Спосіб визначення зиготності рослини кукурудзи, що містить об’єкт das-40278-9 aad-1 кукурудзи

Реферат: Винахід належить до способу визначення зиготності рослини кукурудзи, що містить об'єкт DAS40278-9 AAD-1 кукурудзи, яка містить SEQ ID NO:1, де вказаний об'єкт містить трансгенну конструкцію, що містить ген AAD-1, де вказана трансгенна конструкція фланкована 5фланкуючою геномною ДНК кукурудзи і 3-фланкуючою геномною ДНК кукурудзи, де вказана 5'фланкуюча геномна ДНК кукурудзи складається із залишків 1-1873 SEQ ID NO:1, і вказана 3'фланкуюча геномна ДНК кукурудзи складається із залишків 6690-8557 SEQ ID NO:1, і де вказана трансгенна конструкція складається із залишків 1874-6689 SEQ ID NO:1. Також винахід належить до аналізу Taqman ПЛР за кінцевою точкою для об'єкта 40278-9 AAD-1 кукурудзи. UA 109882 C2 (12) UA 109882 C2 UA 109882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Ген aad-1 (спочатку ген Sphingobium herbicidovorans) кодує білок арилоксіалканоат діоксигеназу (AAD-1). Ця ознака забезпечує стійкість до гербіцидів 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти та арилоксифеноксипропіонату (які звичайно позначають як гербіциди "фоп", такі як диклофоп і кізалофоп), і її можна застосовувати у ролі селективного маркера під час трансформації рослини, а також у селекційних розплідниках. Роль гена aad-1 у стійкості до гербіцидів уперше розкрита в WO 2005/107437 (див. також US 2009-0093366). Відомі різні способи детекції об'єкта (event). Однак всі вони мають свої недоліки. Один спосіб являє собою піросеквенування, як описано Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). За цим способом сконструйований олігонуклеотид, який перекривається зі стиком фланкуючої геномної ДНК і ДНК-вставки. Олігонуклеотид гібридизують з одноланцюговим ПЛР-продуктом із потрібної ділянки (з одним праймером у вбудованій послідовності та одним праймером у фланкуючій геномній послідовності) та інкубують у присутності ДНК-полімерази, АТФ, сульфурилази, люциферази, апірази, аденозин-5-фосфосульфату і люциферину. Окремо додають DNTP і оцінюють результати включення за світловим сигналом. За успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну або багато основ сигнал вказує на наявність вставки/фланкуючої послідовності. Флуоресцентна поляризація являє собою інший спосіб, який можна використати для детекції амплікону за даним винаходом. За цим способом сконструйований олігонуклеотид, який перекривається зі стиком геномної фланкуючої послідовності і ДНК-вставки. Олігонуклеотид гібридизують із одноланцюговим ПЛР-продуктом із потрібної ділянки (з одним праймером у вбудованій послідовності та одним праймером у фланкуючій геномній послідовності) та інкубують у присутності ДНК-полімерази і флуоресцентно мічених ddNTP. Однонуклеотидне подовження призводить до включення ddNTP. Включення можна оцінювати за зміною поляризації із застосуванням флюориметра. За успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу зміна поляризації вказує на присутність трансгенної вставки/фланкуючої послідовності. Описані молекулярні сигнальні індикатори для застосування в детекції послідовності. У стислому викладі, сконструйований олігонуклеотидний зонд FRET, який перекривається зі стиком геномної фланкуючої послідовності і ДНК-вставки. Завдяки своїй унікальній структурі зонд FRET містить вторинну структуру, яка містить флуоресцентні фрагменти і фрагменти, що гасять, у безпосередній близькості. Зонд FRET і праймери ПЛР (один праймер у вбудованій послідовності та один праймер у фланкуючій геномній послідовності) піддають циклам гібридизації в присутності термостабільної полімерази і dNTP. Після успішної ПЛР-ампліфікації гібридизація зонда FRET із послідовністю-мішенню призводить до видалення вторинної структури зонда і просторового відділення флуоресцентної частини від частини, що не флуоресціює. Внаслідок цього продукується флуоресцентний сигнал. За успішної ампліфікації і гібридизації цей флуоресцентний сигнал вказує на наявність фланкуючої послідовності/трансгенної вставки. Аналіз на основі гідролізу зондів, інакше відомий як метод TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster City, California), являє собою спосіб детекції і кількісного визначення наявності ДНКпослідовності. У стислому викладі, сконструйований олігонуклеотидний зонд FRET, який перекривається зі стиком геномної фланкуючої послідовності і ДНК-вставки. Зонд FRET і ПЛРпраймери (один праймер у вбудованій ДНК і один праймер у фланкуючій геномній ДНКпослідовності) піддають циклам гібридизації в присутності термостабільної полімерази і dNTP. Гібридизація зонда FRET призводить до відщеплення і вивільнення флуоресцентної частини від частини, що не флуоресціює на зонді FRET. За успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу флуоресцентний сигнал вказує на присутність фланкуючої послідовності/трансгенної вставки. Ще одне завдання, серед багатьох інших, полягає в пошуку придатного референтного гена для даного тесту. Наприклад, як вказано в рефераті Czechowski et al., "Виключно велика група даних, одержаних при аналізі генома Affymetrix ATH1 GeneChip, надає способи ідентифікації нового покоління референтних генів із дуже стабільними рівнями експресії у модельного виду рослини Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). Знайдені сотні генів Arabidopsis, що перевершують референтні гени, що традиційно застосовувалися щодо стабільності експресії в ході розвитку і за різних умов навколишнього середовища." (Czechowski et al. (2005) Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 139, 5-17.) Brodmann et al. (2002) описує кількісну ПЛР у реальному часі для детекції вмісту трансгенної кукурудзи в їжі для чотирьох різних сортів кукурудзи, затверджених Європейським Союзом. 1 UA 109882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Brodmann, P.D., P.D., Ilg Е. С, Berthoud Н., and Herrmann, A. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. of AOAC international 2002 85 (3) Hernandez et al. (2004) вказує чотири можливих гени для застосування в ПЛР у реальному часі. Hernandez, M., Duplan, M.-N., Berthier, G., Vaitilingom, M., Hauser, W., Freyer, R., Pla, M., and Bertheau, Y. Development and comparison of four real-time polymerase chain reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays L. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 4632-4637. Costa et al. (2007) вивчив ці чотири гени (також у контексті ПЛР у реальному часі) і зробив висновок, що гени алкоголь-дегідрогенази і зеїнів являють собою кращі референтні гени для детекції зразків "об'єкта" (гена лектину) в трансгенних продуктах харчування. Costa, L. D., and Martinelli L. Development of а Real-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Components. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 1264-1273. Huang et al. (2004) застосовували плазміди pMulM2 як референтні молекули для детекції трансгенів MON810 і NK603 у кукурудзи. Huang and Pan, "Detection of Genetically Modified Maize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods," J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (11), pp 3264-3268. Gasparic et al. (2008) запропонували технологію ЗНК, створену на основі способу циклізації зонда, TaqMan і різних складових ПЛР у реальному часі, для кількісної оцінки об'єктів кукурудзи (таких як MON810). Gasparic, Cankar, ZeI, and Gruden, "Comparison of different realtime PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms," BMC Biotechnol. 