Номер патенту: 113494

Опубліковано: 10.02.2017

Автори: Шеррьєр Дарла Джанін, Лакшманан Венкатачалам, Байс Харш

Є ще 17 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб підвищення засухостійкості рослини, який включає застосування щонайменше 1x106 КУО Bacillus subtilis FB17 до рослини або насінини рослини.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що включає застосування Bacillus subtilis FB17 до насінини рослини.

3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що рослина є біоенергетичною культурною рослиною.

4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що рослина є Brachypodium distachyon.

5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що рослину вибирають із групи, що складається з рослини кукурудзи, рослини сої, рослини рису, рослини томата, рослини Zinnia й ячменю.

6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що додатково включає перетворення на біопаливо біомаси рослини, до якої застосували Bacillus subtilis FB17.

7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що передбачає застосування Bacillus subtilis FBI7 до рослини рису в кількості, ефективній для одержання принаймні на приблизно 25 % більшої концентрації заліза в рослині рису у порівнянні з необробленою рослиною рису.

8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що передбачає застосування Bacillus subtilis FB17 в кількості, ефективній для інгібування інфекції рослини грибковим патогеном у порівнянні з необробленою рослиною, причому рослина являє собою рослину рису й грибковий патоген являє собою пірикуляріоз рису.

9. Спосіб за п. 7 або п. 8, який відрізняється тим, що передбачає застосування Bacillus subtilis FB17 до насінини рослини рису перед посівом.

10. Спосіб за п. 1 або п. 9, який відрізняється тим, що передбачає застосування Bacillus subtilis FB17 до насінини в кількості від приблизно 1x106 КУО/насінина до приблизно 1x108 КУО/насінина.

11. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що симптоми пірикуляріоза рису зменшують на від приблизно 5 % до приблизно 100 % у порівнянні з необробленою рослиною.

12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-11, який відрізняється тим, що кількість застосованої Bacillus subtilis FB17 становить щонайменше 5 мл В. subtilis FB17 (0,5 оптичної густини (ОГ) при довжині хвилі 600 нм)/рослина або щонайменше 1x106 КУО В. subtilis FB17/насінина.

13. Сільськогосподарський носій, який містить щонайменше 1x106 КУО Bacillus subtilis FB17.

14. Покриття насінини рослини, яке містить щонайменше 1x106 КУО Bacillus subtilis FB17.

15. Насінина рослини, на яку нанесене покриття за п. 14.

