Трансгенна рослина, яка продукує білки cry3aa і cry6aa, для запобігання розвитку стійкості у кукурудзяних кореневих жуків (diabrotica spp.)

Реферат: Винахід належить до трансгенної рослини, яка продукує інсектицидно активний білок Cry3Aa і інсектицидно активний білок Cry6Aa, де зазначений інсектицидно активний білок Cry3Aa і інсектицидно активний білок Cry6Aa мають різні сайти зв'язування рецепторів в кишечнику кукурудзяного кореневого жука. Комбінації Сrу3Аа і Сrу6Aа можуть використовуватися для запобігання розвитку стійкості (до будь-якої системи інсектицидного білка окремо) у популяції кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica spp.). UA 114391 C2 (12) UA 114391 C2 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Передумови створення винаходу Люди вирощують кукурудзу для застосування в їжу і як джерела енергії. Кукурудза являє собою важливу сільськогосподарську культуру. Вона є важливим джерелом їжі, харчових продуктів і корму для тварин у багатьох регіонах світу. Комахи вживають у їжу й ушкоджують рослини і, таким чином, підривають ці зусилля людей. Щорічно мільярди доларів витрачаються для боротьби з комахами-шкідниками і ще мільярди втрачаються внаслідок заподіюваного ними збитку. Шкода, заподіювана комахами-шкідниками, є основним фактором втрати врожаїв кукурудзи в усьому світі, незважаючи на використання захисних заходів, таких як хімічні пестициди. У зв'язку з цим, у сільськогосподарські культури, такі як кукурудза, методами генної інженерії були введені гени стійкості до комах для боротьби зі збитком, заподіюваним комахами, і для зниження потреби в традиційних хімічних пестицидах. Щорічно, більше 10 мільйонів акрів (більше 4050000 га) кукурудзяних полів у США заражаються комплексом видів кукурудзяного кореневого жука. Комплекс видів кукурудзяного кореневого жука включає північного кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica barberi), південного кукурудзяного кореневого жука (D. undecimpunctata howardi) і західного кукурудзяного кореневого жука (D. virgifera virgifera) (інші види включають Diabrotica virgifera zeae (Мексиканський кукурудзяний кореневий жук), Diabrotica balteata (Бразильський кукурудзяний кореневий жук) і комплекс Бразильського кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica viridula і Diabrotica speciosa)). Личинки цих видів Diabrotica, що живуть у ґрунті, харчуються коренями рослин кукурудзи, викликаючи вилягання. Вилягання в кінцевому рахунку знижує врожайність і часто приводить до загибелі рослини. Вживаючи в їжу маточкові стовпчики кукурудзи, дорослі жуки зменшують запилення і, тому, згубно впливають на врожай зерна кукурудзяної рослини. Крім того, дорослі особини і личинки роду Diabrotica атакують гарбузові культури (огірки, дині, гарбузи і т. д.) і багато овочевих і польових культур у промисловому рослинництві, а також ті, котрі вирощуються в городах на присадибних ділянках. Синтетичні органічні хімічні інсектициди були першочерговими інструментами, використовуваними для боротьби з комахами-шкідниками, але біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, одержані з Bacillus thuringiensis (B.t.), відігравали важливу роль у деяких регіонах. Можливість одержання стійких до комах рослин за допомогою трансформації генами інсектицидного білка B.t. радикально змінила сучасне сільське господарство і підвищила значення і цінність інсектицидних білків і їх генів. Інсектицидні кристалічні білки з деяких штамів Bacillus thuringiensis (B.t.) добре відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Hofte et al. Microbial Reviews, Vol. 53, № 2, pp. 242-255 (1989). Ці білки звичайно продукуються бактеріями у вигляді протоксинів з молекулярною масою приблизно 130 кДа, які потім розщеплюються протеазами в середній кишці комах після потрапляння в травну систему комахи для продукції корового токсину з молекулярною масою приблизно 60 кДа. Ці білки відомі як кристалічні білки, тому що в деяких штамах B.t. можуть спостерігатися виразні кристалічні включення зі спорами. Ці кристалічні включення часто складені з декількох різних білків. Однією групою генів, які використовувалися для одержання трансгенних, стійких до комах культур, є дельта-ендотоксини з Bacillus thuringiensis (B.t.). Дельта-ендотоксини були успішно експресовані в таких сільськогосподарських культурах як бавовна, картопля, рис, соняшник, а також кукурудза, і, як виявилося, забезпечують чудовий контроль над комахами-шкідниками (Perlak F.J. et al. (1990), Bio/Technology 8, 939-943; Perlak F.J. et al. (1993), Plant Mol. Biol. 22:313321; Fujimoto H. et al. (1993), Bio/Technology, 11:1151-1155; Tu et al. (2000), Nature Biotechnology, 18:1101-1104; PCT публікація міжнародної патентної заявки WO 01/13731; і Bing J.W. et al. th (2000), Efficacy of Cry IF Transgenic Maize, 14 Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, Colo.). Декілька білків B.t. використовувалися для створення стійких до комах трансгенних рослин, що були успішно зареєстровані і в даний час запущені в серійне виробництво. Вони включають Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F, Cry1A.105, Cry2Ab, Cry3Aa, Cry3Bb і Cry34/35Ab у кукурудзі, Cry1Ac і Cry2Ab у бавовні і Cry3A у картоплі. Продукти, що випускаються в промисловому масштабі, експресуючі ці білки, експресують один білок, за винятком випадків, де бажаний комбінований інсектицидний спектр із 2 білків (наприклад, Cry1Ab і Cry3Bb у кукурудзі, комбіновані для забезпечення стійкості відповідно до лускокрилих шкідників і блішки довговусої), або де незалежна дія білків робить їх корисними як інструмент для затримки розвитку стійкості у популяцій сприйнятливих комах (наприклад, 1 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Cry1Ac і Cry2Ab у бавовні, комбіновані для забезпечення керування стійкістю відносно тютюнової совки). Деякі з якостей стійких до комах трансгенних рослин, що привели до швидкого і широко розповсюдженого прийняття цієї технології, також викликають занепокоєність, що у популяцій шкідників розів'ється стійкість до інсектицидних білків, продукованих цими рослинами. Було запропоновано декілька стратегій для збереження корисності ознак стійкості до комах на основі B.t., що включають розміщення білків у високій дозі в комбінації з резерватом, чергування з різними токсинами або спільне розміщення з ними (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management", Nature Biotechnol. 16:144-146). Білки, вибрані для використання в пакеті Керування стійкості до комах (IRM), повинні бути активними для того, щоб стійкість, що розвилася до одного білка, не надавала стійкості до другого білка (тобто перехресна стійкість до білків відсутня). Якщо, наприклад, популяція шкідників, вибрана для стійкості до "білка A", чутлива до "білка B", то можна зробити висновок, що немає перехресної стійкості і що комбінація білка A і білка B буде ефективною в затримці стійкості до одного білка A. За відсутності стійких до комах популяцій, оцінки можуть здійснюватися на основі інших характеристик, що вважаються пов'язаними з потенціалом перехресної стійкості. При ідентифікації інсектицидних білків з імовірністю відсутності прояву перехресної стійкості було запропоноване використання рецепторно-опосередкованого зв'язування (van Mellaert et al. 1999). Ключовим прогностичним показником відсутності перехресної стійкості, властивим цьому підходу, є те, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори у чутливого виду комах. У випадку, коли токсини B.t. конкурують за один і той же рецептор, то, якщо цей рецептор мутує у цій комасі, так що один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором і, таким чином, більше не є інсектицидним проти комахи, у цьому випадку комаха буде також стійкою до другого токсину (який конкурентно зв'язаний з тим же рецептором). Тобто, комаха вважається перехресно стійкою до обох токсинів B.t. Однак, якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, то це може бути показником того, що комаха не буде одночасно стійкою до цих двох токсинів. Відносно більш нова система інсектицидного білка була виявлена у Bacillus thuringiensis, як описано в міжнародному