2008; 8: 26. US 20070148646 належить до способу подовження праймера для кількісної оцінки, що вимагає контрольованого вивільнення окремих нуклеотидів, які можна детектувати і кількісно оцінювати на основі кількості включених нуклеотидів. Цей спосіб відрізняється від способу ПЛР TaqMan, в якому застосовують цілий референтний ген. Для відрізнення гомозиготних і гемізиготних генотипів TC 1507 успішно проводили аналіз Invader для цього об'єкта. Gupta, M., Nirunsuksiri, W., Schulenberg, G., Hartl, Т., Novak, S., Bryan, J., Vanopdorp, N., Bing, J. and Thompson, S. A non-PCR-based Invader Assay Quantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex Plant Genomes. MoI. Breeding 2008, 21, 173-181. Huabang (2009) описує заснований на ПЛР аналіз зиготності трансгенної кукурудзи. Однак у цій роботі не застосовували референтних генів. Huabang, "An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method for Genetically Modified Maize," Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.3, 619-623. СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід надає способи детекції наявності об'єкта AAD-1 кукурудзи, що позначають DAS-40278-9, у зразку (наприклад, у зерні кукурудзи). (Зразки насіння депоновані в Американській колекції типових культур (ATCC) під реєстраційним номером PTA-10244 (гібридне насіння жовтої зубовидної кукурудзи (Zea Mays L.):DAS-40278-9; депоновані згідно з Будапештським договором Dow AgroSciences LLC; дата одержання насіння/штаму(ів) в ATTC: 10 липня 2009 року; життєздатність підтверджена 17 серпня 2009 року.) Також наведені набори та умови, використані при проведенні аналізів. Конкретніше, даний винахід частково стосується аналізу TaqMan ПЛР за кінцевою точкою для об'єкта AAD-1 кукурудзи із застосуванням ендогенних референтних генів кукурудзи. Деякі варіанти здійснення спрямовані на способи аналізу зиготності з високою пропускною здатністю. Даний винахід далі частково стосується пошуку переважних референтних генів інвертаз для застосування у визначенні зиготності. Таким чином, цей винахід також частково стосується селекції рослин, що включає описані тут способи детекції. У деяких варіантах здійснення вказаний об'єкт можна "поєднувати" з іншими ознаками, включаючи, наприклад, інший (інші) ген(и) стійкості до гербіцидів і/або білки стійкості до комах. Дані процедури можна використати для однозначної ідентифікації ліній кукурудзи, що містять об'єкт за даним винаходом. СТИСЛИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ На Фіг. 1 представлена стратегія клонування ДНК-вставки в об'єкт DAS-40278-9 кукурудзи. На Фіг. 2 представлена схема праймерів, використаних у ПЛР-ампліфікації для підтвердження наявності фланкуючих суміжних ділянок в об'єкті DAS-40278-9 кукурудзи. Схема відображає розташування праймерів для підтвердження повнорозмірного секвенса об'єкта DAS40278-9 кукурудзи AAD-1 від 5-кінця до 3-кінця. На Фіг. 3 представлена стратегія клонування для фланкуючих суміжних ділянок об'єкта DAS 2 UA 109882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 40278-9 кукурудзи. Геномну ДНК об'єкта кукурудзи DAS-40278-9 розщеплювали із застосуванням EcoR V, Stu I або Sca I і складали відповідні бібліотеки GenomeWalker™, які використали як матрицю для ампліфікації потрібної ДНК-послідовності. СТИСЛИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ SEQ ID NO:1 являє собою послідовність 5- і 3-фланкуючих геномних послідовностей із кожного боку вставки AAD-1, включаючи вставку, для об'єкта DAS-40278-9 кукурудзи. SEQ ID NO:2-7 являють собою праймери і зонди для застосування за даним винаходом. SEQ ID NO:8 являє собою приклад амплікону об'єкта. SEQ ID NO:9 являє собою приклад референтного амплікону. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Трансгенний об'єкт DAS-40278-9 кукурудзи AAD-1 (що забезпечує стійкість до гербіцидів) одержували за допомогою трансформації струшуванням клітин у суспензії мікроголок. Фланкуючі послідовності як 5-кінця, так і 3-кінця цієї трансгенної вставки AAD-1 клонували, секвенували та аналізували, як описано в USSN 61/235248 (поданій 19 серпня 2009 року). Конструювали спеціальні праймери TAQMAN і зонди, як описано в цьому документі, що частково відповідають послідовностям ДНК, розташованим на 5-кінці з'єднання вставки і геномної ДНК. Проводили успішний дуплексний аналіз об'єкт-специфічності праймерів і зондів за допомогою ПЛР у реальному часі для 16 різних об'єктів AAD-1 кукурудзи і двох нетрансгенних різновидів кукурудзи з геном інвертази кукурудзи у ролі референтного гена. Розроблені процедури для обробки результатів об'єкт-специфічного аналізу TAQMAN для DAS40278-9 AAD-1 кукурудзи, як описано в цьому документі. Послідовність, що включає ділянку стику хазяйської ДНК рослини та інтегрованої генної конструкції в цій AAD-1 кукурудзі, є унікальною. Її використали для проведення об'єктспецифічних аналізів (традиційної ПЛР або ПЛР у реальному часі) для детекції наявності AAD-1 кукурудзи DAS-40278-9 для тестування ГМО і визначення зиготності рослин у популяції, що розмножується. Об'єкт-специфічний аналіз TAQMAN, описаний у цьому документі, можна застосовувати для обох цілей. Даний винахід надає аналізи для детекції присутності трансгенного об'єкта DAS-40278-9 кукурудзи, що викликає інтерес, (також відомого як pDAS 1740-278) у зразку. Аспекти даного винаходу включають способи конструювання і/або одержання діагностичних молекул нуклеїнової кислоти, наведені як приклади або надані в цьому документі. Даний винахід також частково стосується селекції рослин, що включає будь-який із цих способів. У деяких варіантах здійснення об'єкт за даним винаходом можна "поєднувати" з іншими ознаками (наприклад, такими як інший (інші) ген(и) стійкості до гербіцидів і/або ген(и), що кодує(ють) білки стійкості до комах). Лінії рослин, що містять вказаний об'єкт, можна детектувати із застосуванням послідовностей, розкритих і наданих у цьому документі. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується ідентифікації стійких до гербіцидів ліній кукурудзи. Даний винахід частково стосується детекції наявності вказаного об'єкта для з'ясування того, чи несуть потомки схрещування об'єкт, що викликає інтерес. Крім того, наданий спосіб детекції об'єкта, корисний, наприклад, із точки зору додержання правил, що диктують регуляторні органи, які дають дозвіл на надходження даного продукту на ринок і вимагають, наприклад, наявності на упаковці харчового продукту інформації про те, що він одержаний із рекомбінантних сільськогосподарських рослин. Даний винахід частково стосується заснованої на флуоресценції обробці результатів аналізу TaqMan ПЛР із застосуванням ендогенного гена як референтного (число піків) контроль для аналізу зиготності об'єкта кукурудзи AAD-1 із високою пропускною здатністю. Даний винахід частково стосується виявлення переважного референтного гена, інвертази. Декілька референтних генів вказані як можливі. Даний винахід також частково стосується розробки аналізу TaqMan ПЛР за кінцевою точкою для AAD-1 об'єкта-специфічного аналізу зиготності. Далі, даний винахід частково стосується одержання тестових наборів для селекції AAD-1. Аналізи TaqMan за кінцевою точкою ґрунтуються на стратегії плюс-мінус, де "плюс" означає зразок, позитивний на ген, що вивчається, а "мінус" означає зразок, негативний на ген, що вивчається. У цих аналізах, як правило, застосовують два набори олігонуклеотидів для визначення трансгенної послідовності AAD-1 і генної послідовності дикого типу, відповідно, а також двояко-мічені зонди для вимірювання вмісту трансгенної послідовності і послідовності дикого типу. Хоча аналіз Invader визнаний надійним способом оцінки об'єктів, він дуже чутливий до якості ДНК. Крім того, для аналізу необхідна велика кількість ДНК. Для аналізу Invader також необхідне проведення додаткового етапу денатурації, у разі неправильного проведення якого