Текст

Реферат: Винахід належить до способу підвищення засухостійкості рослини за допомогою використання 6 1×10 KУО Bacillus subtilis FB17 до рослини, насінини рослини. UA 113494 C2 (12) UA 113494 C2 UA 113494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ Дана заявка заявляє пріоритет заявки з номером 61/309134, поданої 1 березня 2010 року, заявки з номером 61/414108, поданої 16 листопада 2010 року, і заявки з номером 61/416039, поданої 22 листопада 2010 року, які включені в даний документ за допомогою посилання у всій повноті та всіх відношеннях. ПОСТАНОВА ПРО ДЕРЖАВНУ ПІДТРИМКУ Дослідження, яке привело до винаходу, що розкривається, фінансувалося, зокрема, грантом Національного наукового фонду (NSF) № 0923806 і грантом NSF № IOS-0814477 при технічній підтримці дослідної польової станції Міністерства сільського господарства США у Джоржтауні, DE у Делаверському університеті. Таким чином, уряд США може мати певні права на даний винахід. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується загалом застосування стимулюючих ріст рослин ризобактерій для підсилення різні характеристики росту рослин, включаючи збільшення біомаси, підвищення засухостійкості, зменшення вмісту лігніну, збільшення проростання насіння, збільшення концентрації заліза й збільшення стійкості до патогенів. Зокрема, варіанти здійснення даного винаходу стосуються застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини. Отримані рослини можуть бути використані в одержанні біопалива, продуктів харчування або для інших цілей. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ Продовольча безпека завжди була вищим пріоритетом в усьому світі, й зростаюче занепокоєння про вплив рослинництва на навколишнє середовище робить необхідними розробку й застосування нових способів, щоб підвищити продуктивність, одночасно захищаючи навколишнє середовище. Ботаніки розробляють і впроваджують стратегії високої продуктивності культурних рослин з метою забезпечення доступності необхідної сировини зростаючому населенню світу. Однак, розвиток біопалива й поновлюваних технологій зараховують до цієї задачі, тому що вони також стали вкрай важливим пріоритетом. Тому, існує зростаюча потреба в удосконалених підходах, щоб підвищити врожайність культури в різних польових умовах. Різноманіття різних географічних середовищ і кліматів в усьому світі представляє різні типи проблем у виробі збільшеної біомаси й потенційно можливого урожаю культурних рослин. Засуха є провідним чинником, який глобально обмежує виробництво культур. Довгочасна засуха або короткочасна засуха в період вегетації можуть суттєво обмежити або навіть знищити виробництво культур. Зміни глобальних погодних умов вплинули на частоту й інтенсивність засухи навіть в основних регіонах вирощування культур у світі. Доступність поживних речовин також обмежує виробництво культур. Поповнення ґрунту поживними речовинами є дорогим та енергоємним, і навіть якщо поживні речовини доступні в достатніх кількостях, культурні рослини іноді нездатні до поглинання поживних речовин. Недостатнє поглинання важливих поживних речовин призводить до більш низьких урожаїв і до продовольчих культур з більш низькою поживною цінністю. Приміром, рис (насінина однодольних рослин Oryza sativa або Oryza glaberrima) є найважливішим основним продуктом харчування для більш ніж двох третіх населення світу, забезпечуючи значну частину споживаних калорій. Так як рис є важливим основним продуктом харчування для значної частини населення світу, виробництво рису з більшими рівнями заліза може мати значний вплив на скорочення дефіциту поживних мікроелементів в усьому світі, тому що недостача заліза являє собою одну із найбільш широко розповсюджених недостач мікроелементів серед людей у світі. Патогенне навантаження також обмежує продуктивність. Рослини повинні витрачати енергію, щоб пережити атаку патогену, і ця витрата енергії призводить до більш низьких урожаїв. Рослини також змінюють свій склад, щоб затримати розвиток хвороби, і такі зміни часто роблять переробку культур більш складною. Додатково деякі патогени культур не можуть бути ефективно обмежені ні генетичною різноманітністю, ні хімічним контролем і значно впливають на глобальне виробництво культур. Пірикуляріоз рису (Magnaporthe grisea або Magnaporthe oryzae) є патогенним грибком рослин, який викликає серйозне захворювання, що впливає на рис. Він є причиною економічно значної втрати культур щорічно, призводячи до передбачуваної 40 % урожайності культур. Пірикуляріоз рису знищує достатню кількість рису для харчування мільйонів людей в усьому світі кожний період вегетації. Так як рис є важливим основним продуктом харчування для значної частини людства, ефекти пірикуляріозу рису мають значний вплив на здоров'я людини й навколишнє середовище. Недостачі рису призводять безпосередньо до голодування людей. Пірикуляріоз рису також призводить до втрати культур і потрібне застосування додаткових 1 UA 113494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ресурсів для компенсації зменшеного урожаю. Залишається велика потреба в стратегіях, які підсилюють різні характеристики росту рослин у різноманітних умовах росту, такі як стійкість до стресу, викликаного засухою, стійкість до тиску патогенів, доступність поживних речовин і зрештою урожай культур, так щоб більші кількості продуктів харчування зі збільшеною поживністю могли бути доступні для населення світу й для інших важливих переваг, таких як одержання біопалива. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Варіант здійснення даного винаходу забезпечує спосіб одержання більшої біомаси рослини, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, насінини рослини або ґрунту, що оточує рослину або насінину рослини, у кількості, ефективній для одержання більшої біомаси рослини в порівнянні з необробленою рослиною. Інший варіант здійснення забезпечує спосіб підвищення засухостійкості рослини, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, насінини рослини або ґрунту, що оточує рослину або насінину рослини, у кількості, ефективній для підвищення засухостійкості рослини в порівнянні з необробленою рослиною. Інший варіант здійснення забезпечує спосіб одержання зниженої концентрації лігніну в рослині, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, насінини рослини або ґрунту, що оточує рослину або насінину рослини, у кількості, ефективній для одержання зниженої концентрації лігніну в рослині в порівнянні з необробленою рослиною. Інший варіант здійснення забезпечує спосіб збільшення проростання насіння рослин, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, насінини рослини або ґрунту, що оточує рослини або насіння рослин, у кількості, ефективній для підвищення проростання насіння рослин у порівнянні з необробленими рослинами. Інший варіант здійснення забезпечує спосіб одержання більшої концентрації заліза в рослині, особливо рослині рису, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, насінини рослини або ґрунту, що оточує рослину або насінину, у кількості, ефективній для одержання вищої концентрації заліза в рослині у порівнянні з необробленою рослиною. Інший варіант здійснення забезпечує спосіб інгібування росту патогенного грибка рослини й інфекції рослини, особливо рослини рису, грибковим патогеном, особливо пірикуляріозом рису, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, насінини рослини або ґрунту, що оточує рослину або насіння, у кількості, ефективній для інгібування інфекції рослини грибковим патогеном. Додаткові варіанти здійснення забезпечують сільськогосподарські носії й покриття насіння, що містять Bacillus subtilis FB17. Біомаса рослини, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, може бути перетворена в біопаливо, і отримана культура може бути використана безпечно для людини або тварини в якості їжі або в інших цілях. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР Фігура 1: Морфометричний аналіз (кількість відгалужень, кількість листків, висота пагона, маса пагона, довжина кореня, маса кореня) рослин Brachypodium distachyon (Bd2-1), оброблених B. subtilis FB17, у порівнянні з контролями. Показано, що інокуляція B. subtilis FB17 збільшує морфологію рослини. Фігура 2: Біохімічний аналіз рослин Brachypodium distachyon, оброблених B. subtilis FB17, у порівнянні з контролями, як виміряне за допомогою загального вмісту хлорофілу й каротиноїдів. Показано, що інокуляція B. subtilis FB17 позитивно впливає на здатність рослин накопичувати енергію світла. Фігура 3: Кількості B. subtilis FB17 і контролів, виділених із ґрунту й коренів Brachypodium distachyon. Це демонструє сталість асоціації з коренем B. subtilis FB17 інокульованих рослин. Фігура 4: Загальний приріст біомаси у різних видів рослин, оброблених B. subtilis FB17. Значне збільшення (~28 %) як надземної, так і кореневої біомаси спостерігається в Z. mays (MO17). Фігура 5: Кількісні дані, що відображають збільшену кореневу біомасу й біомасу пагонів у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 рослин Z. mays Mo-17. Фігура 6: Кількісні дані, що відображають збільшені кількості листків у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 рослин біоенергетичної культури Brachypodium distachyon (генотип Bd21). Фігура 7: Кількісні дані, що відображають збільшену кореневу біомасу й біомасу пагонів у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 рослин біоенергетичної культури Brachypodium distachyon (генотип Bd2-1). Фігура 8: Кількісні дані, що відображають збільшену кореневу біомасу й біомасу пагонів у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 Zinnia sp. "Red Spider". 2 UA 113494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 9: Кількісні дані, що відображають збільшену кореневу біомасу й біомасу пагонів у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 Zinnia sp. "Red Spider". Фігура 10: Загальний вміст хлорофілу в рослинах, оброблених B. subtilis FB17. Значне збільшення загального вмісту хлорофілу спостерігається у томата (14 %), Z. mays CML10 (72 %) і CML258 (87 %) після обробки FB17. Фігура 11: Загальний вміст каротиноїдів у рослинах, оброблених B. subtilis FB17. Значне збільшення загального вмісту каротиноїдів спостерігається у сої (31 %) і Z. mays MO17 (82 %) після обробки FB17. Фігура 12: Кількісні дані, що відображають підвищену фотосинтетичну ефективність у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 рослин Mo-17. Фігура 13: Кількісні дані, що відображають підвищену фотосинтетичну ефективність у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 рослин біоенергетичної культури Brachypodium distachyon (генотип Bd2-1). Фігура 14: Кількісні дані, що відображають підвищену фотосинтетичну ефективність у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 Zinnia sp. "Red Spider". Фігура 15: Кількісні дані, що відображають підвищену фотосинтетичну ефективність у підданої насіннєвій обробці B. subtilis FB17 екзотичної кукурудзи CML 10 і CML 258. Фігура 16: Підвищення процента проростання насіння, обробленого B. subtilis FB17. Значне збільшення загальної частки процента проростання спостерігається у томата (6 %), Z. mays MO17 (2,1 %) і CML258 (14 %) після обробки FB17. Зокрема, дуже збільшилося проростання екзотичної кукурудзи лінії CML258. Фігура 17: Швидкість росту в Zea mays, обробленої B. subtilis FB17. Фігура 18: Водоутримуюча здатність у рослин, оброблених B. subtilis FB17. Значне збільшення загальної водоутримуючої здатності й затримки спостерігається у томата (2,1 %) і Z. mays MO17 (3,5 %) після обробки FB17. Фігура 19: Засухостійкість у рослин, оброблених B. subtilis FB17. Значне підвищення швидкості росту при впливі засухи (відсутності води) спостерігається в MO17 після обробки FB17, тобто 37,5 % підвищення у порівнянні з підданим стресу, викликаним засухою (відсутністю води), неінокульованим обробкою контролем. Фігура 20: Насіннєва обробка B. subtilis FB17 знижує вміст лігніну в кукурудзі. Значне зменшення загального вмісту лігніну спостерігається у Z. mays (MO17=46 %; CML10=64 % і CML58=49 %) після обробки FB17 в безстресових умовах. Фігура 21: Збільшення надземної та кореневої біомаси у Oryza sativa (Nipponbare), обробленого B. subtilis FB17. Значне збільшення загальної біомаси спостерігається у O. sativa (рис; сорт Nipponbare) (більше 200 %) після обробки FB17. Фігура 22: Концентрація заліза, що спостерігалася в оброблених Bacillus subtilis FB17 рослин рису в порівнянні з необробленими рослинами рису. Ці дані показують, що інокуляція FB17 приводить до більшого урожаю культур і до більш високих концентрацій заліза у рисовому зерні. Фігура 23: Узагальнення впливів B. subtilis FB17 на різні ознаки у численних видів рослин. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Заявниками було виявлено, що штам стимулюючих ріст рослин ризобактерій (СРРР), Bacillus subtilis FB17, проявляє дивні ефекти, коли його застосовують до рослин. B. subtilis штам FB17 був спочатку виділений із коренів буряка столового в Північній Америці (див. Fall et al. 2004 System Appli. Microbiol. 27: 372-379, включений у даний документ за допомогою посилання). Цей штам був виділений із кореня буряка на основі його здатності утворювати поверхневу біоплівку й дендритний ріст. Зокрема, Bacillus subtilis FB17 забезпечив дивне збільшення біомаси у філогенетично різноманітних рослин, а також підвищену фотосинтетичну ефективність та підвищені швидкості росту в умовах засухи. Застосування Bacillus subtilis FB17 до рослин також привело до зменшеної концентрації лігніну в рослинах, що може забезпечити важливі переваги в галузі біоенергетики, тому що лігнін є однією з основних перешкод у перетворенні біомаси рослин у біопаливо. Щодо рослин рису Bacillus subtilis FB17 забезпечив дивне збільшення концентрації заліза в рисі, а також показав здатність послабляти ріст пірикуляріоза рису, грибкового патогену, який знищує культури рису в усьому світі. Даний винахід забезпечує способи збільшення біомаси, підвищення засухостійкості, зниження вмісту лігніну, підвищення проростання насіння, підвищення концентрації заліза й збільшення стійкості до патогенів у різних рослин, особливо культур рослин, таких як кукурудза, соя й рис. Даний винахід також забезпечує сільськогосподарські носії й покриття насіння, що містять Bacillus subtilis FB17. Варіант здійснення даного винаходу забезпечує спосіб одержання більшої біомаси у рослини, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, насінини рослини або 3 UA 113494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ґрунту, що оточує рослину або насінину, у кількості, ефективній для одержання більшої біомаси рослини в порівнянні з необробленою рослиною. Як використовується в даному документі, біомаса рослини стосується загальної маси рослинного матеріалу. Якщо не встановлено інше, біомаса включає як поверхневу біомасу (тобто, надземну біомасу, включаючи без обмеження стебло, листя та/або зерно), так і підземну біомасу (тобто, корені). Біомаса рослини, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, може бути виміряна згідно відомих способів. В одному варіанті здійснення біомасу рослини вимірюють згідно сухої маси (СМ) рослини в грамах. Біомаса рослини, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, може бути виміряна в момент часу, який знаходиться в проміжку від приблизно 7 днів до приблизно 100 днів, від приблизно 10 днів до приблизно 75 днів або від приблизно 15 днів до приблизно 35 днів після застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини. Альтернативно, біомаса культурної рослини, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, може бути виміряна в той час, коли рослину пожинають для збору її зерна або продукції, тобто, у той час, коли зрілу культурну рослину, таку як кукурудза, соя або рослина томата, забирають із поля. Наприклад, культурна рослина, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, згідно