Спосіб відбору популяції рослин або насіння з використанням епігенетично модифікованих популяцій

Реферат: Запропоновано спосіб відбору популяції епігенетично однорідних сільськогосподарських рослин з високою ефективністю використання енергії, підвищеною життєздатністю, підвищеною здатністю до врожаю або підвищеною стійкістю до несприятливих абіотичних умов, який, серед іншого, включає визначення швидкості клітинного дихання у рослин. UA 108851 C2 (12) UA 108851 C2 UA 108851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Область винаходу Винахід стосується галузі сільського господарства. Більш специфічно, забезпечуються методи для відбору популяцій рослин, включаючи зернові культури, які виявляють високу ефективність використання енергії або високу ефективність використання енергії у поєднанні зі стійкістю до посухи, та які відрізняються лише за епігенетичним станом, що дозволяє підвищити врожайність таких відібраних та епігенетично відмінних популяцій у порівнянні з популяціями, що не піддавались селекції. Також забезпечуються епігенетично відмінні рослини та популяції рослин, що виявляють високу ефективність використання енергії, які можуть бути ідентифіковані за допомогою їх комбінованої нижчої швидкості клітинного дихання та вищим вмістом енергії клітин, за допомогою їх підвищеного вмісту аскорбату і/або підвищеного вмісту комплексу I мітохондріального дихального ланцюга. Крім того, забезпечуються епігенетично відмінні рослини та популяції рослин, що виявляють високу ефективність використання енергії у поєднанні зі стійкістю до посухи. Епігенетичні модифікації можуть бути закріпленими та передаватись наступним поколінням. Також було виявлено, що епігенетична компонента ефективності використання енергії може поєднуватись з гібридною силою (гетерозисом) та призводити до підвищення врожайності гібридів. Передумови винаходу Виробництво сільськогосподарської продукції та, зокрема, харчових продуктів і кормів, у достатній кількості та належної якості є важливим завданням, актуальність якого неухильно зростає. З одного боку, існує постійне зростання вимог до сільськогосподарських продуктів у зв’язку зі збільшенням населення у світі, а також через зростання середнього стандарту життя для переважної більшості населення світу. З іншого боку, території, придатні або доступні для ведення сільського господарства, постійно скорочуються, частково у зв’язку зі зміною клімату, що може призвести до пошкодження територій, які були раніше придатні для сільськогосподарської діяльності. Існує постійна потреба у збільшенні потенціалу врожайності сільськогосподарських культур або, принаймні, підтримання такого потенціалу врожайності при вирощуванні сільськогосподарських культур в субоптимальних або несприятливих абіотичних умовах. До сьогоднішнього часу, зусилля, спрямовані на підвищення потенціалу врожайності були зосереджені, в основному, на використанні генетичної варіабельності сільськогосподарських культур. За допомогою існуючих традиційних методик схрещування або індукованих варіантів алелі поєднуються у нові комбінації. Зовсім нещодавно, пул варіабельності був розширений за рахунок молекулярних методик, які роблять можливим обмін генетичного матеріалу, долаючи бар’єри між видами і, навіть, між царствами. Проте, набагато менше уваги приділялось з’ясуванню ролі, яку механізми епігенетичного контролю можуть відігравати у визначенні кількісних ознак, таких як врожайність. У дійсності, всі кількісні ознаки, такі як розмір та вага тварин чи врожайність, насамперед, врожайність насіння сільськогосподарських культур, виявляють різноманіття з нормальним розподілом, навіть в межах популяції генетично ідентичних окремих особин. В основі фенотипової мінливості лежать генетичні складові та чинники навколишнього середовища, а також епігенетичні складові. Була підтверджена важливість для рослин складових епігенетичного контролю при короткочасній чи довгостроковій адаптаціїї до стресу (Molinier et al. 2006, Transgeneration memory of stress in plants. Nature 442, 1046-1049). До того ж, було продемонстровано, що змінені епігенетичні стани можуть бути передані до наступних поколінь, які не зазнавали або вже не зазнають дії індукуючих чинників (огляд представлений у роботі Jablonka and Raz, 2009 Transgenerational epigenetic inheritance: prevalence, mechanisms, and implications for the study of heredity and evolution. The Quarterly Review of Biology 84, No. 2, 131-176). Однак, не існує безпосереднього підтвердження, що повторна селекція дозволяє спрямувати епігенетичну складову кількісної