аналіз 3 UA 109882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Invader може виявитися неуспішним. Крім того, проведення аналізу Invader займає багато часу, що не дозволяє ефективно обробляти велику кількість зразків AAD-1 для проведення аналізу в комерційних цілях. Головна перевага даного винаходу полягає в скороченні часу аналізу і виключенні етапу денатурації. Аналіз TaqMan, що розглядається, за кінцевою точкою для детекції AAD-1 об'єктів надає несподівані переваги в порівнянні з аналізом Invader, особливо при обробці великої кількості зразків. Даний винахід може допомогти одержувати та описувати ознаки стійкості AAD-1 до гербіцидів у сільськогосподарських культур, включаючи кукурудзу, сою і бавовну. Визначення і приклади надані в цьому документі для зручності опису даного винаходу і для вказування фахівцям у даній галузі способів здійснення винаходу. Якщо не вказано інакше, терміни потрібно розуміти згідно з традиційним застосуванням фахівцями у відповідній галузі. Використана система позначення основ ДНК, наведена в 37 CFR §1.822. Як застосовують у цьому документі, термін "потомство" означає потомків будь-якого покоління батьківської рослини, яке містить об'єкт DAS-40278-9 кукурудзи AAD-1. Трансгенний "об'єкт" (event) одержують трансформацією рослинних клітин гетерологічної ДНК, тобто конструкцією нуклеїнової кислоти, яка включає необхідний трансген, із подальшою регенерацією популяції рослин внаслідок вбудовування трансгена в геном рослини і відбору конкретної рослини, що характеризується наявністю вставки в конкретному положенні генома. Термін "об'єкт" стосується вихідного трансформанта і потомства цього трансформанта, яке включає гетерологічну ДНК. Термін "об'єкт" також означає потомство, продуковане шляхом статевого ауткросинга між даним трансформантом та іншим сортом, який включає гетерологічну ДНК. Навіть після повторного поворотного схрещування з рекурентною батьківською лінією вбудована ДНК і фланкуюча ДНК від трансформованої батьківської лінії присутня у потомстві цього кросу в тому ж самому положенні хромосоми. Термін "об'єкт" також означає ДНК від вихідного об'єкта, що містить вбудовану ДНК і фланкуючу геномну послідовність, безпосередньо суміжну з вбудованою ДНК, яка, як чекають, повинна передаватися потомству, яке успадковує вбудовану ДНК, що включає потрібний трансген, переданий внаслідок статевого схрещування батьківської лінії, що містить вбудовану ДНК (наприклад, вихідний трансформант і потомство, одержане в результаті самозапилення), із батьківською лінією, яка не містить вбудованої ДНК. "Послідовність стику" охоплює ділянку, в якій вбудована в геном ДНК стикується з ДНК природного генома кукурудзи, фланкуючої сайт інсерції. У неї включені послідовності ДНК, що охоплюють вставки в об'єкти кукурудзи, описані в цьому документі, і що мають однакову довжину з фланкуючими ДНК. Даний винахід стосується ідентифікації потрібного об'єкта. Відповідні ПЛР-праймери та амплікони включені у винахід. Ці молекули можна використати для детекції або визначення комерційних різновидів трансгенної кукурудзи або ліній, що розглядаються, одержаних від ліній трансгенної кукурудзи. Повна послідовність вставки разом із ділянками відповідних фланкуючих послідовностей надана у цьому документі в SEQ ID NO:1. Сайти вставки і фланкуючих послідовностей для цього об'єкта стосовно SEQ ID NO:1 (всього 8557 пар нуклеотидів) надані нижче. Залишки (SEQ:1): Довжина (п.н.): 45 50 55 Вставка 1874-6689 4816 п.н. 5-фланкуюча 1-1873 1873 п.н. 3-фланкуюча 6690-8557 1868 п.н. Компоненти AAD-1 вставки і фланкуючих послідовностей для цього об'єкта далі наведені на фіг. 1-3. Способи детекції за даним винаходом можна використати в поєднанні з селекцією рослин для визначення того, які потомки містять даний об'єкт після схрещування батьківської рослини, яка містить об'єкт, що викликає інтерес, із рослиною іншої лінії з метою внесення однієї або декількох додаткових ознак, що викликають інтерес, у потомство. Способи за винаходом можна застосовувати, наприклад, у програмах селекції кукурудзи, а також у контролі якості, особливо для трансгенного насіння кукурудзи, що застосовується в комерційних цілях. Це також може полегшити реєстрацію продуктів і керування виробництвом. Ці способи можна використати для поліпшених стратегій селекції. У деяких варіантах здійснення заснований на флуоресценції аналіз TaqMan за кінцевою точкою для визначення зиготності дозволяє безпосередньо аналізувати результати в спектрофотометрі для читання планшетів з ідентифікацією AAD-1 об'єкта в кукурудзі і 4 UA 109882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 референтного гена. Даний винахід включає галузі застосування в селекції, такі як аналіз інтрогресії AAD-1 об'єкта в інші лінії кукурудзи. Способи детекції і набори за даним винаходом можна використати для визначення об'єктів відповідно до даного винаходу. Способи і набори за даним винаходом можна використати для поліпшених стратегій селекції та аналізу зчеплення генів. Способи детекції за даним винаходом особливо ефективні в поєднанні з селекцією рослин для визначення того, які потомки містять даний об'єкт після схрещування батьківської рослини, що містить об'єкт, який викликає інтерес, із рослиною іншої лінії з метою передачі однієї або декількох додаткових ознак, що викликають інтерес, потомству. Ці способи аналізу Taqman ПЛР ефективні для застосування в програмах селекції кукурудзи, а також у контролі якості, особливо для насіння кукурудзи, що комерційно використовується. Також можна одержувати і застосовувати набори Taqman ПЛР для таких ліній трансгенної кукурудзи. Це також може бути ефективним для реєстрації продуктів і керування виробництвом. Більше того вказані способи можна використовувати для вивчення та опису процесу інтеграції трансгена, опису геномного сайта інтеграції, сортування об'єктів, стабільності трансгенів і їхніх фланкуючих послідовностей і генної експресії (особливо транскрипції гена, що стосується пригнічення, патернів метилування трансгена, ефекту положення і потенційно пов'язаних з експресією елементів, таких як MARS [райони приєднання до ядерного матриксу], і т.ін.). Як застосовують у цьому документі, термін "кукурудза" означає маїс (Zea mays) і включає всі його різновиди, які можна схрестити з кукурудзою. Даний винахід далі включає способи схрещування і застосування способів за даним винаходом. Наприклад, даний винахід включає спосіб одержання гібридного насіння F1 за допомогою схрещування представленої у ролі прикладу рослини з іншою (наприклад, інбредною батьківською) рослиною з одержанням гібридного насіння, і детекцію необхідного об'єкта. Якості одержаних рослин можна також поліпшувати за допомогою об'єднання способів за даним винаходом. Стійкі до гербіцидів рослини кукурудзи можна схрещувати за допомогою статевого схрещування першої батьківської рослини, що являє собою рослину кукурудзи, вирощену з насіння лінії, вказаної в цьому документі, з другою батьківською рослиною кукурудзи з одержанням безлічі рослин першого покоління; і потім відбору рослини першого покоління, стійкої до гербіциду (або яка несе об'єкт, що розглядається); і самоопилення рослин першого покоління з одержанням безлічі рослин другого покоління; і потім відбору з рослин другого покоління рослини, стійкої до гербіциду (або яка несе, принаймні, один з об'єктів). Ці етапи можуть далі включати зворотне схрещування рослини першого покоління або рослини другого покоління з другою батьківською рослиною кукурудзи або третьою батьківською рослиною кукурудзи. Урожай зерна, що містить насіння кукурудзи за даним винаходом, або його потомство, можна висаджувати. Також необхідно розуміти, що