способу даного винаходу дає більшу кількість загальної поверхневої й підземної біомаси, як виміряне в грамах сухої маси, у кількості щонайменше приблизно на 1 %, від приблизно 5 % до приблизно 200 %, від приблизно 5 % до приблизно 100 %, від приблизно 7,5 % до приблизно 75 %, від приблизно 15 % до приблизно 60 % або від приблизно 30 % до приблизно 55 % більше, ніж необроблена рослина. В одному варіанті здійснення спосіб включає застосування Bacillus subtilis FB17 до насінини рослини перед посівом насінини в ґрунт у кількості, ефективній для одержання більшої біомаси у рослини, в кількості приблизно на 5 %-100 % більше, ніж у необробленої рослини після застосування Bacillus subtilis FB17. Наприклад, як проілюстровано на фігурі 4, збільшення приблизно на 28 % надземної та кореневої біомаси спостерігали у обробленої Bacillus subtilis FB17 кукурудзи в порівнянні з необробленою кукурудзою через 15 днів після обробки. Інший варіант здійснення даного винаходу забезпечує спосіб одержання більшої засухостійкості у рослини, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, насінини рослини або ґрунту, що оточує рослину або насінину, у кількості, ефективній для одержання більшої засухостійкості у рослини в порівнянні з необробленою рослиною. Засухою є відсутність дощу або поливу протягом періоду часу, достатнього, щоб вичерпати ґрунтову вологу й пошкодити рослини. Стрес, викликаний засухою, виникає, коли втрата води рослиною перевищує здатність коренів рослини вбирати воду, й коли вміст води в рослині знижений настільки, щоб завадити нормальним процесам у рослині. Рослина відповідає на нестачу води зупинкою росту, зменшенням фотосинтезу й іншими процесами рослини, щоб зменшити споживання води. Як використовується в даному документі, засухостійкість стосується швидкості росту рослини за добу при відсутності води, наприклад, грам за добу збільшення біомаси рослини, інокульованої Bacillus subtilis FB17, у порівнянні з необробленою рослиною. Наприклад, як проілюстровано на фігурі 19, насіння рослин кукурудзи, оброблене Bacillus subtilis FB17, при відсутності води давало приблизно на 37,5 % більшу швидкість росту за добу в порівнянні з необробленими рослинами 15 днів після обробки. В одному варіанті здійснення спосіб включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, ґрунту, що оточує рослину, або насінини рослини перед посівом насінини в ґрунт у кількості, ефективній для одержання більшої засухостійкості у рослини, в кількості щонайменше приблизно на 10 % більше ніж у необробленої рослини, після застосування вказаного Bacillus subtilis FB17. Інший варіант здійснення даного винаходу забезпечує спосіб одержання зниженої концентрації лігніну в рослині, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, насінини рослини або ґрунту, що оточує рослину або насінину, у кількості, ефективній для одержання зниженої концентрації лігніну в рослині у порівнянні з необробленою рослиною. Концентрація лігніну може бути виміряна згідно відомим способам. Наприклад, як проілюстровано на фігурі 20, рослини, оброблені Bacillus subtilis FB17, показують від приблизно 46 % до приблизно 64 % зменшення кількості лігніфікованих клітин, які спостерігали у необроблених рослин. Лігнін є невід'ємним компонентом рослин і знаходиться в стінках рослинних клітин, а також між рослинними клітинами. Лігнін є однією з основних перешкод для перетворення біомаси рослин у біопаливо. Целюлоза, інший компонент рослини, в даний час є головним джерелом для біопалива. Тоді як целюлоза легко ферментується до спирту, лігнін не перетворюється при використанні процесів ферментації, які існують, і робить екстракцію цукрів, які здатні до ферментації, складною. Тому вигідно одержати рослини, які мають знижену концентрацію лігніну. Даний винахід забезпечує біопаливо, яке одержують шляхом перетворення будь-якої з біомас рослини (наприклад, усієї біомаси рослини або будь-якої частини біомаси рослини), до якої застосовували Bacillus subtilis FB17 згідно кожному зі 4 UA 113494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 способів даного винаходу, у біопаливо. Біомаса рослини, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, може бути перетворена в біопаливо будь-яким відомим способом, таким як ферментація цукрових компонентів рослини. Інший варіант здійснення даного винаходу забезпечує спосіб підвищення швидкості проростання насіння у рослин, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослин, насіння рослин або ґрунту, що оточує рослини або насіння рослин, у кількості, ефективній для підвищення проростання насіння рослин у порівнянні з необробленими рослинами. Наприклад, як проілюстровано на фігурі 16, підвищення загальних процентів проростання спостерігали у томата й рослин кукурудзи після застосування Bacillus subtilis FB17. Інший варіант здійснення даного винаходу забезпечує спосіб одержання більшої концентрації заліза у рослині, особливо рослині рису, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, насінини рослини або ґрунту, що оточує рослину або насінину, у кількості, ефективній для одержання більшої концентрації заліза в рослині у порівнянні з необробленою рослиною. Оскільки недостача заліза є однією з найбільш широко розповсюджених недостач мікроелементів у людей, і рис є найбільш важливим основним продуктом харчування для великої частини населення світу, рослини рису, отримані згідно способам даного винаходу, можуть забезпечити важливі поживні переваги в усьому світі. Концентрація заліза в рослині, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, може бути виміряна згідно відомим способам, включаючи атомно-емісійну спектрометрію з індуктивно зв'язаною плазмою (ICP-AES), масспектрометрію з індуктивно зв'язаною плазмою (ICP-MS) або інші стандартні способи. В одному варіанті здійснення концентрація заліза рослини вимірюється згідно міліграмам заліза на кілограм сухої маси рослини. Як проілюстровано на фігурі 22, збільшення вмісту заліза приблизно на 81 % спостерігали в оброблених FB17 рослин рису у порівнянні з необробленими рослинами, як виміряне в мг заліза на кг сухої маси рослини. Придатні рослини рису для застосування в даному винаході включають Oryza sativa, Oryza glaberrima і всі підвиди й сорти такого. Концентрація заліза рослини рису, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, може бути виміряна в той час, коли рис пожинають для збору його зерна або продукції, тобто в той час, коли зрілі рисові зерна забирають із поля. Альтернативно, концентрація заліза рослини рису, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, може бути виміряна в момент часу, наприклад, від приблизно одного тижня до приблизно п'яти місяців, переважно приблизно в три місяці після застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини рису. Рослина рису, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, згідно способу даного винаходу дає більшу кількість заліза, як виміряно, наприклад, у грамах заліза на грам сухої маси поверхневої й підземної біомаси рослини рису. Наприклад, рослина рису, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, згідно способу даного винаходу дає більшу кількість заліза в сухій масі поверхневої й підземної біомаси рослини рису в кількості, яка становить щонайменше приблизно на 5 %, від приблизно 10 % до приблизно 200 %, від приблизно 25 % до приблизно 150 %, від приблизно 50 % до приблизно 100 %, від приблизно 70 % до приблизно 90 %, від приблизно 75 % до приблизно 85 %, або приблизно на 80 % більше, ніж необроблена рослина. Наприклад, в одному варіанті здійснення спосіб включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рисової насінини перед посівом рисової насінини в ґрунт у кількості, ефективній для одержання більшої концентрації заліза у рослині рису, у кількості щонайменше приблизно на 25 % більше, ніж у необробленій рослині, після введення зазначеного Bacillus subtilis FB17. Інший варіант здійснення даного винаходу забезпечує