Антиангіогенна терапія для лікування раку молочної залози, що раніше піддавався лікуванню

Реферат: Винахід належить до лікування хворого з діагнозом потрійного негативного метастатичного раку молочної залози, що раніше був підданий лікуванню, який включає отримання хворим схеми лікування, яка поєднує хіміотерапію як терапію другої лінії з введенням ефективної кількості антитіла проти VEGF, причому схема лікування за допомогою хіміотерапії включає введення щонайменше одного хіміотерапевтичного засобу, вибраного з групи, яка включає таксани, капецитабін, гемцитабін і вінорелбін, і де схема лікування ефективно збільшує період виживання без прогресування захворювання у хворого. UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 За даною заявкою вимагається пріоритет попередньої заявки Сполучених Штатів № 61/266343, зареєстрованої 3 грудня 2009 р., і попередньої заявки Сполучених Штатів № 61/234281, зареєстрованої 15 серпня 2009 р., описи яких включені в даний документ в їх повному об'ємі. Галузь техніки, до якої належить винахід Цей винахід загалом стосується лікування захворювань і патологічних станів людини. Більш конкретно, винахід стосується антиангіогенної терапії, або самої по собі, або в поєднанні з іншими видами протиракової терапії для лікування раку молочної залози, що раніше піддавався лікуванню. Відомий рівень техніки Рак залишається однією з найбільш смертельних загроз здоров'ю людини. У США рак уражає близько 1,3 мільйони нових хворих кожний рік і є другою провідною причиною смерті після захворювань серця, будучи причиною приблизно 1 з 4 смертей. Передбачається також, що рак може перевищити серцево-судинні захворювання, ставши причиною номер один смерті в межах 5 років. За більшість з цих смертей відповідальні солідні пухлини. Хоча досягнуті істотні успіхи в медичному лікуванні певних типів раку, загалом 5-річний коефіцієнт виживання для всіх типів раку поліпшений тільки приблизно на 10 % в останні 20 років. Типи раку або злоякісні пухлини неконтрольованим чином швидко метастазують і ростуть, роблячи надто важким своєчасне виявлення і лікування. Рак молочної залози являє собою захворювання, яке кожний рік вбиває багато жінок в Сполучених Штатах. За даними американського ракового суспільства приблизно 40000 жінок помре від цього захворювання у 2008 р. Більше 180000 нових випадків раку молочної залози діагностується щорічно, і підраховано, що у однієї з восьми жінок виникне рак молочної залози. Ці цифри вказують на те, що рак молочної залози є одним з найбільш небезпечних захворювань, з яким стикаються жінки в даний час. Метастатичний рак молочної залози є звичайно невиліковним, і тільки у невеликої кількості хворих досягається довгострокове виживання після стандартної хіміотерапії. Greenberg et al., J. Clin. Oncol. 14:2197-2205 (1996). Знання основ біології раку молочної залози експонентно розвиваються протягом трьох останніх десятиріч, причому деякі роблять внесок в його лікування. На фазі II багатонаціонального відритого клінічного випробування на 222 жінках з метастатичним раком молочної залози, що гіперекспресує HER2, виявлений показник реакції у відповідь, що становить 15 %, з шістьма підтвердженими повними відповідями при використанні рекомбінантного гуманізованого моноклонального антитіла (трастузумабу, також відомого як герцептин®, Genentech, South San Francisco), спрямованого проти HER2 (Cobleigh et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17:97 (1998)). На фазі III рандомізованого випробування оцінені безпека і ефективність додавання герцептину до першої лінії хіміотерапії або паклітакселом, або поєднанням доксорубіцину і циклофосфаміду. Сумарний показник реакції у відповідь і час до прогресування захворювання істотно поліпшувалися при додаванні герцептину до хіміотерапії в порівнянні тільки з хіміотерапією (Slamon et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17:98 (1998)). Додавання герцептину пролонгувало виживання в цілому (Norton et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 18:127a (1999)). Хоча трастузумаб є першим новим біологічно обґрунтованим терапевтичним агентом, схваленим для лікування субпопуляції хворих на рак молочної залози, що мають типи раку з гіперекспресією HER2, продемонстровані перспективи деяких інших підходів і їх введення в клініку. Однак підраховано, що у 75 процентів жінок з недавно діагностованим метастатичним раком молочної залози він є HER2-негативним. Сполуки, які інгібують ангіогенез, викликають особливий інтерес в плані обхвату додаткових популяцій хворих на рак молочної залози і були і є предметом клінічних випробувань, як в США, так і в інших країнах. Оскільки рак все ще є однією з найбільш смертельних загроз, необхідні додаткові способи лікування раку у хворих. Винахід спрямований на ці і інші потреби, як буде ясно з розгляду подальшого розкриття. Короткий виклад суті винаходу Пропонуються варіанти застосування антитіла проти VEGF для ефективного лікування хворих на рак молочної залози, що раніше піддавалися лікуванню метастатичного раку молочної залози. Зокрема у винаході надані дані по фазі III рандомізованого клінічного випробування бевацизумабу (AVASTIN) в поєднанні зі схемами хіміотерапії індивідуумів, що раніше піддавалися лікуванню метастатичного раку молочної залози у індивідуумів людини. Такі схеми хіміотерапії включають лікування таксанами (наприклад, паклітакселом кожні 3 тижні або щотижня, частинками паклітакселу, зв'язаного з білком (наприклад, Abraxane®) або доцетакселом), гемцитабіном, вінорелбіном або лікування капецитабіном. Успіх випробування 1 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 показує, що додавання антитіла проти VEGF до хіміотерапії забезпечує статистично значущі і клінічно показові переваги як терапія другої лінії для хворих, що раніше піддавалися лікуванню раку молочної залози. Результати, отримані в клінічних дослідженнях по використанню бевацизумабу у індивідуумів людини з метастатичним раком молочної залози, показують, що при оцінці по виживанню без прогресування захворювання (PFS) ефективність була позитивною особливо при порівнянні з даними по PFS при лікуванні тільки хіміотерапевтичними агентами. Індивідууми, які в клінічних випробуваннях отримували бевацизумаб в поєднанні з хіміотерапією (терапія таксанами, капецитабіном, геміцитабіном або вінорелбіном) мали підвищене виживання без прогресування захворювання в порівнянні з індивідуумами, яких лікували тільки з допомогою хіміотерапії. Відмінність була статистично значущою. Відповідно, у винаході пропонується спосіб лікування хворого з діагнозом метастатичного раку молочної залози, що раніше був підданий лікуванню, що включає отримання хворим схеми лікування, що поєднує хіміотерапію з введенням ефективної кількості антитіла проти VEGF. Схема лікування, що поєднує хіміотерапію з введенням антитіла проти VEGF, ефективно збільшує виживання без прогресування захворювання (PFS) у хворого. У певних варіантах здійснення PFS збільшується приблизно на 0,5 місяці, 1 місяць, 1,2 місяці, 2 місяці, 2,1 місяці, 2,2 місяці, 2,8 місяці, 3 місяці і т.д. В одному варіанті здійснення PFS збільшується приблизно на 2,1 місяці. В одному варіанті здійснення PFS збільшується приблизно на 2,2 місяці. В одному варіанті здійснення PFS збільшується приблизно на 2,8 місяці. Будь-який хіміотерапевтичний агент, що проявляє протиракову активність, може бути використаний за винаходом. У певних варіантах здійснення хіміотерапевтичний агент вибраний з групи, що складається з алкілуючих агентів, антиметаболітів, аналогів фолієвої кислоти, аналогів піримідину, аналогів пурину і споріднених інгібіторів, алкалоїдів барвінку, епідофілотоксинів, антибіотиків, L-аспарагінази, інгібітора топоізомерази, інтерферонів, координаційних комплексів з платиною, заміщеною антрацендіоном сечовини, похідних метилгідразину, супресорного агента для кори надниркових залоз, адренокортикостероїдів, прогестинів, естрогенів, антиестрогену, андрогенів, антиандрогену і аналога гонадотропінрилізинг гормону. У певних варіантах здійснення хіміотерапевтичний агент являє собою, наприклад, капецитабін, таксан, паклітаксел, доцетаксел, частинки паклітакселу, зв'язаного з білком (наприклад, Abraxane), гемцитабін, вінорелбін або їх поєднання. У певних варіантах здійснення хіміотерапевтичний агент являє собою, наприклад, капецитабін, таксан, паклітаксел, доцетаксел, частинки паклітакселу, зв'язаного з білком (наприклад, Abraxane), гемцитабін або їх поєднання. У певних варіантах здійснення хіміотерапевтичний агент являє собою, наприклад, капецитабін, таксан, паклітаксел, доцетаксел, частинки паклітакселу, зв'язаного з білком (наприклад, Abraxane), або їх поєднання. Два або більше хіміотерапевтичних агенти можуть бути використані в суміші, призначеній для введення в поєднанні з антитілом проти VEGF. Клінічні переваги способів лікування за винаходом можуть бути виміряні, наприклад, по тривалості виживання без прогресування захворювання (PFS), часу до неспроможності лікування, об'єктивному показнику реакції у відповідь і тривалості відповіді. Відповідно у винаході представлений спосіб інструктування індивідуума-людини, що раніше піддавався лікуванню раку, наприклад, молочної залози, шляхом надання інструкцій по отриманню лікування антитілом проти VEGF, з тим, щоб підвищити виживання індивідуума без прогресування захворювання, знизити ризик рецидиву раку у індивідуума або підвищити імовірність виживання у індивідуума. У деяких варіантах здійснення спосіб додатково включає надання інструкцій по отриманню лікування щонайменше з одним хіміотерапевтичним агентом. Лікування антитілом проти VEGF може проводитися одночасно з лікуванням хіміотерапевтичним агентом або послідовно відносно нього. У певних варіантах здійснення індивідуума лікують, як наказується способом інструктування. У винаході представлений також спосіб просування, що включає просування введення антитіла проти VEGF для лікування індивідуума-людини, раніше підданого лікуванню раку, наприклад, молочної залози. У деяких варіантах здійснення метод додатково включає просування введення щонайменше одного хіміотерапевтичного агента. Введення антитіла проти VEGF може проводитися одночасно з введенням хіміотерапевтичного агента або послідовно відносно нього. Просування може проводитися будь-яким з доступних засобів. У деяких варіантах здійснення просування здійснюється за допомогою рекламного вкладиша в упаковку, що супроводжує склад антитіла проти VEGF, що продається. Просування також може здійснюватися за допомогою рекламного вкладиша в упаковку, що супроводжує склад хіміотерапевтичного агента, який продається. Просування може бути у вигляді письмової або 2 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 усної інформації лікареві або працівнику охорони здоров'я. У деяких варіантах здійснення просування здійснюється за допомогою рекламного вкладиша в упаковку, де в рекламному вкладиші надаються інструкції по отриманню лікування антитілом проти VEGF. У деяких варіантах здійснення за просуванням йде лікування індивідуума антитілом проти VEGF з хіміотерапевтичним агентом або без нього. У винаході пропонується спосіб ведення бізнесу, що включає маркетинг антитіла проти VEGF для лікування індивідуума-людини, що раніше піддавався лікуванню раку, наприклад, молочної залози, з тим, щоб підвищити період виживання індивідуума без прогресування захворювання або знизити імовірність рецидиву раку у індивідуума, або підвищити імовірність виживання у індивідуума. У деяких варіантах здійснення спосіб додатково включає маркетинг хіміотерапевтичного агента для використання в поєднанні з антитілом проти VEGF. У деяких варіантах здійснення за маркетингом йде лікування індивідуума антитілом проти VEGF з хіміотерапевтичним агентом або без нього. Пропонується також спосіб ведення бізнесу, що включає маркетинг хіміотерапевтичного агента в поєднанні з антитілом проти VEGF для лікування індивідуума-людини, що раніше була піддана лікуванню раку, наприклад, молочної залози, з тим, щоб підвищити період виживання індивідуума без прогресування захворювання або знизити імовірність рецидиву раку у індивідуума, або підвищити імовірність виживання у індивідуума. У деяких варіантах здійснення за маркетингом йде лікування індивідуума поєднанням хіміотерапевтичного агента і антитіла проти VEGF. У кожному з способів за винаходом антитіло проти VEGF може бути замінене специфічним антагоністом VEGF, наприклад, молекулою рецептора VEGF або молекулою гібридного рецептора VEGF, як описано нижче. У певних варіантах здійснення способів за винаходом антитіло проти VEGF являє собою бевацизумаб. Антитіло проти VEGF або його антигензв'язувальний фрагмент може являти собою моноклональне антитіло, гібридне антитіло, антитіло повністю від людини або гуманізоване антитіло. Приклади антитіл, придатних для способів за винаходом, включають бевацизумаб (AVASTIN), антитіло G6, антитіло B20 і їх фрагменти. У певних варіантах здійснення антитіло проти VEGF має варіабельну область важкого ланцюга, що включає наступну амінокислотну послідовність: EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO:1) і варіабельну область легкого ланцюга, що включає наступну амінокислотну послідовність: DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR (SEQ ID NO:2). Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент може також являти собою антитіло, в якому відсутня частина Fc, структура F(ab')2, Fab або Fv. В одному варіанті здійснення лікування являє собою поєднання специфічного для VEGF антагоніста, наприклад, антитіла проти VEGF, і щонайменше одного хіміотерапевтичного агента. Кожний з способів за винаходом може бути здійснений на практиці відносно лікування типів раку, включаючи, але, не обмежуючись цим, карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкоз. Більш конкретні приклади таких типів раку включають рак молочної залози, плоскоклітинний рак, дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарциному легені, сквамозну карциному легені, рак очеревини, гепатоцелюлярний рак, рак шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак ободової кишки, колоректальний рак, карциному ендометрію або матки, карциному слинної залози, рак нирки, рак печінки, рак простати, нирковий рак, рак вульви, рак щитовидної залози, карциному печінки, рак шлунка, меланому і різні типи раку голови і шиї. У деяких варіантах здійснення індивідуум страждає HER2-негативним метастатичним раком молочної залози, що раніше піддавався лікуванню. Кожний з вказаних вище аспектів може додатково включати контролювання стану індивідуума на предмет рецидиву раку. Контролювання може здійснюватися, наприклад, за допомогою оцінки тривалості виживання без прогресування захворювання (PFS), або загального виживання (OS), або об'єктивного показника реакції у відповідь (ORR). В одному варіанті здійснення PFS, або OS, або ORR оцінюється після початку лікування. Залежно від типу і тяжкості захворювання в цьому документі описується переважні дозування антитіла проти VEGF, наприклад, бевацизумабу, і вони можуть знаходитися в діапазоні від приблизно 1 мкг/кг до приблизно 50 мг/кг, найбільш переважно від приблизно 5 мг/кг до приблизно 15 мг/кг, включаючи, але, не обмежуючись цим, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг або 3 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15 мг/кг. Частота введення повинна варіюватися залежно від типу і тяжкості захворювання. Для повторних введень протягом декількох днів або більше залежно від стану лікування підтримують доти, поки рак лікується або досягається бажаний терапевтичний ефект при вимірюванні методами, описаними в цьому документі або відомими в даній галузі техніки. В одному прикладі антитіло проти VEGF за винаходом вводять один раз кожний тиждень, кожні два тижні або кожні три тижні в діапазоні доз від приблизно 5 мг/кг до приблизно 15 мг/кг, включаючи, але, не обмежуючись цим, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг або 15 мг/кг. Однак можуть бути використані інші схеми дозування. Хід терапії за винаходом легко простежується за допомогою загальноприйнятих методів і тестів. У додаткових варіантах здійснення кожного з вказаних вище аспектів специфічний для VEGF антагоніст, наприклад, антитіло проти VEGF, вводять місцево або системно (наприклад, перорально або внутрішньовенно). В інших варіантах здійснення одним аспектом лікування є лікування специфічним для VEGF антагоністом у вигляді лікування з пролонгованою фазою або підтримуючої терапії, як оцінюється лікарем або описується в цьому документі. В інших варіантах здійснення лікування специфічним для VEGF антагоністом метастатичного раку молочної залози, що раніше піддавався лікуванню, здійснюється в поєднанні з додатковою протираковою терапією, включаючи, але, не обмежуючись цим, хірургічне втручання, променеву терапію, хіміотерапію, диференційовану терапію, біотерапію, імунну терапію, лікування інгібітором ангіогенезу, цитотоксичним агентом і антипроліферативною сполукою. Лікування специфічним для VEGF антагоністом може також включати будь-яке поєднання вказаних вище типів терапевтичних схем. У деяких варіантах здійснення хіміотерапевтичний агент і специфічний для VEGF антагоніст вводять спільно. У варіантах здійснення, які включають додаткову протиракову терапію, індивідуума можна додатково лікувати додатковою протираковою терапією до, протягом (наприклад, одночасно) або після введення специфічного для VEGF антагоніста. В одному