дві різні трансгенні рослини також можна схрещувати з одержанням потомства, яке містить два незалежно сегрегуючих екзогенних гена. Внаслідок самоопилення відповідного потомства можна одержувати рослини, гомозиготні за обома цими екзогенними генами. У даному винаході також розглядається зворотне схрещування з батьківською рослиною і ауткросинг з нетрансгенною рослиною, а також вегетативне розмноження. Інші способи схрещування, загальновживані для різних ознак і культур, також відомі в даній галузі. Зворотне схрещування застосовували для перенесення генів, що кодують ознаки з простим домінантним успадкуванням, у потрібну гомозиготну культурну або інбредну лінію, яка являє собою рекурентну батьківську рослину. Рослину-носія ознаки, що підлягає перенесенню, називають батьківською рослиною-донором. Чекають, що одержана рослина несе ознаки рекурентної батьківської рослини (наприклад, культурного сорту) і бажану ознаку, одержану від батьківської рослини-донора. Після першого схрещування відбирають рослини, що мають фенотип батьківської рослини-донора, і повторно схрещують їх (зворотне схрещування) з рекурентною батьківською рослиною. Чекають, що одержана рослина несе ознаки рекурентної батьківської рослини (наприклад, культурного сорту) і бажану ознаку, одержану від батьківської рослини-донора. Даний винахід можна використати в поєднанні зі способом схрещування із застосуванням маркера (MAB). Також молекули ДНК за даним винаходом можна використати з іншими способами (такими як маркери AFLP, маркери RFLP, маркери RAPD, SNP і SSR), які дозволяють ідентифікувати генетично зчеплені агрономічно корисні ознаки. Ознаки стійкості до гербіцидів можна відстежувати у потомства кросу (або потомків цього потомства і будь-яких 5 UA 109882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інших культурних сортів або різновидів кукурудзи) із застосуванням способів MAB. Способи за даним винаходом можна використати для ідентифікації будь-яких різновидів кукурудзи, що несуть об'єкт, який викликає інтерес. Способи за даним винаходом включають спосіб одержання стійких до гербіцидів рослин кукурудзи, де вказаний спосіб включає схрещування з рослиною, що несе об'єкт, який викликає інтерес. Переважні способи додатково включають відбір потомків від вказаного кроса за допомогою перевірки вказаного потомства на наявність об'єкта, детектованих відповідно до даного винаходу. Наприклад, даний винахід можна використати для відстеження потрібного об'єкта в циклах схрещування рослин, що несуть бажані ознаки, такі як агрономічні ознаки. Рослини, що містять потрібний об'єкт і бажані ознаки, можна, наприклад, детектувати, ідентифікувати, відбирати і швидко застосовувати в подальших циклах схрещування. Потрібний об'єкт/ознаку можна також поєднувати за допомогою схрещування з ознакою (ознаками) стійкості до комах і/або додатковими ознаками стійкості до гербіцидів і відстежувати відповідно до даного винаходу. Один переважний варіант здійснення являє собою рослину, що містить потрібний об'єкт у поєднанні з геном, що кодує стійкість до гербіцидів імідазолінону, гліфосату і/або глуфосинату. У деяких варіантах здійснення можна застосовувати ген стійкості до дикамби. Таким чином, даний винахід можна комбінувати з, наприклад, генами, що кодують стійкість до гліфосату (наприклад, стійка рослина або бактеріальні EPSPS, GOX, GAT), стійкість до глуфосинату (наприклад, Pat, bar), стійкість до гербіцидів, інгібуючих ацетолактатсинтазу (ALS) (наприклад, імідазолінонів [таких як імазетапір], сульфонілкарбаміду, триазолопіримідину сульфонаніліду, піримідинілтіобензоатів та інших хімічних сполук [Csrl, SurA, et al.]), стійкість до бромоксинілу (наприклад, Bxn), стійкість до інгібіторів ферменту HPPD (4-гідроксифеніл-піруватдіоксигеназа), стійкість до інгібіторів фітоен десатурази (PDS), стійкість до гербіцидів, інгібуючих фотосистему II (наприклад, psbA), стійкість до гербіцидів, інгібуючих фотосистему I, стійкість до гербіцидів, інгібуючих протопорфіриноген оксидазу IX (PPO) (наприклад, PPO-I), стійкість до гербіцидів фенілуреї (наприклад, CYP76B1), дикамба-руйнуючих ферментів (див., наприклад, US 20030135879), та іншими, які можна поєднувати окремо або в складних комбінаціях для надання можливості ефективного контролю або запобігання зараженню бур'янами і/або стійкість до гербіцидів вказаних вище класів. Щодо додаткових гербіцидів деякі додаткові переважні ALS (також відомі як AHAS) інгібітори включають триазолопіримідину сульфонаніліди (такі як клорансулам-метил, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам і пеноксулам), піримідинілтіобензоати (такі як біспірибак і піритіобак) і флукарбазон. Деякі переважні інгібітори HPPD включають мезотрион, ізоксафлютол і сулькотріон. Деякі переважні інгібітори PPO включають флуміклорак, флуміоксазин, флуфенпір, пірафлуфен, флутіацет, бутафенацил, карфентразон, сульфентразон і дифенілефіри (такі як ацифлуорфен, фомесафен, лактофен і оксифлуорфен). Крім того, AAD-1 окремо або в поєднанні з однією або декількома додатковими ознаками HTC можна поєднувати з однією або декількома додатковими первинними (наприклад, стійкість до комах, стійкість до грибів або стійкість до стресу та ін.) або вторинними (наприклад, підвищена врожайність, поліпшені характеристики олій, підвищена якість волокон і ін.) ознаками. Таким чином, даний винахід можна застосовувати для надання повного агрономічного набору, що включає поліпшену якість культури і можливість гнучкого контролю будь-якої кількості сільськогосподарських шкідників з оптимальними витратами. Як застосовують у цьому документі, "лінія" являє собою групу рослин, яка характеризується низькою генетичною різноманітністю або її відсутністю між індивідуумами для, принаймні, однієї ознаки. Такі лінії можна одержувати за допомогою самоопилення і відбору для декількох послідовних поколінь, або за допомогою вегетативного розмноження однієї батьківської рослини із застосуванням способів тканинної або клітинної культури. Як застосовують у цьому документі, терміни "культурний сорт" і "різновид" є синонімами і належать до лінії, яку застосовують для комерційного виробництва. "Стабільність" або "стабільний" означає, що стосовно даного компонента компонент одержують від покоління до покоління, і, переважно, принаймні, протягом трьох поколінь, на практично однаковому рівні, наприклад, переважно ±15 %, переважніше ±10 %, найбільш переважно ±5 %. На стабільність може впливати температура, місце, стрес і час посадки. При порівнянні послідовних поколінь у польових умовах рівні одержання компонента повинні бути схожими. Під "комерційною придатністю" розуміють високу потужність рослин і високу фертильність, у зв'язку з чим урожай можуть одержувати фермери, що застосовують традиційне фермерське обладнання, а з насіння можна виділяти масло з описаними компонентами із застосуванням 6 UA 109882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 традиційного дробильного та екстракційного обладнання. Комерційно придатний урожай при оцінці за масою насіння, вмістом олії і загальною кількістю олії, що одержується з розрахунку на акр, відрізняється не більше за 15 % від середнього урожаю порівнянного комерційного різновиду кукурудзи без ознак виняткових ознак, що росте в тому ж регіоні. "Агрономічно цінний" означає, що лінія має бажані агрономічні характеристики, такі як врожайність, стиглість, стійкість до захворювань і т.