спосіб інгібування інфекції рослини грибковим патогеном, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, насінини рослини або ґрунту, що оточує рослину або насінину, у кількості, ефективній для інгібування інфекції рослини грибковим патогеном у порівнянні з необробленою рослиною. Приклади рослин включають рослини рису і ячменю, такі як сорт рису Nipponbare. В особливому варіанті здійснення даний винахід забезпечує способи для інгібування інфекції рослини рису грибковим патогеном, особливо пірикуляріозом рису, який включає застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини рису, насінини рослини рису або ґрунту, що оточує рослину рису або насінину, у кількості, ефективній для інгібування інфекції рослини рису грибковим патогеном у порівнянні з необробленою рослиною рису. Як використовується в даному документі, "пірикуляріоз рису" стосується фітопатогенних грибів Magnaporthe grisea або Magnaporthe oryzae. Симптоми пірикуляріоза рису включають пошкодження або плями (які можуть бути, наприклад, білими або сірими), що утворюються на будь-якій частині рослини, особливо на надземних або поверхневих частинах рослини, таких як листя. Як використовується в даному документі, "інгібування інфекції" стосується виникнення ослабленої грибкової інфекції у рослини рису, як виміряно шляхом зменшення симптомів грибкової інфекції, наприклад, зменшуваною 5 UA 113494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кількістю пошкоджень на надземних частинах рослини рису в порівнянні з необробленою рослиною або зменшуваним розміром деяких або всіх пошкоджень. Наприклад, в особливих варіантах здійснення Bacillus subtilis FB17 застосовують до рослини рису, насінини рослини рису або ґрунту, що оточує рослину рису або насінину, у кількості, ефективній для зменшення кількості пошкоджень на рослині рису, викликаних пірикуляріозом рису, від приблизно 5 % до приблизно 100 %, від приблизно 10 % до приблизно 80 %, від приблизно 20 % до приблизно 60 % або від приблизно 25 % до приблизно 45 % у порівнянні з необробленою рослиною рису. Не будучи зв'язаним з будь-якою теорією, вважається, що B. subtilis FB17 утворює протигрибкову летку сполуку, яка послаблює або інгібує ріст M. оryzae. В особливих варіантах здійснення, щоб інгібувати ріст пірикуляріоза рису й інфекцію рослини рису, до насінини рису 7 застосовують Bacillus subtilis FB17 у кількості від приблизно 1×10 KУО/насіння до приблизно 9 8 1×10 KУО/насіння, більш переважно приблизно 1×10 KУО/насіння, а потім насінину висівають у ґрунт. Як використовується в даному документі, "необроблена рослина" стосується рослини того самого виду й вирощеної по суті за тих самих умов (наприклад, протягом тієї самої кількості часу, у тому самому кліматі і культивованій згідно тим самим способам, застосовуючи ті ж самі матеріали, з біомасою, засухостійкістю, концентрацією лігніну, концентрацією заліза, грибковою інфекцією й іншими параметрами, вимірюваними згідно тим самим способам), що й рослина, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, згідно способу даного винаходу, за винятком того, що до необробленої рослини не застосовували Bacillus subtilis FB17. Як використовується в даному документі, характеристика рослини, до якої застосовували Bacillus subtilis FB17, така як більша біомаса, більша засухостійкість, знижена концентрація лігніну, більша концентрація заліза або зменшена грибкова інфекція, в порівнянні з необробленою рослиною стосується більшої біомаси, більшої засухостійкості, зниженої концентрації лігніну, більшої концентрації заліза або зменшеної грибкової інфекції, як виміряно в той самий момент часу, відповідно. У певних варіантах здійснення способів, описаних у даному документі, Bacillus subtilis FB17 застосовують до насінини в кількості від приблизно 1 мл/кг інокулята Bacillus subtilis FB17 (тобто, 1 мл/кг 0,5 оптичної густини (ОГ) Bacillus subtilis FB17, вирощеного за ніч у середовищі LB, як виміряно із застосуванням спектрофотометра Smartspec Bio Rad при довжині хвилі 600 нм) до приблизно 50 мл/кг, переважно від приблизно 5 мл/кг до приблизно 25 мл/кг, більш переважно від приблизно 10 мл/кг до приблизно 15 мл/кг, найбільш переважно приблизно 12,5 мл/кг. В альтернативних варіантах здійснення Bacillus subtilis FB17 застосовують до насінини в 6 9 кількості від приблизно 1×10 KУО/насінина до приблизно 1×10 KУО/насінина, більш переважно 7 8 від приблизно 1×10 KУО/насінина до приблизно 1×10 KУО/насінина. Способи даного винаходу можна застосовувати для обробки багатьох типів рослин (а також їх насіння або навколишнього ґрунту), щоб збільшити біомасу, підвищити засухостійкість, знизити вміст лігніну, підвищити проростання насіння, збільшити концентрацію заліза й підвищити стійкість до патогенів. Рослини можуть включати однодольні або дводольні. Зокрема, рослини можуть включати культури, такі як кукурудза, соя, томат, рис або ячмінь. Додаткові приклади рослин, які можна обробляти згідно способам даного винаходу, включають Arabidopsis thaliana і Zinnia, а також біоенергетичні культурні рослини, тобто, рослини, які в даний час використовують або мають потенціал бути використовуваними в якості джерел біоенергії (наприклад, рослини, які корисні у виробництві біопалива), такі як Brachypodium distachyon. Згідно даному винаходу Bacillus subtilis FB17 можна застосовувати до рослини будь-яким відомим способом, де обробляють усю рослину або частину рослини, наприклад, кореневою, насіннєвою або листяною інокуляцією. Наприклад, Bacillus subtilis FB17 можна застосовувати до надземних частин рослини, таких як листки й стебло, до коренів рослини, до насінини рослини перед посівом насінини в ґрунт, або до ґрунту, що оточує рослину або насінину рослини. Способи застосування включають зрошення, розпилення, покриття, ін'єкцію або інші способи, відомі фахівцям у даній галузі. Як використовується в даному документі, застосування Bacillus subtilis FB17 стосується кожного з однократного застосування, багаторазового застосування (тобто, застосування Bacillus subtilis FB17 більше ніж один раз) або безперервного застосування. Bacillus subtilis FB17 можна застосовувати в будь-який момент життєвого циклу рослини (наприклад, до або після проростання). Наприклад, Bacillus subtilis FB17 можна застосовувати до насінини рослини перед посівом насінини в ґрунт і до проростання. Альтернативно Bacillus subtilis FB17 можна застосовувати до рослини, насінини рослини або ґрунту, що оточує рослину, після того, як відбулося проростання. Після застосування Bacillus subtilis FB17 насіння може бути висіяне в ґрунт і культивоване із застосуванням звичайних способів для генерування росту рослини. 6 UA 113494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно варіантам здійснення даного винаходу Bacillus subtilis FB17 можна застосовувати до рослини, насінини рослини або ґрунту як окремо, так і в суміші з іншими матеріалами. Наприклад, Bacillus subtilis FB17 можна застосовувати в складі, який складається по суті з Bacillus subtilis FB17 у живильному середовищі без будь-яких додаткових добавок або матеріалів. Альтернативно Bacillus subtilis FB17 можна застосовувати в складі, який включає Bacillus subtilis FB17 у живильному середовищі, носій, такий як вода, водний розчин або порошок. Живильне середовище, носій, водний розчин або порошок можуть містити додаткові добавки, такі як інсектицид або фунгіцид. Альтернативно Bacillus subtilis FB17 можна застосовувати нарізно з іншими добавками або матеріалами, застосовуваними в різний час. У визначених варіантах здійснення Bacillus subtilis FB17 застосовують у складі, який включає Bacillus subtilis FB17 у кількості від приблизно 1 мл/кг (тобто, 1 мл/кг 0,5 оптичної густини (ОГ) Bacillus subtilis FB17, вирощеного за ніч у середовищі LB, як виміряне із застосуванням спектрофотометра Smartspec Bio Rad при довжині хвилі 600 нм) до приблизно 50 мл/кг, переважно від приблизно 5 мл/кг до приблизно 25 мл/кг, більш переважно