характеристики у напрямку до кінця нормальної кривої розподілу. Іншими словами, аналіз попереднього рівня техніки свідчить про відсутність даних щодо здатності впливати або здійснювати відбір з популяції, насамперед, з генетично однорідної популяції особин, для яких значення кількісної ознаки знаходиться вище або нижче середнього значення і закріплювати ці відібрані епігенетичні складові в (суб)популяції. Enfield and colleagues (Enfield, F.D., Comstock, R.E. & Braskerud, O. Selection for pupa weight in Tribolium castaneum. І. Parameters in base populations. Genetics 54, 523-533 (1966); Kaufman, P.K. & Enfield, F.D., Comstock, R.E. Stabilizing selection for pupa weight in Tribolium castaneum. Genetics 87, 324-341 (1977) описали результати експериментів, в яких, починаючи від популяції, отриманої внаслідок схрещування між двома інбредними борошнистими хрущаками з середньою вагою лялечки 2400 мкг, вони були здатні вибирати популяцію з середньою вагою лялечки 5800 мкг шляхом безперервного інбридингу протягом 120 поколінь. Enfield та інші 1 UA 108851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 висловили своє здивування щодо того, що високий рівень генетичного різноманіття підтримується протягом багатьох поколінь інбридингу. Це, однак, не є малоймовірним, що на певному етапі селекційного процесу здійснюється добір епігенетичної, а не генетичної мінливості. Це, у подальшому, підтримується ідентичними експериментами, починаючи з інбредних ліній, що були гомозиготними за генами, які впливають на вагу лялечки (Enfield, F.D. & Braskerud, O. Mutational variance for pupa weight in Tribolium castaneum. Теор. Прикл. Генет.77,416-420 (1989)). Для з’ясування кореляції з потенційною врожайністю рослини були залучені різні параметри. Була виявлена позитивна кореляція між потенційною врожайністю та нижчими швидкостями клітинного дихання. Wilson описав відповідь на селекцію швидкості темнового дихання дорослих листків у Lolium perenne та її вплив на ріст молодих рослин та штучних газонів. (Wilson Ann. Bot.49,303-312 (1982)). Wilson та Джонс описали вплив селекції щодо швидкості темнового дихання дорослих листків на врожайність Lolium perenne cv. S23. (Wilson and JonesAnn. Bot. 49,313-320 (1982)). Kraus et al. повідомив про перевищення врожайності у популяцій Lolium perenne cv. S23, з низькою швидкістю дихання порівняно з популяціями цього виду, для яких характерна висока швидкість дихання, що залежить від щільності рослин. (Kraus et al. New Phytol. 123, 39-44 (1993)) та від способу культивування на врожайність двох популяцій Lolium perenne, відібраних за відмінністю у швидкості дихання дорослих листків (Kraus et al. Phisiol. Plant.89,341-346 (1993)). Nunes-Nesi et al. описали підвищену фотосинтетичну здатність і ріст внаслідок зниження активності мітохондріальної малатдегідрогенази у рослин трансгенних томатів. (Nunes-Nesi et al. Plant Physiol. 137, 611-622 (2005)). Є повідомлення Juczczuk et al. про вплив перебудови мітохондріального геному на респіраторну активність, фотосинтез, фотодихання і енергетичний статус мутанта огірка MSC16 (Cucumis sativus) (Juczczuk et al, Physiol. Plant. 131, 527-541 (2007)). De Block та De Brouwer описали простий та надійний метод аналізу in vitro, для кількісної оцінки життєздатності ліній насіння рапсу та гібридів. (Plant Physiol. Biochem. 40, 845-852 (2002)). WO 02/066972 забезпечує методи та засоби для визначення батьківських інбредних ліній рослин з хорошою комбінуючою здатністю, для визначення хороших комбінацій батьківських інбредних ліній рослин, здатних призводити до отримання високогетерозисних гібридних ліній, та, у подальшому, для визначення агрономічної продуктивності різних рослинних ліній, які можуть бути виконані in vitro шляхом визначення електронного потоку у мітохондріях в умовах контролю та стресу. Жоден з попередньо прийнятих нормативних документів, що описували попередню селекцію для низької швидкості клітинного дихання у генетично однорідній популяції рослин, яка дозволяє отримувати (суб)популяції рослин, що мають вищий потенціал щодо врожайності та стійкість до несприятливих біотичних умов. Епігенетичний компонент може, у подальшому, бути успадкований у наступних поколіннях (та виступає як домінантний або кодомінантний чинник). Короткий опис винаходу В одному втіленні цього винаходу метод відбору популяції рослин, таких як олійна редька, рослини томатів або рису або їх насіння з високою ефективністю використання енергії містить наступні етапи: a. забезпечення популяції, яка включає сукупність окремих рослин, що є генетично