патенті WO 97/40162. Ця система містить два білки - один масою приблизно 14-15 кДа і інший масою приблизно 44-45 кДа. Див. також патенти США 6083499 і 6127180. Тепер ці білки були віднесені до їх власного класу і, відповідно, одержали позначення Cry, відповідно Cry34 і Cry35. Див. Crickmore et al. сайт Інтернету (biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). На даний час виявлені багато інших споріднених білків цього типу системи. Див., наприклад, патент США 6372480; міжнародні патенти WO 01/14417 і WO 00/66742. Були також описані оптимізовані для рослин гени, що кодують такі білки, де гени створені методами генної інженерії для використання кодонів для оптимізованої експресії у рослин. Див. наприклад патент США 6218188. Точний тип дії системи Cry34/35 ще має бути визначений, але вважають, що вона утворює пори в мембранах клітин кишечнику комах. Див. Moellenbeck et al. Nature Biotechnology, vol. 19, p. 668 (July 2001); Masson et al. Biochemistry, 43 (12349-12357) (2004). Точний механізм дії залишається неясним, незважаючи на тривимірні атомарні координати і структури кристалів, відомі для білка Cry34 і Cry35. Див. патенти США 7524810 і 7309785. Наприклад, неясно, один або обидва з цих білків зв'язуються з конкретним видом рецептора, таким як лужна фосфатаза або амінопептидаза. Крім того, через те, що існують різні механізми, за допомогою яких у комахи може розвитися стійкість до білка Cry (такі як змінене глікозилування рецептора [див. Jurat-Fuentes et al. (2002) 68 AEM 5711-5717], видалення рецепторного білка [див. Lee et al. (1995) 61 AEM 3836-3842], мутування рецептора або інші механізми [див. Heckel et al. J. Inv. Pathol. 95 (2007) 192-197]), було неможливо свідомо прогнозувати, чи буде існувати перехресна стійкість між Cry34/35 і іншими Cry-білками. Прогнозування конкурентного зв'язування для системи Cry34/35 також додатково ускладнюється тим, що два білки залучені в бінарну систему Cry34/35. Крім того, неясно, чи зв'язуються і наскільки ефективно зв'язуються ці білки з кишечником/клітинами кишечнику, і чи взаємодіють вони і як взаємодіють або зв'язуються один з одним. Інші варіанти для боротьби з твердокрилими комахами включають токсини Cry3Bb, Cry3C, Cry6B, ET29, ET33 з ET34, TIC407, TIC435, TIC417, TIC901, TIC1201, ET29 з TIC810, ET70, ET76 з ET80, TIC851 і інші. Були також запропоновані підходи РНКі (інтерференції РНК). Див. наприклад, Baum et al. Nature Biotechnology, vol. 25, № 11 (Nov. 2007), pp. 1322-1326. 2 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Meihls et al. пропонують використання резервних культур для керування стійкістю у кукурудзяного кореневого жука. PNAS (2008), vol. 105, № 49, 19177-19182. Короткий опис сутності винаходу Даний винахід стосується частково Cry3Аа в комбінації з Cry6Aa. Даний винахід стосується частково відкриття, що Cry3Aa і Cry6Aa можуть використовуватися для запобігання розвитку стійкості (до будь-якої системи інсектицидного білка окремо) у популяції кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica spp.). Як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі після ознайомлення зі сприятливими аспектами розкритого в даному описі винаходу, рослини, продукуючі ці інсектицидні Cry-білки, можуть використовуватися для зменшення побоювань того, що може розвитися популяція кукурудзяного кореневого жука, яка може бути стійкою до будь-якої з цих систем інсектицидного білка окремо. Даний винахід частково підтверджується виявленням того, що компоненти цих систем Cryбілка не конкурують один з одним за зв'язування з рецепторами кишечнику кукурудзяного кореневого жука. Даний винахід також частково стосується потрійних пакетів або "пірамід" із трьох (або більше) систем токсинів, де основною парою є Cry3Aa і Cry6Aa. Таким чином, рослини (і посівна площа, засаджена такими рослинами), які продукують ці дві системи інсектицидних білків, включені в обсяг даного винаходу. Короткий опис фігур 125 125 Фіг. 1. Зв'язування трипсинової серцевини I-Cry3Aa (фіг. 1A) і I-Cry6Aa1 (повної довжини) (фіг. 1B) як функція внесених мічених радіоактивним ізотопом Cry-токсинів у BBMV (мембранних пузирчиках щіткової облямівки), одержаних з личинок західних кукурудзяних кореневих жуків. Специфічне зв'язування=загальне зв'язування-неспецифічне зв'язування, "вуса"=SEM (стандартна помилка середньої). 125 Фіг. 2. Зв'язування I-Cry3Aa з BBMV, одержаними з личинок при різних концентраціях неміченого конкурента (log0,1=-1,0, log1=0, log10=1,0, log100=2,0, log1000=3,0). Короткий опис послідовностей SEQ ID NO:1: повна послідовність білка Cry3Aa; SEQ ID NO:2: послідовність трипсинового корового білка Cry3Aa; SEQ ID NO:3: повна послідовність білка Cry6Aa1. Докладний опис винаходу Послідовності білків Cry3Aa і Cry6Aa можуть бути одержані, наприклад, з ізолятів Bacillus thuringiensis, як перераховано на сайті Інтернету Crickmore et al. (lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html). Даний винахід включає використання інсектицидних білків Cry3Aa у комбінації з токсином Cry6Aa для захисту кукурудзи від ушкодження і втрати врожайності, викликаних вживанням у їжу популяціями кукурудзяних кореневих жуків, у яких може розвитися стійкість до стійкість до будь-якого із системи білків Cry окремо (без іншого). Таким чином, у даному винаході мова йде про пакет Керування стійкості комах (IRM) для запобігання розвитку у кукурудзяного кореневого жука стійкості до Cry6Aa і/або Cry3Aa. Даний винахід стосується композицій для боротьби зі шкідниками-кореневими жуками, які містять клітини, що продукують інсектицидний білок Cry6Aa і інсектицидний білок Cry3Aa. Винахід додатково включає хазяїна, трансформованого для продукції як білка Cry6Aa, так і інсектицидного білка Cry3Aa, де зазначений хазяїн являє собою мікроорганізм або рослинну клітину. Додатково передбачається, що винахід стосується способу боротьби зі шкідникамикореневими жуками, який включає приведення в контакт зазначених шкідників або середовища мешкання зазначених шкідників з ефективною кількістю композиції, що містить інсектицидний білок Cry3Aa. Варіант здійснення винаходу включає маїс, що містить експресований рослиною ген, який кодує інсектицидний білок Cry3Aa, і експресований рослиною ген, який кодує білок Cry6Aa, і насіння такої рослини. Додатковий варіант здійснення винаходу включає маїс, де експресований рослиною ген, який кодує інсектицидний білок Cry3Aa, і експресований рослиною ген, який кодує білок Cry6Aa, були інтрогресовані в зазначений маїс, і насіння такої рослини. Як описано в розділі "Приклади", дослідження конкурентного зв'язування з рецепторами з використанням міченого радіоактивним ізотопом корового токсинного білка Cry3Aaпоказують, що коровий токсинний білок Cry6Aa не конкурує за зв'язування в зразках тканини комах CRW (кукурудзяних кореневих жуків), з якими зв'язується Cry3Aa. Див. фіг. 2. Ці результати вказують 3 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на те, що комбінація білків Cry6Aa і Cry3Aa являє собою ефективний засіб для зменшення розвитку стійкості у популяцій CRW до будь-якої білкової системи окремо. Таким чином, частково на основі даних, описаних вище і в інших місцях даного опису, білки Cry3Aa і Cry6Aa можуть бути використані для одержання комбінацій IRM для запобігання і зменшення розвитку стійкості у CRW. Інші білки можуть бути додані до цієї комбінації, наприклад, для розширення спектра боротьби з комахами. Комбінація, що розглядається, також може бути використана в деяких переважних "потрійних пакетах" або "піраміді" у комбінації з ще одним білком для боротьби з кореневими жуками, таким як Cry3Ba або бінарні білки Cry34/35. Таким чином, такі додаткові комбінації будуть забезпечувати множинні типи дії проти кореневих жуків. РНКі проти кореневих жуків являє собою ще один варіант. Див., наприклад, Baum et al. Nature Biotechnology, vol. 25, № 11 (Nov. 2007), pp. 1322-1326. У світлі опису заявки USSN 61/327240 (поданої 23 квітня, 2010 р.), що стосується комбінацій білків Cry34Ab/35Ab і Cry3Aa, заявки USSN 61/388273 (поданої 30 вересня, 2010 р.), що стосується комбінації білків Cry34Ab/35Ab і Cry6Aa, і заявки USSN 61/476005 (поданої 15 квітня, 2011 р.), що стосується комбінацій білків Cry34Ab/35Ab і Cry3Ba, деякі переважні "потрійні пакети" або "множинні типи пакетів дії" даного винаходу включають білок Cry6Aa у комбінації з білком Cry3Aa, разом з білком Cry3Ba або бінарними білками Cry34/35. Трансгенні рослини, включаючи кукурудзу, що містить ген Сry6Aa і ген Сry3Aa (необов'язково, із третьою або четвертою системою токсину, наприклад Сry3B і/або Сry34/35), включені в обсяг даного винаходу. Таким чином, такі варіанти здійснення націлені на комаху щонайменше трьома типами дії. Варіанти здійснення за даним винаходом включають використання білків Cry6Aa і Cry3Aa в областях вирощування кукурудзи, де Diabrotica spp. є проблематичними. Іншим варіантом здійснення може бути використання одного або обох з білків Cry6Aa і Cry3Aa у комбінації з іншими ознаками. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що токсини B.t., навіть у межах визначеного класу, такого як Cry6Aa і Cry3Aa, можуть до деякої міри варіювати. Гени і токсини. Термін "ізольований" стосується полінуклеотиду в конструкті, що не зустрічається в природних умовах, або білка в очищеному стані або в стані, що іншим чином не зустрічається в природних умовах. Гени і токсини, використовувані відповідно до даного винаходу, включають не тільки повні описані послідовності, але також фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, що зберігають характерну пестицидну активність токсинів, конкретно проілюстрованих у даному описі. Використовувані в даному описі терміни "варіанти" або "зміни" генів стосуються нуклеотидних послідовностей, які кодують ті ж токсини, або які кодують еквівалентні токсини, які мають пестицидну активність. Використовуваний у даному описі термін "еквівалентні токсини" стосується токсинів, що мають таку ж або по суті таку ж біологічну активність проти шкідників-мішеней, як заявлені токсини. Те ж стосується Cry3B і Cry34/35, якщо вони використовуються в потрійних/множинних пакетах відповідно до даного винаходу. Домени/субдомени цих білків можуть бути виміняні, наприклад, для одержання химерних білків. Див. наприклад, патенти США 7309785 і 7524810 стосовно білків Cry34/35. У патенті '785 мова також йде про усічені білки Cry35. Усічені токсини також проілюстровані в даному описі. Використовуваний у даному описі термін "границі" представляє ідентичність послідовностей приблизно 95 % (білків Cry6Aa і Cry3Aa), 78 % (білків Cry6A і Cry3A) і 45 % (білків Cry6 і Cry3) відповідно до "Revision of Nomenclature for Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins" N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998), Vol 62:807-813. Те ж стосується Cry3B при використанні в потрійних пакетах, наприклад, відповідно до даного винаходу. Для фахівця в даній галузі буде очевидно, що гени, які кодують активні токсини, можуть бути ідентифіковані й одержані декількома способами. Визначені гени або частини генів, проілюстровані в даному описі, можуть бути одержані з ізолятів, депонованих у депозитарії культур. Ці гени або їх частини або варіанти також можуть бути сконструйовані синтетично, наприклад, шляхом використання генного синтезатора. Варіанти генів можуть бути легко сконструйовані з використанням стандартних технологій одержання точкових мутацій. Також, фрагменти цих генів можуть бути одержані з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз, згідно зі стандартними методиками. Наприклад, ферменти, такі як Bal31, або сайт-направлений мутагенез можуть бути використані для систематичного відсічення нуклеотидів від кінців цих генів. Гени, які кодують активні фрагменти, також можуть бути одержані з використанням різноманітних рестрикційних ферментів. Протеази можна використовувати для безпосереднього одержання активних фрагментів білкових токсинів. 4 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Фрагменти й еквіваленти, що зберігають пестицидну активність проілюстрованих токсинів, будуть входити в обсяг даного винаходу. Також, через надмірність генетичного коду, різноманітність різних послідовностей ДНК може кодувати амінокислотні послідовності, розкриті в даному описі. Фахівець у даній галузі цілком може створити альтернативні послідовності ДНК, які кодують однакові або по суті однакові токсини. Ці варіантні послідовності ДНК входять в обсяг даного винаходу. Використовуване в даному описі посилання на "по суті однакову" послідовність стосується послідовностей, що мають амінокислотні заміщення, делеції, додавання або вставки, які суттєво не впливають на пестицидну активність. Фрагменти генів, які кодують білки, що зберігають пестицидну активність, також включені в це визначення. Фрагменти генів, які кодують білки, що зберігають пестицидну активність, також включені в це визначення. Додатковий спосіб ідентифікації генів, які кодують токсини, і частин генів, використовуваних відповідно до даного винаходу, здійснюють шляхом використання олігонуклеотидних зондів. Ці зонди являють собою детектовані нуклеотидні послідовності. Ці послідовності можуть бути виявлені за допомогою відповідної мітки або можуть бути одержані ендогенно флуоресцентними, як описано в міжнародній патентній заявці № WО 93/16094. Як добре відомо в даній галузі, якщо молекула зонда і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються з утворенням міцного зв'язку між двома молекулами, то можна резонно припустити, що зонд і зразок мають суттєву гомологію. Переважно, гібридизацію проводять у жорстких умовах методиками, добре відомими в даній галузі, як описано, наприклад, у публікації Keller G.H., Manak M.M. (1987), DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Деякі приклади сольових концентрацій і температурних комбінацій наступні (у порядку збільшення жорсткості умов): 2X SSPE (0,18M NaCl, 10 мМ NaHPO4, 1 мМ EDTA, pН 7,0) або SSC (15 мМ цитрату натрію, 150 мМ хлориду натрію, pН 7,0) при кімнатній температурі; 1X SSPE або SSC при 42C; 0,1X SSPE або SSC при 42C; 0,1X SSPE або SSC при 65C. Виявлення зонда забезпечує засіб для визначення відомим чином, чи відбулася гібридизація. Такий зондовий аналіз забезпечує швидкий спосіб ідентифікації генів даного винаходу, які кодують токсин. Нуклеотидні сегменти, використовувані як зонди відповідно до винаходу, можуть бути синтезовані з використанням синтезатора ДНК і стандартних методик. Ці нуклеотидні послідовності також можуть бути використані як затравки ПЛР для ампліфікації генів за даним винаходом. Варіантні токсини. У даному описі були спеціально проілюстровані визначені токсини за даним винаходом. Оскільки ці токсини просто ілюструють токсини за даним винаходом, то буде цілком очевидно, що даний винахід включає варіантні або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), які мають таку ж або подібну пестицидну активність, як ілюстрований токсин. Еквівалентні токсини мають гомологію амінокислот з ілюстрованим токсином. Ця амінокислотна ідентичність звичайно складає більше ніж 75 % або переважно більше ніж 85 %, переважно більше ніж 90 %, переважно більше ніж 95 %, переважно більше ніж 96 %, переважно більше ніж 97 %, переважно більше ніж 98 % або в деяких варіантах здійснення переважно більше ніж 99 %. Амінокислотна ідентичність звичайно найвища в критичних областях токсину, що відповідають за біологічну активність або беруть участь у визначенні тривимірної конфігурації, яка, у кінцевому рахунку, відповідальна за біологічну активність. У цьому відношенні, прийнятні і можуть очікуватися деякі амінокислотні заміщення, якщо ці заміщення відбуваються в областях, що не мають вирішального значення для активності або являють собою консервативні амінокислотні заміщення, які не впливають на тривимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можуть бути розміщені в наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислотні. Консервативні заміщення, за допомогою яких амінокислота одного класу заміщається іншою амінокислотою того ж типу, входять в обсяг даного винаходу, поки заміщення суттєво не змінює біологічну активність сполуки. У таблиці 1 представлений список прикладів амінокислот, що належать до кожного класу. Таблиця 1 Клас амінокислот Неполярні Незаряджені