від приблизно 10 мл/кг до приблизно 15 мл/кг, найбільше переважно приблизно 12,5 мл/кг. В альтернативних варіантах здійснення Bacillus subtilis FB17 застосовують у складі, який включає Bacillus subtilis 6 9 FB17 у кількості від приблизно 1×10 KУО/насінина до приблизно 1×10 KУО/насінина, більш 7 8 переважно від приблизно 1×10 KУО/насінина до приблизно 1×10 KУО/насінина. Даний винахід додатково забезпечує сільськогосподарські носії, що включають Bacillus subtilis FB17, які можна застосовувати до рослин (наприклад, коренів), до ґрунту, що оточує рослини, або до насіння перед посівом, а також покриття насіння, що включають Bacillus subtilis FB17, які можна застосувати до насіння рослин. Даний винахід також забезпечує насінину рослини, переважно насінину культурної рослини (наприклад, насінину рослини кукурудзи, рослини сої, рослини рису, рослини томата або біоенергетичної культури, такої як Brachypodium distachyon), яка покрита Bacillus subtilis FB17 так, що вся насінина або частина насінини має покриття або плівку, що включає Bacillus subtilis FB17. Сільськогосподарський носій може включати Bacillus subtilis FB17 у кількості від приблизно 1 мл/кг інокулята Bacillus subtilis FB17 (тобто, 1 мл/кг 0,5 оптичної густини (ОГ) Bacillus subtilis FB17, вирощеного за ніч у середовищі LB, як виміряне із застосуванням спектрофотометра Smartspec Bio Rad при довжині хвилі 600 нм) до приблизно 50 мл/кг, від приблизно 5 мл/кг до приблизно 25 мл/кг, від приблизно 10 мл/кг до приблизно 15 мл/кг або приблизно 12,5 мл/кг. Покриття насінини може включати Bacillus 6 8 subtilis FB17 у кількості від приблизно 1×10 KУО/насінина до приблизно 1×10 KУО/насінина, 7 більш переважно приблизно 1×10 KУО/насінина. Сільськогосподарський носій і покриття насінини можуть кожний складатися по суті з Bacillus subtilis FB17 у живильному середовищі без будь-яких додаткових добавок або матеріалів. Альтернативно, сільськогосподарський носій і покриття насінини можуть кожний включати Bacillus subtilis FB17 у живильному середовищі, такому як вода, водний розчин або порошок. Живильне середовище, водний розчин або порошок можуть містити додаткові добавки, такі як інсектицид або фунгіцид. У даного винаходу є як основне, так і прикладне застосування. У широкому розумінні можна застосовувати способи, описані в даному документі, для збільшення біомаси (наприклад, в альтернативних видах рослин, використовуваних для біопалива, або для впливу на потенційно можливий урожай культурних рослин) і надання підвищеної засухостійкості. У порівнянні з трансгенними підходами такі способи безпосередньо застосовні до будь-якої рослини, без часу, необхідного для генної ідентифікації, генерації й характеристики трансгенних ліній, і являються незалежними від нормативних і соціальних питань, пов'язаних із застосуванням трансгенів. У порівнянні з використанням традиційних агрономічних прийомів (застосуваннями хімічних добрив і води) способи, описані в даному винаході, являються менш ресурсномісткими й трудомісткими для фермера й більш нешкідливими для навколишнього середовища. Крім того, застосування хімічних добрив, як відомо, підсилює чутливість культури до хвороби індукцією швидко ослабленого росту, тоді як рослини, вирощені за даним способом, не демонструють підвищеної чутливості до хвороб. У порівнянні з іншими ризобактеріями, які застосовують для обробки насіння, FB17 передбачає малі інокуляти для надання вигідних результатів. Нарешті, такі способи сумісні з практиками органічного землеробства, тоді як інші способи, описані вище (наприклад, застосування хімічних добрив), - ні. Депонування B. subtilis штаму FB17 було доступне з 1 березня 2010 в Delaware Biotechnology Institute, 15 Innovation way, Room # 145, Newark, DE 19711. Депонування B. subtilis штаму FB17 буде здійснюватися з Американською колекцією типових культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 США. Доступ до цього задепонованого штаму ATCC буде можливий під час перебування заявки на розгляді спеціальному уповноваженому по патентам і торговим маркам і особам, обраним спеціальним уповноваженим бути 7 UA 113494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 правомочними окрім нього за вимогою. Депонований штам буде підтримуватися в депозитарії ATCC, який є громадським депозитарієм, протягом 30 років або 5 років після самого останнього запиту, або протягом терміну дії патенту, що має законну силу, ,залежно від того, який довше, і буде відновлений, якщо стане нежиттєздатним під час цього періоду. Депонований штам буде доступний, як вимагається іноземними патентними правами, в країнах, у яких подані аналоги заявок по такому ж об'єкту, або його оновлені версії. Далі, об'єкт депонування буде зберігатися й буде доступний громадськості відповідно до положень Будапештської угоди закладки мікроорганізмів, тобто, він буде зберігатися з усією необхідною обережністю, щоб підтримувати його життєздатним і неконтамінованим протягом щонайменше п'яти років після самого останнього запиту стосовно надання зразка депонування, але в будь-якому випадку, протягом щонайменше тридцяти (30) років після дати депонування або стосовно терміну дії будь-якого патенту, що має законну силу, у якому можуть опублікувати розкриття культури. Наступні приклади забезпечені для опису даного винаходу більш детально й призначені для ілюстрування без обмеження даного винаходу. "UD10-22", як зазначено на деяких фігурах, описаних нижче, стосується Bacillus subtilis FB17. ПРИКЛАДИ Приклад 1 Brachypodium distachyon і рослини кукурудзи пророщували й вирощували протягом 21 дня. Один раз в 5 днів (3 рази) додавали по 5 мл 0,5 ОП B. subtilis FB17 на вегетаційну посудину. Для контролю додавали 5 мл 0,5 ОП E. coli OP50 на вегетаційну посудину. FB17 і OP50 вирощували протягом ночі в живильному середовищі LB й оптичну густину (ОГ) одержували з використанням спектрофотометра Smartspec (Bio Rad) при довжині хвилі (600 нм). Через десять днів після останньої обробки рослини піддавали аналізу. Контролі, описані у всіх експериментах у даному документі, стосуються рослин, які не обробляли бактеріями або які обробляли E. coli OP50. Brachypodium distachyon (Bd2-1) і рослини кукурудзи, оброблені B. subtilis FB17, бактеріальний контроль по E. сoli, або фіктивна обробка, вирощували в 4×4 дюймових вегетаційних посудинах при стандартних умовах (22-25 °C, 60 % вологість, 16 год. світловий – 8 год. темновий фотоперіод) протягом 30 днів після обробки. Надземна й коренева біомаса енергетичної культури B. distachyon збільшилася у випадку обробки FB17. На фігурі 1 показано, що біомаса B. distachyon, обробленого FB17, була збільшена на статистичному рівні. На фігурі 2 відображене збільшення фотосинтетичної ефективності, яку спостерігали в B. distachyon, що пройшов обробку FB17. B. distachyon, оброблений FB17, містив більше хлорофілу й більший загальний вміст каротиноїдів, ніж контролі, показуючи сильну життєздатність рослини. На фігурі 3 показані кількості FB17, виділені із ґрунту, що оточує коріння B. distachyon. На фігурі показано, що FB17 зв'язана набагато сильніше з коренями B. distachyon у порівнянні з E. coli, говорячи про дійсну ризобактеріальну природу FB17. Рослини кукурудзи також показали збільшення надземної й кореневої біомаси після 30 денного росту після обробки B. subtilis FB17, бактеріальний контроль по E. coli OP50 або такий, що імітує обробку. Приклад 2 Насіння Arabidopsis thaliana пророщували й вирощували протягом 21 дня. Один раз в 5 днів (3 рази) додавали 5 мл 0,5 ОП B. subtilis FB17 на вегетаційну посудину. Для контролю додавали 5 мл 0,5 ОП E. coli OP50 на вегетаційну посудину. FB17 і OP50 вирощували протягом ночі в живильному середовищі LB й оптичну густину (ОГ) одержували з використанням спектрофотометра Smartspec (Bio Rad) при довжині хвилі (600 нм). Через десять днів після останньої обробки рослини піддавали засусі (тобто, не додавали воду) при 25 °C з 40 % вологістю протягом 4 тижнів. Через