варіанті здійснення специфічний для VEGF антагоніст, що вводиться або одиночно, або з протираковою терапією, можна вводити у вигляді підтримуючої терапії. Інші особливості і переваги винаходу будуть ясні з подальшого докладного опису, фігур і формули винаходу. Короткий опис фігур На фіг. 1 представлений дослідницький дизайн випробування при лікуванні метастатичного раку молочної залози, що раніше піддавався лікуванню з використанням бевацизумабу (група А) або плацебо (група В) з різними варіантами хіміотерапії. На фіг. 2 зображений аналіз основного кінцевого показника PFS в дослідженні, поданому на фіг. 1. На фіг. 3 зображені аналізи PFS в дослідженні, поданому на фіг. 1, специфічні для когорт хворих. На фіг. 4 зображений об'єктивний показник реакцію у відповідь в дослідженні, поданому на фіг. 1. Докладний опис 1. Визначення Термін "VEGF" або "VEGF-A" використовується для позначення 165-амінокислотного фактора росту ендотеліальних клітин судин людини і споріднених 121-, 145-189- і 206амінокислотних факторів росту ендотеліальних клітин судин людини, як описано, наприклад, Leung et al. Science, 246:1306 (1989) і Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), разом з їх природними алельними формами і формами їх процесингу. VEGF-A є частиною сімейства генів, що включає VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F і P1GF. VEGF-A насамперед зв'язується з двома високоафінними рецепторними тирозинкіназами, VEGFR-1 (Flt-1) і VEGFR-2 (Flk-1/KDR), причому остання є основним фактором передачі мітогенних сигналів VEGF-A в ендотеліальних клітинах судин. Крім того, нейропілін-1 був ідентифікований як рецептор ізоформ VEGF-A, зв'язаних з гепарином, і він може грати роль в розвитку судин. Термін "VEGF" або "VEGF-A" також стосується VEGFs від видів, що не належать до людини, таких як миша, щур або примат. Іноді VEGF від конкретних видів вказується за допомогою таких термінів як hVEGF для VEGF людини або mVEGF для мишачого VEGF. Термін "VEGF" також використовується для позначення укорочених форм або фрагментів поліпептиду, що включають амінокислоти з 8 по 109 або з 1 по 109 з 165-амінокислотного фактора росту ендотеліальних клітин судин людини. Посилання на будь-яку з таких форм VEGF може бути ідентифіковане в заявці, наприклад, як "VEGF (8-109)», "VEGF (1-109)» або "VEGF165". Положення амінокислот у нативного "укороченого" VEGF нумеруються, як указано в нативній послідовності VEGF. Наприклад, амінокислота в 17 положенні (метіонін) в укороченому нативному VEGF займає 17 4 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 положення (метіонін) також в нативному VEGF. Укорочений нативний VEGF має зв'язувальну спорідненістю до рецепторів KDR і Flt-1, порівнянних з нативним VEGF. "Антитіло проти VEGF" являє собою антитіло, яке зв'язується з VEGF з достатньою спорідненістю і специфічністю. Вибране антитіло повинне звичайно мати зв'язувальну спорідненість до VEGF, наприклад, антитіло може зв'язувати hVEGF з величиною Kd між 100 нМ - 1 пМ. Величини спорідненості антитіла можуть бути визначені, наприклад, за допомогою аналізу на основі поверхневого плазмонного резонансу (такого як аналіз на BIAcore, як описано в опублікованій заявці PCT № WO2005/012359); імуноферментного аналізу (ELISA); і тестів на основі конкурентного аналізу (наприклад, РІА). У певних варіантах здійснення антитіло проти VEGF за винаходом може бути використане як терапевтичний агент для спрямованої дії і втручання в захворювання або стани, в які залучена активність VEGF. Антитіло може бути також піддане тестам на інші типи біологічної активності, наприклад, для оцінки його ефективності як терапевтичного агента. Такі тести відомі в даній галузі техніки і залежать від антигену-мішені і використання антитіла, що планується. Приклади включають, але не обмежуються цим, тест інгібування HUVEC; тести інгібування росту пухлинних клітин (як описано, наприклад, в патенті WO89/06692). Антитіло проти VEGF звичайно не зв'язується ні з іншими гомологами VEGF, такими як VEGF-B або VEGF-C, ні з іншими факторами росту, такими як P1GF, PDGF або bFGF. "Антагоніст VEGF" означає молекулу, здатну нейтралізувати, блокувати, інгібувати, відміняти, знижувати або перешкоджати активності VEGF, включаючи його зв'язування з одним або більше рецепторів VEGF. Антагоністи VEGF включають антитіла проти VEGF і їх антигензв'язувальні фрагменти, рецепторні молекули і похідні, які специфічно зв'язуються з VEGF, тим самим відділяючи його від зв'язування з одним або більше рецепторами, антитіла проти рецепторів VEGF і антагоністи рецепторів VEGF, такі як низькомолекулярні інгібітори тирозинкіназ VEGFR. Поліпептид з "нативною послідовністю" включає поліпептид, що має ту ж саму амінокислотну послідовність, що і поліпептид з природного джерела. Таким чином, нативна послідовність поліпептиду може мати амінокислотну послідовність природного поліпептиду від будь-якого ссавця. Такий поліпептид з нативною послідовністю може бути виділений з природного джерела або може бути отриманий за допомогою рекомбінантних методів або методів синтезу. Термін поліпептид з "нативною послідовністю" конкретно охоплює наявні в природі укорочені або секретовані форми поліпептиду (наприклад, послідовність позаклітинного домену), варіанти форм, що існують в природі (наприклад, форми альтернативного сплайсингу) і наявні в природі алельні варіанти поліпептиду. "Варіант" поліпептиду означає біологічно активний поліпептид, що має щонайменше приблизно 80 % ідентичність амінокислотної послідовності з природною послідовністю поліпептиду. Такі варіанти включають, наприклад, поліпептиди, в яких один або більше амінокислотних залишків додані або видалені на N- або С-кінці поліпептиду. Звичайно варіант повинен мати щонайменше приблизно 80 % ідентичність амінокислотної послідовності, більш переважно щонайменше приблизно 90 % ідентичність амінокислотної послідовності і навіть більш переважно щонайменше приблизно 95 % ідентичність амінокислотної послідовності з природною послідовністю поліпептиду. Термін "антитіло" використовується в самому широкому значенні і включає моноклональні антитіла (включаючи повнорозмірні або інтактні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла, мультивалентні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) і фрагменти антитіл (див. нижче), доти, поки вони виявляють бажану біологічну активність. У всьому описі і формулі винаходу нумерація залишків у важкому ланцюгу імуноглобуліну здійснюється по індексу EU, як розкрита в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological th Interest, 5 Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), спеціально включене в даний опис як посилання. "Індекс EU по Kabat" означає EU-нумерацію залишків антитіла IgG1 людини. "Kd" або "величина Kd" за даним винаходом в одному варіанті здійснення вимірюється за допомогою аналізу зв'язування радіоактивно міченого VEGF (РІА), що виконується з Fab варіантом антитіла і молекулою VEGF, як описано в наступному методі, в якому в розчині вимірюють зв'язувальну спорідненість Fabs до VEGF шляхом урівноваження Fab з мінімальною 125 концентрацією ( I)-міченого VEGF(109) в присутності серій титрування неміченого VEGF, з подальшим захопленням зв'язаного VEGF на планшеті, покритому антитілами проти Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). В одному прикладі для визначення умов методу планшети для мікротитрування (Dynex) покривають протягом ночі 5 мкг/мл захоплюючим 5 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитілом проти Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбонаті натрію (рН 9,6) і потім блокують 2 % (мас./об.) бичачим сироватковим альбуміном в PBS протягом від двох до п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23С). В неадсорбуючому планшеті (Nunc #269620), 100 пМ 125 або 26 пМ [ I]VEGF(109) змішують з серійним розведенням Fab, що представляє інтерес, наприклад, Fab-12 (Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Fab, що представляє інтерес, потім інкубують протягом ночі; однак інкубація може продовжуватися протягом 65 годин для упевненості в досягненні рівноваги. Після цього суміш переносять на захоплюючий планшет для інкубації при кімнатній температурі протягом однієї години. Розчин потім видаляють, і планшет промивають вісім разів 0,1 % твіном-20 в PBS. Коли планшети висохнуть, додають 150 мкл/ямку сцинтилятора (MicroScint-20; Packard), і проводять підрахунок на гамма-лічильнику Topcount (Packard) протягом десяти хвилин. Концентрації кожного Fab, які дають зв'язування, менше або рівне 20 % від максимального, вибирають для використання в аналізах конкурентного зв'язування. Згідно з іншим варіантом здійснення Kd або величину Kd вимірюють із застосуванням методів поверхневого плазмонного резонансу, використовуючи BIAcore™-2000 або BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25С з імобілізованими чіпами hVEGF (8109) CM5 при ~10 одиниць відповіді (RU). Коротко, біосенсорні чіпи з карбоксиметильованим декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активують N-етил-N'-(3-диметиламінопропіл)карбодііміду гідрохлоридом (EDC) і N-гідроксисукцинімідом (NHS) відповідно до інструкцій постачальника. VEGF людини розводять 10 мМ ацетатом натрію, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед введенням при швидкості струму 5 мкл/хвилину для досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (RU) приєднаного білка. Після введення VEGF людини вводять 1 М етаноламіну для блокування груп, що не прореагували. Для вимірювань кінетики двократне серійне розведення Fab (від 0,78 нМ до 500 нМ) вводять в PBS з 0,05 % твіном 20 (PBST) при 25С при швидкості струму приблизно 25 мкл/хвилину. Швидкості асоціації (k on) і швидкості дисоціації (k off) розраховують, використовуючи просту модель зв'язування Ленгмюра один до одного (BIAcore Evaluation Software version 3.2) за допомогою одночасної підгонки сенсограм асоціації і дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Kd) розраховують як відношення k off/kon. Див., наприклад, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Якщо швидкість асоціації перевищує 6 -1 -1 10 М S по вказаному вище методу поверхневого плазмонного резонансу, то швидкість асоціації може бути визначена з використанням методу гасіння флуоресценції, в якому вимірюється підвищення або пониження інтенсивності емісії флуоресценції (збудження = 295 нм; емісія = 340 нм, смуга пропущення 16 нм) при 25С 20 нМ антитіла проти VEGF (в формі Fab) в PBS, рН 7,2, в присутності концентрацій короткої форми VEGF людини (8-109), що підвищуються або мишачому VEGF при вимірюванні на спектрометрі, такому як спектрофотометр, обладнаний системою зупинки потоку (Aviv Instruments) або спектрофотометр 8000-серій SLM-Aminco (ThermoSpectronic) з кюветою, що перемішується. "Kd" або "величину Kd" за даним винаходом в одному варіанту здійснення вимірюють за допомогою методів, відомих в даній галузі техніки. "Блокуюче" антитіло або антитіло-«антагоніст" являє собою антитіло, яке інгібує або знижує біологічну активність антигену, з яким воно зв'язується. Наприклад, специфічне для VEGF антитіло-антагоніст зв'язує VEGF і інгібує здатність VEGF індукувати проліферацію клітин ендотелію судин або індукувати проникність судин. Переважні блокуючі антитіла або антитілаантагоністи повністю інгібують біологічну активність антигену. Якщо не указано інакше, вираз "мультивалентне антитіло" використовується в цьому описі для позначення антитіла, що включає три або більше антигензв'язувальних сайти. Наприклад, мультивалентне антитіло конструюється як таке, що містить три або більше антигензв'язувальних сайти і звичайно не є нативною послідовністю антитіла IgM або IgA. "Фрагменти антитіла" включають тільки частину інтактного антитіла, звичайно включаючи антигензв'язувальний сайт інтактного антитіла і, отже, зберігаючи здатність зв'язувати антиген. Приклади фрагментів антитіла, що охоплюються даним винаходом, включають: (i) Fab фрагмент, що має домени VL, CL, VH і CH1; (ii) Fab' фрагмент, який являє собою Fab фрагмент, що має один або більше цистеїнових залишків на С-кінці домену CH1; (iii) Fd фрагмент, що має домени VH і CH1; (iv) Fd' фрагмент, що має домени VH і CH1 і один або більше цистеїнових залишків на С-кінці домену CH1; (v) Fv що має домени VL і VH одного плеча антитіла; (vi) dAb фрагмент (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), який складається з домену VH; (vii) виділені області CDR; (viii) F(ab')2 фрагменти, двовалентний фрагмент, що включає два Fab' фрагменти, з'єднані дисульфідним містком в шарнірній області; (ix) молекули одноланцюгових антитіл (наприклад, одноланцюговий Fv; scFv) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); і Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (х) "діатіла" з двома антигензв'язувальними сайтами, що включають варіабельний домен важкого ланцюга (VH), зв'язаний з варіабельним доменом 6 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 легкого ланцюга (VL) в один і той же поліпептидний ланцюг (див., наприклад, патенти EP 404097; WO93/11161; і Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) "лінійні антитіла", що включають пару тандемних сегментів Fd (VH-CH1-VH-CH1), які разом з поліпептидами комплементарних легких ланцюгів утворюють пару антигензв'язувальних областей (Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); і патент США № 5641870). Термін "моноклональне антитіло", що застосовується в даному описі стосується антитіла, отриманого з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла, що складають популяцію, є ідентичними за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутніми в мінорних кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними, будучи спрямованими проти єдиного антигену. Більше того, на відміну від препаратів поліклональних антитіл, які звичайно включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло спрямоване проти одиничної детермінанти на антигені. Визначення "моноклональне" не тлумачиться як таке, що вимагає отримання антитіла за допомогою якогонебудь конкретного методу. Наприклад, моноклональні антитіла для використання за винаходом можуть бути отримані гібридомним методом, уперше описаним Kohler et al., Nature 256:495 (1975), або можуть бути отримані методами рекомбінантної ДНК (див., наприклад, патент США № 4816567). "Моноклональні антитіла" можуть бути також виділені з фагових бібліотек антитіл з використанням методів, описаних, наприклад, в Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) або Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991). Фрагмент "Fv" являє собою фрагмент антитіла, який містить повний сайт, пізнавальний і зв'язувальний антиген. Ця область складається з димеру варіабельного домену одного важкого і одного легкого ланцюга, що знаходяться в міцному зв'язку, який може бути ковалентної природи, наприклад, в scFv. Саме в цій конфігурації три CDRs кожного варіабельного домену взаємодіють, визначаючи антигензв'язувальний сайт на поверхні димеру VH-VL. Спільно шість CDRs або їх підгрупу додають антитілу специфічність зв'язування антигену. Однак навіть єдиний варіабельний домен (або половина Fv, що включає тільки три CDRs, специфічна для антигену) має здатність пізнавати і зв'язувати антиген, хоча звичайно з більш низькою спорідненістю, ніж повний зв'язувальний сайт. Термін "варіабельний домен антитіла", що застосовується в даному описі стосується частин легень і важких ланцюгів молекул антитіла, які включають амінокислотні послідовності областей, що визначають комплементарність (CDRs; тобто CDR1, CDR2 і CDR3), і області каркасу (FRs). VH означає варіабельний домен важкого ланцюга. VL означає варіабельний домен легкого ланцюга. Відповідно до методів, що використовуються в даному винаході, положення амінокислот, встановлені для CDRs і FRs, можуть бути визначені по Кабату (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)). Нумерація амінокислот антитіл або антигензв'язувальних фрагментів також відповідає нумерації по Кабату. Застосовуваний в даному описі термін "області, що визначають комплементарність" (CDRs; тобто CDR1, CDR2 і CDR3), стосується амінокислотних залишків варіабельного домену антитіла, присутність яких необхідна для зв'язування антигену. Кожний варіабельний домен звичайно має три області CDR, ідентифіковані як CDR1, CDR2 і CDR3. Кожна область, що визначає комплементарність, може включати амінокислотні залишки з "області, що визначає комплементарність", як визначено Кабатом (тобто приблизно залишки 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 8997 (L3) у варіабельному домені легкого ланцюга і 31-35 (H1), 50-65 (H2) і 95-102 (H3) у варіабельному домені важкого ланцюга; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological th Interest, 5 Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) і/або ті залишки з "гіперваріабельної петлі" (тобто приблизно залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 (L3) у варіабельному домені легкого ланцюга і 26-32 (H1), 53-55 (H2) і 96-101 (H3) у варіабельному домені важкого ланцюга; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). В деяких випадках область, що визначає комплементарність, може включати амінокислоти як з області CDR, визначеної по Кабату, так і з гіперваріабельної петлі. Наприклад, CDRH1 важкого ланцюга антитіла 4D5 включає амінокислоти з 26 по 35. "Області каркасу" (в даному описі далі FR) являють собою ті залишки варіабельних доменів, які відрізняються від залишків CDR. Кожний варіабельний домен звичайно має чотири FRs, ідентифіковані як FR1, FR2, FR3 і FR4. Якщо CDRs визначаються по Кабату, залишки FR легкого ланцюга розташовані приблизно як залишки 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) і 98-107 (LCFR4), і залишки FR важкого ланцюга розташовані приблизно як залишки 130 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) і 103-113 (HCFR4) в залишках важкого ланцюга. Якщо CDRs включають амінокислотні залишки з гіперваріабельних петель, залишки FR легкого ланцюга розташовані приблизно як залишки 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) і 97 7 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 107 (LCFR4) в легкому ланцюгу і залишки FR важкого ланцюга розташовані приблизно як залишки 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) і 102-113 (HCFR4) в залишках важкого ланцюга. У деяких випадках, коли CDR включає амінокислоти як з CDR, визначеної по Кабату, так і амінокислоти з гіперваріабельної петлі, залишки FR повинні бути відповідно підігнані. Наприклад, коли CDRH1 включає амінокислоти H26-H35, залишки важкого ланцюга FR1 знаходяться в положеннях 1-25, і залишки FR2 знаходяться в положеннях 36-49. "Fab" фрагмент містить варіабельний і константний домен легкого ланцюга і варіабельний домен, і перший константний домен (CH1) важкого ланцюга. F(ab') 2 фрагменти антитіла включають пару Fab фрагментів, які звичайно ковалентно сполучені в області їх карбоксильних кінців за допомогою цистеїнів шарніра між ними. Інші хімічні сполуки фрагментів антитіл також відомі в даній галузі техніки. "Одноланцюгові Fv" або "scFv" фрагменти антитіла включають домени VH і VL антитіла, де ці домени присутні в єдиному поліпептидному ланцюгу. Звичайно Fv поліпептид додатково включає поліпептидний лінкер між доменами VH і VL, який дозволяє scFv утворювати бажану структуру для зв'язування антигену. Як огляд scFv див. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994). Термін "діатіла" стосується невеликих фрагментів антитіл з двома антигензв'язувальними сайтами, причому фрагменти включають варіабельний домен важкого ланцюга (VH), зв'язаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) в одному і тому ж поліпептидному ланцюгу (VH і VL). За допомогою використання лінкера, який є дуже коротким, щоб дозволити спаровування між двома доменами на одному і тому ж ланцюгу, домени змушують утворювати пару з комплементарними доменами іншого ланцюга і створюють два антигензв'язувальних сайти. Діатіла описані більш повно, наприклад, в патентах EP 404097; WO93/11161; і Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Вираз "лінійні антитіла" стосується антитіл, описаних в Zapata et al., Protein Eng., 8(10):10571062 (1995). Коротко, ці антитіла включають пару тандемних сегментів Fd (VH-CH1-VH-CH1), які разом з комплементарними поліпептидами легкого ланцюга утворюють пару антигензв'язувальних областей. Лінійні антитіла можуть бути біспецифічними або моноспецифічними. Моноклональні антитіла в даному описі особливо включають "гібридні" антитіла (імуноглобуліни), в яких частина важкого і/або легкого ланцюга ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, що походять від конкретних видів або що належать до конкретного класу або підкласу антитіл, тоді як залишок ланцюга(ів) ідентичний або гомологічний відповідним послідовностям в антитілах, що походять від інших видів або що належать до іншого класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, доти, поки вони проявляють бажану біологічну активність (патент США № 4816567; і Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). "Гуманізовані" форми антитіл, що походять не від людини, (наприклад, мишачих) являють собою гібридні антитіла, які містять мінімальну послідовність, що походять від імуноглобуліну, що не належать до людини. Здебільшого гуманізовані антитіла являють собою імуноглобуліни людини (антитіло-реципієнт), в яких залишки з гіперваріабельної області реципієнта замінені залишками з гіперваріабельної області (антитіла-донора) від видів, що не належать до людини, таких як миша, щур, кролик або нелюдиноподібний примат, що мають бажану специфічність, афінність і ємність. У деяких випадках залишки Fv області каркаса (FR) імуноглобуліну людини замінюють відповідними залишками, що походять не від людини. Більше того, гуманізовані антитіла можуть включати залишки, які не виявляються в антитілі-реципієнтові або в антитілідонорові. Ці модифікації створюються для додаткового поліпшення характеристики антитіла. Загалом, гуманізоване антитіло повинно включати по суті все щонайменше з одного і звичайно з двох варіабельних доменів, в яких всі або по суті всі гіперваріабельні петлі відповідають петлям імуноглобуліну, що походить не від людини, і всі або по суті всі області FR являють собою області послідовності імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло необов'язково також може включати щонайменше частину константної області (Fc) імуноглобуліну, звичайно імуноглобуліну людини. Для додаткових подробиць див. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); і Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). "Антитіло людини" являє собою антитіло, яке має амінокислотну послідовність, яка відповідає послідовності антитіла, що продукується людиною, і/або створене з використанням будь-якого з методів отримання антитіл людини, як розкрито в даному описі. Це визначення антитіла людини спеціально виключає гуманізоване антитіло, що включає антигензв'язувальні залишки, що походять не від людини. Антитіла людини можуть бути отримані з використанням 8 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 різних методів, відомих в даній галузі техніки. В одному варіанті здійснення антитіло людини вибране з фагової бібліотеки, де ця фагова бібліотека експресує антитіла людини (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996); Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Антитіла людини можуть бути також отримані шляхом введення локусів імуноглобулінів людини трансгенним тваринам, наприклад, мишам, у яких гени ендогенних імуноглобулінів частково або повністю інактивовані. При навантаженні спостерігається продукція антитіл людини, які надто схожі з антитілами, що виявляються у людей, у всіх відношеннях, включаючи перегрупування генів, збирання і репертуар антитіл. Цей підхід описаний, наприклад, в патентах США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016, і в наступних наукових публікаціях: Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:6593 (1995). Альтернативно антитіло людини може бути отримане шляхом іморталізації Влімфоцитів людини, що продукують антитіло, спрямоване проти антигену-мішені (такі Влімфоцити можуть бути отримані від індивідуума, або їх можна імунізувати in vitro). Див., наприклад, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991); і патент США № 5750373. Антитіло зі "зрілою афінністю" являє собою антитіло з однією або більше змінами в одній або більше його CDRs, які приводять до поліпшення афінності антитіла відносно антигену в порівнянні з батьківським антитілом, яке не має цієї(цих) зміни(змін). Переважні антитіла зі зрілою афінністю повинні мати наномолярні або навіть пікомолярні афінності відносно антигенумішені. Антитіла зі зрілою афінністю отримують способами, відомими в даній галузі техніки. У статті Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) описано дозрівання афінності внаслідок перетасовування доменів VH і VL. Описаний випадковий мутагенез залишків CDR і/або каркасу: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); і Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992). "Функціональний антигензв'язувальний сайт" антитіла являє собою сайт, який здатний зв'язувати антиген-мішень. Афінність зв'язування антигену антигензв'язувальним сайтом необов'язково є такою ж високою, як у батьківського антитіла, з якого походить антигензв'язувальний сайт, але здатність зв'язувати антиген повинна бути вимірною з використанням будь-якого з множини способів, відомих для оцінки зв'язування антитіла з антигеном. Більше того, афінність зв'язування антигену кожним з антигензв'язувальних сайтів мультивалентного антитіла за даним описом необов'язково повинна бути однаковою кількісно. У разі мультимерних антитіл за даним описом кількість функціональних антигензв'язувальних сайтів може бути оцінена з використанням аналізу на основі ультрацентрифугування, як описана в прикладі 2 публікації патентної заявки США № 20050186208. Згідно з цим методом аналізу антиген-мішень і мультимерне антитіло об'єднують в різних співвідношеннях і розраховують середню молекулярну масу комплексів, допускаючи число функціональних сайтів зв'язування, що розрізнюється. Ці теоретичні величини порівнюють з отриманими реальними експериментальними значеннями, щоб оцінити число функціональних сайтів зв'язування. Антитіло, що має "біологічну характеристику" вказаного антитіла, являє собою антитіло, яке має одну або більше біологічних характеристик цього антитіла, які відрізняють його від інших антитіл, які зв'язуються з тим же самим антигеном. Щоб провести скринінг антитіл, які зв'язуються з епітопом на антигені, що зв'язується антитілом, що представляє інтерес, може бути виконаний звичайний аналіз перехресного блокування, такий як аналіз, описаний в Antibodies, А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). "Антитіло, залежне від виду", являє собою антитіло, яке має більш сильну афінність зв'язування для антигену з першого виду ссавців, ніж вона складає для гомолога цього антигену з другого виду ссавців. Звичайне антитіло, залежне від виду, "специфічно зв'язується" з антигеном людини (наприклад, має величину зв'язувальної спорідненості (Kd) не більше -7 -8 -9 приблизно 110 М, або не більш приблизно 110 М, або не більш приблизно 110 М), але має зв'язувальну спорідненість для гомолога антигену з другого виду ссавців, яке є щонайменше приблизно в 50 разів, або щонайменше приблизно в 500 разів, або щонайменше приблизно в 1000 разів слабшим, ніж його зв'язувальна спорідненість до антигену людини. Антитіло, залежне від виду, може являти собою будь-яке з різних типів антитіл, як визначено вище, але звичайно являє собою гуманізоване антитіло або антитіло людини. 9 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Мутантне антитіло" або "варіант антитіла" при застосуванні в даному описі стосується варіанту амінокислотної послідовності антитіла, залежного від виду, де один або більше амінокислотних залишків антитіла, залежного від виду, модифіковані. Такі мутанти обов'язково мають ідентичність або схожість послідовності з антитілом, залежним від виду, менше за 100 %. В одному варіанті здійснення мутантне антитіло може мати амінокислотну послідовність, що має щонайменше 75 % ідентичності або схожість амінокислотної послідовності варіабельного домену або важкого, або легкого ланцюга з антитілом, залежним від виду, більш переважно щонайменше 80 %, більш переважно щонайменше 85 %, більш переважно щонайменше 90 %, і найбільш переважно щонайменше 95 %. Ідентичність або схожість відносно цієї послідовності визначається в даному описі як процент амінокислотних залишків в кандидатній послідовності, які є ідентичними (тобто той же залишок) або схожими (тобто амінокислотний залишок з тієї ж самої групи на основі загальних властивостей бокових ланцюгів, див. нижче) із залишками антитіла, залежного від виду, після вирівнювання послідовностей і введення з потреби пропусків для досягнення максимального процента ідентичності послідовностей. Ні N-кінцеві, ні С-кінцеві, ні внутрішні розширення, делеції або вставки в послідовність антитіла поза варіабельного домену не повинні тлумачитися як такі, що впливають на ідентичність або схожість послідовностей. Щоб збільшити час напівжиття антитіл або поліпептиду, що містять амінокислотні послідовності за даним винаходом, можна приєднати до антитіла епітоп зв'язування рецептора порятунку, як описано, наприклад, в патенті США 5739277. Наприклад, молекула нуклеїнової кислоти, що кодує епітоп зв'язування рецептора порятунку, може бути сполучена в рамці зчитування з нуклеїновою кислотою, що кодує послідовність поліпептиду за даним винаходом, так щоб гібридний білок, що експресується створеною молекулою нуклеїнової кислоти, включав епітоп зв'язування рецептора порятунку і поліпептидну послідовність за даним винаходом. Термін "епітоп зв'язування рецептора, що застосовується в даному описі порятунку" стосується епітопу області Fc молекули IgG (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4), який відповідальний за збільшення часу напівжиття молекули IgG в сироватці in vivo (наприклад, Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000), таблиця 1). Антитіла із замінами в їх Fc області і підвищеним часом напівжиття в сироватці описані також в патентах WO00/42072, WO02/060919; Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)). В іншому варіанті здійснення час напівжиття в сироватці може бути також збільшений, наприклад, шляхом приєднання інших поліпептидних послідовностей. Наприклад, антитіла або інші поліпептиди, придатні для способів за винаходом, можуть бути приєднані до сироваткового альбуміну або до частини сироваткового альбуміну, яка зв'язується з рецептором FcRn, або до сироваткового альбумінзв'язувального пептиду, так що сироватковий альбумін зв'язується з антитілом або поліпептидом, наприклад, таким як поліпептидні послідовності, розкриті в патенті WO01/45746. В одному варіанті здійснення пептид сироваткового альбуміну, який приєднують, включає амінокислотну послідовність DICLPRWGCLW. В іншому варіанті здійснення за допомогою цих методів підвищують час напівжиття Fab. Відносно послідовностей альбумінзв'язувального пептиду сироватки див. також Dennis et al. J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002). "Гібридний білковий рецептор VEGF" являє собою молекулу рецептора VEGF, що має амінокислотні послідовності, що походять щонайменше від двох різних білків щонайменше один з яких являє собою білковий рецептор VEGF. У певних варіантах здійснення гібридний білковий рецептор VEGF здатний зв'язуватися з VEGF і інгібувати його біологічну активність. "Виділене" антитіло являє собою антитіло, яке ідентифікують і відділяють і/або отримують з компонента його природного оточення. Забруднюючі компоненти його природного оточення являють собою речовини, які повинні заважати діагностичному і терапевтичному використанню антитіла, і можуть включати ферменти, гормони і інші білкові і небілкові розчинені речовини. У певних варіантах здійснення антитіло повинне бути очищене (1) до більше за 95 % по масі антитіла при визначенні по методу Лоурі і найбільш переважно до більше за 99 % по масі, (2) до ступеня, достатнього для отримання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності при використанні секвенатора з посудиною, що обертається, або (3) до гомогенності з допомогою SDS-PAGE у відновлювальних або невідновлювальних умовах з використанням забарвлення блакитним кумасі або сріблом. Виділене антитіло включає антитіло in situ в рекомбінантних клітинах, оскільки щонайменше один компонент природного оточення антитіла не повинен бути присутнім. Звичайно, однак, виділене антитіло повинно бути отримане з допомогою щонайменше однієї стадії очищення. Під "фрагментом" мається на увазі частина поліпептиду або молекули нуклеїнової кислоти, яка містить переважно щонайменше 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або більш повної довжини реперної молекули нуклеїнової кислоти або поліпептиду. Фрагмент 10 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 може містити 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або 100, 200, 300, 400, 500, 600 або більше нуклеотидів або 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 або більше амінокислот. "Антиангіогенний агент" або "інгібітор ангіогенезу" стосується речовини низької молекулярної маси, полінуклеотиду, поліпептиду, виділеного білка, рекомбінантного білка, антитіла або їх кон'югатів або гібридних білків, які інгібують ангіогенез, васкулогенез або небажану проникність судин або прямо, або опосередковано. Повинно бути зрозуміло, що антиангіогенний агент включає ті агенти, які зв'язують і блокують ангіогенну активність ангіогенного фактора або його рецептора. Наприклад, антиангіогенним агентом є антитіло або інший антагоніст ангіогенного агента, як визначено в даному описі або відомо в даній галузі техніки, наприклад, але, не обмежуючись цим, антитіла до VEGF-A, або до рецептора VEGF-A (наприклад, до рецептора KDR і/або рецептора Flt-1), манок VEGF, інгібітори анти-PDGFR, такі як Gleevec™ (іматинібу мезилат). Антиангіогенні агенти включають також нативні інгібітори ангіогенезу, наприклад, ангіостатин, ендостатин і т.д. див., наприклад, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (наприклад, таблицю 3, в якій перераховується лікування антиангіогенними агентами при злоякісній меланомі); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5:1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (наприклад, таблицю 2, в якій перераховуються відомі антиангіогенні фактори); і Sato. Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (наприклад, таблицю 1, в якій перераховані антиангіогенні агенти, що застосовуються в клінічних випробуваннях). "Підтримуюча" доза в даному описі стосується однієї або більше доз терапевтичного агента, що вводиться хворому протягом або після періоду лікування. Звичайно підтримуючі дози вводять в інтервали лікування з перервами, такі як приблизно кожний тиждень, приблизно кожні 2 тижні, приблизно кожні 3 тижні або приблизно кожні 4 тижні. "Виживання" стосується часу, коли хворий залишається живим, і включає тривалість виживання без прогресування захворювання (PFS) і загальне виживання (OS). Виживання може бути визначене по методу Каплана-Мейєра, і будь-які відмінності у виживанні обчислюються з використанням стратифікованого логарифмічного рангового критерію. "Виживання без прогресування захворювання (PFS)» стосується часу від лікування (або рандомізації) до першої прогресії захворювання або смерті. Наприклад, це період часу, коли хворий залишається живим без повернення раку, наприклад, протягом певного періоду часу, такого як приблизно 0,5 місяця, 1 місяць, 2 місяці, 2,1 місяці, 2,2 місяці, 2,8 місяці, 3 місяці і т.д. від початку лікування або від первинного діагнозу. В одному варіанті здійснення PFS збільшується приблизно на 2,1 місяці. В одному аспекті винаходу PFS може бути оцінена за допомогою критеріїв оцінки відповідей солідних пухлин (RECIST). "Загальне виживання" стосується часу, коли хворий залишається живим протягом певного періоду часу, такого як приблизно 1 рік, приблизно 2 роки, приблизно 3 роки, приблизно 4 роки, приблизно 5 років, приблизно 10 років і т.д. від початку лікування або від первинного діагнозу. Під "продовженим виживанням" або "збільшеною імовірністю виживання" розуміється підвищення PFS і/або OS у хворого, що отримував лікування, відносно хворого, що не отримував лікування, (тобто відносно хворого, що не отримував лікування VEGF-специфічним антагоністом, наприклад, антитілом проти VEGF) або відносно протоколу контрольного лікування, такого як лікування тільки хіміотерапевтичним агентом, таким як агенти, що використовуються для лікування раку молочної залози. Виживання простежується протягом, щонайменше, одного місяця, двох місяців, чотирьох місяців, шести місяців, дев'яти місяців або щонайменше приблизно 1 року, або щонайменше приблизно 2 років, або щонайменше приблизно 3 років, або щонайменше приблизно 4 років, або щонайменше приблизно 5 років, або щонайменше приблизно 10 років і т.д., після початку лікування або після первинного діагнозу. Коефіцієнт ризику (HR) являє собою статистичне визначення показників подій. Для мети даного винаходу коефіцієнт ризику визначається як такий, що представляє можливість події в експериментальній групі, ділену на можливість події в контрольній групі в будь-яку конкретну точку часу. "Коефіцієнт ризику" при аналізі виживання без прогресування захворювання являє собою суму відмінностей між двома кривими виживання без прогресування захворювання, що представляє зниження ризику смерті при лікуванні в порівнянні з контролем протягом періоду спостереження. Термін "одночасно" використовується в даному описі для позначення введення двох або більше терапевтичних агентів, де щонайменше частина введень перекривається у часі. Відповідно, одночасне введення включає схему дозування, при якій введення одного або 11 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 більше агента(тів) продовжується після припинення введення одного або більше іншого(их) агента(тів). Під "підтримуючою терапією" мається на увазі схема терапії, яка призначається для зниження імовірності рецидиву або прогресування захворювання. Підтримуючу терапію можна надати протягом будь-якого часового періоду, включаючи тривалі періоди часу до тривалості життя індивідуума. Підтримуючу терапію можна надавати після первинного лікування або в поєднанні з первинним і додатковим лікуванням. Дозування, що використовується для підтримуючої терапії, може варіюватися і може включати зменшені дози в порівнянні з дозами, що використовуються для інших типів лікування. Терміни "рак" і "злоякісний" стосуються або описують фізіологічний стан у ссавців, який звичайно характеризується нерегульованим клітинним ростом. У це визначення включаються доброякісні і злоякісні пухлини, а також пухлини в стані спокою або мікрометастази. Приклади раку включають, але не обмежуються цим, карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкоз. Більш конкретні приклади таких типів раку включають рак молочної залози, сквамозноклітинний рак, рак легені (включаючи дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарциному легені і сквамозну карциному легені), рак очеревини, гепатоклітинний рак, шлунковий рак або рак шлунка (включаючи рак шлунково-кишкового тракту), рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак ободової кишки, колоректальний рак, карциному ендометрію або матки, карциному слинних залоз, рак нирки або нирковий рак, рак печінки, рак простати, рак вульви, рак щитовидної залози, карциному печінки і різні типи раку голови і шиї, а також В-клітинну лімфому (включаючи фолікулярну неходжкінську лімфому (NHL) низького ступеня злоякісності; дрібноклітинну лімфоцитарну (SL) NHL; фолікулярну NHL середнього ступеня злоякісності; дифузну NHL середнього ступеня злоякісності; імунобластну NHL високого ступеня злоякісності; лімфобластну NHL високого ступеня злоякісності; дрібноклітинну NHL з нерозщепленими ядрами високого ступеня злоякісності; NHL з масивною пухлинною масою; лімфому з клітин мантійної зони; пов'язану зі СНІДом лімфому; і макроглобулінемію Вальденстрема); хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL); гострий лімфобластний лейкоз (ALL); лейкоз ворсистих клітин; хронічний мієлобластний лейкоз і посттрансплантаційне лімфопроліферативне порушення (PTLD), а також аномальну проліферацію судин, пов'язану з факоматозом, едемою (такою як едема, пов'язана з пухлинами головного мозку) і синдромом Мейгса. Під "метастазом" мається на увазі поширення раку з його первинного місця локалізації в інші місця організму. Ракові клітини відділяються від первинної пухлини, проникають в лімфатичні і кровоносні судини, циркулюють в кровотоці і ростуть (метастазують) у віддаленому вогнищі в нормальних тканинах в будь-якому іншому місці організму. Метастаз може бути місцевим або віддаленим. Метастазування є послідовним процесом, що залежить від пухлинних клітин, що відділяються від первинної пухлини, мандрують в кровотоці і затримуються у віддаленому місці. На новому місці клітини утворюють кровопостачання і можуть рости, утворюючи загрозливу життю масу. Ця поведінка регулюється в пухлинній клітині як стимулюючими, так і інгібуючими молекулярними шляхами, і значення мають також взаємодії між пухлинною клітиною і клітинами-хазяїнами у віддаленому місці. Під "індивідуумом" мається на увазі ссавець, що включає без обмеження людину або ссавця, що не є людиною, такого як корови, коні, собачі, вівці або котячі. Переважно індивідуум є людиною. У даному описі хворі також є індивідуумами. Для способів за винаходом термін предмет "інструктування" означає надання вказівок для терапії, що застосовується, препаратів, лікування, схем лікування і тому подібного будь-якими способами, але переважно в письмовій формі, такій як в формі рекламного вкладиша в упаковку або іншого письмового матеріалу для просування. Для способів за винаходом термін "просування" означає надання, рекламування, реалізацію або опис конкретних ліків, поєднання ліків або способу лікування за допомогою будь-яких засобів, включаючи письмову форму, таку як форму рекламних вкладишів в упаковки. У даному описі просування стосується просування терапевтичного агента, такого як антагоніст VEGF, наприклад, антитіло проти VEGF, або хіміотерапевтичного агента, за показом, таким як лікування раку молочної залози, де таке просування санкціоноване Управлінням по контролю за продуктами і ліками (FDA) як таке, що продемонструвало зв'язок зі статистично значущою терапевтичною ефективністю і допустимою безпекою у популяції індивідуумів. Термін "маркетинг", що застосовується в даному описі, використовується для опису просування, реалізації або поширення продукту (наприклад, ліки). Маркетинг конкретно включає упаковку, рекламування і будь-яку комерційну активність з метою промислового впровадження продукту. 12 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Популяція" індивідуумів стосується групи індивідуумів з раком, такої як група в клінічному випробуванні, або такої як група, що знаходиться під спостереженням онкологів після схвалення FDA по конкретному показу, такому як лікування раку молочної залози. Термін "протиракова терапія" стосується терапії, придатної для лікування раку. Приклади протиракових терапевтичних засобів включають, але не обмежуються цим, наприклад, хірургічне втручання, хіміотерапевтичні агенти, агенти, що інгібують ріст, цитотоксичні агенти, агенти, що використовуються в променевій терапії, антиангіогенні агенти, агенти, що викликають апоптоз, агенти проти тубуліну і інші агенти для лікування раку, такі як антитіла проти HER-2, антитіла проти CD20, антагоніст рецептора епідермального фактора росту (EGFR) (наприклад, інгібітор тирозинкінази), інгібітор HER1/EGFR (наприклад, ерлотиніб (Tarceva), інгібітори фактора росту з тромбоцитів (наприклад, Gleevec™ (іматинібу мезилат)), інгібітор COX-2 (наприклад, целекоксиб), інтерферони, цитокіни, антагоністи (наприклад, нейтралізуючі антитіла, низькомолекулярні інгібітори і т.д.), які зв'язуються з однією або більше з наступних мішеней - ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-бета, BlyS, APRIL, BCMA або рецептор(и) VEGF, VEGF, TRAIL/Apo2, і інші біоактивні і органічні хімічні агенти і т.д. Їх поєднання також включаються у винахід. Термін "цитотоксичний агент", що застосовується в даному описі, стосується речовини, яка інгібує функцію або перешкоджає функціонуванню клітин і/або спричиняє руйнування клітин. 211 131 125 90 186 Термін призначений для включення радіоактивних ізотопів (наприклад, At , I , I , Y , Re , 188 153 212 32 Re , Sm , Bi , P і радіоактивні ізотопи Lu), хіміотерапевтичних агентів і токсинів, таких як низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини, що походять з бактерій, грибів, рослин або тварин, включаючи їх фрагменти і/або варіанти. "Хіміотерапевтичний агент" являє собою хімічну сполуку, що застосовується для лікування раку. Приклади хіміотерапевтичних агентів включають хімічну сполуку, що застосовується для лікування раку. Приклади хіміотерапевтичних агентів включають алкілуючі агенти, такі як тіотепа і CYTOXAN циклофосфамід; алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбохінон, метуредопа і уредопа; етиленіміни і метиламеламіни, включаючи алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметилоломеламін; ацетогеніни (особливо, булатацин і булатацинон); камптотецин (включаючи синтетичний аналог топотекан); бріостатин; калістатин; CC-1065 (включаючи його синтетичні аналоги адозелезин, карзелезин і бізелезин); криптофіцини (особливо, криптофіцин 1 і криптофіцин 8); доластатин; дуокарміцин (включаючи синтетичні аналоги KW-2189 і CB1-TM1); елеутеробін; панкратистатин; саркодиктиїн; спонгістатин; азотистий іприт, такий як хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, гідрохлорид оксиду мехлоретаміну, мелфалан, новембіхин, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, урацилмустин; похідні нітрозосечовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин і ранімнустин; антибіотики, такі як енедіїнові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, особливо каліхеаміцин-гамма II і каліхеаміцин-омега II (див., наприклад, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)); динеміцин, включаючи динеміцин А; бісфофонати, такі як клодронат; еспераміцин; а також хромофор неокарциностатину і споріднені хромофори хромопротеїнів - енедіїнові антибіотики), аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, карабіцин, карміноміцин, карзинофілін, хромоміцин, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6-діазо-5оксо-L-норлейцин, ADRIAMYCIN доксорубіцин (включаючи морфолінодоксорубіцин, ціаноморфолінодоксорубіцин, 2-піролінодоксорубіцин і дезоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, такі як мітоміцин С, мікофенолову кислоту, ногаламіцин, олівоміцини, пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурину, такі як флударабін, 6-меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; аналоги піримідину, такі як анцитабін, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксіуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин; андрогени, такі як калустерон, пропіонат дромостанолону, епітіостанол, мепітіостан, тестолактон; агенти, що пригнічують функції надниркових залоз, такі як аміноглютетімід, мітотан, трилостан; замінник фолієвої кислоти, такий як фролінова кислота; ацеглатон; глікозид альдофосфаміду; амінолевулінову кислоту; енілурацил; амсакрин; бестрабуцил; бісантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазиквон; елфорнітин; ацетат еліптинію; епотилон; етоглуцид; нітрат галію; гідроксисечовину; лентинан; лонідаїнін; мейтанзиноїди, такі як мейтанзин і ансамітоцини; мітогуазон; мітоксантрон; мопіданмол; нітраерин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лозоксантрон; подофілінову кислоту; 2-етилгідразид; прокарбазин; полісахаридний комплекс 13 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофіран; спірогерманій; тенуазонову кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриетиламін; трихотецени (особливо, токсин Т2, веракурин А, роридин А і ангуїдин); уретан; віндезин; дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("Ara-C"); циклофосфамід; тіотепа; таксоїди, наприклад, паклітаксел TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), препарат паклітакселу на основі сконструйованих зв'язаних з альбуміном наночастинок, вільних від кремофору ABRAXANE® (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), і доксетаксел TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабін GEMZAR®; 6тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платини, такі як цисплатин і карбоплатин; вінбластин; платину; етопозид (VP-16); іфосфамід; мітоксантрон; вінкристин; вінорелбін NAVELBINE®; новантрон; теніпозид; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; кселоду; ібандронат; іринотекан (Camptosar, CPT-11) (включаючи схему лікування іринотеканом з 5-FU і лейковорином); інгібітор топоізомерази RFS 2000; дифторметилорнітин (DMFO); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота; капецитабін; комбретастатин; лейковорин (LV); оксаліплатин, включаючи схему лікування оксаліплатином (FOLFOX); лапатиніб (Tykerb®); інгібітори PKC-альфа, Raf, HRas, EGFR (наприклад, ерлотиніб (Tarceva®)) і VEGF-A, які знижують клітинну проліферацію, і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якого агента, з вказаних вище. Також у вказане визначення включені антигормональні агенти, які діють, регулюючи або інгібуючи гормональну дію на пухлини, такі як антиестрогени і вибіркові модулятори рецепторів естрогенів (SERM), включаючи, наприклад, тамоксифен (включаючи тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон і тореміфен FARESTON; інгібітори ароматази, які інгібують фермент ароматазу, яка регулює продукцію естрогенів в надниркових залозах, такі як, наприклад, 4(5)-імідазоли, аміноглутетімід, ацетат мегестролу MEGASE®, екземестан AROMASIN®, форместан, фадрозол, ворозол RIVISOR®, летрозол FEMARA® і анастрозол ARIMIDEX®; і антиандрогени, такі як флутамід, нілутамід, бікалутамід, лейпролід і гозерелін; а також троксацитабін (1,3діоксолановий нуклеозидний аналог цитозину); антисмислові олігонуклеотиди, зокрема олігонуклеотиди, які інгібують експресію генів в шляхах передачі сигналів, залучених в проліферацію аберантних клітин, таких як, наприклад, PKC-альфа, Raf і H-Ras; рибозими, такі як інгібітор експресії VEGF (наприклад, рибозим ANDIOZYME®) і інгібітор експресії HER2; вакцини, такі як вакцини для генної терапії, наприклад, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® і вакцина VAXID®; rIL-2 PROLEUKIN®; інгібітор топоізомерази 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX® і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якого з вказаних вище агентів. Термін "цитокін" є родовою назвою білків, що вивільняються однією популяцією клітин, які діють на іншу клітину як міжклітинні медіатори. Прикладами таких цитокінів є лімфокіни, монокіни і традиційні поліпептидні гормони. До цитокінів належить гормон росту, такий як гормон росту людини, N-метіоніл-гормон росту людини і бичачий гормон росту; паратиреоїдний гормон; тироксин; інсулін; проінсулін; релаксин; прорелаксин; глікопротеїдні гормони, такі як фолікулостимулюючий гормон (ФСГ), тиреотропний гормон (ТТГ) і лютеїнізуючий гормон (ЛГ); епідермальний фактор росту; фактор росту гепатоцитів; фактор росту фібробластів; пролактин; плацентарний лактоген; фактор некрозу пухлини-альфа і -бета; антимюлерів гормон; мишачий асоційований з гонадотропіном пептид; інгібін; активін; фактор росту ендотелію судин; інтегрин; тромбопоетин (TPO); фактори росту нервів, такі як NGF-альфа; фактор росту тромбоцитів; трансформуючі фактори росту (TGF), такі як TGF-альфа і TGF-бета; інсуліноподібний фактор росту-I і -II; еритропоетин (EPO); остеоіндуктивні фактори; інтерферони, такі як інтерферональфа, -бета і -гамма, колонієстимулюючі фактори (CSFs), такі як CSF макрофагів (M-CSF), CSF гранулоцитів і макрофагів (GM-CSF) і CSF гранулоцитів (G-CSF); інтерлейкіни (ІЛ), такі як ІЛ-1, ІЛ-1-альфа, ІЛ-2, ІЛ-3, ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-6, ІЛ-7, ІЛ-8, ІЛ-9, ІЛ-10, ІЛ-11, ІЛ-12; фактор некрозу пухлин, такий як TNF-альфа або TNF-бета; і інші поліпептидні фактори, включаючи LIF і ліганд kit (KL). Термін цитокін, що застосовується в даному описі, включає білки з природних джерел або з культури рекомбінантних клітин і біологічно активні еквіваленти цитокінів з нативною послідовністю. "Агент, що інгібує ріст" при використанні в даному описі стосується сполуки або композиції, які інгібують ріст клітини in vitro і/або in vivo. Таким чином, агентом, що інгібує ріст, може бути агент, який значною мірою зменшує процентний вміст клітин в S-фазі. Приклади агентів, що інгібують ріст, включають агенти, які блокують прогресію клітинного циклу (в іншій фазі, що відрізняється від S-фази), такі як агенти, які індукують зупинку в G1-фазі і зупинку в M-фазі. Класичні блокатори M-фази включають алкалоїди барвінку (вінкристин і вінбластин), TAXOL і інгібітори топоізомерази II, такі як доксорубіцин, епірубіцин, даунорубіцин, етопозид і блеоміцин. 