полярні Кислотні Основні Приклади амінокислот Ala, Val, Leu, Ile, Pro Met, Phe, Trp Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Asp, Glu Lys, Arg, His 5 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких випадках також можуть здійснюватися неконсервативні заміщення. Вирішальним фактором є те, що ці заміщення не повинні значно знижувати біологічну активність токсину. Рекомбінантні хазяїни. Гени, які кодують токсини даного винаходу, можуть вводитися в широку різноманітність мікробних або рослинних хазяїнів. Експресія гена токсину приводить, прямо або побічно, до внутрішньоклітинної продукції і підтримання пестициду. Кон'югальне перенесення і рекомбінантне перенесення можуть бути використані для створення штаму B.t., що експресує обидва токсини даного винаходу. Інші організми хазяїнів також можуть бути трансформовані одним або більше генами токсину, використовуваними потім для надання синергічного ефекту. З придатними мікробними хазяїнами, наприклад Pseudomonas, мікроби можуть наноситися на місцезнаходження шкідника, де вони проліферують і вживаються в їжу. Результатом є контроль над шкідником. Альтернативно, мікроб, що несе ген токсину, може бути підданий обробці в умовах, що продовжують активність токсину і стабілізують клітину. Оброблена клітина, що зберігає токсичну активність, потім може вноситися в середовище мешкання шкідника-мішені. В обсяг даного винаходу включені нерегенеровані/нетотипотентні рослинні клітини з рослини за даним винаходом (що містять щонайменше один з розглянутих генів IRM). Трансформація рослини. Переважним варіантом здійснення даного винаходу є трансформація рослин генами, які кодують розглянутий інсектицидний білок або його варіанти. Трансформовані рослини стійкі до атаки цільовою комахою-шкідником за рахунок присутності контролюючих кількостей розглянутого інсектицидного білка або його варіантів у клітинах трансформованої рослини. При включенні генетичного матеріалу, який кодує інсектицидні властивості інсектицидних токсинів B.t., у геном рослини, вживаної в їжу визначеною комахоюшкідником, дорослі особини або личинки загинуть після вживання в їжу рослини. Були трансформовані численні члени односім'ядольних і дводольних класифікацій. Трансгенні агрономічні культури, а також фрукти й овочі становлять промисловий інтерес. Такі культури включають, але без обмеження, маїс, рис, сою, канолу, соняшник, люцерну, сорго, пшеницю, бавовну, арахіс, томати, картоплю тощо. Існує декілька технологій введення стороннього генетичного матеріалу в клітини рослин і одержання рослин, що стабільно підтримують і експресують введений ген. Такі технології включають акселерацію генетичного матеріалу, нанесеного на мікрочастинки, безпосередньо в клітини (патент США 4945050 і патент США 5141131). Рослини можуть бути трансформовані з використанням технології Agrobacterium, див. патент США 5177010, патент США 5104310, Європейську патентну заявку № 0131624B1, Європейську патентну заявку № 120516, Європейську патентну заявку № 159418B1, Європейську патентну заявку № 176112, патент США 5149645, патент США 5469976, патент США 5464763, патент США 4940838, патент США 4693976, Європейську патентну заявку № 116718, Європейську патентну заявку № 290799, Європейську патентну заявку № 320500, Європейську патентну заявку № 604662, Європейську патентну заявку № 627752, Європейську патентну заявку № 0267159, Європейську патентну заявку № 0292435, патент США 5231019, патент США 5463174, патент США 4762785, патент США 5004863 і патент США 5159135. Інша технологія трансформації включає технологію WHISKERS™, див. патент США 5302523 і патент США 5464765. Технологія електропорації також використовувалася для трансформації рослин, див. Міжнародний патент WO 87/06614, патент США 5472869, патент США 5384253, Міжнародний патент WO 9209696 і Міжнародний патент WO 9321335. Усі ці патенти і публікації, що стосуються трансформації, включені в даний опис за допомогою посилання. На доповнення до численних технологій трансформації рослин, тип тканини, що контактує зі сторонніми генами, також може змінюватися. Така тканина включає, але не обмежується ними, ембріональну тканину, I і II типи калюсної тканини, гіпокотиль, меристему тощо. Майже всі рослинні тканини можуть бути трансформовані під час дедиференціювання з використанням відповідних технологій у межах кваліфікації фахівця в даній галузі. Гени, які кодують будь-який з розглянутих токсинів, можуть бути вставлені в клітини рослини з використанням різноманітних технологій, які добре відомі в даній галузі, як описано вище. Наприклад, доступне велике число векторів клонування, що містять маркер, який забезпечує можливість відбору трансформованих мікробних клітин, і реплікаційна система, функціональна в Escherichia coli, для одержання і модифікації сторонніх генів для вставки у вищі рослини. Такі маніпуляції можуть включати, наприклад, введення мутацій, усічень, додавань або заміщень, як бажано для передбачуваного використання. Вектори включають, наприклад, pBR322, групу pUC, групу M13mp, pACYC184 і т. д. Відповідно, послідовність, що кодує Cry-білок або варіанти, може бути вставлена у вектор у придатний сайт рестрикції. Одержану плазміду використовують для трансформації клітин E. coli, які культивують у придатному живильному середовищі, потім збирають і лізують для того, щоб були витягнуті придатні для обробки кількості плазміди. Аналіз 6 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовності, аналіз фрагментів рестрикції, електрофорез і інші біохімічні-молекулярнобіологічні способи звичайно проводять як способи аналізу. Після кожної маніпуляції, використовувана послідовність ДНК може бути розщеплена і з'єднана з наступною послідовністю ДНК. Кожна піддана маніпулюванню послідовність ДНК може бути клонована в ту ж або іншу плазміду. Використання векторів, що містять T-ДНК, для трансформації клітин рослин інтенсивно досліджувалося і достатньо описане в Європейському патенті EP 120516; публікаціях Lee і Gelvin (2008), Fraley et al. (1986), і An et al. (1985), і достатньо загальноприйняте в даній галузі. Як тільки вставлена ДНК інтегрується в геном рослини, вона стає відносно стійкою у всіх наступних поколіннях. Вектор, використовуваний для трансформації клітини рослини, звичайно містить вибраний маркерний ген, який кодує білок, що надає трансформованим клітинам рослин стійкість до гербіциду або антибіотика, такого як, поряд з іншими, біалафос, канаміцин, G418, блеоміцин або гігроміцин. Відповідно, окремо використовуваний вибраний маркерний ген повинен забезпечити можливість вибору трансформованих клітин, у той час як ріст клітин, що не містять вставлену ДНК, пригнічується селекційною сполукою. Доступне велике число способів вставлення ДНК у клітину рослини-хазяїна. Ці способи включають трансформацію T-DNA, доставлену Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як агентом трансформації. Додатково, може бути використане злиття протопластів рослини з ліпосомами, що містять підлягаючу доставці ДНК, пряма ін'єкція ДНК, трансформація біологічною балістикою (бомбардуванням мікрочастинками) або електропорація, а також інші можливі способи. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, рослини трансформуються генами, де використання кодону області, що кодує білок, було оптимізоване для рослин. Див., наприклад, патент США 5380831, що включений у даний опис за допомогою посилання. Також, переважно використовуються рослини, що кодують усічений токсин. Усічений токсин звичайно кодує приблизно від 55 % до приблизно 80 % токсину повної довжини. Способи створення синтетичних генів B.t. для використання в рослинах відомі в даній галузі (Stewart, 2007). Незалежно від методики трансформації, ген переважно включають у вектор перенесення гена, адаптований для експресування генів інсектицидного токсину B.t. і варіанти в рослинній клітині включенням у вектор рослинного промотору. На доповнення до рослинних промоторів, у рослинних клітинах для експресування чужорідних генів можуть ефективно використовуватися промотори з різноманітних джерел. Наприклад, можливе використання промоторів бактеріального походження, таких як промотор октопінсинтази, промотор нопалінсинтази і промотор манопінсинтази. У деяких переважних варіантах здійснення можуть використовуватися промотори, не зв'язані з Bacillus thuringiensis. Можуть використовуватися промотори, що походять з рослинних вірусів, наприклад промотори 35S і 19S вірусу мозаїки цвітної капусти, промотор з вірусу мозаїки жилок касави тощо. Рослинні промотори включають, але без обмеження, малу субодиницю (ssu), промотор бета-конгліциніну, промотор фазеоліну, промотор ADH (алкогольдегідрогенази), промотори теплового шоку, промотор ADF (деполімеризації актину), промотор убіквітину, промотор актину і тканиноспецифічні промотори. Промотори можуть також містити визначені енхансерні елементи послідовності, які можуть підвищити ефективність транскрипції. Конкретні енхансери включають, але без обмеження, ADH1-інтрон 1 і ADH1-інтрон 6. Можуть використовуватися конститутивні промотори. Конститутивні промотори направляють безупинну генну експресію майже у всіх типах клітин і майже в будь-який час (наприклад, актину, убіквітину, CaMV 35S). Тканиноспецифічні промотори відповідальні за генну експресію у певних типах клітин або тканини, таких як листи або насіння (наприклад, промотори зеїну, олеозину, напіну, ACP (ацил білка-носія)), і ці промотори також можуть бути використані. Можуть також використовуватися промотори, які активні під час певної стадії розвитку рослин, а також активні у певних тканинах і органах рослин. Приклади таких промоторів включають, але без обмеження, промотори, що є специфічними для коренів, специфічними для пилка, специфічними для зародків, специфічними для "шовку" кукурудзи, специфічними для бавовняних волокон, специфічними для ендосперми насіння, специфічними для флоеми тощо. У певних умовах може бути бажаним використання індукованого промотору. Індукований промотор відповідальний за експресію генів у відповідь на специфічний сигнал, такий як фізичний стимул (наприклад, гени теплового шоку); світло (наприклад, RUBP карбоксилаза); гормон (наприклад, глюкокортикоїд); антибіотик (наприклад, тетрациклін); метаболіти; і стрес (наприклад, посуху). Можуть використовуватися інші бажані транскрипційні і трансляційні елементи, що функціонують у рослинах, такі як 5'-нетрансльовані лідерні послідовності, РНК 7 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовності транскрипції термінації і сигнальні послідовності додавання поліаденілату. У даній галузі відомі численні специфічні для рослин вектори перенесення генів. Трансгенні культури, що містять ознаки стійкості до комах (IR), є переважними в рослинах кукурудзи і бавовни по всій Північній Америці, і використання цих ознак поширюється по усьому світі. Промислові трансгенні культури, що комбінують ознаки IR і стійкість до гербіцидів (HT), були розроблені множинною насіннєвих компаній. Вони включають комбінації ознак IR, наданих інсектицидними білками B.t., і ознак HT, таких як стійкість до інгібіторів ацетолактатсинтази (ALS), таких як сульфонілсечовини, імідазолінони, триазолпіримідин, сульфонаніліди тощо, інгібіторів глутамінсинтетази (GS), таких як біалафос, глюфосинат тощо, інгібіторів 4гідроксифенілпіруватдіоксигенази (HPPD), таких як мезотріон, ізоксафлутол тощо, інгібіторів 5енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (EPSPS), таких як гліфосат тощо, інгібіторів ацетилкоензим-A-карбоксилази (ACCase), таких як галоксифоп, квілазофоп, диклофоп тощо. Відомі інші приклади, у яких трансгенно одержані білки забезпечують стійкість рослин до хімічних класів гербіцидів, таких як гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі ауксинпіридилоксіацетатів (див. Міжнародну патентну заявку WO 2007/053482 A2) або гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі арилоксифеноксипропіонатів (див. Міжнародну патентну заявку 2005107437 A2, A3). Здатність контролювати множинні пов'язані зі шкідниками проблеми за допомогою ознак IR являє собою цінну концепцію промислового продукту, і зручність цієї продуктової концепції підвищується, якщо ознаки, що забезпечують контроль над комахами, і ознаки, що забезпечують контроль над бур'янами, комбінуються в одній рослині. Додатково, підвищена значимість може бути одержана за допомогою комбінацій в одній рослині ознак IR, наданих інсектицидним білком B.t., таким як інсектицидний білок за даним винаходом, з однією або більше додатковими ознаками HT, такими, як зазначено вище, плюс одна або більше додаткових ознак, що вводяться (наприклад, стійкості до інших комах, наданої білками, що походять з B.t. або з інших інсектицидних білків, стійкості до комах, наданої такими механізмами як РНКі тощо, стійкості до нематодів, стійкості до захворювань, стійкості до стресу, поліпшеної утилізації азоту і тому подібних), або продуктивні ознаки (наприклад, високе вміст олій, корисний для здоров'я склад, поліпшення живильної цінності тощо). Такі комбінації можуть бути одержані або звичайною селекцією (селекційний пакет), або спільно у вигляді нового явища трансформації, що включає одночасне введення множинних генів (молекулярний пакет). Сприятливі ефекти включають здатність справлятися зі шкідниками і поліпшену боротьбу з бур'янами культур рослин, що забезпечує вторинні вигоди для виробника і/або споживача. Таким чином, даний винахід може бути використаний в комбінації з іншими ознаками для забезпечення повного агрономічного пакета поліпшеної якості культури зі здатністю гнучко й економічно рентабельно регулювати будь-яке число агрономічних питань. Трансформовані клітини ростуть усередині рослин звичайним чином. Вони можуть утворювати зародкові клітини і передавати трансформовану ознаку(и) потомству рослин. Такі рослини можуть бути вирощені звичайним чином і схрещені з рослинами, що мають такі ж трансформовані спадкові фактори або інші спадкові фактори. Одержані гібридні індивіди мають відповідні фенотипічні властивості. У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини трансформуються генами, де використання кодону було оптимізоване для рослин. Див., наприклад, патент США 5380831. Крім того, способи створення синтетичних генів B.t. для використання в рослинах відомі в даній галузі (Stewart і Burgin, 2007). Одним необмежувальним прикладом переважної трансформованої рослини є фертильна рослина маїсу, що містить експресований рослиною ген, що кодує білок Cry6Aa, і додатково містить другий набір експресованих рослиною генів, що кодують білки Cry3Aa. Перенесення (або інтрогресія) обумовленої(их) білками Cry6Aa і Cry3Aa ознаки (ознак) в інбредні лінії маїсу може бути досягнуте рекурентним селекційним розведенням, наприклад зворотним схрещуванням. У цьому випадку, бажаного рекурентного батька спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентним батьком), що несе відповідний(і) ген(и) для обумовлених Cry ознак. Потім потомство цього однократного схрещування знову спарюють з рекурентним батьком з наступною селекцією в одержаному потомстві для перенесення бажаної ознаки (ознак) від нерекурентного батька. Після трьох, переважно чотирьох, більш переважно п'яти або більше поколінь зворотного схрещування з рекурентним батьком із селекцією бажаної ознаки (ознак), потомство буде гетерозиготним відносно локусів, що контролюють ознаку(и), що переноситься(яться), але буде як рекурентний батько відносно більшості або майже всіх інших генів (див., наприклад, Poehlman & Sleper (1995), Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987), Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376). 8 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Стратегії керування стійкістю до комах (IRM). Roush et al., наприклад, описують "двотоксинні" стратегії, також називані "пірамідуванням" або "пакетуванням", для керування інсектицидними трансгенними культурами (Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998), 353, 1777-1786). Агентство США по захисту навколишнього середовища на своєму сайті в Інтернеті (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) публікує наступні вимоги до забезпечення нетрансгенних (тобто, які не містять B.t.-білки) резервних культур (блока культур, що не містять B.t.