ін., на додаток до стійкості до комах, зумовленої об'єктом(об'єктами), що розглядається(ються). Агрономічні ознаки розглядають окремо або в поєднанні. Фахівці в даній галузі в світлі даного винаходу повинні розуміти, що переважні варіанти здійснення наборів для детекції, наприклад, можуть включати зонди і/або праймери. Наприклад, вони включають полінуклеотидні зонди, праймери і/або амплікони, як вказано в цьому документі. Фахівці у даній галузі також повинні розуміти, що можна конструювати праймери і зонди для гібридизації в діапазоні стандартних умов гібридизації і/або ПЛР із ділянкою SEQ ID NO:1 (або комплементарної послідовності) і комплементарними йому послідовностями, де праймер або зонд не повністю комплементарні наведеній у ролі прикладу послідовності. Таким чином, можна допускати деякий ступінь порушення комплементарності. Наприклад, для праймера довжиною в приблизно 20 нуклеотидів, як правило, один або два або т.ін. нуклеотидів можуть не зв'язуватися з лежачою навпроти ниткою, якщо некомплементарна основа є внутрішньою або знаходиться на кінці праймера, протилежному амплікону. Різні придатні умови гібридизації наведені нижче. Синтетичні аналоги нуклеотидів, такі як інозин, також можна використати в зондах. Також можна використати зонди з пептидних нуклеїнових кислот (ПНК), а також ДНК- і РНК-зонди. Важливо, що такі зонди і праймери є діагностичними ознаками (здатними однозначно ідентифікувати і розрізняти) на наявність об'єкта за даним винаходом. Компоненти кожної "вставки" наведені на Фіг. 1-3. Полінуклеотидні послідовності ДНК цих компонентів або їх фрагментів можна використати у ролі ДНК-праймерів або зондів у способах за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення винаходу надані композиції і способи детекції наявності ділянки-вставки трансген/геном у рослин і насіння і т.ін. кукурудзи. У деяких варіантах здійснення послідовності ДНК, що містять суміжний фрагмент нової ділянки-вставки трансген/геном, являють собою аспекти за даним винаходом. Включені послідовності ДНК, що містять достатню кількість полінуклеотидів із послідовності трансгенної вставки і достатню кількість полінуклеотидів із геномної послідовності кукурудзи і/або послідовності, що застосовується як послідовність праймера для одержання амплікону для діагностики однієї або декількох таких рослин кукурудзи. Пов'язані з цим варіанти здійснення стосуються послідовностей ДНК, що містять, принаймні, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більш послідовних нуклеотидів трансгенної ділянки послідовності ДНК, наведеної в цьому документі, або комплементарних до неї послідовностей. Такі послідовності можна застосовувати у ролі ДНК-праймерів у способах ампліфікації ДНК. Амплікони, одержані із застосуванням цих праймерів, є діагностичними ознаками наявності об'єкта кукурудзи, вказаного у цьому документі. Таким чином, винахід також включає амплікони, одержані із застосуванням таких ДНК-праймерів і гомологічних праймерів. Даний винахід включає способи детекції наявності в зразку ДНК, відповідної ДНК об'єкта кукурудзи, вказаного в цьому документі. Такі способи можуть включати етапи: (а) контактування біологічного зразка з парою праймерів, які при застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти із вказаною ДНК продукують амплікон, який являє собою діагностичний показник присутності вказаного(их) об'єкта(ів); (b) проведення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з одержанням амплікону; і (с) детекції вказаного амплікону. Подальші способи детекції за даним винаходом включають спосіб детекції присутності в зразку ДНК, що відповідає, принаймні, одному з вказаних об'єктів, де вказаний спосіб включає етапи: (а) контактування біологічного зразка із зондом, який гібридизується в жорстких умовах гібридизації із вказаною ДНК і не гібридизується в жорстких умовах гібридизації з ДНК контрольної рослини кукурудзи (що не містить вбудовану ДНК, яка викликає інтерес); (b) створення жорстких умов гібридизації для вказаного зразка і зонда; і (с) детекції гібридизації вказаного зонда з ДНК. Даний винахід включає способи детекції присутності в зразку ДНК від, принаймні, однієї рослини кукурудзи, вказаної в цьому документі. Такі способи можуть включати етапи: (a) контактування біологічного зразка з парою праймерів, які при застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з вказаною ДНК продукують амплікон, який являє собою діагностичний 7 UA 109882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 показник присутності вказаного(их) об'єкта(ів); (b) проведення реакції ампліфікації TAQMAN ПЛР, використовуючи референтний ген, вказаний у цьому документі; і (с) аналізу результатів. У додаткових варіантах здійснення даний винахід включає способи одержання рослини кукурудзи, що містить AAD-1 об'єкт за даним винаходом, де вказаний спосіб включає етапи: (a) статевого схрещування першої батьківської лінії кукурудзи (що містить експресуючі касети за даним винаходом, які надають вказану ознаку стійкості до гербіцидів рослинам вказаної лінії) і другої батьківської лінії кукурудзи (позбавленої ознаки стійкості до гербіцидів) з одержанням безлічі рослин-потомків; і (b) відбору потомків із застосуванням молекулярних маркерів. Такі способи необов'язково містять подальший етап зворотного схрещування потомства з другою батьківською лінією кукурудзи з одержанням гомозиготної рослини, що несе вказану ознаку стійкості до гербіцидів. За іншим аспектом винаходу надані способи визначення зиготності потомства кроса із застосуванням розглядуваного об'єкта. Вказані способи можуть включати контактування зразка, що містить ДНК кукурудзи, із парою праймерів за даним винаходом. Вказані праймери при застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти із вказаною ДНК продукують перший амплікон, який являє собою діагностичну ознаку наявності, принаймні, одного з вказаних об'єктів кукурудзи. Такі способи додатково включають проведення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з одержанням першого амплікону; детекцію першого амплікону; і контактування зразка, що містить ДНК кукурудзи, із парою вказаних праймерів, які при застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК рослин кукурудзи продукують другий амплікон, що містить природну геномну ДНК кукурудзи, гомологічну до геномної ділянки кукурудзи; і проведення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з одержанням другого амплікону. Способи додатково містять детекцію другого амплікону і порівняння першого і другого ампліконів у зразку, де наявність обох ампліконів вказує на те, що зразок є гетерозиготним за трансгенною вставкою. Набори для детекції ДНК можна одержувати із застосуванням композицій, що описуються в цьому документі, і способів, добре відомих у галузі детекції ДНК. Набори ефективні для ідентифікації ДНК об'єкта кукурудзи, що розглядається в зразку, і їх можна застосовувати в способах схрещування рослин кукурудзи, що містять таку ДНК. Набори містять послідовності ДНК, гомологічні або комплементарні ампліконам, наприклад, послідовностям ДНК, що описуються в цьому документі, або, гомологічні або комплементарні ДНК, що міститься в трансгенних генетичних елементах об'єктів, що розглядаються. Ці послідовності ДНК можна використати в реакціях ампліфікації ДНК або як зонди в способі гібридизації ДНК. Набори можуть також містити реагенти і матеріали, необхідні для проведення детекції. "Зонд" являє собою виділену молекулу нуклеїнової кислоти, зв'язану зі стандартною детектованою міткою або репортерною молекулою (такою як радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний засіб або фермент). Такий зонд комплементарний послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, а у разі даного винаходу – послідовності геномної ДНК, що походить від одного з вказаних об'єктів кукурудзи, або від рослини кукурудзи, або від зразка, що включає ДНК даного об'єкта. Зонди за даним винаходом включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також поліаміди та інші матеріализонди, які специфічно зв'язуються з ДНК-послідовністю-мішенню і які можна застосовувати для детекції присутності такої ДНК-послідовності-мішені. "Праймери" являють собою виділені/синтезовані нуклеїнові кислоти, які випалюються з комплементарною ДНК-послідовністю-мішенню з утворенням гібрида між праймером і ДНКпослідовністю-мішенню з подальшим подовженням вздовж ланцюга ДНК-мішені за допомогою полімерази, наприклад, ДНК-полімерази. Пари праймерів за даним винаходом застосовують для ампліфікації послідовності-мішені нуклеїнової кислоти, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або інших традиційних способів ампліфікації нуклеїнових кислот. Довжина зондів і праймерів становить, як правило, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 8 UA 109882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 або 500 полінуклеотидів або більше. Такі зонди і праймери специфічно гібридизуються з послідовністю-мішенню при суворих умовах гібридизації. Переважно послідовності зондів і праймерів за даним винаходом повністю співпадають із послідовністю-мішенню, хоч традиційними способами можна конструювати зонди, відмінні від послідовності-мішені і що зберігають здатність гібридизуватися з послідовністю-мішенню. Способи одержання і застосування зондів і праймерів описані, наприклад, у Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989. Пари ПЛР-праймерів можна одержувати з відомої послідовності, наприклад, із застосуванням комп'ютерних програм, призначених для цієї мети. Праймери і зонди, сконструйовані на основі фланкуючих ДНК і послідовностей-вставок, описаних у даній заявці, можна застосовувати для підтвердження (і, за необхідності, коректування) послідовностей, що розглядаються традиційними способами, наприклад, за допомогою повторного клонування і секвенування таких послідовностей. Зонди нуклеїнових кислот і праймери за даним винаходом гібридизуються в жорстких умовах із ДНК послідовністю-мішенню. Для детекції наявності в зразку ДНК трансгенного об'єкта можна застосовувати будь-який традиційний спосіб гібридизації або ампліфікації нуклеїнової кислоти. Молекули нуклеїнової кислоти або їх фрагменти здатні до специфічної гібридизації з іншими молекулами нуклеїнової кислоти за певних умов. Як застосовують у цьому документі, вказано, що дві молекули нуклеїнової кислоти здатні специфічно гібридизуватися одна з одною, якщо вказані дві молекули здатні до утворення антипаралельної дволанцюгової структури нуклеїнової кислоти. Молекулу нуклеїнової кислоти вважають "комплементарною" іншій молекулі нуклеїнової кислоти, якщо вони мають повну комплементарність. Як застосовують у цьому документі, вважають, що молекули мають "повну комплементарність", якщо кожний нуклеотид однієї молекули комплементарний нуклеотиду іншої молекули. Вважають, що дві молекули мають "мінімальну комплементарність", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною зі стабільністю, достатньою для їхньої гібридизації однієї з одною, принаймні, у стандартних умовах "низької жорсткості". Аналогічно, вважають, що молекули "комплементарні", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною зі стабільністю, достатньою для їхньої гібридизації однієї з одною в стандартних умовах "високої жорсткості". Стандартні умови жорсткості описані в Sambrook et al., 1989. Таким чином, відхилення від повної комплементарності допустимі за умови, що такі відхилення ніяк не перешкоджають здатності молекул утворювати дволанцюгові структури. Щоб молекула нуклеїнової кислоти була у ролі праймера або зонда, необхідно тільки, щоб ступінь її комплементарності потрібної послідовності був достатнім для утворення стабільної дволанцюгової структури в конкретному розчиннику і в конкретних концентраціях солі. Як застосовують в цьому документі, по суті гомологічна послідовність являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, що специфічно гібридизується з комплементом послідовності нуклеїнової кислоти, з якою її порівнюють, в умовах високої жорсткості. Термін "жорсткі умови" функціонально визначають стосовно гібридизації нуклеїновокислотного зонда з нуклеїновою кислотою-мішенню (тобто з певною послідовністю нуклеїнової кислоти, що викликає інтерес) за допомогою способів гібридизації, описаних у Sambrook et al., 1989, у 9.529.55. Див. також Sambrook et al., 1989 у 9.47-9.52 і 9.56-9.58. Таким чином, нуклеотидні послідовності за винаходом можна використати завдяки їхній здатності специфічно утворювати подвійні молекули з комплементарними ділянками фрагментів ДНК. Залежно від ділянки застосування можна використати різні умови гібридизації для досягнення різних ступенів специфічності зонда до послідовності-мішені. Для ділянок 9 UA 109882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосування, що вимагають високої специфічності, як правило, застосовують відносно жорсткі умови для одержання гібридів, наприклад, застосовують умови з відносно низькою концентрацією солі і/або високою температурою, такі як від приблизно 0,02 M до приблизно 0,15 M NaCl при температурі від приблизно 50 °C до приблизно 70 °C. Жорсткі умови, наприклад, можуть включати, принаймні, двократне промивання фільтра для гібридизації буфером для промивання в умовах високої жорсткості (0,2 X SSC, 0,1 % SDS, 65 °C). Придатні умови жорсткості, які сприяють гібридизації ДНК, наприклад, 6,0 X хлорид натрію/цитрат натрію (SSC) при приблизно 45 °C із подальшим промиванням 2,0 X SSC при 50 °C, відомі фахівцям у даній галузі. Наприклад, концентрація солі на етапі промивання може варіювати від концентрації, що використовується в умовах низької жорсткості і складає приблизно 2,0 X SSC при 50 °C, до концентрації, що використовується в умовах високої жорсткості і складає приблизно 0,2 X SSC при 50 °C. Крім того, температуру на етапі промивання можна збільшувати від кімнатної температури, що використовується в умовах низької жорсткості і складає приблизно 22 °C, до температури, що використовується в умовах високої жорсткості і складає приблизно 65 °C. Можна змінювати одночасно і температуру, і концентрацію солі, або можна підтримувати температуру на постійному рівні, змінюючи концентрацію солі, і навпаки. Такі вибіркові умови не допускають незбіг, або допускають тільки невеликий незбіг, між зондом і матричним ланцюгом або ланцюгом-мішенню. Детекція послідовності ДНК за допомогою гібридизації добре відома фахівцям у даній галузі, і патенти США №№ 4965188 і 5176995 надають приклади способів аналізу гібридизації. В особливо переважному варіанті здійснення нуклеїнова кислота за даним винаходом специфічно гібридизується з одним або декількома праймерами (або ампліконами або іншими послідовностями), наведеними як приклади або наданими в цьому документі, включаючи їх комплементи і фрагменти, в умовах високої жорсткості. В одному з аспектів даного винаходу молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом має послідовність нуклеїнової кислоти, представлену в SEQ ID NO:2-7, або її комплементи і/або фрагменти. В іншому аспекті даного винаходу послідовність маркерної молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом на 80-100 % або 90-100 % ідентична послідовності такої нуклеїнової кислоти. У додатковому аспекті даного винаходу послідовність маркерної молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом на 95-100 % ідентична такій послідовності. Такі послідовності можна використати як маркери в способах схрещування рослин для ідентифікації потомства генетичних кросів. Гібридизацію зонда з молекулою ДНК-мішені можна детектувати різними способами, відомими фахівцям у даній галузі, причому ці способи