-418 - для відбору трансформантів за допомогою ρΡΖΡ111.79.71Ε1-Ββκτορ3. Після утворення кореневої системи рослини переносять у грунт і вирощують в оранжереї. 9.4 Визначення дуррину Вміст дуррину визначають з застосуванням спектрофотометричного ціанідного аналізу, раніше описаного у роботі Halkier et al, Plant Physiol 90: 1552-1559, 1989, тільки у даному разі 5-10мг тканини листя тричі заморожують і розморожують, перш ніж додати 0,1мг b-d-глюкозидази, Тип II (Sigma). 9.5 Аналіз трансгенної рослини Arabidopsis thaliana Відірвані листки A. thaliana просочують 2мкл (ІІ-14С)-тирозину (0,05мкКі/мкл, 443 мКі/ммоль, Amersham) і залишають на добу у 100мкл Н 2О у закритих посудинах Епендорфа. Метаболіти екстрагують шляхом кип'ятіння 90% метанолу протягом 5хв, екстракти концентрують і наносять на пластинки для тонкошарової хроматографії (Силікагель 60 F254). Ме таболіти відокремлюють у трьох різних системах розчинників, залежно від їхньої гідрофобность/гідрофільності. Систему розчинників етилацетат/ацетон/дихлорметан/метанол/вода (20/15/6/5/4, усі - за об'ємом) в оптимальному варіанті використовують для відокремлення різних ціаногенних глюкозидів. Система розчинників ізопропанол/етилацетат/вода (7/1/2) відокремлює різні глюкозинолати. Система розчинників толуол/етилацетат (5/1) відокремлює гідрофобні проміжні продукти. Радіомічені субстрати та продукти візуалізують з використанням люмінофорного фотоприймача STORM 840 (Molecular Dynamics, USA). Метанольні екстракти .листя A. Thaliana, які аналізували шляхом тонкошарової хроматографії рослин, перетворених за допомогою P450TYR та Р450ОХ з використанням A. tumefaciens C58C1/pGV3850/pPZP111.79.71E1, виявляють присутність нової сполуки, яка комігрує з ціаногенним глюкозидом дуррином. Обробка радіоміченим тирозином відірваних листків показує, що радіомітка міститься у см узі, яка комігрує з дуррином. Колориметричний ціанідний аналіз усієї тканини листя перетвореної рослини (Lambert et al, 1975, Analytic Chemistry 47, 917-919) виявляє, що Т1 трансформанти містили від 1 до 6нмоль ціаніду/мг сирої маси. На відміну від них, контрольні рослини, перетворені лише nptll з використанням A. tumefaciens C58C1/pGV3850/pPZP111 виявили вміст ціаніду 1,2±0,35нмоль на мг сирої маси. У диких рослин A. thaliana не було виявлено вмісту ціаногенних глюкозидів, і видимий рівень ціаніду, виявлений у контрольних рослинах, найбільш імовірно відображає присутність тіоціанатів. Тіоціанати є продуктами розпаду глюкозинолатів, і відомо, що вони дають несправжню реакцію при колориметричному ціанідному аналізі (Epstein, 1974, Analytic Chemistry 19, 272-274). Продукування великої кількості ціаногенного глюкозиду дуррину в результаті введення Ρ450TYR та Р450ОХ, яке спостерігалося на прикладі A. Thaliana, свідчить про присутність UDP-глюкозилтрансферази, яка глюкозилує р-гідроксиманделонітрил, утвореного у правильній позиції. Оскільки стереоспецифічність глікозилтрансферази не відома, то існує можливість того, що утворений ціаногенний глюкозид насправді є таксифіліном, який є епімером (дзеркальним ізомером) дуррину. Коли Ρ450TYR вводять за допомогою C58C1/pGV3850/pPZP111.79 A. tumefaciens в A. Thaliana, у великій кількості накопичується сполука, яка комігрує з похідним від тирозину глюкозинолатом, ргідроксибензилглюкозинолатом. Це свідчить про те, що введення Ρ450TYR веде до утворення ргідроксифенілацетальдоксиму з тирозину. Похідний від тирозину оксим у такому разі далі метаболізується ферментами шляхом глюкозитпату до р-гідроксибензилглюкозинолату. Це чітко показує, що фермент, який за оксимом на шляху глюкозинолату, має низьку субстратну специфічність по відношенню до структури бокових ланцюгів і що профіль глюкозинолату в цілому визначають за субстратною специфічністю першого цитохрому Р450 на цьому шляху. Субстратна специфічність Р450ОХ є не такою вузькою, як у P450TYR. Р450ОХ може метаболізувати інші похідні від амінокислот оксими, наприклад, похідний від фенілаланіну оксим, фенілацетальдоксим, тоді як P450TYR може лише метаболізувати тирозин. При введенні Ρ450ОХ у рослини, що продукують глюкозинолат, таким чином, можна сподіватися, що ціаногенні глюкозиди накопичуються як утворені похідними від амінокислот оксимами на шляху біосинтезу глюкозинолату. Оскільки Ρ450TYR та Р450ОХ взаємодіють з ферментами та попередниками на шляху біосинтезу глюкозинолату, очікуєься, що профіль глюкозинолату також має бути змінений. 