-білки/кукурудзи) для використання з трансгенними культурами, продукуючими один білок B.t., активний проти шкідників-мішеней. "Специфічні структуровані вимоги до захищеного від кукурудзяного метелика B.t. (Cry1 Ab або Cry 1F) кукурудзяних продуктів наступні: структуровані резервати: 20 % не захищених від лускокрилих B.t. кукурудзяних резервних культур у Кукурудзяній смузі; 50 % не захищених від лускокрилих B.t. резервних культур у Бавовняній смузі. Блоки внутрішній (тобто в межах поля B.t.); 1 зовнішній (тобто окремі поля в межах ½ милі (804 м) (якщо можливо /4 милі (402 м)) від поля B.t. для максимізації випадкового спарювання). Смуги усередині поля смуги повинні бути шириною щонайменше 4 ряди (переважно 6 рядів) для зменшення ефектів пересування личинок". Крім того, Національна Асоціація фермерів, що вирощують кукурудзу, на своєму сайті Інтернету (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) також публікує аналогічне керівництво відносно вимог до резервату. Наприклад: "Вимоги до IRM відносно кукурудзяного метелика: - Засійте щонайменше 20 % вашого кукурудзяного поля гібридами немодифікованого насіння. - В областях, продукуючих бавовну, резерват повинен складати 50 %. 1 - Повинні бути засіяні в межах /2 милі (804 м) від гібридів немодифікованого насіння. - Немодифіковане насіння може засіватися у вигляді смуг у межах поля B.t.; смуги резервних культур повинні мати ширину щонайменше 4 ряди. - Резервні культури можуть оброблятися звичайними пестицидами, тільки якщо для комахимішені досягаються економічні пороги. - Розпилювані інсектициди на основі B.t. не можуть використовуватися на немодифікованій кукурудзі. - Відповідна резервна культура повинна висіватися на кожній фермі з B.t.-кукурудзою". Як зазначено Roush et al. (наприклад, на стор. 1780 і 1784 у правому стовпчику), пакетування або "пірамідування" із двох різних білків, кожного ефективного проти шкідниківмішеней і з невеликою або відсутньою перехресною стійкістю, може забезпечити можливість використання меншого резервату. Roush припускає, що для успішного пакета, розмір резервату менше ніж 10 % може забезпечити керування стійкістю, порівнянне приблизно з 50 % резерватом для однієї ("непірамідованої") ознаки. Для доступних на даний час "пірамідованих" B.t. кукурудзяних продуктів, Агентство США по захисту навколишнього середовища вимагає засівання значно меншого (як правило 5 %) структурованого резервату, що не містить B.t.-білки, кукурудзою, ніж для продуктів з однією ознакою (як правило 20 %). Існують різні шляхи забезпечення ефектів IRM резервату, включаючи різні геометричні типи посіву на полях (як зазначено вище) і суміші насіння у мішку, як додатково обговорюється Roush et al. (див. вище) і в патенті США 6551962. Зазначені вище процентні частки або подібні співвідношення резервату можуть використовуватися для розглянутих подвійних або потрійних пакетів або пірамід. Усі патенти, патентні заявки, тимчасові заявки і публікації, наведені у вигляді посилання або процитовані в даному описі, повністю включені за допомогою посилання в тій мірі, у якій вони не суперечать визначеним положенням даного опису. Нижче наведені приклади, що ілюструють методи здійснення винаходу. Ці приклади не слід розглядати як обмежувальні. Якщо не зазначене інше, усі процентні частки представлені по масі, і всі пропорції сумішей у розчиннику представлені по об'єму. Усі величини температури представлені в градусах Цельсія. Якщо спеціально на зазначене інше або не мається на увазі інше, однина означає використовуваний у даному описі термін "щонайменше один". ПРИКЛАДИ 9 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 1 - Конструювання експресійних плазмід, що кодують токсини повної довжини Cry3Aa і Cry6Aa Стандартні способи клонування використовували при конструюванні експресійних плазмід Pseudomonas fluorescens (Pf), сконструйованих для продукції відповідно Cry-білків Cry3Aa і Cry6Aa повної довжини. Рестрикційні ендонуклеази з біологічних лабораторій Нової Англії (NEB; Ipswich, MA) використовували для розщеплення ДНК, і T4 ДНК лігазу від компанії Invitrogen використовували для лігування ДНК. Плазміди одержували з використанням набору Plasmid Mini (Qiagen, Valencia, CA), додержуючись інструкцій постачальника. Фрагменти ДНК очищали, використовуючи картридж Millipore Ultrafree®-DA (Billerica, MA), після гель-електрофорезу в агарозному гелі з тріс-ацетатним буфером. Основна стратегія клонування передбачала субклонування кодуючих послідовностей (CDS) Cry-білків повної довжини в pMYC1803 для Cry3Aa і в pDOW1169 для Cry6Aa, у рестрикційні сайти SpeI і XhoI (або SalI, який сумісний з XhoI), відповідно, за допомогою чого їх поміщали під контроль відповідно промотору Ptac і термінатора rrnBT1T2 або rrnBT2 із плазміди pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). pMYC1803 являє собою середню копію плазміди з походженням реплікації з RSF1010, гена стійкості до тетрацикліну, і сайтом зв'язування рибосоми, що передує сайту розпізнавання рестрикційного ферменту, у які можуть бути внесені фрагменти ДНК, що містять кодуючі білок області (заявка на патент США № 20080193974). Експресійну плазміду для Cry3Aa (рекомбінантну pMYC1803) трансформували електропорацією у штам MB214 P. fluorescens, витягнутий у середовищі SOC-соєвий гідролізат, і висівали на чашки з лізогенним бульйонним (LB) середовищем, що містить 20 мкг/мл тетрацикліну. Вектор експресії pDOW1169 аналогічний pMYC1803, але pDOW1169 несе ген pyrF, що кодує урацил, який використовували як маркер для скринінгу трансформантів, коли урацил-ауксотрофний штам P. fluorescens (такий як DPf10) використовували для трансформації на чашці з мінімальним середовищем M9, де був відсутній урацил (Schneider et al. 2005). Подробиці мікробіологічних маніпуляцій доступні в заявці на патент США № 20060008877, заявці на патент США № 20080193974 і заявці на патент США № 20080058262, включених у даний опис за допомогою посилання. Проводили скринінг колоній рестрикційним розщепленням міні-препарату плазмідної ДНК. Послідовність плазмідної ДНК вибраних клонів, що містять вставки, визначали за контрактом з комерційною організацією, що проводить визначення послідовностей, такою як MWG Biotech (Huntsville, AL). Дані послідовностей збирали й аналізували, використовуючи програмне забезпечення Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI). Приклад 2 - Ріст і експресія Аналіз росту й експресії у струшуваних колбах і продукцію токсинів Cry3Aa і Cry6Aa для характеристики, включаючи зв'язування рецептора B.t. і біологічний аналіз комах, здійснювали штамами P. fluorescens, що містять експресійні конструкти, вирощеними в струшуваних колбах (наприклад, клону pMYC3122 для Cry3Aa, і pDAB102018 для Cry6Aa). Культури, що висіваються, для Cry3Aa, вирощені протягом ночі в середовищі P. fluorescens з добавкою 20 мкг/мл тетрацикліну, використовували для інокуляції 200 мл того ж середовища з 20 мкг/мл тетрацикліну. Однак культуру, що висівається, для Cry6Aa вирощували в мінімальному бульйоні M9 протягом ночі і використовували для інокуляції 200 мл середовища P. fluorescens без антибіотика. Експресію токсинів Cry3Aa і Cry6Aa за допомогою промотору Ptac індукували додаванням ізопропіл-β-D-1-тіогалактопіранозиду (IPTG) після початкової інкубації протягом 24 годин при 28-30C при струшуванні при 300 об./хв. Зразки культури брали під час індукції й у різні часові точки після індукції. Густину клітин вимірювали по оптичній густині при 600 нм (OD600). Приклад 3 - Фракціонування клітин і аналіз SDS-PAGE (електрофорезом у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію) зразків зі струшуваних колб У кожну часову точку взяття проб густину клітин зразків доводили до OD 600=20 і аліквоти об'ємом по 1 мл центрифугували при 14000g протягом 5 хвилин. Клітинні осади після центрифугування заморожували при -80C. Розчинні і нерозчинні фракції з заморожених зразків клітинних осадів після центрифугування зі струшуваних колб генерували з використанням розчину для екстракції бактеріального білка EasyLyse™ (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, WI). Кожен клітинний осад ресуспендували в 1 мл розчину EasyLyse™ і додатково розводили 1:4 у літичному