включають як необмежуючі приклади флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, мітки на основі антитіл і хемілюмінесцентні мітки. Що стосується ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені (наприклад, за допомогою ПЛР) із застосуванням певної пари праймерів для ампліфікації, "жорсткі умови" являють собою умови, які дозволяють парі праймерів гібридизуватися тільки з послідовністю нуклеїнової кислоти-мішені, з якою зв'язується праймер, що містить відповідну послідовність дикого типу (або її комплемент), із переважним одержанням унікального продукту ампліфікації, амплікону. Термін "специфічний для (послідовності-мішені)” означає, що зонд або праймер гібридизується в жорстких умовах гібридизації тільки з послідовністю-мішенню в зразку, що містить послідовність-мішень. Як застосовують у цьому документі, "ампліфікована ДНК" або "амплікон" стосується продукту нуклеїновокислотної ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, яка є частиною матричної нуклеїнової кислоти. Наприклад, щоб визначити, чи містить рослина кукурудзи, одержана внаслідок статевого схрещування, геномну ДНК трансгенного об'єкта, що походить від рослини кукурудзи за даним винаходом, ДНК, виділену із зразка тканини рослини кукурудзи, піддають нуклеїновокислотній ампліфікації із застосуванням пари праймерів, яка включає один праймер, що походить від фланкуючої послідовності в геномі рослини, суміжної з сайтом інсерції вбудованої гетерологічної ДНК, і другий праймер, що походить від вбудованої гетерологічної ДНК, з одержанням амплікону, який є діагностичною ознакою наявності трансгенної ДНК. Довжина і послідовність амплікону також є діагностичними ознаками наявності об'єкта. Довжина такого амплікону може варіювати, складаючи загальну довжину пар праймерів плюс одна пара нуклеотидів, і/або загальну довжину пар праймерів плюс приблизно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 10 UA 109882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 або більше пар нуклеотидів (плюс або мінус значення подовження, наведені вище). Альтернативно, пара праймерів може походити від фланкуючої послідовності з обох боків вбудованої ДНК, так, щоб продукувати амплікон, що включає всю вбудовану нуклеотидну послідовність. Член пари праймерів, що походить від геномної послідовності рослини, може знаходитися на відстані від вбудованої послідовності ДНК. Ця відстань може варіювати від однієї пари нуклеотидів до приблизно двадцяти тисяч пар нуклеотидів. Зокрема, застосування терміну "амплікон" виключає димери праймерів, які можуть утворюватися в реакції термоампліфікації ДНК. Ампліфікацію нуклеїнових кислот можна провести різними способами ампліфікації нуклеїнових кислот, відомими в даній галузі, які включають полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Ряд способів ампліфікації відомі в даній галузі та описані, у тому числі, у патенті США № 4683195 і патенті США № 4683202. Розроблені способи ПЛР-ампліфікації для ампліфікації до 22 т.п.н. геномної ДНК. Ці способи, а також інші відомі в даній галузі способи ампліфікації ДНК, можна застосовувати в практичному здійсненні даного винаходу. Послідовність гетерологічної трансгенної ДНК-вставки або фланкуючої геномної послідовності, що походить від об'єкта кукурудзи, який розглядається, можна підтверджувати (і за необхідності коректувати) за допомогою ампліфікації таких послідовностей вказаного об'єкта із застосуванням праймерів, що походять від послідовностей, наведених у цьому документі, із подальшим проведенням стандартного секвенування ДНК ПЛР-амплікону або клонованої ДНК. Амплікон, який одержують цими способами, можна детектувати різними способами. Електрофорез в агарозному гелі і забарвлювання бромистим етидієм являє собою традиційний добре відомий спосіб детекції ДНК-ампліконів. Інший такий спосіб являє собою аналіз генетичного коду, в якому конструюють ДНК-олігонуклеотид, що перекривається як із суміжною фланкуючою геномною послідовністю ДНК, так і з вбудованою послідовністю ДНК. Олігонуклеотид іммобілізують на ямку мікроямкового планшета. Після проведення ПЛР потрібної ділянки (із застосуванням одного праймера у вбудованій послідовності та одного праймера в суміжній фланкуючій геномній послідовності) одноланцюговий ПЛР-продукт можна гібридизувати з іммобілізованим олігонуклеотидом, і він може бути у ролі матриці для реакції подовження на одну основу із застосуванням ДНК-полімерази і міченими ddNTP, специфічними до наступної передбачуваної основи. Зчитування даних можна провести за допомогою флуоресцентного аналізу або ELISA-аналізу. За успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу сигнал вказує на присутність вставки/фланкуючої послідовності. Всі патенти, патентні заявки, попередні заявки і публікації, що згадуються або що цитуються в цьому документі, у повному обсязі включені шляхом посилання в тій мірі, в якій вони відповідають ідеї даного винаходу. Застосовують наведені нижче скорочення, якщо не вказано інакше. 11 UA 109882 C2 AAD-1 п.н. °С ДНК DIG ЕДТА т.п.н. мкг мкл мл M OLP ПЛР PTU SDS SOP SSC TBE V 5 10 15 20 25 30 арилоксіалканоат діоксигеназа-1 пара нуклеотидів градуси Цельсія дезоксирибонуклеїнова кислота дигоксигенін етилендіамінтетраоцтова кислота тисяча пар нуклеотидів мікрограм мікролітр мілілітр молярна маса перекривний зонд полімеразна ланцюгова реакція одиниця транскрипції рослини додецилсульфат натрію стандартна методика роботи буферний розчин, що містить суміш хлориду натрію і цитрату натрію, pH 7,0 буферний розчин, що містить суміш трису, борної кислоти і ЕДТА, pH 8,3 вольт ПРИКЛАДИ Приклад 1 Об'єкт-специфічний аналіз Taqman Об'єкт-специфічний аналіз Taqman розроблений для детекції наявності об'єкта кукурудзи DAS-40278-9 і визначення типу зиготності рослин у популяціях, що розмножуються. Для проведення об'єкт-специфічного аналізу розроблені специфічні праймери і зонди Taqman на основі послідовності ДНК, розташованій у ділянці 5-кінця стику трансген-геном. Для специфічної детекції DAS-40278-9 ампліфікували фрагмент ДНК довжиною в 73 т.п.н., який охоплює ділянку стику на 5-кінці, із застосуванням двох специфічних праймерів. Ампліфікацію цього ПЛР-продукту оцінювали із застосуванням мішень-специфічного зонда MGB, синтезованого Applied Biosystems, що містить мітку FAM на 5-кінці. Специфічність такого способу детекції Taqman для об'єкта DAS-40278-9 AAD-1 кукурудзи тестували на 16 різних об'єктах AAD-1 кукурудзи і нетрансгенних різновидах кукурудзи із застосуванням специфічного для кукурудзи ендогенного референтного гена, гена інвертази. Приклад 1.1 Виділення гДНК Тестували зразки гДНК від 16 різних об'єктів AAD-1 кукурудзи і нетрансгенних різновидів кукурудзи. гДНК виділяли із застосуванням двох способів, набору Qiagen і CTAB. Для зразків гДНК, виділених за допомогою набору Qiagen, використали вісім свіжих шматочків листа кукурудзи для виділення гДНК згідно з модифікованою методикою Qiagen DNeasy 96 Plant Kit. Для зразків гДНК, виділених із застосуванням способу CTAB, використали приблизно 0,3 г ліофілізованої тканини листа згідно з методикою, наведеною в Permingeat et al., 1998. Кількість гДНК оцінювали за допомогою способу Pico Green згідно з інструкцією виробника (Molecular Probes, Eugene, OR). Для проведення даного дослідження зразки гДНК розводили вільною від ДНКази водою з одержанням концентрації, що становить 10 нг/мкл. Приклад 1.2 Аналіз Taqman і результати Для проведення аналізу Taqman, специфічного до об'єкта DAS-40278-9, конструювали специфічні праймери і зонди Taqman. Ці реагенти можна використати в умовах, наведених нижче, для детекції об'єкта DAS-40278-9 AAD-1 кукурудзи. У таблиці 1 наведені послідовності праймера і зонда, спеціально розроблені для детекції об'єкта DAS-40278-9. 