9.6 Аналіз трансгенної рослини Nicotiana tabacum cv Xhanti Виділені з рослин тютюну мікросоми, які були перетворені за допомогою pPZP111.79 і функціонально експресують CYP79, каталізують формування тирозину у р-гідроксифенілацетальдоксим. Метанольні екстракти з відірваних листків тютюну, що експресують CYP79 і оброблені радіоміченим тирозином, містять три додаткові мічені смуги порівняно з дикою рослиною тютюну, про що свідчить аналіз шляхом тонкошарової хроматографії з використанням системи розчинників ізопропанол/етилацетат/вода (7/1/2). Додаткові три смуги комігрують у тонкошаровій хроматографії з міченими смугами, виявленими у дикому тютюні, обробленому радіоміченим р-гідроксифенілацетальдоксимом. При, аналізі у системі розчинників толуол/етилацетат (5/1) підтверджується, що одна зі смуг є р-гідроксифенілацетальдоксимом, про що свідчить коміграція з холодними стандартами. Ідентичність двох додаткових смуг досі не виявлена, але, судячи з їх мобільності удво х системах розчинників, вони мають бути менш гідрофобними, ніж ргідроксифенуіацетальдоксим, і найвірогідніше, вони є глікозильованими похідними ргідроксифенілацетальдоксиму. Аналіз CYP79-рослин підтверджує, що CYP79 може функціонально експресуватися у тютюні і що при цьому утворюється певна кількість вільного ргідроксифенілацетальдоксиму, але більша частина утвореного р-гідроксифенілацетальдоксимудалі метаболізується рослинами. Рослини, що експресують P450TYR та Р450ОХ, можуть бути одержані шляхом схрещування рослин, що експерсують P450TYR, з рослинами, що експресують Ρ450ОХ. Або ж рослини, що експресують P450TYR або Р450ОХ, можуть бути заново перетворені за допомогою A. tumefaciens C58C1/pGV3850/pPZP221.71E1 або A. Tumefaciens C58C1/pGV3850/ pPZP111.79, користуючись тим, що дві послідовності цитохромів Р450 зв'язуються з двома різними невиключними маркерами резистентності, nptll та аасСІ. Приклад 10: Експресія дуррину у трансгенній кукурудзі 10.1 Створення векторних плазмід Наступні два вектори, рСІВ 9842 та рСІВ 9833, утворюються протягом біолітичного перетворення кукурудзи за допомогою P450TYR та Р450ОХ. рСІВ 9842: КДНК клон, що кодує P450TYR, клонований у EcoRI сайт pBluescript II SK, як описано у WO95/16041, використовують для утворення ВаmНІ сайту у старт-кодоні ATG кодон та ВgІ II сайт у стопкодоні шляхом PCR. ВаmНІ-ВgІ II фрагмент, що містить ген P450 TYR, клонують у ВаmНІ та ВgІ II розрив рСІВ 9805, рослинний вектор експресії на основі pUC19, підданий інженерії за допомогою Aflll/Notl/Ascl сайтів за 256 пар нуклеотидів до Hindlll сайту і через 778п.н. після ВgІІІ сайту, що містить промотор на зразок металотіоніну, описаний в ЕР-А-452269, та 35S термінатор. рСІВ 9833: Р450ОХ кДНК клон за Прикладом, клонований у a Notl-BstXI сайт pcDNAII (In vitrogen) використовують для утворення ВаmНІ сайту у старт-кодоні ATG та ВgІ II сайту у стоп-кодоні. ВаmНІ-ВgІ II фрагмент, що містить Р450ОХ ген, також клонують у рСІВ 9805, обрізаний за допомогою ВаmНІ та ВgІІІ. 10.2 Способи перетворення кукурудзи Ембріогенні калюсні культури І типу (Green et at, 1983; Wan et al, 1994) ланкастерського інбридингу ініціювали з недорозвинених ембріонів, 1,5-2,5мм завдовжки. Ембріони асептично вирізають зі стерильної поверхні вирощувани х в оранжереї колосків приблизно через 14 днів після запилення, поміщують у середовище Дункана для ініціації калюсу з 2% цукрози та 5мг/л хлорамбену і культивують у темряві. Ембріогенну реакцію видаляють з експлантатів приблизно через 14 днів і поміщують на стабілізуюче середовище Дункана з 2% цукрози та 0,5мг/л 2,4-d. Через 4-8 тижнів щотижневого пересаджування для оновлення стабілізуючого середовища з'являються високоякісні компактні ембріогенні культури. Активно зростаючі ембріогенні фрагменти калюсу відбирають як тканини-мішені для введення генів. Фрагменти калюсу поміщують на планшети-мішені, що містять стабілізуюче середовище з 12% цукрози приблизно за 4 години до введення генів. Фрагменти калюсу розташовують колами, за 8 та 10мм від центру планшетумішені. Плазмідну ДНК осаджують на золоті мікроносії, як описано у посібнику DuPont Biolistics. Від двох до трьох мкг кожної плазміди використовують у кожному 6-дозовому препараті. Гени вводять у тканинні клітини-мішені з використанням пристрою PDS-I000He