буфері і інкубували зі струшуванням при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Лізат центрифугували при 14000 об./хв. протягом 20 хвилин при 4C, і супернатант витягали у вигляді розчинної фракції. Потім осад після центрифугування (нерозчинну фракцію) ресуспендували в рівному об'ємі забуференого фосфатом сольового розчину (PBS; 11,9 мМ Na2HPO4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, pН 7,4). Зразки змішували у співвідношенні 3:1 з буфером зразка 4X Laemmli, що містить β-меркаптоетанол, і кип'ятили протягом 5 хвилин перед 10 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 завантаженням на гелі NuPAGE Novex 4-20 % Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA). Електрофорез виконували в рекомендованому буфері, NuPAGE MOPS. Гелі забарвлювали безпечною фарбою SimplyBlue™ Safe Stain відповідно до протоколу виробника (Invitrogen) і візуалізували з використанням візуалізуючої системи Typhoon (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA). Приклад 4 - Одержання тілець включення Препарати тілець включення (IB) Cry-білка одержували на клітинах у результаті ферментації P. fluorescens, що забезпечувало продукцію нерозчинного інсектицидного білка B.t., як було продемонстровано SDS-PAGE і MALDI-MS (лазерною десорбцією при сприянні матриці/іонізаційною мас-спектрометрією). Клітинні осади P. fluorescens після центрифугування, одержані через 48 годин після індукції, розморожували на водяній бані при 37C. Клітини ресуспендували до 25 % мас./об. у літичному буфері (50 мМ Тріс, pН 7,5, 200 мМ NaCl, 20 мМ динатрієвої солі EDTA (етилендіамінтетраоцтової кислоти), 1 % Triton X-100 і 5 мМ дитіотреїтолу (DTT)); безпосередньо перед використанням додавали 5 мл/л коктейлю інгібітору бактеріальної протеази (P8465 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Клітини суспендували, використовуючи гомогенізатор при установленні на найнижчий режим (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). До клітинної суспензії додавали лізоцим (25 мг Sigma L7651 з білка курячого яйця), змішуванням металевим шпателем, і суспензію інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години. Суспензію охолоджували на льоду протягом 15 хвилин, потім обробляли ультразвуком, використовуючи ультразвуковий генератор Branson Sonifier 250 (два 1-хвилинних сеанси, при 50 % робочому циклі, продуктивність 30 %). Лізис клітин перевіряли мікроскопією. За необхідності, додавали додаткові 25 мг лізоциму й інкубацію й обробку ультразвуком повторювали. Коли лізис клітин підтверджувався мікроскопією, то лізат центрифугували при 11500g протягом 25 хвилин (4 °C) для утворення осаду IB, і супернатант видаляли. Осад IB ресуспендували 100 мл літичного буфера, гомогенізували ручною мішалкою і центрифугували, як зазначено вище. Осад IB повторно промивали ресуспендуванням (у 50 мл літичного буфера), гомогенізацією, обробкою ультразвуком і центрифугуванням доти, поки супернатант не ставав безбарвним, і осад IB ставав щільним і не зовсім білим за кольором. Для кінцевого промивання, осад IB ресуспендували в підданій стерилізаційній фільтрації (через фільтр із розміром пор 0,22 мкм) дистильованій воді, що містить 2 мМ EDTA, і центрифугували. Кінцевий осад ресуспендували в підданій стерилізаційній фільтрації дистильованій воді, що містить 2 мМ EDTA, і зберігали в 1 мл аліквотах при -80C. Приклад 5 - Аналіз SDS-PAGE і кількісне визначення Аналіз SDS-PAGE і кількісне визначення білка в препаратах IB проводили розморожуванням 1 мл аліквоти осаду IB і розведенням 1:20 підданою стерилізаційній фільтрації дистильованою водою. Потім розведений зразок кип'ятили з 4X відновлювального буфера зразка [250 мМ Тріс, pН 6,8, 40 % гліцерин (об./об.), 0,4 % бромфенол синій (мас./об.), 8 % SDS (мас./об.) і 8 % βмеркаптоетанол (об./об.)] і завантажували на Novex® 4-20 % Тріс-гліцин, 12+2-ямковий гель (Invitrogen), що працює з буфером IX Тріс/гліцин/SDS (Invitrogen). Гель задіювали протягом приблизно 60 хв. при 200 вольтах, потім забарвлювали і знебарвлювали наступними процедурами з використанням безпечного барвника SimplyBlue™ Safe Stain (Invitrogen). Кількісне визначення цільових смуг проводили порівнянням денситометричних величин для смуг, у порівнянні зі зразками бичачого сироваткового альбуміну (BSA), обробленими на тому ж гелі, для побудови стандартної кривої, використовуючи програмне забезпечення Bio-Rad Quantity One. Приклад 6 - Солюбілізація тілець включення 10 мл суспензій тілець включення з клонів P. fluorescens MR832 і DPf13032 (що містять, відповідно, 50-70 мг/мл білків Cry3Aa і Cry6Aa) центрифугували при установленні на найвищий режим мікроцентрифуги Eppendorf моделі 5415C (приблизно 14000g) для осадження включень. Супернатант буфера для зберігання видаляли і заміняли 25 мл 50 мМ буфера CAPS [3-(циклогексаміно)-1-пропансульфонової кислоти], pН 10,5, як для Cry3Aa, так і для Cry6Aa, у конічній пробірці ємністю 50 мл. Включення ресуспендували, використовуючи піпетку, і перемішували у вихровій мішалці для ретельного змішування. Пробірки поміщали на платформу, що повільно обертається, при 4C протягом ночі для екстракції білків Cry3Aa і Cry6Aa повної довжини. Екстракти центрифугували при 30000g протягом 30 хв. при 4C, і зберігали одержані супернатанти, що містять солюбілізовані Cry-білки повної довжини. Приклад 7 - Усічення протоксинів повної довжини Білок Cry3Aa повної довжини перетравлювали трипсином для генерування активної форми Cry-білка, стійкої до подальшого перетравлювання трипсином. Зокрема, солюбілізований білок Cry3Aa повної довжини інкубували з трипсином (з бичачої підшлункової залози) (Sigma, St. MO) (при 20:1=Cry-білок:фермент, мас./мас.) у 100 мМ буфера карбонату натрію, pН 11, при 11 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кімнатній температурі протягом 1-3 годин. Повну активацію або усічення підтверджували аналізом SDS-PAGE. Молекулярна маса Cry3Aa повної довжини відповідно склала ≈73 кДа, і трипсинової серцевини ≈55 кДа. Амінокислотні послідовності повної довжини і трипсинової серцевини Cry3Aa представлені у вигляді SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2. Cry6Aa повної довжини значно активніше для націлювання на кукурудзяного кореневого жука, ніж його хімотрипсинова або трипсинова серцевина. Таким чином Cry6Aa повної довжини використовували для аналізів зв'язування. Амінокислотна послідовність Cry6Aa представлена у вигляді SEQ ID NO:3. Приклад 8 - Очищення Cry-токсинів Додатково очищали трипсинізований Cry3Aa і Cry6Aa повної довжини з використанням іонообмінної хроматографії. Зокрема, їх додатково очищали, використовуючи систему рідинної хроматографії ATKA (Amersham Biosciences). Як для Cry3Aa, так і Cry6Aa, буфер A являв собою буфер 10 мМ CAPS, pН 10,5, і буфер B являв собою буфер 10 мМ CAPS, pН 10,5+1M NaCl. Використовували колонку Capto Q (5 мл) (GE). Після повного зрівноваження колонки з використанням буфера A, розчин Cry-токсину інжектували в колонку зі швидкістю потоку 5 мл/хв. Елюювання виконували, використовуючи градієнт 0-100 % буфера B зі швидкістю потоку 5 мл/хв. при 1 мл/фракцію. Після аналізу SDS-PAGE вибраних фракцій для додаткового відбору фракцій, що містять білок-мішень найкращої якості, фракції об'єднували. Буфер заміняли як для очищеної трипсинової серцевини Cry3Aa, так і для Cry6Aa повної довжини на 10 мМ CAPS, pН 10,5, за допомогою діалізу. Зразки зберігали при 4C для аналізу пізніше після кількісного визначення з використанням SDS-PAGE і системи візуалізації Typhoon (GE) з BSA як стандартом. Приклад 9 - Препарати BBMV Препарати пузирчиків мембрани щіткової облямівки (BBMV) середньої кишки комах широко використовуються для аналізів зв'язування Cry-токсину з рецептором. Препарати BBMV, використовувані в даному винаході, одержували з ізольованих середніх кишок третьої вікової стадії західного кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), використовуючи спосіб, описаний Wolferberger et al. (1987). Лейцинамінопептидазу використовували як маркер мембранних білків у препараті, і активність лейцинамінопептидази неочищеного гомогенату і препарату BBMV визначали, як описано раніше (Li et al. 2004a). Концентрацію білка в препараті BBMV вимірювали, використовуючи спосіб Bradford (1976). 