Спосіб очищення цитохрому р450 ароматази

Спосіб очищення цитохрому Р450 ароматази, який передбачає гомогенізацію вихідної сировини, виділення мікросом, екстрагування мікросомальних білків та елюцію ферменту, який відрізняється тим, що перед елюцією до екстракту додають рівний об'єм 40-60 мг/мл суспензії агарози, до якої ковалентно приєднують 17-метилтестостерон через спейсер - янтарну кислоту в 0,05-0,2 М трисНСІ буфері при рН 7,3-7,5, витримують протя-гом 3-7 хвилин при температурі 35-40°С з наступним центріфугуванням протягом 5 хвилин при 10000 g Винахід відноситься до біохімії та може бути використаний у ферментній технологи, біохімічних та акушерсько-гінекологічних дослідженнях З того рівня техніки, що існує в даній галузі, відомий спосіб очищення цитохрому Р450 D1, який був описаний у статті James М О Isolation of cytochrome P450 from hepatopancreas microsomes of spiny lobster, Panuhrus argus, and determination of catalytic activity with NADPH cytochrome P450 reductase from vertabrate liver Arch Bioehem Biophys , 1990, 282, № 1, p 8-17, що був обраний як прототип За цим способом гепатопанкреас гомогенізують у 0,25 М водному розчині сахарози, виділяють мікросоми методом діференціиного центрифугування та екстрагують мікросомальні білки шляхом обробки мікросом 1% водним розчином холату б підвищити вихід ферменту, ступінь його очищення, а також чистоту препарату Поставлена задача вирішується таким чином у способі очищення цитохрому Р450 ароматази, що передбачає гомогенізацію вихідної сировини, виділення мікросом, екстракцію мікросомальних білків та елюцію ферменту Перед елюцією до фермету додають рівний об'єм 40-60 мг/мл суспензії агарози, до якої ковалентно приєднюють 17-метилтестостерон через спейсер - янтарну кислоту, в 0,05-0,2 М трис-НСІ буфері при рН 7,3-7,5, витримують протягом 3-7 хвилин при температурі 3540°С з наступним центрифугуванням протягом 5 хвилин при 10000 g Введення таким чином здійсненого афінного осадження разом з відомими операціями надає можливість отримати гомогенний препарат цитохрому Р450 ароматази з високим виходом ферменту та ступенем його очищення у зв'язку з абсолютною спорідненістю між ферментом та субстратом Більша частина ферменту, що знаходиться у бюматеріалі, зв'язується з субстратом, який ковалентно з'єднаний з сорбентом (агарозою) та осаджується, а сторонні білки легко елімінуються, тому що не споріднені ні до субстрату, ні до агарози Спосіб здійснюється таким чином Приклад 1 Матку щойно декапітованих тварин гомогенізують в 0,25 М водному розчині сахарози Потім вилучають усі фракції, крім мікросомальної шляхом центрифугування протягом 30-35 хвилин при 24000-25000 g Осад вилучають, а з мікросом екстрагують ароматазу доданням рівного об'єму 1% водного розчину холату натрію Фермент осаджують шляхом додання до середовища ацетону, охолодженого до -18°С та через 25-30 хвилин центрифугують протягом 10-15 хвилин при 19000 натрію Після ЦЬОГО ПОСЛІДОВНО проводять іонооб мінну хроматографію на ДЕАЕ - целюлозі та гідрофобну хроматографію з наступною елюцією ферменту Ознаки гомогенізація матеріалу, виділення мікросом, екстракція мікросомальних білків та елюція ферменту є спільними з тим способом, що пропонується Вказаний спосіб не дає можливості одержати гомогенний препарат з високим виходом ферменту та дає відносно низький ступінь його очищення, тому що під час іонообмінної хроматографії спорідненість ферменту та сорбенту зоснована на протилежності їх зарядів, а у випадку з гідрофобною хроматографією - на здатності ферменту та сорбенту зв'язуватись слабкими гідрофобними зв'язками В основу винаходу поставлено задачу створити такий спосіб очищення цитохрому Р450 ароматази, у якому шляхом заміни операцій іонообмінної та гідрофобної хроматографії на нову можна було 00 42198 20000 g Супернатант вилучають, а осад розчиняють у бідистильованій воді Далі до одержаного білкового екстракту додають рівний об'єм 40 мг/мл суспензії агарози, до котрої ковалентно приєднують 17-метилтестостерон Для цього його зв'язують з янтарною кислотою у реакційній системі, яка вміщує 20 мМ розчин 17-метилтестостерону у 96% етанолі, 22 мМ водний розчин янтарної кислоти та концентровану сірчану кислоту (у співвідношенні 10 9 1), яку шкубують ЗО хвилин при 50°С Після цього до неї додають сферичну агарозу із розрахунку 100 мг на 1 мл, залишають на 60 хвилин та періодично помішують Одержаний гель відмивають 1,0 М NaCI, а потім бідистильованою водою та суспендують його у 0,05 М трис-НСІ буфері при рН 7,3 із розрахунку 40 мг/мл Після цього витримують протягом 3 хвилин при температурі 35°С, безперервно перемішуючи Потім центрифугують протягом 5 хвилин при 10000 g Супернатант вилучають, а з осаду елююютьфермент 0,1 М трисНСІ буфером при рН 8,0, який вміщує 1 М NaCI та 20 мкМ 17-метилтестостерону із розрахунку 2 мл буферу на 1 мл агарозної суспензії Елюат використовують, як ферментний препарат Приклад 2 Всі операції здійснюють так само, як у прикладі 1, з тою різницею, що до білкового екстракту, одержаного після осадження ацетоном та розчинення осаду, додають рівний об'єм 50 мг/мл суспензії агарози, до якої ковалентно приєднюють 17-метилтестостерон через спейсер янтарну кислоту, в 0,1 М трис-НСІ буфері при рН 7,4 та витримують протягом 5 хвилин при температурі 38°С Приклад З Всі операції здійснюють так само, як у прикладах 1 та 2, з тою різницею, що до білкового екстракту, одержаного після осадження ацетоном та розчинення осаду, додають рівний об'єм 60 мг/мл суспензії агарози, до якої ковалентно приєднюють 17-метилтестостерон через спейсер янтарну кислоту, в 0,2 М трис-НСІ буфері при рН 7,5 та витримують протягом 7 хвилин при температурі 40°С Результати очищення за прикладами 1-3 наведені в таблиці Таблиця Концентрація трис-НСІ буЧас витриму- Температуферу, в якому Концентра- вання проб у ра, при якій суспендують ція агароз- термостаті під проводять агарозу, до аффінне ної суспен- час аффінноякої ковалензії, мг/мл го осадження, осадження, тно приєднахв °С ний субстрат, М ЗО 1 ЗО 0,01 40 3 35 0,05 50 5 38 0,1 60 40 0,2 7 70 10 45 0,3 рН трисНСІ буфеСтупінь ру, в якому очищення Вихід суспендуцитохрому фер- Чистота препають агароР450 аро- менрату зу, до якої матази, ту, % ковалентно рази приєднаний субстрат 7,2 138,1 8,9 не гомогенний 7,3 212,6 17,4 не гомогенний 7,4 257,2 23,3 гомогенний 7,5 204,6 14 не гомогенний 7,6 151,6 9,3 не гомогенний ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Киів-133, бульв Лесі Українки, 26 (044)295-81-42, 295-61-97 Підписано до друку _ 2002 р Формат 60x84 1/8 Обсяг обл -вид арк Тираж 50 прим Зам УкрІНТЕІ, 03680, Киів-39 МСП, вул Горького, 180 (044) 268-25-22