Biolistics. Параметри пристрою Biolistics є такими: 8мм між диском розриву та макроносієм, 10мм між макроносієм та гальмуючим екраном і 7см між гальмуючим екраном та мішенню. У кожен планшет-мішень двічі вводять дозу з використанням дисків розриву 650psi. Між гальмуючим екраном та тканиною-мішенню розміщують сито з нержавіючої сталі 200x200 (McMaster-Carr, New Brunswick, NJ). Через сім днів після введення генів фрагменти тканин-мішеней переносять з високоосмотичного середовища до селективного середовища, що містить 100-120мг/л глюфозинату амонію (Basta). Усі амінокислоти видаляють з селективного середовища. Через 5-8 тижнів на селективному середовищі високого рівня усі колонії, що розвиваються, переносять до середовища, яке містить 20мг/л Basta. Ембріогенний калюс переносять кожні 2 тижні протягом 4-8 тижнів, а потім переносять до зміненого MS-середовища, що містить 3% цукрози, 0,25мг/л анцимідолу, 0,5мг/л кінетину без селективного агента і ставлять під світло. Анцимідол та кінетин видаляють через 2 тижні. Паростки, що відновлюються, з корінням або без нього, переносять до ящиків Магента, що містять MS-середовище з 3% цукрози, і молоді рослини з корінням зрештою відновлюються і їх переносять у гр унт в оранжереї. Приклад 11: Ідентифікація гомологів P450TYR у видах, що містять глюкозинолат, шляхом PCR На основі комп'ютерного визначення послідовності гомолога P450 TYR Arabidopsis EST (інвентарний номер Т42902) та гомолога P450TYR від Sinapis конструюють два вироджені олігонуклеотиди-праймери, які дозволяють ампліфікувати фрагменти PCR гомологів P450TYR з видів геномної ДНК, що містять глюкозинолат. Смисловий ланцюговий праймер (5’-GCGGAATTCAARCCIGAR MGIC AYYT-3') о хоплює збережену амінокислотну послідовність KPERHL (SEQ ID NO: 18) і включає сайт клонування EcoRI. Антисмисловий ланцюговий праймер 2 (5'-GCGGATCCRCAICCICKYTTICCNGT-3') охоплює збережену амінокислотну послідовність TGKRGC (SEQ ID NO: 19) і включає сайт клонування ВаmНІ. PCR здійснюють на геномній ДНК, приготовленій з використанням комплекту Nucleon Phytopure Plant DNA Extraction з Амстердаму. PCR здійснюють у загальному об'ємі 100мкл, що містить 5% ДМСО, 200мкМ dNTP, 200пмоль кожного праймера, 2,5 одиниць Tаg-полімерази у буфері для PCR (50мМ КСІ, 10мМ Tris-HCI (pH 8,8), 1,5мМ МgСІ2 та 0,1 % тритону Х-100) з використанням 1мкг геномної ДНК з Sinapis alba, A. thaliana, Brassica napus, Tropaeolum majus або N. tabacum cv Xhanti. PCR здійснюють у чотири послідовні етапи: етап 1: один цикл у 5 хв. при 95°С; етап 2: 5 циклів по 30сек. при 95°С, 30сек. при 55°С, 30сек. при 72°С; етап 3: 30 циклів по 30сек. при 95°С, 30сек. при 60°С, 30сек. при 72°С; і етап 4: один цикл у 5 хв. при 72°С. Для утворення достатньої кількості смуги приблизно у 100п.н. з Т. majus, етап 2 може бути змінений на 5 циклів по 30сек. при 95°С, 30сек. при 50°С, 30сек. при 71°С. Продукти PCR очищають з використанням комплекту QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), рестрикційно обробляють за допомогою EcoRI та SamHI і відокремлюють на 3% ТАЕ-агарозному гелі. Вирізають домінантний ланцюг приблизно у 100п.н. і лігують у лінеаризований за допомогою FcoR\/BamHl pBluescript II SK (Stratagene). Приблизно 10 клонів з кожних з 5 зразків секвенують з використанням комплекту для секвенування з флуоресцентно міченим праймером Thermo Sequence Fluorescent-labelled Primer (7-deaza dGTP) (Amersham) і аналізують на ALF-Express (Pharmacia). З чотирьох видів, що містять глюкозинолат, S. alba, A. thaliana, В. Napus та Т. majus ідентифікують фрагменти PCR, що кодують збережену амінокислотну послідовність, KPERH(L/F)NECSEVTLTENDLRFISFSTGKRGC (SEQ ID NO: 20 та 21 відповідно). Ця узгоджена амінокислотна послідовність є ідентичною раніше ідентифікованим гомологічним P450TYR послідовностям з S. alba та A. Thaliana і є дуже подібною до амінокислотної послідовності P450tyr. З рослини, що не містить глюкозинолату, N. tabacum cv Xhanti фрагмент PCR, що кодує цю узгоджену послідовність, ідентифіковано не було. Присутність цієї гомологічної P450TYR узгодженої амінокислотної послідовності у наведених чотирьох видах рослин, що містять глюкозинолат, показує, що цито хром Р450 амінокислотної Nгідроксилази з родини P450TYR перетворює вихідні амінокислоти або вихідні амінокислоти з видовженими ланцюгами на відповідні оксими у глюкозинолатах. Утворення фрагментів PCR, специфічних для гомологів P450TYR дозволяє здійснювати виділення гомологічної кДНК або геномних клонів з відповідних бібліотек. Хоча цей винахід був описаний у деяких деталях шляхом ілюстрацій та прикладів з метою більш чіткого розуміння, зрозуміло, що у ньому можливі певні зміни без відхилення від суті формули. ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ (1) ЗАГ АЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ: (і) ПОДАВЕЦЬ: (A) Н АЗВА: CIBA-GEIGY AG (Б) ВУЛИЦЯ: Klybeckstr. 141 (B) МІСТО: Базель (Д) КРАЇНА: Швейцарія (Е) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС (ZIP): 4002 (Є) ТЕЛЕФОН: +41 61 69 11 11 (Ж) ТЕЛЕФАКС: + 41 61 696 79 76 (З) ТЕЛЕКС: 962 991 (A) Н АЗВА: Ro yal Veterinary & Agricultural University (Королівський університет ветеринарії та сільського господарства) (Б) ВУЛИЦЯ: 40, Thorvaldsensvej (B) МІСТО: Фредеріксберг (Г) ОКРУГ: Копенгаген (Д) КРАЇНА: Данія (Е) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС (ZIP): 1871 (іі) НАЗВА ВИНАХОДУ: Цито хром-Р450-монооксигенази (ііі) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 21 (iv) ФОРМА КОМП'ЮТЕРНОГО ЗЧИТУВАННЯ: (A) ТИП НОСІЯ: Дискета (Б) КОМП'ЮТЕР: IBM PC (B) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (Г) ПРОГРАМА: Patentin Release #1,0, Version #1,25 (ЕРО) (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 1: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 1929 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: подвійна (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: кДНК (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Р450ОХ (іх) ОСОБЛИВІСТЬ: (А) Н АЗВА/КОД: CDS (Б) РОЗМІЩЕННЯ: 81..1673 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 1 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 2: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 531 амінокислота (Б) ТИП: амінокислота (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: протеїн (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 2: (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 3: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 16 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: невідома (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ν) ТИП ФРАГ МЕНТУ: N-кінцевий (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: N-кінцевий пептид (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 3: (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 4: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 13 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (B) ЛАНІДЮГОВІСТЬ: невідома (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ν) ТИП ФРАГ МЕНТУ: N-кінцевий (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Внутрішній пептид (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 5: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 26 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Праймер 1 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 6: GCGGAATTCT TYIIICCNGA RMGNTT (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 5: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 6 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: невідома (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ν) ТИП ФРАГ МЕНТУ: внутрішній (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Амінокислоти, кодовані праймером 1 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 6: (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 7: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 26 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Праймер 2 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 7 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 8: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 7 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: невідома (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ν) ТИП ФРАГ МЕНТУ: внутрішній (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Амінокислоти, кодовані праймером 2 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 8 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 9: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 17 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: 77 праймер (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 9 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 