14 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ті агенти, які зупиняють цикл в G1, також розповсюджують свою дію на зупинку в S-фазі, наприклад, алкілуючі ДНК агенти, такі як тамоксифен, преднізон, дакарбазин, мехлоретамін, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил і ara-C. Додаткову інформацію можна знайти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., в розділі 1, озаглавленому "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особливо на стор. 13. Термін "проліки", що використовується в даній заявці, стосується форми попередника або похідної фармацевтично активної речовини, яка є менш цитотоксичною відносно пухлинних клітин в порівнянні з батьківськими ліками і здатна піддаватися ферментативній активації або перетворенню в більш активну батьківську форму. Див., наприклад, Wilman, "Prodrugs in Cancer th Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615 Meeting Belfast (1986) і Stella et al., "Prodrugs: А Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985). Проліки за винаходом включають, але не обмежуються цим, проліки, що містять фосфат, проліки, що містять тіофосфат, проліки, що містять сульфат, проліки, що містять пептид, проліки, модифіковані D-амінокислотами, глікозильовані проліки, проліки, що містять β-лактам, проліки, що містять необов'язково заміщений феноксіацетамід, або проліки, що містять необов'язково заміщений фенілацетамід, проліки, що містять 5-фторцитозин і інші 5-фторуридини, які можуть бути перетворені в більш активні цитотоксичні вільні ліки. Приклади цитотоксичних ліків, які можуть бути дериватизовані в пролікарську форму для застосування в даному винаході, включають, але не обмежуються цим, ті хіміотерапевтичні агенти, які описані вище. Під "променевою терапією" мається на увазі використання спрямованих гамма-променів або бета-променів для індукції достатнього пошкодження клітини так, щоб обмежити її здатність нормально функціонувати або зовсім зруйнувати клітину. Повинно бути зрозуміло, що існує багато способів, відомих в даній галузі техніки, для визначення дози і тривалості лікування. Звичайно лікування проводиться як однократне призначення, і типовий діапазон доз складає від 10 до 200 одиниць (Грей) на день. Під "зниженням або інгібуванням" мається на увазі здатність запобігати/затримувати або спричиняти підсумкове зниження на 20 % або більше, більш переважно на 50 % або більше, і найбільш переважно на 75 %, 85 %, 90 %, 95 % або більше. Зниження або інгібування може стосуватися симптомів порушення, що піддається лікуванню, присутності або розміру метастазів або мікрометастазів, розміру первинної пухлини, присутності або розміру пухлини, що знаходиться в спокої, або до розміру і кількості кровоносних судин при ангіогенних порушеннях. Термін "внутрішньовенна інфузія" стосується введення ліків у вену хворої тварини або людини протягом періоду часу, більш тривалих, ніж 5 хвилин, переважно приблизно від 30 до 90 хвилин, хоча, згідно з даним винаходом, альтернативно внутрішньовенна інфузія проводиться протягом 10 годин або менше. Термін "внутрішньовенне болюсне введення" або "внутрішньовенне навантажувальне введення" стосується введення ліків у вену тварини або людини так, щоб ліки були сприйняті організмом в межах приблизно 15 хвилин або менше, переважно 5 хвилин або менше. Термін "підшкірне введення" стосується введення ліків під шкіру хворої тварини або людини переважно в кишеню між шкірою і прилеглою нижче тканиною при відносно повільній доставці, що підтримується з кишені, що вміщує ліки. Кишеня може бути створена за допомогою затиснення або відтягання шкіри вгору і від прилеглої нижче тканини. Термін "підшкірна інфузія" стосується введення ліків під шкіру хворої тварини або людини переважно в кишеню між шкірою і прилеглою нижче тканиною при відносно повільній доставці, що підтримується, з кишені, що вміщає ліки, протягом періоду часу, включаючи, але, не обмежуючись цим, 30 хвилин або менше або 90 хвилин або менше. Необов'язково інфузія може бути здійснена за допомогою підшкірної імплантації лікарської помпи для доставки, що імплантується під шкіру хворої тварини або людини, де помпа здійснює доставку заздалегідь визначеної кількості ліків протягом заздалегідь визначеного періоду часу, такого як 30 хвилин, 90 хвилин, або період часу, що охоплює тривалість схеми лікування. Термін "підшкірне болюсне введення" стосується введення ліків під шкіру хворої тварини або людини, де болюсна доставка ліків складає переважно менше приблизно 15 хвилин, більш переважно менше 5 хвилин, і найбільш переважно менше 60 секунд. Введення здійснюється переважно в кишеню між шкірою і прилеглою нижче тканиною, де кишеня створюється, наприклад, за допомогою затиснення або відтягання шкіри вгору і від прилеглої нижче тканини. "Порушення" являє собою будь-який стан, при якому може бути корисне лікування антитілом. Таке порушення включає хронічні і гострі порушення або захворювання, включаючи 15 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ті патологічні стани, які зумовлюють схильність ссавця до порушення, що розглядається. Необмежувальні приклади порушень, що піддаються лікуванню згідно з даним винаходом, включають рак; доброякісні і злоякісні пухлини; лейкоз і лімфоїдні злоякісні новоутворення; нейронні, гліальні, астрогліальні, гіпоталамічні і інші порушення, що стосуються залози, макрофаги, епітелій, строму і бластоцель; і запальні, ангіогенні і імунологічні порушення. Термін "терапевтично ефективна кількість" стосується кількості ліків, ефективної для лікування захворювання або порушення у ссавця. У випадку раку терапевтично ефективна кількість ліків може зменшити кількість ракових клітин; знизити розмір пухлини; інгібувати (тобто певною мірою сповільнити і переважно зупинити) інфільтрацію ракових клітин до периферичних органів; інгібувати (тобто певною мірою сповільнити і переважно зупинити) метастазування пухлини; певною мірою інгібувати ріст пухлини; і/або певною мірою ослабити один або більше симптомів, пов'язаних з порушенням. Залежно від ступеня, в якому ліки можуть запобігати росту і/або знищувати наявні ракові клітини, вони можуть бути цитостатичними і/або цитотоксичними. У разі терапії раку ефективність in vivo можна, наприклад, виміряти, оцінюючи тривалість виживання, тривалість виживання без прогресування захворювання (PFS), показники реакції (RR) у відповідь, тривалість відповіді і/або якість життя. "Лікування" стосується як терапевтичного лікування, так і профілактичних або превентивних заходів. До індивідуумів, що потребують лікування, належать індивідууми, що вже мають порушення, а також індивідуумів, у яких треба запобігти порушенню. Слово "мітка" при використанні в даному описі стосується сполуки або композиції, що реєструється, які прямо або опосередковано кон'юговані з поліпептидом. Мітку можна реєструвати як таку (наприклад, радіоізотопні мітки або флуоресцентні мітки), або, у разі ферментативної мітки, вона може каталізувати хімічну зміну субстратної сполуки або композиції, яка реєструється. II. Антитіла проти VEGF і антагоністи (i) Антиген VEGF Антиген VEGF, призначений для використання при продукції антитіл, може являти собою, наприклад, молекулу VEGF165, а також інші ізоформи VEGF або його фрагмент, що містить бажаний епітоп. Інші форми VEGF, придатні для вироблення антитіл проти VEGF за винаходом, повинні бути очевидні фахівцям в даній галузі техніки. VEGF людини був отриманий спочатку шляхом скринінгу бібліотеки кДНК, отриманої з клітин людини, з використанням кДНК VEGF бика як гібридизаційного зонду. Leung et al. (1989) Science, 246:1306. Одна кДНК, ідентифікована таким чином, кодує білок з 165 амінокислот, що має більш ніж 95 % гомологію з VEGF бика; цей білок з 165 амінокислот звичайно позначається як VEGF людини (hVEGF) або VEGF165. Мітогенна активність VEGF людини була підтверджена шляхом експресії кДНК VEGF людини в клітинах-хазяїнах ссавців. Середовища, кондиціоновані клітинами, трансфікованими кДНК VEGF людини, стимулювали проліферацію ендотеліальних клітин капілярів, тоді як контрольні клітини не викликали цього ефекту. Leung et al. (1989) Science, вище. Хоча фактор росту ендотеліальних клітин судин для подальшого терапевтичного застосування може бути виділений і очищений з природних джерел, відносно низькі концентрації білка в фолікулярних клітинах і висока вартість отримання VEGF, як в плані зусиль, так і витрат, доводить неспроможність таких комерційних зусиль. Відповідно, були зроблені подальші спроби для клонування і експресії VEGF за допомогою методів рекомбінантної ДНК. (Див., наприклад, Ferrara, Laboratory Investigation 72:615-618 (1995) і посилання, що цитуються там). VEGF експресується в різноманітних тканинах у вигляді множинних гомодимерних форм (121, 145, 165, 189 і 206 амінокислот на мономер), що відбуваються в результаті альтернативного сплайсингу РНК. VEGF121 являє собою розчинний мітоген, який не зв'язує гепарин; більш довгі форми VEGF зв'язують гепарин з прогресивно більш високою спорідненістю. Форми VEGF, що зв'язують гепарин, можуть бути розщеплені на карбоксильному кінці плазміном з вивільненням здатної(них) до дифузії форм(и) VEGF. Секвенування амінокислот карбоксикінцевого пептиду, ідентифікованого після розщеплення плазміном, дає Arg110-Arg111. Амінокінцевий "каркасний" білок, VEGF (1-110), виділений у вигляді гомодимеру, зв'язується нейтралізуючими моноклональними антитілами (такими як антитіла, позначені як 4.6.1 і 3.2 E3.1.1) і розчинними формами рецепторів VEGF зі спорідненістю, схожою зі спорідненістю гомодимеру інтактного VEGF165. Нещодавно також ідентифіковано декілька молекул, структурно схожих з VEGF, включаючи фактор росту плаценти (PIGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D і VEGF-E. Ferrara and Davis-Smyth (1987) Endocr. Rev., вище; Ogawa et al. J. Biological Chem. 273:31273-31281(1998); Meyer et al. 16 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 EMBO J., 18:363-374(1999). Рецепторна тирозинкіназа Flt-4 (VEGFR-3) ідентифікована як рецептор VEGF-C і VEGF-D. Joukov et al. EMBO. J. 15:1751(1996); Lee et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1988-1992(1996); Achen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:548-553. VEGF-C, як показано, залучений до регуляції лімфатичного ангіогенезу, Jeltsch et al. Science 276:14231425(1997). (ii) Антитіла проти VEGF Антитіла проти VEGF, які придатні в способах по цьому винаходу, включають будь-яке антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які зв'язуються з VEGF з достатньою афінністю і специфічністю і можуть знижувати або інгібувати біологічну активність VEGF. Антитіло проти VEGF звичайно не може зв'язуватися ні з іншими гомологами VEGF, такими як VEGF-B або VEGF-C, ні з іншими факторами росту, такими як P1GF, PDGF або bFGF. У певних варіантах здійснення цього винаходу антитіла проти VEGF включають, але не обмежуються цим, моноклональне антитіло, яке зв'язується з тим же самим епітопом, що і моноклональне антитіло проти VEGF A4.6.1, що продукується гібридомою ATCC HB 10709; рекомбінантне гуманізоване моноклональне антитіло проти VEGF, створене по Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599. В одному варіанті здійснення антитіло проти VEGF являє собою "бевацизумаб (BV)», також відоме як "rhuMAb VEGF" або AVASTIN. Воно включає області каркасу мутантного IgG1 людини і антигензв'язувальні області, що визначають комплементарність, від мишачого моноклонального антитіла A.4.6.1 проти hVEGF, які блокують зв'язування VEGF людини з його рецепторами. Приблизно 93 % амінокислотних послідовності бевацизумабу, включаючи найбільшу частину областей каркаса, походить від IgG1 людини і приблизно 7 % послідовності походить від мишачого антитіла A.4.6.1. Бевацизумаб і інші гуманізовані антитіла проти VEGF додатково описані в патенті № 6884879, опублікованому 26 лютого 2005 р. Додаткові антитіла включають серії антитіл G6 або B20 (наприклад, G6-31, B20-4.1), як описано в публікації PCT № WO2005/012359, публікації PCT № WO2005/044853 і опублікованій патентній заявці США US2009-0142343, зміст цих патентних заявок спеціально включений в даний опис як посилання. Відносно додаткових антитіл див. патенти США №№ 7060269, 6582959, 6703020; 6054297; W098/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; опубліковані патентні заявки США №№ 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 і 20050112126; і Popkov et al, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004). Інші антитіла включають антитіла, які зв'язуються з функціональним епітопом на VEGF людини, що включає залишки F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 і C104, або, альтернативно, що включає залишки F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 і Q89. В одному варіанті здійснення цього винаходу антитіло проти VEGF має варіабельну область важкого ланцюга, що включає наступну амінокислотну послідовність: EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO:1) і варіабельну область легкого ланцюга, що включає наступну амінокислотну послідовність: DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR (SEQ ID NO:2). "Антитіло серій G6" за даним винаходом являє собою антитіло проти VEGF, яке походить з послідовності антитіла G6 або антитіла, що походить з G6, відповідно до будь-якої з фігур 7, 2426 і 34-35 публікації PCT № WO2005/012359, повне розкриття якої спеціально включене в даний опис як посилання. Див. також публікацію PCT № WO2005/044853, повне розкриття якої спеціально включене в даний опис як посилання. В одному варіанті здійснення антитіло серій G6 зв'язується з функціональним епітопом VEGF людини, що включає залишки F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 і Q89. "Антитіло серій B20" за даним винаходом являє собою антитіло проти VEGF, яке походить з послідовності антитіла B20 або антитіла, що походить з B20, у відповідності з будь-якою з фігур 27-29 публікації PCT № WO2005/012359, повне розкриття якої спеціально включене в даний опис як посилання. Див. також публікацію PCT № WO2005/044853 і опубліковані патентні заявки США US2009-0142343, зміст цих патентних заявок спеціально включений в даний опис як посилання. В одному варіанті здійснення антитіло серій B20 зв'язується з функціональним епітопом VEGF людини, що включає залишки F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 і C104. "Функціональний епітоп" за даним винаходом належить до амінокислотних залишків антигену, які роблять енергетичний внесок в зв'язування антитіла. Мутація будь-якого із залишків антигену, що роблять енергетичний внесок (наприклад, мутація VEGF дикого типу із 17 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 заміною на аланін або гомологічна мутація), буде порушувати зв'язування антитіла, так що відношення відносної спорідненості (IC50 мутанта VEGF/IC50 VEGF дикого типу) антитіла буде вищим за 5 (див. приклад 2 патенту WO2005/012359). В одному варіанті здійснення відношення відносної спорідненості визначається по зв'язуванню фагового дисплея в розчині з допомогою ELISA. Коротко, 96-ямкові імунопланшети Maxisorp (NUNC) покривають протягом ночі при 4С Fab формою антитіла, що піддається тестуванню, в концентрації 2 мкг/мл в PBS і блокують PBS, 0,5 % BSA і 0,05 % твіном 20 (PBT) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Серійне розведення фагового дисплея мутантів hVEGF з точковими замінами на аланін (форма із залишками 8-109) або hVEGF дикого типу (8-109) в PBT спочатку інкубують в планшетах, покритих Fab, протягом 15 хвилин при кімнатній температурі, і планшети промивають PBS, 0,05 % твіном 20 (PBST). Зв'язаний фаг визначають з допомогою моноклонального антитіла проти M13, кон'югованого з пероксидазою хрону (Amersham Pharmacia), в розведенні 1:5000 в PBT, при розвитку забарвлення субстрат 3,3', 5,5'-тетраметилбензидину (TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD) протягом приблизно 5 хв., реакцію зупиняють 1,0 М H3PO4, і результат зчитують спектрофотометрично при 450 нм. Відношення величин IC50 (IC50, ala/IC50, wt) показує ступінь зниження зв'язуючої спорідненості (відносна зв'язуюча спорідненість). (iii) Молекули рецептора VEGF Ідентифіковано два рецептори VEGF, Flt-1 (також званий VEGFR-1) і KDR (також званий VEGFR-2). Shibuya et al. (1990) Oncogene 8:519-527; de Vries et al. (1992) Science 255:989-991; Terman et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579-1586. Специфічність кожного рецептора для кожного