тридцять днів після обробки, засуху оцінювали по втраті стоячого зеленого фенотипу в необроблених рослинах у порівнянні з обробленими FB17 рослинами, указуючи на те, що FB17 надає підвищену засухостійкість Arabidopsis. Приклад 3 Обробка насінини B. subtilis FB17 сприяє збільшенню біомаси у кукурудзи Mo17, CML258, CML10, Zinnia і Brachypodium distachyon. Для перевірки впливу B. subtilis FB17 на збільшення біомаси у кукурудзи (Mo17, CML258, CML10), сої (Will-82), томата (Solanum lycopersicum), Zinnia і Brachypodium distachyon (модель енергетичної культури) здійснювали насіннєву обробку 50 насінин (n=50) кожного виду рослин 7 B. subtilis FB17 (приблизно 1×10 KУО/насінина або 12,5 мл/кг 0,5 оптичної густини (ОГ) Bacillus subtilis FB17, вирощеного за ніч у середовищі LB, як виміряне із застосуванням спектрофотометра Smartspec Bio Rad при довжині хвилі 600 нм). Після насіннєвої обробки 8 UA 113494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 насіння окремо висівали у вегетаційні посудини (4×4 дюйма) із ґрунтовою сумішшю для вивчення проростання й біомаси. Цікаво, що обробка насінини B. subtilis FB17 сприяла росту кореня й пагона в усіх досліджуваних видах культур. Вимірювання проводили 15 днів після обробки. Насіннєва обробка рослин сприяла збільшеній кореневій біомасі, що привело до більш густих кореневих систем, а не до збільшеної довжини кореня. Більш густа коренева система виникає з доданих бічних коренів і кореневих волосків, що забезпечують більш доступне поглинання води й поживних речовин. Zea mays var. CML258 мала своїм результатом приблизно 16 % збільшення надземної біомаси (г СМ) у порівнянні з контролем. Zea mays var. CML10 мала своїм результатом приблизно 9 % збільшення надземної біомаси (г СМ) у порівнянні з контролем. Zea mays var. Mo-17 мала своїм результатом приблизно 38 % збільшення надземної біомаси (г СМ) у порівнянні з контролем. Brachypodium мав своїм результатом приблизно 40 % надземної біомаси (г СМ) у порівнянні з контролем. Значне збільшення приблизно на 28 % загальної надземної й кореневої біомаси спостерігали у Z. mays (MO17) у порівнянні з контролем. На фігурі 4 проілюстрований загальний приріст біомаси у рослин, оброблених B. subtilis FB17. На фігурі 5 показані кількісні дані, що відображають збільшену кореневу біомасу й біомасу пагонів у минулих насінну обробку B. subtilis FB17 рослин Mo-17. На фігурі 6 показані кількісні дані, що відображають збільшені кількості листків у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 рослин біоенергетичної культури Brachypodium distachyon (генотип Bd2-1). На фігурі 7 показані кількісні дані, що відображають збільшену кореневу біомасу й біомасу пагонів у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 рослин біоенергетичної культури Brachypodium distachyon (генотип Bd2-1). На фігурах 8 і 9 показані кількісні дані, що відображають збільшену кореневу біомасу й біомасу пагонів у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 Zinnia sp. "Red Spider". Приклад 4 Насіннєва обробка B. subtilis FB17 сприяє фотосинтетичній ефективності у кукурудзи й томата. Для перевірки впливу B. subtilis FB17 на фотосинтетичну ефективність у кукурудзи (Mo17, CML258, CML10), сої (Will-82), томата (Solanum lycopersicum), Zinnia і Brachypodium (модель енергетичної культури) здійснювали насіннєву обробку 50 насінин (n=50) кожного виду рослин B. subtilis FB17 (12,5 мл/кг або 1e7 KУО/насінина). Листки через 15-32 дні після обробки збирали й піддавали аналізу на загальний вміст хлорофілу. Результати показали, що інокульовані B. subtilis FB17 рослини кукурудзи й томатів (лінії томатів і екзотичні лінії кукурудзи CML258 і CML10) показали збільшений вміст хлорофілу й каротиноїдів у порівнянні з необробленими зразками, як відображено на фігурах 10 і 11. Збільшені значення загального вмісту хлорофілу мають потенціал сприяти підвищеній міцності й біомасі, як спостерігається з CML258 і CML10. Загальний вміст хлорофілу в інокульованому насіння томатів B. subtilis FB17 мало своїм результатом збільшення приблизно на 14 %. Ще більш значними являються екзотичні лінії кукурудзи CML258 і CML10 зі збільшенням приблизно на 87 % і збільшенням приблизно на 72 %, відповідно. Хоча має місце збільшення загального вмісту хлорофілу, це не означає, що загальний вміст каротиноїдів буде також відповідати збільшеному значенню. В інокульованих B. subtilis FB17 томатів і Zinnia був значно знижений загальний процент каротиноїдів у порівнянні з необробленим насінням. У кукурудзи CML258 і CML10 були значно збільшені загальні проценти каротиноїдів, у той час як соя, кукурудза Mo17 і Brachypodium не показали статистично достовірну різницю між обробленим та необробленим насінням. На фігурі 12 показані кількісні дані, що відображають підвищену фотосинтетичну ефективність у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 рослин Mo-17. На фігурі 13 показані кількісні дані, що відображають підвищену фотосинтетичну ефективність у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 рослин біоенергетичної культури Brachypodium distachyon (генотип Bd21). На фігурі 14 показані кількісні дані, що відображають підвищену фотосинтетичну ефективність у підданих насіннєвій обробці B. subtilis FB17 Zinnia sp. "Red Spider". На фігурі 15 показані кількісні дані, що відображають підвищену фотосинтетичну ефективність у підданої насіннєвій обробці B. subtilis FB17 екзотичної кукурудзи CML 10 і CML 258. Приклад 5 Насіннєва обробка B. subtilis FB17 сприяє проростанню рослин кукурудзи й томатів. Для перевірки впливу B. subtilis FB17 на збільшення процента проростання у кукурудзи (Mo17, CML258, CML10), сої (Will-82), томатів (Solanum lycopersicum), Zinnia і Brachypodium (модель енергетичної культури) здійснювали насіннєву обробку 50 насінин (n=50) кожного виду рослин B. subtilis FB17 (12,5 мл/кг або 1e7 KУО/насінина). Останні проценти проростання 9 UA 113494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 оцінювали 8 днів після дати посіву. Результати показали, що обробка B. subtilis FB17 сприяє статистично достовірній відповіді проростання у томатів і кукурудзи, як показано на фігурі 16. Оброблене B. subtilis FB17 насіння томатів і екзотичної кукурудзи лінії CML 258 мали 5,9 % і 14 % збільшення процента проростання, відповідно. Насіннєва обробка B. subtilis FB17 мала нейтральний і позитивний ефекти щодо всіх протестованих видів культур. Якщо застосовували насіннєву обробку, статистично негативної відповіді щодо процента проростання не було. Приклад 6 Для перевірки впливу B. subtilis FB17 на кукурудзу (Mo17, CML258, CML10), сою (Will-82), томати (Solanum lycopersicum), Zinnia і Brachypodium (модель енергетичної культури) здійснювали насіннєву обробку 50 насінин (n=50) кожного виду рослин B. subtilis FB17 (1e7 KУО/насінина або 12,5 мл/кг 0,5 оптичної густини (ОГ) Bacillus subtilis FB17, вирощеного за ніч у середовищі LB, як виміряне із застосуванням спектрофотометра Smartspec Bio Rad при довжині хвилі 600 нм). Після насіннєвої обробки насіння окремо висівали у вегетаційні посудини (4×4 дюйма). Вимірювання проводили через 15 днів після обробки. На фігурі 17 показана швидкість росту Zea mays після обробки B. subtilis FB17. На фігурі 18 показана водоутримуюча здатність у рослин, оброблених B. subtilis FB17. Значне збільшення загальної водоутримуючої здатності й затримки спостерігали у томатів (2,1 %) і Z. mays MO17 (3,5 %) після обробки FB17. На фігурі 19 показана засухостійкість рослин, оброблених B. subtilis FB17. Значне підвищення швидкостей росту при впливі засухи спостерігали в MO17 (37,5 % збільшення відносно не обробленого водою контролю) після обробки FB17. На фігурі 20 показано, що насіннєва обробка B. subtilis FB17 знижує вміст лігніну в кукурудзі. Значне зниження загального вмісту лігніну спостерігали у Z. mays (приблизно 46 % зниження у MO17; приблизно 64 % зниження у CML10 і приблизно 49 % зниження у CML58) після обробки FB17. Приклад 