Спосіб виготовлення тканинного еквівалента на основі колагенового гелю, що містить культуру фібробластів

Спосіб виготовлення тканинного еквівалента на основі колагенового гелю, що містить культуру фібробластів, який відрізняється тим, що готовий розчин колагену з клітинами кріоконсервуготь до настання полімеризації, при цьому формування власне гелю відбувається у процесі розморожування. Спосіб відноситься до біології І медицини, а саме до біотехнології і може бути використаний для виготовлення і кріозберігання запасу готових тканинних еквівалентів, з можливістю їхнього тривалого транспортування і наступного застосування в хірургії. Тканинні еквіваленти, що складаються з колагенового гелю і культури фібробластів застосовуються для лікування мезенхімальних дефектів будь-якої етіології. Відомі різні способи виготовлення гелю, що містить клітинну культуру [1] Найбільш близьким аналогом пропонованого способу є виготовлення аналога дерми з колагенового гелю й іммобілізованих у ньому фібробластів [2]. Основним недоліком існуючого способу є обмежений час придатності для використання готового тканинного еквівалента, зв'язане з термінами життєздатності культури кліток у гелі. Це унеможливлює процес тривалого збереження і транспортування готових тканинних еквівалентів В основу пропонованого способу поставлена задача створити умови при яких можливо тривале збереження, транспортування і застосування готового тканинного еквівалента що складається з колагенового гелю і культури фібробластів, без збитку для життєздатності клітинної культури і якості гелю. Поставлена задача вирішується за рахунок програмного кріоконсервування суспензії кліток у розчині колагену на останньому етапі готування гелю, до настання полімеризації'. Полімеризація і формування готового тканинного еквівалента здійснюється в процесі його розморожування на водяній лазні. Спосіб використовується таким чином. Фетальні фібробласти людини виділяють з абортивного матеріалу, отриманого в ході планових операцій по перериванню вагітності при термінах гестації до 8 тижнів. Виділення, культивування і пассирування фетальних фібробластів проводять згідно загальноприйнятих методик [2]. Для виготовлення тканинного еквівалента використовують клітини 4-6 пасажів Колаген 1 типу одержують із сухожиль хвостів нелінійних щурів вагою 200 р. Після ампутації хвости занурюють у 70 % етанол на 1-2 години. Подальші операції проводили в стерильних умовах За допомогою пінцета і ножиців відокремлюють сухожилля і поміщають у розчин оцтової кислоти 1:1000. На 1 літр розчину кислоти використовують сухожилля від 10 хвостів. Екстракція колагену при безупинному перемішуванні продовжується 48 годин при +4°С Потім розчин центрифугують при 2500 об/хв.. протягом 2 годин при +4°С. Після цього супернатант зливають у ю 5140 стерильний посуд і зберігають при +4"С. Зміст колагену визначають висушуванням до постійної ваги. Стерильний 0,34М розчин NaOH з'єднують з концентрованої (хЮ) живильним середовищем 199 чи Ігла у відношенні 1:2 і на кожні ЮОмол., суміші додають ЮОмг. глутаміну і 9мол. 7,5% бікарбонату натрію Отриману суміш з'єднують з охолодженим розчином колагену в оцтовій кислоті в співвідношенні V4, після чого поміщають на лід для запобігання швидкої полімеризації. Необхідну аликвоту суспензії фібробластів додають у свіже приготовлену суміш колагену і живильного середовища при температурі 4"С. Суспензію фібробластів у суміші розчину колагену і живильного середовища переносять в стерильну чашку Петрі, закривають кришкою і герметизують за допомогою плівки «Parafilm M». Далі суміш заморожують у програмному замора Комп'ютерна верстка Н. Лисенко живателе по стандартній програмі [3]. Збереження і транспортування замороженої суспензії здійснюють у парах рідкого азоту чи низькотемпературному холодильнику. Розморожування проводять за стандартною методикою [3] на водяній лазні при температурі 37-38°С. У процесі розморожування відбувається полімеризація колагену і формування гелю Джерела інформації прийняті до уваги: 1) Bell E., Ehrlich H.P., Sher S. (1981) Development and use of a living skin equivalent. J. Plastic & Reconstruct. Surg., 3, 386-392. 2) Гаврилюк Б.К , Рочев Ю.А., Николаева Т.Н. (1988) Культура клеток и реконструкция ткани (на примере кожи). ОНТИ НЦБИ АН СССР, Пущино, 123с. 3) Криоконсервирование клеточных суспензий /Под ред. А.А. Цуцаевой - Киев, 1983.-5бс. Підписне Тираж 37 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ-42, 01601