члена сімейства VEGF варіюється, але VEGF-A зв'язується як з Flt-1, так і з KDR. Нейропілін-1, як показано, є селективним рецептором VEGF, здатним зв'язувати ізоформи VEGF, які зв'язують гепарин (Soker et al. (1998) Cell 92:735-45). Як Flt-I, так і KDR належать до сімейства рецепторних тирозинкіназ (RTKs). RTKs включають велике сімейство трансмембранних рецепторів з різноманітною біологічною активністю. На даний час ідентифіковано щонайменше дев'ятнадцять (19) окремих підродин RTK. Сімейство рецепторних тирозинкіназ (RTK) включає рецептори, які є ключовими для росту і диференціювання різних клітинних типів (Yarden and Ullrich (1988) Ann. Rev. Biochem.57:433-478; Ullrich and Schlessinger (1990) Cell 61:243-254). Властива RTKs функція активується при зв'язуванні ліганда, яке веде до фосфорилування рецептора і множини клітинних субстратів, що згодом приводить до різноманітних відповідей клітини (Ullrich & Schlessinger (1990) Cell 61:203-212). Таким чином, передача сигналу, опосередкована рецепторною тирозинкіназою, ініціюється позаклітинною взаємодією зі специфічним фактором росту (лігандом), за яким звичайно йде димеризація рецепторів, стимуляція власної тирозинкіназної активності білка і перехресне фосфорилування рецепторів. Внаслідок цього утворюються зв'язувальні сайти для молекул, що беруть участь в передачі внутрішньоклітинного сигналу, що веде до утворення комплексів зі спектром цитоплазматичних сигнальних молекул, що сприяє відповідній клітинній відповіді (наприклад, клітинному розподілу, диференціюванню, метаболічним ефектам, змінам у позаклітинному мікрооточенні), див. Schlessinger and Ullrich (1992) Neuron 9:1-20. Структурно як Flt-1, так і KDR мають у позаклітинному домені сім імуноглобуліноподібних доменів, один трансмембранний домен і консенсусну тирозинкіназну послідовність, яка уривається вставковим для кінази доменом. Matthews et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9026-9030; Terman et al. (1991) Oncogene 6:1677-1683. Молекули рецептора VEGF або його фрагмента, які специфічно зв'язуються з VEGF, можуть бути використані в способах за винаходом для зв'язування і відділення білка VEGF, тим самим перешкоджаючи його сигналізації. У певних варіантах здійснення молекула рецептора VEGF або її зв'язувальний VEGF фрагмент знаходиться в розчинній формі, такій як sFlt-1. Розчинна форма рецептора чинить інгібіторний вплив на біологічну активність білка VEGF внаслідок зв'язування з VEGF, що тим самим перешкоджає його зв'язуванню з його природними рецепторами, присутніми на поверхні клітин-мішеней. Включеними є також гібридні рецепторні білки для VEGF, приклади яких описуються нижче. Гібридний рецепторний білок для VEGF являє собою рецепторну молекулу, що має амінокислотні послідовності, що походять щонайменше з двох різних білків щонайменше один з яких являє собою рецепторний білок (наприклад, рецептор flt-1 або KDR), який здатний зв'язуватися з VEGF і інгібувати його біологічну активність. У певних варіантах здійснення гібридні рецепторні білки для VEGF за винаходом складаються з амінокислотних послідовностей, що походять тільки з двох різних рецепторних молекул для VEGF; однак, амінокислотні послідовності, що включають один, два, три, чотири, п'ять, шість або всі сім Igподібних доменів позаклітинної лігандів'язувальної області рецептора flt-1 і/або KDR, можуть 18 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 бути сполучені з амінокислотними послідовностями інших неродинних білків, наприклад, послідовностями імуноглобулінів. Інші амінокислотні послідовності, до яких приєднують Igподібні домени, повинні бути без великих зусиль зрозумілі фахівцям в даній галузі техніки. Приклади гібридних рецепторних білків для VEGF включають, наприклад, Flt-1/Fc, KDR/Fc або FLt-1/KDR/Fc (також відомий як манок VEGF). (Див., наприклад, опубліковану заявку PCT № WО97/44453). Розчинний рецепторний білок для VEGF або гібридні рецепторні білки для VEGF за винаходом включають рецепторні білки для VEGF, які не фіксовані на поверхні клітин через трансмембранний домен. По суті розчинні форми рецептора VEGF, включаючи гібридні рецепторні білки, при здатності зв'язуватися з VEGF і інактивувати його не включають трансмембранного домену і, отже, звичайно не стають зв'язаними з клітинною мембраною клітин, в яких експресується молекула. III. Терапевтичне використання антитіл проти VEGF Винаходом охоплюється антиангіогенна терапія, нова стратегія лікування раку, спрямована на пригнічення розвитку кров'яних судин в пухлині, необхідних для постачання поживними речовинами, що підтримують ріст пухлини. Оскільки ангіогенез бере участь в рості і первинній пухлині, і метастазів, антиангіогенне лікування, що пропонується у винаході, здатне пригнічувати неопластичний ріст пухлини в місці вихідної локалізації, а також запобігати метастазуванню пухлин у вторинних ділянках, забезпечуючи тим самим атакуючу дію на пухлини інших терапевтичних агентів. Конкретно, у винаході пропонується метод лікування хворого з діагностованим і раніше підданим лікуванню метастатичним раком молочної залози, що включає застосування до хворого схеми лікування, що поєднує хіміотерапію з введенням ефективної кількості антитіла проти VEGF. Форми поєднаної терапії Винахід відрізняється використанням поєднання щонайменше одного специфічного антагоніста VEGF з одним або більше додаткових протиракових лікувальних агентів. Приклади протиракових лікувальних агентів включають, але не обмежуються цим, хірургічну операцію, рентгенотерапію (радіотерапію), біотерапію, імунотерапію, хіміотерапію або поєднання цих видів терапії. Крім того, в поєднанні зі специфічним антагоністом VEGF можуть бути використані цитотоксичні агенти, антиангіогенні і антипроліферативні агенти. У певних аспектах винаходу пропонується метод лікування раку молочної залози, що раніше піддавався лікуванню, шляхом введення ефективних кількостей антитіла проти VEGF і одного або більше хіміотерапевтичних агентів хворому, схильному до метастатичного раку або з діагностованим метастатичним раком, що раніше був підданий лікуванню. У методах за винаходом поєднаного лікування може бути використана множина хіміотерапевтичних агентів. Ілюстративний і необмежувальний перелік хіміотерапевтичних агентів, що розглядаються, представлений в даному описі в розділі "Визначення" або описаний в даному описі. В одному прикладі винахід відрізняється використанням специфічного антагоніста VEGF з одним або більше хіміотерапевтичними агентами (наприклад, сумішшю) або їх будь-яким поєднанням. Поєднане введення включає одночасне введення, використання окремих складів або єдиного фармацевтичного складу, послідовне введення в будь-якому порядку, при якому переважно є період часу, коли обидва (або всі) активні агенти чинять свою біологічну дію одночасно. Отримання і режими дозування таких хіміотерапевтичних агентів можуть бути використані відповідно до інструкцій виробників або визначені емпірично практикуючим лікарем. Отримання і режими дозування для хіміотерапії описані також в Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992). Хіміотерапевтичний агент може передувати або слідувати за введенням специфічного антагоніста VEGF або може бути введений одночасно з ним. У деяких інших аспектах інші терапевтичні агенти, придатні для поєднаної терапії пухлини антитілом винаходу, включають антагоністи інших факторів, залучених до пухлинного росту, таких як, але, не обмежуючись цим, EGFR, ErbB2 (також відомим як Her2) ErbB3, ErbB4 або TNF. Іноді може бути вигідно також введення хворому одного або більше цитокінів. В одному варіанті здійснення антитіло проти VEGF вводять спільно з агентом, що пригнічує ріст. Наприклад, спочатку можна вводити агент, що пригнічує ріст, а потім антитіло проти VEGF. Однак передбачається і одночасне введення або введення антитіла проти VEGF першим. Прийнятними дозами для агента, що пригнічує ріст, є дози, що використовуються в цей час, і вони можуть бути знижені завдяки поєднаній дії (синергізму) агента, що пригнічує ріст, і антитіла проти VEGF. 19 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Склад в даному описі також може містити більше однієї активної сполуки, якщо це необхідно по конкретним показам для лікування, переважно сполуки з комплементарними типами активності, які не чинять несприятливої дії одна на одну. Наприклад, може бути бажаним додаткове введення антитіл, які зв'язуються з EGFR, VEGF (наприклад, антитіло, яке зв'язує інший епітоп на VEGF), VEGFR або ErbB2 (наприклад, Herceptinо), в одному складі. Альтернативно або додатково композиція може включати цитотоксичний агент, цитокін, агент, що пригнічує ріст, і/або низькомолекулярний антагоніст VEGFR. Такі молекули переважно знаходяться в поєднанні в кількостях, які є ефективними для наміченої мети. У певних аспектах інші терапевтичні агенти, придатні для поєднаної з антитілом за винаходом терапії раку, включають інші антиангіогенні агенти. Було виявлено і відомо в даній галузі техніки багато антиангіогенних агентів, включаючи ті, які перераховані Carmeliet і Jain (2000). В одному варіанті здійснення антитіло проти VEGF за винаходом використовують в поєднанні з іншим антагоністом VEGF або антагоністом рецептора VEGF, таким як варіанти VEGF, розчинні фрагменти рецептора VEGF, аптамери, здатні блокувати VEGF або VEGFR, нейтралізуючі антитіла проти VEGFR, низькомолекулярні інгібітори тирозинкіназ VEGFR або будь-якими їх поєднаннями. Альтернативно або додатково хворому можна вводити спільно два або більше антитіл проти VEGF. Для профілактики або лікування захворювання прийнятна доза специфічного антагоніста VEGF повинна залежати від типу захворювання, що підлягає лікуванню, як визначено вище, тяжкості і перебігу захворювання, від того, чи вводиться специфічний антагоніст VEGF для цілей профілактики або лікування, попередньої терапії, історії хвороби хворого, відповіді на специфічний антагоніст VEGF і вибору лікуючого лікаря. Специфічний антагоніст VEGF відповідно вводять хворому однократно або за допомогою серії введень. При схемі поєднаної терапії специфічний антагоніст VEGF і один або більше протиракових терапевтичних агентів вводять в терапевтично ефективній або синергічній кількості. У даному описі терапевтично ефективна кількість являє собою таку кількість, яку при спільному введенні специфічного антагоніста VEGF і одного або більше протиракових терапевтичних агентів або при введенні композиції за винаходом спричиняє зменшення або пригнічення раку, як описано вище. Терапевтично синергічна кількість являє собою кількість специфічного антагоніста VEGF і одного або більше протиракових терапевтичних агентів, необхідну для синергічного або значного зниження або усунення станів або симптомів, пов'язаних з конкретним захворюванням. Специфічний антагоніст VEGF і один або більше протиракових терапевтичних агентів можна вводити одночасно або послідовно в кількості і протягом періоду, достатнього для зниження або усунення наявності або повторної появи пухлини, пухлини в неактивній стадії або мікрометастазів. Специфічний антагоніст VEGF і один або більше протиракових терапевтичних агентів можна вводити як підтримуючу терапію для профілактики або зниження імовірності повторної появи пухлини. Як повинно бути ясно фахівцям в даній галузі техніки, прийнятні дози хіміотерапевтичних агентів або інших протиракових агентів звичайно повинні бути приблизно такими ж, які вже використовуються в клінічній терапії, наприклад, при введенні хіміотерапевтичних агентів роздільно або в поєднанні з іншими хіміотерапевтичними агентами. Доза повинна, ймовірно, залежати від стану, що підлягає лікуванню. Лікар, що призначає лікування, повинен бути здатний визначити прийнятну дозу для окремого індивідуума. Додатково до вказаних вище терапевтичних схем хворий може бути підданий рентгенотерапії. У певних варіантах здійснення антитіло, що вводиться проти VEGF, являє собою інтактне антитіло як таке. Однак антитіло проти VEGF може бути кон'юговане з цитотоксичним агентом. У певних варіантах здійснення кон'юговане антитіло і/або антиген, з яким воно зв'язане, інтерналізується/інтерналізуються клітиною, що приводить до підвищення терапевтичної ефективності кон'югату в плані знищення ракової клітини, з якою воно зв'язується. В одному варіанті здійснення цитотоксичний агент ушкоджує нуклеїнову кислоту або інтерферує з нею в раковій клітині. Приклади цитотоксичних агентів включають мейтансиноїди, каліхеаміцини, рибонуклеази і ДНК-ендонуклеази. Винахід також відрізняється методом інструктування індивідуума-людини, що раніше лікувався від раку молочної залози, шляхом надання інструкцій по отриманню лікування антитілом проти VEGF з тим, щоб збільшити час виживання без прогресування захворювання, знизити ризик рецидиву раку у індивідуума або підвищити імовірність виживання індивідуума. У деяких варіантах здійснення метод додатково включає надання інструкцій по лікуванню щонайменше одним терапевтичним агентом. Лікування антитілом проти VEGF може здійснюватися одночасно з лікуванням хіміотерапевтичним агентом або після нього. У певних 20 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіантах здійснення індивідуума лікують відповідно до вказівок методу інструктування. Лікування раку молочної залози шляхом введення антитіла проти VEGF спільно з хіміотерапією або без неї може продовжуватися до рецидиву раку або смерті. У винаході додатково пропонується спосіб просування, що включає просування введення антитіла проти VEGF для лікування раніше підданого лікуванню раку молочної залози у індивідуума-людини. У деяких варіантах здійснення метод додатково включає просування введення щонайменше одного хіміотерапевтичного агента. Введення антитіла проти VEGF може проводитися одночасно з введенням хіміотерапевтичного агента або після нього. Просування може проводитися будь-яким з доступних засобів. У деяких варіантах здійснення просування здійснюється за допомогою рекламного вкладиша в упаковці, що супроводжує склад антитіла проти VEGF, що продається. Просування також може здійснюватися за допомогою рекламного вкладиша в упаковці, що супроводжує склад хіміотерапевтичного агента, що продається. Просування може бути у вигляді письмового або усного повідомлення лікареві або працівнику охорони здоров'я. У деяких варіантах здійснення просування здійснюється за допомогою рекламного вкладиша в упаковці, де в рекламному вкладиші надаються інструкції по отриманню лікування антитілом проти VEGF. У додатковому варіанті здійснення рекламний вкладиш в упаковці включає деякі або всі результати прикладу 1. В деяких варіантах здійснення за просуванням йде лікування індивідуума антитілом проти VEGF і хіміотерапевтичним агентом або без нього. У винаході пропонується спосіб ведення бізнесу, який включає маркетинг антитіла проти VEGF для лікування раніше підданого лікуванню раку молочної залози у індивідуума-людини з тим, щоб збільшити час виживання без прогресування захворювання, знизити ризик рецидиву раку у індивідуума або підвищити імовірність виживання індивідуума. У деяких варіантах здійснення спосіб додатково включає маркетинг хіміотерапевтичного агента для використання в поєднанні з антитілом проти VEGF. У деяких варіантах здійснення за маркетингом йде лікування індивідуума антитілом проти VEGF і хіміотерапевтичним агентом або без нього. Пропонується також спосіб ведення бізнесу, що включає маркетинг хіміотерапевтичного агента в поєднанні з антитілом проти VEGF для лікування раніше підданого лікуванню раку молочної залози у індивідуума-людини з тим, щоб збільшити час виживання без прогресування захворювання, знизити ризик рецидиву раку у індивідуума або підвищити імовірність виживання індивідуума. У деяких варіантах здійснення за маркетингом йде лікування індивідуума поєднанням хіміотерапевтичного агента і антитіла проти VEGF. IV. Дози і тривалість Композиція специфічного антагоніста VEGF повинна бути складена, дозована і введена способом, що відповідає хорошій медичній практиці. Чинники, що розглядаються в цьому контексті, включають конкретне порушення, що підлягає лікуванню, конкретного індивідуума, що підлягає лікуванню, клінічний стан конкретного хворого, причину порушення, місце доставки агента, метод введення, схему введення і інші чинники, відомі практикуючим клініцистам. "Терапевтично ефективна кількість" специфічного антагоніста VEGF для введення повинна залежати від таких чинників і являє собою мінімальну кількість, необхідну для профілактики, полегшення або лікування або стабілізації раку; для збільшення часу до настання прогресування (тривалість виживання без прогресування захворювання) або для лікування або профілактики наявності або рецидиву пухлини, пухлини в неактивній стадії або мікрометастазів раніше підданого лікуванню раку. Для специфічного антагоніста VEGF немає необхідності складання з одним або більше агентами, що використовуються в цей час для профілактики або лікування раку або ризику розвитку раку, але таке складання можливе по вибору. Ефективна кількість таких інших агентів залежить від кількості специфічного антагоніста VEGF, що знаходиться в складі, типу порушення або лікування і інших чинників, що обговорювалося вище. Їх звичайно використовують в тих же дозах і при тих же шляхах введення, які використовувалися раніше, або приблизно від 1 до 99 % від доз, що використовувалися до цього. Залежно від типу і тяжкості захворювання вихідна доза специфічного антагоніста VEGF, що пропонується для введення