однорідними; b. виділення (ізоляція) тканинного зразка або експланту від окремих рослин вказаної популяції у спосіб, який дозволяє подальше культивування вказаних зразків окремих рослин; c. на вибір, культивування вказаних тканинних зразків або експлантів за умов, які активують метаболізм у вказаних рослин; d. визначення швидкості клітинного дихання вказаних окремих рослин шляхом аналізу вказаних зразків вибраних рослин; e. відбір низки рослин, де вказані зразки виявляють клітинну експірацію, що є нижчою, переважно значно нижчою, ніж середнє значення швидкості клітинного дихання зразків зі вказаної популяції; f. вирощування відібраних рослин та розмноження з кожної з відібраних рослин лінії клонованого потомства рослин; g. визначення ефективності використання енергії для кожної лінії клонованого потомства рослин; 2 UA 108851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 h. відбір лінії клонованих рослин, де вказана ефективність використання енергії є вищою, ніж середнє значення ефективності використання енергії всіх ліній клонованого потомства рослин, переважно відбір лінії клонованого потомства рослин з найвищою ефективністю використання енергії; i. вирощування популяції окремих рослин вказаної відібраної лінії клонованого потомства рослин; та j. відтворення, принаймні один раз, етапів від b до i на вказаній наступній популяції. Ефективність використання енергії може бути визначена шляхом визначення інтенсивності клітинного дихання і визначення вмісту НАДФ у ізольованому зразку і шляхом ділення вмісту НАДФ на інтенсивність дихання, для того щоб визначити інтенсивність використання енергії. Ефективність використання енергії може також бути визначена шляхом вимірювання вмісту аскорбату або аскорбінової кислоти в рослині або шляхом вимірювання активності комплексу І дихального ланцюга у вказаному зразку. Забезпечені методи включають ідентифікацію рослин з високою ефективністю використання енергії шляхом визначення інтенсивності клітинного дихання у вказаному зразку і, щонайменше, одного серед наступних параметрів: вміст аскорбату; вміст НАДФ; активність комплексу І дихального (респіраторного) ланцюга; або фотодихання; і відбір тих рослин з низькою інтенсивністю клітинного дихання і високим вмістом аскорбату, або вищою активністю комплексу I дихального ланцюга або нижчої інтенсивності фотодихання, ніж у контрольних рослин (тобто рослин вихідної популяції, які не зазнавали повторної селекції для низького клітинного дихання). Як правило, швидкість клітинного дихання може знаходитись між 85 і 95% швидкості клітинного дихання контрольної рослини і вміст НАДФ може знаходитись між 95 і 105% вмісту НАДФ у контрольної рослини. Активність комплексу I дихального ланцюга, як правило, може становити від 120 до 140% активності комплексу I дихального ланцюга контрольної рослини і вміст аскорбату може становити від 150 до 220% вмісту аскорбату контрольної рослини. Фотодихання переважно знаходиться у проміжку від 80 до 92% фотодихання контрольної рослини. Винахід також забезпечує спосіб отримання популяції рослин або насіння з підвищеною здатністю до врожаю, який включає відбір з популяції окремих рослин, що є генетично однорідними, тих рослин чи субпопуляцій рослин або насіння з високою ефективністю використання енергії відповідно до селекційних методів, які тут представлені. Відібрані рослини надалі можуть бути схрещені з іншими рослинами, для того щоб отримати потомство з високою ефективністю використання енергії і підвищеним потенціалом стосовно урожайності. В іншому втіленні винаходу забезпечується спосіб для отримання популяції рослин або насіння з підвищеною життєздатністю і/або підвищеною стійкістю до несприятливих абіотичних умов, який включає відбір з популяції окремих рослин, які генетично однорідні, тих рослин або субпопуляцій рослин чи насіння з високою ефективністю використання енергії відповідно до методів відбору, які тут представлені. Відібрані рослини можуть далі бути схрещені з іншими рослинами, для того щоб отримати потомство з високою ефективність використання енергії та з підвищеною життєздатністю і/або підвищеною стійкістю до несприятливих абіотичних умов. В іншому втіленні винаходу забезпечується спосіб для підвищення врожайності, включаючи етапи отримання субпопуляцій рослин або насіння з високою ефективністю використання енергії з генетично однорідної популяції шляхом повторної селекції стосовно низької швидкості клітинного дихання; вирощування рослин або насіння у польових умовах; і отримання врожаю з цих рослин чи насіння. У ще одному втіленні винаходу