10: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 24 пари нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна ) (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: специфічний до гену "12" праймер (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 10: (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 11: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 25 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 11: (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 12: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 24 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: специфічний до гену "7" праймер (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 12: 2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 13: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 44 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Праймер 3 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 13: (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 14: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 31 пара нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Праймер 4 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 14 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 15: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 41 пара нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Праймер 5 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 15: (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 16: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 39 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (vii) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Праймер 6 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 16 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 17: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 542 амінокислоти (Б) ТИП: амінокислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: невідома (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: протеїн (ііі) ГІПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: НЕМАЄ (іii) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: НЕМАЄ (ν) ТИП ФРАГ МЕНТУ: внутрішній (vi) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: (Б) ШТАМ: Sinapls alba (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 17 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 18: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 6 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ііі) ГІПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: НЕМАЄ (ііі) АНТИСМИСЛОВI ПОСЛІДОВНОСТІ: НЕМАЄ (ν) ТИП ФРАГ МЕНТУ: внутрішній (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 18: (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 19: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 6 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ііі) ГІПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: НЕМАЄ (ііі) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: НЕМАЄ (ν) ТИП ФРАГ МЕНТУ: внутрішній (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 19: (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 20: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 31 амінокислота (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ііі) ГІПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: НЕМАЄ (ііі) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: НЕМАЄ (ν) ТИП ФРАГ МЕНТУ: внутрішній (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 20: (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID NO: 21: (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 31 амінокислота (Б) ТИП: амінокислота (B) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ііі) ГІПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: НЕМАЄ (ііі) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: НЕМАЄ (ν) ТИП ФРАГ МЕНТУ: внутрішній (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 21:

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Cytochrome p450 monooxygenases

Назва патенту російською

Цитохром р450 монооксигеназы

МПК / Мітки

МПК: C12N 15/82, C12N 9/02

Мітки: р450-монооксигенази, цитохром

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/23-72185-citokhrom-r450-monooksigenazi.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Цитохром р450-монооксигенази</a>

Подібні патенти