7 На фігурі 21 показано збільшення надземної й кореневої біомаси у рослин рису, Oryza sativa (Nipponbare), оброблених B. subtilis FB17, через 60 днів після інокуляції. Нічні культури FB17, 8 вирощені в LB, використовували для створення інокулята 10 клітин на мл. Чотиритижневі рослини рису (сорт Nipponbare), вирощені методом гідропоніки, використовували для додавання FB17. Рослини рису, до яких застосовували B. subtilis FB17, показали приблизно 200 % збільшення біомаси у порівнянні з необробленими рослинами рису. Приклад 8 Щоб оцінити, чи колонізує Bacillus subtilis FB17 корені рису, рослини рису (сорт Nipponbare) інокулювали Bacillus subtilis FB17 і корені рослин рису оглядали через 96 годин після інокуляції шляхом лазерної скануючої конфокальної мікроскопії. Спостереження підтвердили, що корисні ризобактерії (Bacillus subtilis FB17) утворюють біоплівку у рослин. Зокрема, дані показують, що Bacillus subtilis FB17 успішно колонізує корені рису після 96 годин від обробки, указуючи на те, що корені рису сприяють колонізації корисними мікробами. Щоб оцінити, чи спричиняє ризобактеріальна обробка рослин рису будь-які зміни в продиховій апертурі, заявники піддали аналізу рослини рису, оброблені ризобактеріями. Результати показали, що ризобактеріальна обробка рису Bacillus subtilis FB17 сильно зменшила продихову апертуру в оброблених рослин рису (сорт Nipponbare). У випадку обробки Bacillus subtilis FB17 замикальні клітини оглядали через 1 тиждень після додавання Bacillus subtilis FB17. Такі результати наводять на думку, що B. subtilis FB17 (Bacillus subtilis FB17) спричиняє загальну відповідь закритості продихів як у однодольних, так і у дводольних рослин, як доведено і з A. thaliana, і з рисом. Щоб оцінити, чи послаблює Bacillus subtilis FB17 ріст пірикуляріоза рису, заявники піддали Magnaporthe oryzae культурам Bacillus subtilis FB17. Чашки для якісного виділення й кількісні дані показали, що Bacillus subtilis FB17 знизили ріст M. оryzae, як показано зниженим радіальним ростом у грибкової культури, підданої дії Bacillus subtilis FB17. Порівняння з контролями (TY і LB) показує ступінь, до якого патоген виріс би без обробки. Як показано в таблиці 1, Bacillus subtilis FB17 затримує ріст M. oryzae на приблизно 25 % in vitro. Такі результати припускають наводять на думку, що B. subtilis FB17 виробляє протигрибкову летку сполуку, яка може послабити або інгібувати ріст M. oryzae. 55 10 UA 113494 C2 Таблиця 1 Обробка TY контроль LB контроль Bacillus subtilis FB17 5 Середній діаметр грибкової колонії (см) 3,175 3,098 2,342 Процент грибкового росту відносно контрольної обробки 100 100 75,59 Bacillus subtilis FB17 індукував системну опірність у рисі і ячмені до Magnaporthe oryzae. Як у рослин рису, так і рослин ячменю, підданих M. Oryzae, зменшилось утворення пошкоджень на листках рису і сім'ядолях ячменю, відповідно, FB 17-оброблених рослин у порівнянні з контролями, як показано в таблиці 2 ("інфікований" визначали як листок, що має щонайменше одне типове ромбовидне пошкодження шкідника на ньому). Таблиця 2 Нічого/Mo FB17/Mo 10 15 20 25 30 # інфіковані листки 3 5 Усього # пошкоджень 23 13 Приклад 9 Щоб оцінити, чи збільшує Bacillus subtilis FB17 збагачення залізом рису, заявники проаналізували загальний вміст заліза у листках рису, коренях і зернах рослин, яким додавали Bacillus subtilis FB17, використовуючи атомно-емісійну спектрометрію з індуктивно зв'язаною плазмою (ICP-AES). Результати показали, що добавка Bacillus subtilis FB17 до рису допомагає мобілізовувати залізо в рослині, тобто, важливий елемент-залізо активне поглинається рослиною, де він використовується для росту і розвитку рослини. Як показано на фігурі, збільшення вмісту заліза на 22, 81 % спостерігали у FB 17-оброблених рослин рису в порівнянні з необробленими контролями, як виміряне в мг заліза на кг сухої маси рослини ("UD1022,” як установлено на фігурі 1, стосується Bacillus subtilis FB17). Таким чином, застосування Bacillus subtilis FB17 до рослини, особливо до рослини рису, може суттєво підвищити поживну цінність продукту харчування шляхом збільшення концентрації заліза в продукті харчування. Фігура 23 узагальнює впливи B. subtilis FB17 на різні ознаки в численних видах рослин, описаних вище. Незважаючи на те, що даний винахід був описаний у поєднанні з певними варіантами здійснення, має бути зрозумілим, що винахід, як заявлено, не повинен бути надмірно обмеженим такими визначеними варіантами здійснення. Дійсно, різні модифікації й варіації описаних складів і способів даного винаходу будуть очевидні для фахівців у даній галузі й призначені перебувати в обсязі формули винаходу, що додана. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 6 35 40 45 1. Спосіб підвищення засухостійкості рослини, який включає застосування щонайменше 1×10 KУО Bacillus subtilis FB17 до рослини або насінини рослини. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що включає застосування Bacillus subtilis FB17 до насінини рослини. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що рослина є біоенергетичною культурною рослиною. 4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що рослина є Brachypodium distachyon. 5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що рослину вибирають із групи, що складається з рослини кукурудзи, рослини сої, рослини рису, рослини томата, рослини Zinnia й ячменю. 6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що додатково включає перетворення на біопаливо біомаси рослини, до якої застосували Bacillus subtilis FB17. 7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що передбачає застосування Bacillus subtilis FBI7 до рослини рису в кількості, ефективній для одержання принаймні на приблизно 25 % більшої концентрації заліза в рослині рису у порівнянні з необробленою рослиною рису. 8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що передбачає застосування Bacillus subtilis FB17 в кількості, ефективній для інгібування інфекції рослини грибковим патогеном у порівнянні з необробленою рослиною, причому рослина являє собою рослину рису й грибковий патоген являє собою пірикуляріоз рису. 11 UA 113494 C2 5 10 9. Спосіб за п. 7 або п. 8, який відрізняється тим, що передбачає застосування Bacillus subtilis FB17 до насінини рослини рису перед посівом. 10. Спосіб за п. 1 або п. 9, який відрізняється тим, що передбачає застосування Bacillus subtilis 6 8 FB17 до насінини в кількості від приблизно 1×10 KУО/насінина до приблизно 1×10 KУО/насінина. 11. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що симптоми пірикуляріоза рису зменшують на від приблизно 5 % до приблизно 100 % у порівнянні з необробленою рослиною. 12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-11, який відрізняється тим, що кількість застосованої Bacillus subtilis FB17 становить щонайменше 5 мл В. subtilis FB17 (0,5 оптичної густини (ОГ) при довжині 6 хвилі 600 нм)/рослина або щонайменше 1×10 KУО В. subtilis FB17/насінина. 6 13. Сільськогосподарський носій, який містить щонайменше 1×10 KУО Bacillus subtilis FB17. 6 14. Покриття насінини рослини, яке містить щонайменше 1×10 KУО Bacillus subtilis FB17. 15. Насінина рослини, на яку нанесене покриття за п. 14. 12 UA 113494 C2 13 UA 113494 C2 14 UA 113494 C2 15 UA 113494 C2 16 UA 113494 C2 17 UA 113494 C2 18 UA 113494 C2 19 UA 113494 C2 20 UA 113494 C2 21 UA 113494 C2 22 UA 113494 C2 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 23

Дивитися

Додаткова інформація

Автори англійською

Bais, Harsh, Sherrier, Darla, Janine, Lakshmannan, Venkatachalam

Автори російською

Байс Харш, Шеррьер Дарла Джанин, Лакшманан Венкатачалам

МПК / Мітки

МПК: C12N 15/01, C12N 5/04, A01H 5/00

Мітки: спосіб, засухостійкості, рослин, збільшення

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/25-113494-sposib-zbilshennya-zasukhostijjkosti-roslin.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб збільшення засухостійкості рослин</a>

Подібні патенти