хворому, складає приблизно від 1 мкг/кг до 100 мг/кг (наприклад, 0,1-20 мг/кг) при введенні, наприклад, або шляхом одного або більше окремих введень, або безперервної інфузії. Типова добова доза може варіювати від приблизно 1 мкг/кг до приблизно 100 мг/кг або більше, залежно від згаданих вище чинників. Особливо бажані дози включають, наприклад, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг і 15 мг/кг. Для повторних введень протягом декількох днів або більше, залежно від стану, лікування підтримують доти, доки проводиться лікування раку, що оцінюється описаними вище або відомими в даній галузі техніки методами. Однак можуть бути придатні інші режими доз. В одному прикладі, коли специфічний антагоніст VEGF являє 21 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 собою антитіло, антитіло за винаходом вводять раз на тиждень, раз на два тижні або разів на три тижні в діапазоні доз від приблизно 5 мг/кг до приблизно 15 мг/кг, включаючи, але не обмежуючись цим, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг або 15 мг/кг. Успішність терапії за винаходом легко відстежувати за допомогою традиційних методів і аналізів. В інших варіантах здійснення такий режим дозування використовують в поєднанні з режимом хіміотерапії як друга лінія терапії для лікування раніше підданого лікуванню метастатичного раку молочної залози. Додаткова інформація відносно прийнятних доз представлена в прикладі нижче. Терапію звичайно продовжують протягом часу, що відповідає медичному показу або до досягнення бажаного терапевтичного ефекту (наприклад, одного з описаних в даному описі). Специфічні антагоністи VEGF за винаходом вводять індивідууму, наприклад, хворій людині відповідно до відомих методів, таких як внутрішньовенне введення у вигляді болюсу або безперервної інфузії протягом деякого періоду часу, внутрішньом'язовий, внутрішньоочеревинний, всередину спинного мозку, підшкірний, внутрішньосуглобовий, інтрасиновіальний, інтратекальний, пероральний, місцевий або інгаляційний шляхи введення. Місцеве введення особливо бажане, якщо з антагонізмом VEGF пов'язані значні побічні ефекти або токсичність. Для терапевтичного застосування також може бути використана стратегія ex vivo. У стратегіях ex vivo використовується трансфекція або трансдукція клітин, отриманих від індивідуума, полінуклеотидом, що кодує антагоніст VEGF. Трансфіковані або трансдуковані клітини потім повертають в організм індивідуума. Клітини можуть належати до будь-якого типу з широкого спектра типів клітин, включаючи, але не обмежуючись цим, гематопоетичні клітини (наприклад, клітини кісткового мозку, макрофаги, моноцити, дендритні клітини, Т-клітини або Вклітини), фібробласти, епітеліальні клітини, ендотеліальні клітини, кератиноцити або м'язові клітини. Наприклад, якщо специфічний антагоніст VEGF являє собою антитіло, антитіло вводять за допомогою будь-яких прийнятних способів, включаючи парентеральне, підшкірне, внутрішньоочеревинне, внутрішньолегеневе і інтраназальне введення і, якщо це бажано для місцевого імунодепресивного лікування, введення всередину пошкодження. Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньоочеревинне або підшкірне введення. Крім того, антитіло відповідно вводять з допомогою імпульсної інфузії, дозами антитіла, що особливо знижуються. Переважно дозу вводять шляхом ін'єкцій, найбільш переважно шляхом внутрішньовенних або підшкірних ін'єкцій, частково залежно від того, чи є введення короткочасним або хронічним. В іншому прикладі сполуку, що є специфічним антагоністом VEGF, вводять місцево, наприклад, шляхом прямих ін'єкцій, коли порушення або локалізація пухлини це дозволяє, і ін'єкції можуть періодично повторюватися. Специфічний антагоніст VEGF може також доставлятися системно індивідууму або прямо до пухлинних клітин, наприклад, до пухлини або ложа пухлини після хірургічного видалення пухлини для профілактики або зниження місцевого рецидиву або метастазу, наприклад, пухлини в неактивній стадії або мікрометастазів. Альтернативно, до відповідних клітин індивідуума може бути доставлена молекула інгібуючої нуклеїнової кислоти або полінуклеотид, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує специфічний антагоніст VEGF. У певних варіантах здійснення нуклеїнова кислота може бути спрямована до самої пухлини. Нуклеїнова кислота може бути введена в клітини способами, що відповідають використовуваному вектору. Багато таких методів добре відомі в даній галузі техніки (Sambrook et al., вище, і Watson et al., Recombinant DNA, Chapter 12, 2d edition, Scientific American Books, 1992). Приклади методів доставки генів включають опосередковану ліпосомами трансфекцію, електропорацію, методи з використанням фосфату кальцію/ДЕАЕ-декстрану, генну гармату і мікроін'єкцію. V. Фармацевтичні склади Терапевтичні склади антитіл, що використовуються за винаходом, отримують для зберігання шляхом змішування антитіла, що має бажаний ступінь чистоти, з необов'язковими фармацевтично прийнятними носіями, ексципієнтами або стабілізаторами (Remington's th Pharmaceutical Sciences 16 edition, Osol, A. Ed. (1980)) в формі ліофілізованих складів або водних розчинів. Прийнятні носії, ексципієнти або стабілізатори є нетоксичними для реципієнтів в дозах і концентраціях, що використовуються, і включають буфери, такі як фосфатний, цитратний і буфери інших органічних кислот; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту і метіонін; консерванти (такі як октадецилметилбензиламонію хлорид; гексаметонію хлорид; бензалконію хлорид; бензетонію хлорид; фенол; бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3пентанол; і м-крезол); низькомолекулярні (менше приблизно 10 залишків) поліпептиди; білки, 22 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди і інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу або декстрини; хелатуючі агенти, такі як ЕДТА; цукор, такий як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солеоутворюючі протиіони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, комплекси Zn-білок); TM TM і/або неіонні поверхнево-активні речовини, такі як TWEEN , PLURONICS або поліетиленгліколь (ПЕГ). Приклади ліофілізованих складів антитіла проти VEGF описані в патенті WO97/04801, спеціально включеному в даний опис як посилання. Необов'язково склад містить фармацевтично прийнятну сіль, звичайно, наприклад, хлорид натрію, і часто в приблизно фізіологічних концентраціях. Необов'язково склади за винаходом можуть містити фармацевтично прийнятний консервант. У деяких варіантах здійснення концентрація консерванту варіює від 0,1 до 2,0 %, звичайно об./об. Прийнятні консерванти включають консерванти, відомі в фармацевтичній галузі техніки. Прикладами консервантів є бензиловий спирт, фенол, м-крезол, метилпарабен і пропілпарабен. Необов'язково склади за винаходом можуть включати фармацевтично прийнятну поверхнево-активну речовину в концентрації від 0,005 до 0,02 %. В одному варіанті здійснення для терапевтичного використання надається бевацизумаб в посудинах для однократного застосування з 100 мг і 400 мг бевацизумабу без консерванту для доставки 4 або 16 мл бевацизумабу (25 мг/мл). 100 мг продукту складені з 240 мг α,α-трегалози дегідрату, 23,2 мг фосфату натрію (одноосновного, моногідрату), 4,8 мг фосфату натрію (двоосновного, безводного), 1,6 мг полісорбату 20 і водою для ін'єкцій, USP. 400 мг продукту складені з 960 мг α,α-трегалози дегідрату, 92,8 мг фосфату натрію (одноосновного, моногідрату), 19,2 мг фосфату натрію (двоосновного, безводного), 6,4 мг полісорбату 20 і водою для ін'єкцій, USP. Див. також етикетку для бевацизумабу. В даний час бевацизумаб є в продажу в деяких країнах. Склад за даним описом може також містити більше однієї активної сполуки, якщо це необхідно по конкретному показу для лікування, переважно сполуки з комплементарними типами активності, які не чинять несприятливої дії одна на одну. Наприклад, може бути бажаним додаткове надання антитіл, які зв'язуються з EGFR, VEGF (наприклад, антитіла, яке зв'язує інший епітоп на VEGF), VEGFR або ErbB2 (наприклад, Herceptin) в одному складі. Альтернативно або додатково композиція може включати цитотоксичний агент, цитокін, агент, що інгібує ріст і/або антагоніст VEGFR (наприклад, низькомолекулярний інгібітор, поліпептид і т.д.). Такі молекули, відповідно, знаходяться в поєднанні в кількостях, які є ефективними для бажаної мети. Активні інгредієнти можуть бути укладені в мікрокапсули, отримані, наприклад, за допомогою методів коацервації або міжфазної полімеризації, наприклад, гідроксиметилцелюлозних або желатинових мікрокапсул і полі-(метилметакрилатних) мікрокапсул, відповідно, в колоїдні системи доставки ліків (наприклад, ліпосоми, мікросфери альбуміну, мікроемульсії, наночастинки і нанокапсули) або в макроемульсії. Такі методи th розкриті в Remington's Pharmaceutical Sciences 16 edition, Osol, A. Ed. (1980). Можуть бути отримані препарати з безперервним вивільненням. Прийнятні приклади препаратів з безперервним вивільненням включають напівпроникні матрикси з твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, причому ці матриці знаходяться в певній формі, наприклад, формі плівок або мікрокапсул. Приклади матриць з безперервним вивільненням включають складні поліефіри, гідрогелі (наприклад, полі(2-гідроксіетилметакрилат) або полі(вініловий спирт)), полілактиди (патент США № 3773919), співполімери L-глутамінової кислоти і γ-етил-L-глутамату, етилен-вінілацетат, що не зруйновується, співполімери молочної TM кислоти-гліколевої кислоти, що зруйновуються, такі як LUPRON DEPOT (мікросфери, що вводяться ін'єкцією, що складаються зі співполімеру молочної кислоти-гліколевої кислоти і ацетату лейпроліду) і полі-D-(-)-3-гідроксимасляна кислота. В той час як такі полімери, як етилен-вінілацетат і молочна кислота-гліколева кислота, здатні вивільняти молекули протягом близько 100 днів, деякі гідрогелі вивільняють білки протягом більш коротких періодів часу. В тому випадку, коли інкапсульовані антитіла залишаються в організмі протягом тривалого часу, вони можуть денатурувати або агрегувати внаслідок впливу вологи при 37С, що приводить до втрати біологічної активності і можливих змін в імуногенності. Можуть бути розроблені раціональні стратегії для стабілізації, залежно від механізму, що залучається. Наприклад, якщо виявлено, що механізмом агрегації є утворення міжмолекулярного S-S-зв'язку в результаті тіодисульфідного обміну, то стабілізація може бути досягнута за допомогою модифікації сульфгідрильних залишків, ліофілізацією з кислих розчинів, регуляцією вологовмісту, 23 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 використанням відповідних добавок і розробкою спеціальних композицій на основі полімерного матриксу. Склади, призначені для введення in vivo, можуть бути стерильними. Це легко здійснити шляхом фільтрування через мембрани для стерильного фільтрування. VI. Ефективність лікування Основною перевагою лікування за винаходом є можливість отримання виражених протиракових ефектів у хворої людини без прояву значної токсичності або побічних ефектів, внаслідок чого хворий виграє від лікування у всіх відношеннях. Ефективність лікування за винаходом можна виміряти на основі різних кінцевих показників, що звичайно використовуються для оцінки лікування раку, включаючи, але не обмежуючись цим, регресію пухлини, зменшення маси або розміру пухлини, час до прогресування, тривалість виживання, виживання без прогресування, загальний показник відповіді, тривалість відповіді і якість життя. Оскільки мішенню антиангіогенних агентів за винаходом є судинна система пухлини і, необов'язково, самі неопластичні клітини, то ці агенти являють собою унікальний клас протиракових лікарських агентів і тому для них може бути необхідність в спеціальних критеріях і визначеннях клінічних відповідей на лікарські агенти. Наприклад, скорочення пухлини більш ніж на 50 % при 2-мірному аналізі є стандартним граничним значенням для твердження про наявність відповіді. Однак антитіло проти VEGF за винаходом може викликати інгібування поширення метастазів без скорочення первинної пухлини або може просто виявляти стабілізуючу дію на пухлину. Відповідно, необов'язково можна використати нові підходи до визначення ефективності антиангіогенної терапії, що включають, наприклад, вимірювання маркерів ангіогенезу в плазмі або сечі і вимірювання відповіді за допомогою радіологічної візуалізації. В іншому варіанті здійснення винаходу пропонуються методи підвищення виживання без прогресування захворювання хворої людини, схильної до розвитку раку або з діагностованим раком, раніше підданим лікуванню. Час прогресування захворювання визначають як час від моменту введення ліків до прогресування хвороби або смерті. В одному варіанті здійснення поєднане лікування за винаходом з використанням антитіла проти VEGF і одного або більше хіміотерапевтичних агентів значно підвищує виживання без прогресування щонайменше приблизно на 0,5 місяці, 1 місяць, 2 місяці, 2,1 місяці, 2,2 місяці 2,8 місяці або більш. В одному варіанті здійснення поєднане лікування за винаходом з використанням антитіла проти VEGF і одного або більше хіміотерапевтичних агентів значно підвищує виживання без прогресування на від приблизно 1 до приблизно 5 місяців в порівнянні з лікуванням тільки хіміотерапією. В одному варіанті здійснення медіана PFS становить 7,2 місяців у хворих, що лікувалися бевацизумабом, в порівнянні з 5,1 місяцями при терапії без бевацизумабу з HR 0,775, величина р (логарифмічне ранжування) 0,0072. В іншому варіанті здійснення PFS в місяцях поданий на фіг. 3. У ще одному варіанті здійснення лікування за винаходом значно підвищує показник відповіді в групі хворих людей, схильних до розвитку раку або з діагностованим раком, раніше підданим лікуванню, яких лікують різними лікарськими агентами. Показник відповіді визначається як процент підданих лікуванню хворих, що реагують на лікування. В одному аспекті поєднане лікування за винаходом з використанням антитіла проти VEGF і одного або більше хіміотерапевтичних агентів значно підвищує показник відповіді в групі підданих лікуванню хворих в порівнянні з групою, підданою лікуванню тільки хіміотерапією. В одному аспекті у винаході пропонуються методи збільшення тривалості відповіді у хворої людини або в групі хворих людей, схильних до розвитку раку або з діагностованим раком. Тривалість відповіді визначається як час від початку відповіді до прогресування захворювання. В одному варіанті здійснення винахід може бути використаний для збільшення тривалості виживання хворої людини, схильної до розвитку раку або з діагностованим раком. VII. Отримання антитіла (i) Поліклональні антитіла Поліклональні антитіла переважно виробляються у тварин шляхом множинних підшкірних (п/шк.) або внутрішньоочеревинних (в/оч.) ін'єкцій відповідного антигену і ад'юванту. Може бути корисним кон'югування відповідного антигену з білком, який є імуногенним для видів, що імунізуються, наприклад, з гемоціаніном молюска фісурелії, сироватковим альбуміном, бичачим тиреоглобуліном або інгібітором трипсину сої, з використанням біфункціонального або дериватизуючого агента, наприклад складного ефіру малеімідобензоїлсульфосукциніміду (кон'югування через залишки цистеїну), N-гідроксисукциніміду (через залишки лізину), 1 1 глутаральдегіду, янтарного ангідриду, SOCl2 або R N=С=NR, де R і R являють собою різні алкільні групи. 24 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Тварин імунізують проти антигену, імуногенних кон'югатів або похідних поєднанням, наприклад, 100 мкг або 5 мкг білка або кон'югату (для кроликів або мишей, відповідно) з 3 об'ємами повного ад'юванту Фрейнда і вводячи ін'єкцією розчин внутрішньошкірно у множину місць. Через місяць тварин піддають бустерній імунізації, використовуючи від 1/5 до 1/10 вихідної кількості пептиду або кон'югату в повному ад'юванті Фрейнда за допомогою підшкірної ін'єкції у множину місць. Через 7-14 днів у тварин беруть кров і аналізують сироватку відносно титру антитіл. Тварин піддають бустерній імунізації аж до виходу титру на плато. Звичайно тварину піддають бустерній імунізації кон'югатом того ж самого антигену, але кон'югованого з іншим білком, і/або отриманого за допомогою іншого поперечно зшиваючого реагенту. Кон'югати також можуть бути отримані в культурі рекомбінантних клітин у вигляді гібридних білків. Також відповідним чином використовують агрегуючі агенти, такі як квасці, для посилення імунної відповіді. (ii) Моноклональні антитіла У даній галузі техніки є різні методи для отримання моноклональних антитіл даного опису. Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути отримані за допомогою методу гібридом, уперше описаного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), або за допомогою методів рекомбінантної ДНК (патент США № 4816567). У методі гібридом мишу або іншу прийнятну тварину-хазяїна, таку як хом'як або макака, імунізують, як описано вище в даному описі, щоб спричинити появу лімфоцитів, які продукують або здатні продукувати антитіла, які будуть специфічно зв'язуватися з білком, що використовується для імунізації. Альтернативно лімфоцити можна імунізувати in vitro. Потім лімфоцити зливають з клітинами мієломи, використовуючи прийнятний агент для злиття, такий як поліетиленгліколь, з утворенням гібридомної клітини (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Отримані таким чином клітини гібридоми висівають і вирощують у прийнятному культуральному середовищі, яке переважно містить одну або декілька речовин, яка інгібує ріст або життєздатність незлитих вихідних клітин мієломи. Наприклад, якщо у вихідних клітинах мієломи відсутній фермент гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансфераза (HGPRT або HPRT), то культуральне середовище для гібридом звичайно повинне включати гіпоксантин, аміноптерин і тимідин (середовище HAT), і такі речовини запобігають росту клітин з недостатністю HGPRT. Переважними мієломними клітинами є такі клітини, які ефективно зливаються, підтримують на стабільно високому рівні продукцію антитіла відібраними клітинами, які продукують антитіло, і чутливі до такого середовища, як середовище HAT. Прикладами таких ліній клітин мієломи є лінії клітин мієломи мишей, такі як лінії, отримані з пухлин мишей MOPC-21 і MPC-11, доступних з Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, і клітини SP-2 або X63-Ag8-653, доступні з Американської колекції типів культур, Rockville, Maryland USA. Лінії клітин мієломи людини і гетеромієломи миші-людини також були описані для отримання моноклональних антитіл людини (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Культуральне середовище, в якому вирощують клітини гібридоми, аналізують у відношенні продукції моноклональних антитіл, спрямованих проти антигену. Специфічність зв'язування моноклональних антитіл, що продукуються клітинами гібридоми, переважно визначають з допомогою імунопреципітації або аналізом зв'язування in vitro, таким як радіоімуноаналіз (РІА) або твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA). Після ідентифікації клітин гібридоми, які продукують антитіла необхідної специфічності, афінності і/або активності, клони можуть бути субклоновані способами лімітуючого розведення і вирощені стандартними способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59103 (Academic Press, 1986)). Прийнятні культуральні середовища для вказаної мети включають, наприклад, середовище D-MEM або RPMI-1640. Крім того, клітини гібридоми можуть бути вирощені in vivo у вигляді асцитних пухлин у тварини. Моноклональні антитіла, що секретуються підклонами, відповідним чином виділяють з культурального середовища, асцитної рідини або сироватки традиційними способами очищення імуноглобулінів, такими як, наприклад, хроматографія з використанням протеїну А-сефарози, гідроксилапатиту, гель-електрофорез, діаліз або афінна хроматографія. ДНК, що кодує моноклональні антитіла, легко виділяють і секвенують, використовуючи звичайні способи (наприклад, використовуючи олігонуклеотидні зонди, які здатні специфічно зв'язуватися з генами, що кодують важкі і легкі ланцюги моноклональних антитіл). Клітини гібридоми служать як джерело такої ДНК. Після виділення ДНК може бути вміщена в експресійні вектори, які потім трансфікують в клітину-хазяїна, такі як клітини E.coli, клітини COS мавпи, клітини яєчника китайського хом'яка (CHO) або клітини мієломи, які в іншому випадку не 25 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 продукують білок імуноглобуліну, щоб отримати синтез моноклональних антитіл в рекомбінантних клітинах-хазяїнах. Рекомбінантна продукція антитіл буде більш детально описана нижче. В іншому варіанті здійснення антитіла або фрагменти антитіл можуть бути виділені з фагових бібліотек антитіл, створених з використанням способів, описаних в McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) і Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) описують виділення мишачих і людських антитіл, відповідно, з використанням фагових бібліотек. У подальших публікаціях описане отримання високоафінних (нМ-діапазон) антитіл людини за допомогою перетасовування ланцюгів (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а також комбінаторної інфекції і рекомбінації in vivo як стратегія конструювання дуже великих фагових бібліотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким чином, вказані способи є прийнятними альтернативами традиційним способам на основі гібридом, що продукують моноклональні антитіла, для виділення моноклональних антитіл. ДНК також може бути модифікована, наприклад, підстановкою кодуючої послідовності константних доменів важкого і легкого ланцюгів людини замість гомологічних мишачих послідовностей (патент США № 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) або ковалентним приєднанням до послідовності, що кодує імуноглобулін, всієї або частини послідовності, що кодує неімуноглобуліновий поліпептид. Звичайно такими неімуноглобуліновими поліпептидами замінюють константні домени антитіла або ними замінюють варіабельні домени однієї антигензв'язувальної ділянки антитіла, щоб створити гібридне бівалентне антитіло, що містить одну антигензв'язувальну ділянку, що має специфічність відносно антигену, і іншу антигензв'язувальну ділянку, що має специфічність відносно іншого антигену. (iii) Гуманізовані і людські антитіла Гуманізоване антитіло містить один або більше амінокислотних залишків, введених в нього з джерела, яке відрізняється від людини. Ці відмінні від людських амінокислотні залишки часто називають "залишками, що імпортуються", які звичайно беруть з "варіабельного домену, що імпортується". Гуманізацію можна, по суті, виконати, слідуючи способу Вінтера і співавторів (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), заміною CDRs або послідовностями CDR гризунів відповідних послідовностей антитіла людини. Відповідно, такі "гуманізовані" антитіла є гібридними антитілами (патент США № 4816567), в яких значно менша частина, ніж інтактний варіабельний домен людини, була замінена відповідною послідовністю виду, який відрізняється від людини. На практиці гуманізовані антитіла звичайно являють собою антитіла людини, в яких деякі залишки CDR і, можливо, деякі залишки FR замінені залишками з аналогічних ділянок антитіл гризунів. Вибір варіабельних доменів людини як легкого, так і важкого ланцюга, антитіл, що використовуються для отримання гуманізованих, дуже важливий для зниження антигенності. Згідно з так званим способом "оптимальної підгонки" послідовність варіабельного домену антитіла гризуна піддають скринінгу в порівнянні з повною бібліотекою відомих послідовностей варіабельних доменів людини. Людську послідовність, яка найбільш близька послідовності гризуна, потім беруть як людський каркас (FR) для гуманізованого антитіла (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). В іншому способі використовують особливий каркас, отриманий з консенсусної послідовності всіх антитіл людини конкретної підгрупи легких або важких ланцюгів. Один і той же каркас можна використати для декількох різних гуманізованих антитіл (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). Крім того, важливо, щоб антитіла були гуманізовані із збереженням високої афінності відносно антигену і інших сприятливих біологічних властивостей. Для досягнення вказаної мети, по одному варіанту здійснення гуманізовані антитіла отримують, проводячи аналіз вихідних послідовностей і різних концептуальних гуманізованих продуктів з використанням тримірних моделей вихідних і гуманізованих послідовностей. Тримірні моделі імуноглобулінів загальнодоступні і відомі фахівцям в даній галузі техніки. Доступні комп'ютерні програми, які ілюструють і показують можливі тримірні конформаційні структури відібраних для дослідження послідовностей імуноглобуліну. Дослідження таких зображень дозволяє проаналізувати вірогідну роль залишків в функціонуванні відібраної для дослідження послідовності імуноглобуліну, тобто аналізувати залишки, які впливають на здатність відібраного для дослідження імуноглобуліну зв'язувати антиген, що йому відповідає. Таким чином, можуть бути відібрані і об'єднані залишки FR з реципієнтних і послідовностей, що імпортуються, так, щоб 26 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 добитися необхідних характеристик антитіла, таких як підвищена афінність відносно антигену(нів)-мішені(ней). Загалом, залишки CDR безпосередньо і в найбільшій мірі впливають на зв'язування антигену. Гуманізовані антитіла проти VEGF і їх варіанти зі зрілою афінністю описані, наприклад, в патенті США № 6884879, опублікованому 26 лютого 2005 р. У цей час можна отримувати трансгенних тварин (наприклад, мишей), які здатні після імунізації продукувати повний репертуар антитіл людини у відсутність продукції ендогенних імуноглобулінів. Наприклад, було описано, що гомозиготна делеція гену з'єднувальної області важкого ланцюга (JH) антитіла у химерних і мутантних по зародковій лінії мишей приводить до повного інгібування продукції ендогенних антитіл. Перенесення набору генів імуноглобулінів зародкової лінії людини в таких мутантних по зародковій лінії мишей повинне приводити до продукції антитіл людини при антигенній стимуляції. Див., наприклад, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); і Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Альтернативно, для отримання антитіл людини і фрагментів антитіл in vitro може бути використана методологія фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) з використанням репертуарів генів варіабельних (V) доменів імуноглобулінів від неімунізованих донорів. Згідно з вказаним методом гени V-доменів антитіл клонують в єдиній рамці зчитування з геном або основного, або мінорного білка оболонки нитчастого бактеріофагу, такого як M13 або fd, і виводять у вигляді функціональних фрагментів антитіл на поверхню фагової частинки. Оскільки нитчаста частинка містить одноланцюгову копію ДНК фагового геному, селекція на основі функціональних властивостей антитіла також приводить до селекції гену, що кодує антитіло, що виявляє такі властивості. Таким чином, фаг імітує деякі властивості В-клітини. Фаговий дисплей може бути виконаний в багатьох форматах, огляд яких наведений, наприклад, в Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Для фагового дисплея можна використати декілька джерел ділянок V-генів. Наприклад, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) виділили широкий спектр антитіл проти оксазолону з невеликої випадкової комбінаторної бібліотеки V-генів, отриманої з селезінок імунізованих мишей. Можна сконструювати репертуар V-генів неімунізованих людей-донорів і можна виділити антитіла до широкого спектра антигенів (включаючи аутоантигени), по суті слідуючи способу, описаному Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) або Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Див. також патенти США №№ 5565332 і 5573905. Як обговорювалося вище, антитіла людини також можуть бути утворені активованими in vitro В-клітинами (див. патенти США 5567610 і 5229275). Моноклональні антитіла людини проти VEGF описані в патенті США № 5730977, опублікованому 24 березня 1998 р. (iv) Фрагменти антитіл Були розроблені різні способи отримання фрагментів антитіл. Традиційно такі фрагменти отримували внаслідок протеолітичного розщеплення інтактних антитіл (див., наприклад, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) і Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однак в цей час такі фрагменти можуть безпосередньо продукуватися рекомбінантними клітинами-хазяїнами. Наприклад, фрагменти антитіл можуть бути виділені з фагових бібліотек антитіл, що обговорюються вище. Альтернативно Fab'-SH-фрагменти можуть бути безпосередньо витягнуті з клітин E.coli і хімічно зв'язані з утворенням F(ab') 2-фрагментів (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Згідно з іншим підходом F(ab') 2-фрагменти можуть бути виділені безпосередньо з культури рекомбінантних клітин-хазяїнів. Інші способи отримання фрагментів антитіл повинні бути ясні фахівцеві в даній галузі техніки. В інших варіантах здійснення переважне антитіло являє собою одноланцюговий Fv-фрагмент (scFv). Див. WO93/16185. (vi) Інші модифікації амінокислотних послідовностей Передбачається модифікація(модифікації) амінокислотної послідовності описаних в даному описі антитіл. Наприклад, може бути бажаним поліпшення спорідненості зв'язування і/або інших біологічних властивостей антитіла. Варіанти амінокислотної послідовності антитіла отримують шляхом введення відповідних нуклеотидних замін в нуклеїнову кислоту антитіла або шляхом пептидного синтезу. Такі модифікації включають, наприклад, делеції і/або вставки і/або заміни залишків в амінокислотних послідовностях антитіла. Для отримання кінцевого конструкту може бути використане будь-яке поєднання делеції, вставки і заміни, що пропонується, так, щоб кінцевий конструкт мав бажані властивості. Зміни амінокислот можуть також впливати на посттрансляційний процесинг антитіла, наприклад, змінюючи кількість або положення сайтів глікозилювання. 27 UA 109881 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Прийнятним методом для ідентифікації певних залишків або областей, які є переважними місцями для мутагенезу, служить так званий "аланіновий скануючий мутагенез", описаний Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989). В даному описі ідентифікують залишок або групу цільових залишків (наприклад, заряджених залишків, таких як arg, asp, his, lys і glu) і замінюють нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (найбільш переважно аланіном або поліаланіном) для впливу на взаємодію амінокислот з антигеном. Ті положення амінокислот, які виявляють функціональну чутливість до замін, потім уточнюють шляхом введення додаткових або інших варіантів в сайти заміни або замість них. Так, хоча сайт введення зміни в амінокислотну послідовність є заздалегідь визначеним, природа мутації як така не обов'язково приречена. Наприклад, для аналізу ефективності мутації по даному сайту проводять скануючий ala або випадковий мутагенез кодону- або області-мішені, і експресовані варіанти антитіла піддають скринінгу на бажану активність. Вставки включають приєднання до аміно- і/або карбоксильного кінця амінокислотних послідовностей, що варіюють по довжині від одного залишку до поліпептидів, що містять сто або більше залишків, а також вставку від одного до множини залишків всередині послідовності. Приклади вставок по кінцях включають антитіло з N-кінцевим залишком метіоніну або антитіло, що є гібридом з цитотоксичним поліпептидом. Інші варіанти з вставками в молекулу антитіла включають гібрид по N- або С-кінцю антитіла з ферментом (наприклад, у випадку ADEPT) або поліпептидом, який підвищує період напівжиття антитіла в сироватці. Варіант іншого типу являє собою варіант з амінокислотною заміною. Ці варіанти містять щонайменше один амінокислотний залишок в молекулі антитіла, замінений іншим залишком. Сайти, що представляють найбільший інтерес для мутагенезу з використанням замін, включають гіперваріабельні області, але передбачаються також зміни FR. Значні модифікації в біологічних властивостях антитіла завершуються відбором замін, які істотно відрізняються по своїй дії на підтримку (a) структури поліпептидного кістяка в області заміни, наприклад, у вигляді складчастої або спіральної конформації, (b) заряду або гідрофобності молекули в сайті-мішені або (с) об'єму бокового ланцюга. Амінокислоти можуть бути згруповані у відповідності зі схожістю властивостей їх бокових ланцюгів (в A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp.73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) неполярні: Ala (А), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (Р), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) незаряджені полярні: Gly (G), Ser (S), Thr (Т), Cys (С), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) кислі: Asp (D), Glu (Е) (4) основні: Lys (K), Arg (R), His(Н) Альтернативно, природні залишки можуть бути розділені на групи на основі спільних властивостей бокового ланцюга: (1) гідрофобні: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) нейтральні гідрофільні: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) кислі: Asp, Glu; (4) основні: His, Lys, Arg; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: Gly, Pro; (6) ароматичні: Trp, Tyr, Phe. Неконсервативні заміни повинні викликати заміну члена одного з цих класів членом іншого класу. Будь-який залишок цистеїну, що не бере участь в підтримці правильної конформації антитіла, також може бути замінений, звичайно серином, для поліпшення стійкості до окиснення молекули і запобігання неправильному поперечному зшиванню. І, навпаки, в антитіло може бути доданий цистеїновий зв'язок(ки) для поліпшення його стабільності (особливо тоді, коли антитіло являє собою фрагмент антитіла, такий як Fv-фрагмент). Приклад варіанту із замінами включає заміну одного або більше залишків гіперваріабельної області вихідного антитіла (наприклад, гуманізованого або людського антитіла). Загалом, відібраний варіант(и) для подальшого удосконалення повинні мати поліпшені біологічні властивості в порівнянні з вихідним антитілом, від якого вони беруть початок. Зручний шлях для створення таких варіантів із замінами включає дозрівання спорідненості з використанням фагового дисплея. Коротко, декілька сайтів гіперваріабельної області (наприклад, 6-7 сайтів) піддають мутаціям з отриманням всіх можливих амінокислотних замін по кожному сайту. Отримані таким чином варіанти антитіла виставляються однотипним чином частинками нитчастого фагу у вигляді гібридів з продуктом гену III M13, упакованого в кожну частинку. Виставлені фагом варіанти потім піддають скринінгу відносно їх біологічної активності (наприклад, спорідненість зв'язування), як розкрито в даному описі. Для ідентифікації кандидатних сайтів гіперваріабельної області для модифікації може бути зроблений аланіновий 28