забезпечується спосіб отримання гібридної рослини або гібридного насіння з високою врожайністю або стійкістю до несприятливих абіотичних умов, який включає наступні етапи: a. відбір популяції рослин з високою ефективністю використання енергії згідно з селекційними методами, які тут згадуються, для, принаймні, однієї батьківської інбредної рослини, включаючи, для, щонайменше, обох батьківських інбредних рослин; і, якщо одна батьківська рослина є рослиною з чоловічою стерильністю, а підтримання вказаної рослини з чоловічою стерильністю потребує застосування підтримуючої лінії, на вибір також для підтримуючої лінії; b. схрещування рослини вказаної популяції з іншою інбредною рослиною; c. виділення гібридного насіння або вказаного гібриду; і d. на вибір, вирощування гібридних рослин із вказаного насіння. У ще іншому втіленні забезпечується рослина, насінина або популяція рослин, відібраних за допомогою одного з описаних тут методів. 3 UA 108851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таким чином, винахід забезпечує рослини, включаючи гібридні рослини, такі як олійна редька (Brassica), рослини томатів або рису, або їх насіння, з високою ефективністю використання енергії, що проявляється у тому, що рослина має низький рівень клітинного дихання, як наприклад, швидкість клітинного дихання знаходиться між 85 і 95% швидкості клітинного дихання контрольних рослин, і, щонайменше, одну, або більше чи всі з-поміж наступних характерних особливостей: i. високий вміст аскорбату, який може знаходитись у проміжку від 150 до 220% вмісту аскорбату контрольної рослини; ii. високий вміст НАДФ, який може знаходитись у проміжку від 95 до 105% вмісту НАДФ контрольної рослини; iii. висока активність комплексу I дихального ланцюга, яка може знаходитись у проміжку від 120 до 140% активності комплексу I дихального ланцюга контрольної рослини або iv. низькa швидкість фотодихання, значення якої може знаходитись у проміжку від 80 до 92% фотодихання контрольної рослини; внаслідок чого контрольні рослини – це рослини генетично однорідної популяції, щодо яких не було застосовано схему повторної селекції на низьку швидкість клітинного дихання. Короткий опис фігур Фігура 1: Схема селекції для виділення субпопуляції каноли, яка відрізняється швидкістю клітинного дихання та ефективністю використання енергії у каноли. Селекція розпочиналась з ізогенної лінії рослин, що є подвійними гаплоїдами. Близько п’яти відібраних рослин з найнижчим, відповідно, найвищим диханням були самозапилені, а потомство було індивідуально протестовано на швидкість дихання та ефективність використання енергії. Селекцію продовжували з популяціями, що мають найвищу, відповідно, найнижчу ефективність використання енергії. Фігура 2: Дихання шести відібраних популяцій каноли у порівнянні з вихідною природною популяцією. Значення були нормалізовані (у %) порівняно з середнім значенням вихідної початкової лінії ‘Simon’. Кожна точка представляє дані, отримані внаслідок дослідження окремої рослини. Кожна популяція включає близько 200 рослин. Мітка у прямокутнику представляє медіану популяції. Мітки представляють середнє відхилення із зазначенням середнього значення. Фігура 3: Ефективність використання енергії шести відібраних популяцій каноли. Значення були нормалізовані (у %) порівняно з середнім значенням вихідної початкової лінії ‘Simon’. Сірі мітки (зліва) представляють значення, отримані для дихання; світло-сірі мітки (посередині) представляють значення, отримані для енергоємності (вміст НАДФ; темно-сірі мітки (справа) представляють ефективність використання енергії (вміст НАДФ, розділений на швидкість дихання). Фігура 4: Стійкість відібраних популяцій каноли до високої температури. Рослини протягом 10 днів вирощувались при температурі 45° за Цельсієм перед фотографуванням. Рослини, розташовані ліворуч, походять з популяції, відібраної як такої, що має низьку ефективність використання енергії; рослини, що знаходяться праворуч, - з популяції, відібраної як такої, що має високу ефективність використання енергії. Фігура 5: Кореляція між ефективністю використання енергії та урожаєм насіння у відібраних популяціях каноли. Значення були нормалізовані (у %) порівняно з середнім значенням вихідної початкової лінії ‘Simon’. Світло-сірі мітки представляють нормалізовану ефективність використання енергії, тоді як темно-сірі мітки представляють врожайність насіння. Фігура 6: Кореляція між ефективністю використання енергії та вмістом аскорбінової кислоти у відібраних популяціях каноли. Вміст аскорбінової кислоти виражається у мг/л; ** p