12 UA 109882 C2 Таблиця 1 Праймери ПЛР і зонди Реакція з об'єктом-мішенню Назва Опис Послідовність від 5-кінця до 3-кінця Corn278-F Прямий праймер Seq ID NO:2: 5-ATTCTGGCTTTGCTGTAAATCGT-3 Corn278-R Зворотний праймер Seq ID NO:3: 5-TTACAATCAACAGCACCGTACCTT-3 Corn278Зонд Seq ID NO:4: 5-FAM-CTAACCTTCATTGTATTCC-MGB-3 Probe Реакція з референтним геном інвертази Назва Опис Послідовність від 5-кінця до 3-кінця IVF Прямий праймер Seq ID NO:5: 5-TGGCGGACGACGACTTGT-3 IVR Зворотний праймер Seq ID NO:6: 5-AAAGTTTGGAGGCTGCCGT-3 Seq ID NO:7: 5-HEXIV-Probe Зонд CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC-BHQ2-3 5 10 15 20 25 Умови множинної ПЛР для ампліфікації наступні: 1X буфера ПЛР, 0,5-2,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкМ праймера Corn-278-F, 0,2 мкМ праймера Corn-278-R, 0,2 мкМ праймера IV-F, 0,2 мкМ праймера IV-R, 0,08 мкМ зонда Corn-278-Probe, 0,08 мкM зонда IV-Probe, 40 Од/мл HotStart Taq, 0,6-2,4 мкг/мл ДНК у загальній реакційній суміші об'ємом 25 мкл. Тестували різні концентрації MgCl2 і ДНК. Застосовували концентрації, що становлять 0,5 мМ, 1,0 мМ, 1,8 мМ і 2,5 мМ MgCl2. Суміш ампліфікували із застосуванням наступних умов: i) 95 °C протягом 15 хв, ii) 95 °C протягом 20 с, iii) 60 °C протягом 60 с, iv) повторення етапів ii-iii протягом 50 циклів, v) утримування при 4 °C. ПЛР у реальному часі проводили на приладі Bio-rad iCycler™. Аналіз даних засновували на вимірюванні порогового циклу (CT), який являє собою номер циклу ПЛР, під час якого флуоресценція досягає встановленого значення. Значення CT розраховували автоматично із застосуванням програмного забезпечення iCycler. Послідовності ампліконів, одержаних із застосуванням вказаних вище праймерів, являють собою: 278F і 278R: ttacaatcaacagcaccgtaccttgaagcggaatacaatgaaggttagctacgatttacagcaaagccagaat (SEQ ID NO:8) IVF і IVR: tggcggacgacgacttgtccgagcagaccgccgtgtacttctacctgctcaagggcacggacggcagcctccaaacttt (SEQ ID NO:9) Спосіб Taqman для детекції об'єкта кукурудзи AAD-1 DAS-40278-9 тестували на 16 різних об'єктах AAD-1 кукурудзи і нетрансгенних різновидах кукурудзи із застосуванням специфічного для кукурудзи ендогенного гена інвертази як референтного гена. Цей аналіз дозволяв специфічно виявляти об'єкт кукурудзи AAD-1 DAS-40278-9 і не давав ніяких хибнопозитивних результатів для контрольних зразків (тобто 16 різних об'єктів кукурудзи AAD-1 і нетрансгенних різновидів кукурудзи). Об'єкт-специфічні праймери і зонди можна використати для детекції AAD1 об'єкта DAS-40278-9 кукурудзи, а також ці умови і реагенти є застосовними для аналізів зиготності. 13 UA 109882 C2 14 UA 109882 C2 15 UA 109882 C2 16 UA 109882 C2 17 UA 109882 C2 18 UA 109882 C2 19 UA 109882 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 1. Спосіб визначення зиготності рослини кукурудзи, що містить об'єкт DAS-40278-9 AAD-1 кукурудзи, що містить SEQ ID NO:1, де вказаний об'єкт містить трансгенну конструкцію, що містить ген AAD-1, де вказана трансгенна конструкція фланкована 5-фланкуючою геномною ДНК кукурудзи і 3-фланкуючою геномною ДНК кукурудзи, де вказана 5'-фланкуюча геномна ДНК кукурудзи складається із залишків 1-1873 SEQ ID NO:1 і вказана 3'-фланкуюча геномна ДНК кукурудзи складається із залишків 6690-8557 SEQ ID NO:1, і де вказана трансгенна конструкція складається із залишків 1874-6689 SEQ ID NO:1, де вказаний спосіб включає: одержання зразка геномної ДНК від вказаної рослини кукурудзи; одержання приведеного в контакт зразка за допомогою контактування вказаного зразка ДНК із: a) першим праймером об'єкта і другим праймером об'єкта, де вказаний перший праймер об'єкта містить комплементарну послідовність сегмента вказаної трансгенної конструкції, вказаний другий праймер об'єкта містить комплементарну послідовність сегмента вказаної 5фланкуючої геномної ДНК кукурудзи або комплементарну послідовність сегмента вказаної 3фланкуючої геномної ДНК кукурудзи, і де вказаний перший праймер об'єкта і вказаний другий праймер об'єкта продукують амплікон об'єкта в умовах TAQMAN ПЛР, b) референтним прямим праймером і референтним зворотним праймером, які продукують амплікон ендогенного референтного гена кукурудзи в умовах TAQMAN ПЛР, с) флуоресцентним зондом об'єкта, який гібридизується із вказаним ампліконом об'єкта, d) флуоресцентним референтним зондом, який гібридизується із вказаним референтним ампліконом; надання вказаного приведеного в контакт зразка умовам основаного на флуоресценції TAQMAN ПЛР за кінцевою точкою; кількісний аналіз вказаного флуоресцентного зонда об'єкта, гібридизованого із вказаним ампліконом об'єкта; кількісний аналіз вказаного флуоресцентного референтного зонда, гібридизованого із вказаним ампліконом референтного гена; порівняння кількості гібридизованого флуоресцентного зонда об'єкта з кількістю гібридизованого флуоресцентного референтного зонда; і визначення зиготності DAS-40278-9 за допомогою порівняння рівнів флуоресценції гібридизованого флуоресцентного зонда до об’єкта і гібридизованого флуоресцентного референтного зонда. 2. Спосіб за п. 1, де вказані амплікони складаються із 50-100 залишків. 3. Спосіб за п. 1, де вказаний референтний ген являє собою ендогенний ген інвертази Zea mays. 20 UA 109882 C2 5 10 15 20 25 30 4. Спосіб за п. 1, де вказаний другий праймер об'єкта зв'язується із залишками 1673-1873 з SEQ ID NO:1 або комплементарною їй послідовністю. 5. Спосіб за п. 1, де другий праймер об'єкта зв'язується із залишками 6690-6890 із SEQ ID NO:1. 6. Спосіб за п. 1, де вказаний спосіб застосовують для аналізу інтрогресії об'єкта ААD-1, що містить SEQ ID NO:1, з метою селекції в іншу лінію кукурудзи. 7. Спосіб за п. 6, де вказана інша лінія кукурудзи позбавлена вказаного об'єкта. 8. Спосіб за п. 1, де вказаний амплікон об'єкта DAS-40278-9 складається з 73 пар основ. 9. Спосіб за п. 1, де вказаний референтний ген гібридизується з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 і SEQ ID NO:7, або містить її. 10. Спосіб за п. 1, де вказані референтні праймери складаються з SEQ ID NO:5 і SEQ ID NO:6, і вказаний референтний зонд містить SEQ ID NO:7. 11. Спосіб за п. 1, де вказані зонди мічені флуоресцентним барвником і гасником. 12. Спосіб за п. 11, де вказаний зонд об'єкта містить FAM у ролі вказаного флуоресцентного барвника на 5-кінці вказаного зонда об'єкта і гасник MGB на 3-кінці вказаного зонда об'єкта. 13. Спосіб за п. 1, де вказаний референтний амплікон являє собою фрагмент довжиною в 79 пар основ, ампліфікований із застосуванням вказаних праймерів. 14. Спосіб за п. 11, де вказаний референтний зонд помічений HEX на 5-кінці вказаного референтного зонда і гасником Black Hole 2 (BHQ2) на 3-кінці вказаного референтного зонда. 15. Спосіб за п. 1, де вказаний амплікон об'єкта складається з SEQ ID NO:8, а вказаний референтний амплікон складається з SEQ ID NO:9. 16. Спосіб за п. 1, де вказаний зонд об'єкта складається з SEQ ID NO:4. 17. Спосіб за п. 1, де вказані праймери об'єкта вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:3. 18. Спосіб за п. 1, де результати вказаного способу зчитують безпосередньо в спектрофотометрі для читання планшетів. 19. Спосіб за п. 1, де вказаний зразок ДНК одержують із рослини кукурудзи в полі. 20. Набір для здійснення способу за п. 1, де вказаний набір включає вказані праймери об'єкта, що складаються з SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:3, вказані референтні праймери, що складаються з SEQ ID NO:5 і SEQ ID NO:6, вказаний зонд об'єкта, що складається з SEQ ID NO:4, і вказаний референтний зонд, що складається з SEQ ID NO:7. 21 UA 109882 C2 22 UA 109882 C2 Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 23