125 Приклад 10 - Мічення I Очищену трипсинову серцевину Cry3Aa і Cry6Aa повної довжини мітили, використовуючи 125 I, для аналізів насичувального і конкурентного зв'язування. Для пересвідчення в тому, що мічення радіоактивним ізотопом не усуває біологічну активність Cry-токсинів, проводили йодуванняв холодному вигляді, використовуючи NaI, відповідно до інструкцій з використання гранул для йодування Pierce® (Pierce Biotechnology, Thermo Scientific, Rockford IL). Результати біоаналізу показали, що і йодована трипсинова серцевина Cry3Aa, і Cry6Aa повної довжини 125 залишалися активними проти личинок західного кукурудзяного кореневого жука. I-Cry3Aa і 125 125 I-Cry6Aa одержували йодуванням гранулами для йодування Pierce® (Pierce) і Na I. Колонки для знесолення на вибір Zeba™ (Pierce) використовували для видалення не включеного або 125 вільного Na I з йодованого білка. Величини питомої радіоактивності йодованих Cry-білків знаходилися в діапазоні від 1 до 5 мкКі/мкг. Проводили множинні серії мічення й аналізів зв'язування. Приклад 11 - Аналізи специфічного зв'язування 125 Аналізи специфічного зв'язування виконували, використовуючи мічені I Cry-токсини, як описано раніше (Li et al. 2004b). Для визначення специфічного зв'язування й оцінки афінності зв'язування (константи дисоціації, Kd) і концентрації сайтів зв'язування (максимальна кількість токсину, специфічно зв'язаного з даною кількістю BBMV, Bmax) Cry3Aa і Cry6Aa з BBMV комах, 125 125 серії зростаючих концентрацій або I-Cry3Aa, або I-Cry6Aa інкубували з даною концентрацією (0,1 мг/мл) BBMV комах відповідно в 150 мкл 20 мМ Bis-Tris, pН 6,0, 150 мМ KCl з додаванням 0,1 % BSA при кімнатній температурі протягом 60 хв. при обережному струшуванні. Токсин, зв'язаний з BBMV, відділяли від вільних токсинів у суспензії центрифугуванням при 20000×g при кімнатній температурі протягом 8 хв. Осад після центрифугування двічі промивали 900 мкл льодяного такого ж буфера, що містить 0,1 % BSA. Радіоактивність, що залишається в осаді після центрифугування, вимірювали автоматично гамма-лічильником COBRAII AutoGamma (Packard, Canberra company) і враховували загальне зв'язування. Паралельно проводили іншу серію реакцій зв'язування, і 500-1000-кратний надлишок неміченого відповідного токсину включали в кожну з реакцій зв'язування для того, щоб він повністю зайняв усі ділянки специфічного зв'язування неміченого відповідного токсину на BBMV, що використовували для визначення неспецифічного зв'язування. Специфічне зв'язування 12 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 оцінювали відніманням неспецифічного зв'язування з загального зв'язування. Величини Kd і Bmax цих токсинів оцінювали, використовуючи число молекул токсину (пкмоль), специфічно зв'язаних на мікрограм білка BBMV, у порівнянні з концентраціями використаного міченого токсину, використовуючи програмне забезпечення GraphPad Prism 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA). Графіки складали з використанням програм або Microsoft Excel, або GraphPad Prism. Експерименти повторювали щонайменше три рази. Ці експерименти зв'язування 125 125 продемонстрували, що як I-Cry3Aa, так і I-Cry6Aa були здатні специфічно зв'язуватися з 125 125 BBMV (фіг. 1A і 1B). I-Cry3Aa і I-Cry6Aa мали афінність зв'язування Kd=24,0±9,76 і 10,14±8,29 (нМ), відповідно, і концентрацію ділянок зв'язування Bmax=21,97±5,99 пкмоль/мкг, 0,66±0,33 (пкмоль/мкг BBMV), відповідно. Приклад 12 - Аналізи конкурентного зв'язування Аналізи конкурентного зв'язування додатково проводили для визначення того, чи розділяють трипсинова серцевина Cry3Aa і Cry6Aa повної довжини ділянки зв'язування BBMV. Для аналізів гомологічного конкурентного зв'язування Cry3Aa, збільшувані кількості (0-2500 нМ) неміченого Cry3Aa спочатку змішували з 5 нМ міченого Cry3Aa, і потім інкубували з даною концентрацією (0,1 мг/мл) BBMV при кімнатній температурі протягом 60 хв., відповідно. 125 Процентні частки зв'язаного I-Cry3Aa з BBMV визначали для кожної з реакцій, у порівнянні з початковим специфічним зв'язуванням за відсутності неміченого конкурента. Аналіз 125 гетерологічного конкурентного зв'язування між I-Cry3Aa і неміченим Cry6Aa виконували для ідентифікації того, чи розділяють вони однаковий набір рецептора (рецепторів). Це досягалося збільшенням кількості неміченого Cry6Aa як конкурента, включеного в реакції, для конкуренції за передбачуваний рецептор(и) на BBMV з міченим Cry3Aa. Експерименти повторювали щонайменше три рази. Експериментальні результати продемонстрували, що Cry3Aa був здатний повністю витіснятися приблизно на 60 %, коли молярна концентрація збільшувалася 125 приблизно до 2500 нМ (500-кратний надлишок, у порівнянні з 5 нМ I-Cry3Aa). Приблизно 40 %, що залишаються, вважали неспецифічним зв'язуванням, яке було нездатне витіснятися на основі результатів насичувального зв'язування, описаних в іншому місці, і визначення неспецифічного зв'язування, і, таким чином, неспецифічне зв'язування віднімали, і воно тут не показане. Це свідчить про те, що специфічне зв'язування повністю витіснялося 500-кратним 125 надлишком неміченого Cry3Aa (фіг. 2). Однак Cry6Aa був нездатний витіснити I-Cry3Aa. Ці дані вказують на те, що Cry3Aa не розділяє рецептор або ділянку зв'язування Cry6Aa. Посилання Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72, 248-254. Li H., Oppert B., Higgins R.A., Huang F., Zhu K.Y., Buschman L.L., 2004a. Comparative analysis of proteinase activities of Bacillus thuringiensis-XQsistant and-susceptible Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae). Insect Biochem. Mol. Biol. 34, 753-762. Li H., Oppert B., Gonzalez-Cabrera J., Ferre J., Higgins R.A., Buschman L.L. and Zhu K.Y. and Huang F. 2004b. Binding analysis of Cry1Ab and Cry1Ac with membrane vesicles from Bacillus thuringiensis-resistant and-susceptible Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae). Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 52-57. Schneider J.C. Jenings A.F., Mun D.M., McGovern P.M., Chew L.C. 2005. Auxotrophic markers pyrF and proC can replace antibiotic markers on protein production plasmids in high-cell-density Pseudomonas fluorescens fermentation. Biotechnology Progress 21, 343-348. Wolfersberger M.G., Luthy P., Maurer A., Parenti P., Sacchi F., Giordana B., Hanozet G.M., 1987. Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the cabbage butterfly (Pieris brassicae). Comp. Biochem. Physiol. 86A, 301308. US Patent Application № 20080193974. 2008. BACTERIAL LEADER SUQUENCES FOR INCREASED EXPRESSION. US Patent Application № 20060008877, 2006. Expression systems with sec-system secretion. US Patent Application № 20080058262, 2008. rPA optimization. 13 UA 114391 C2 14 UA 114391 C2 15 UA 114391 C2 16 UA 114391 C2 17 UA 114391 C2 18 UA 114391 C2 19 UA 114391 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 1. Трансгенна рослина, яка продукує інсектицидно активний білок Cry3Aa і інсектицидно активний білок Cry6Aa, де зазначені інсектицидно активний білок Cry3Aa і інсектицидно активний білок Cry6Aa мають різні сайти зв'язування рецепторів в кишечнику кукурудзяного кореневого жука. 2. Насіння рослини за п. 1, де зазначене насіння містить зазначену ДНК, яка кодує зазначений інсектицидно активний білок Cry3Aa і зазначений інсектицидно активний білок Cry6Aa. 3. Множина рослин, яка містить рослини за п. 1. 4. Множина рослин за п. 3, де зазначена множина додатково містить резервні рослини, що не містять B.t.-білки, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 40 % зазначеної множини рослин. 5. Множина рослин за п. 4, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 30 % усіх культур зазначеної множини рослин. 6. Множина рослин за п. 4, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 20 % усіх культур зазначеної множини рослин. 20 UA 114391 C2 5 10 15 20 25 30 35 7. Множина рослин за п. 4, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 10 % усіх культур зазначеної множини рослин. 8. Множина рослин за п. 4, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 5 % усіх культур зазначеної множини рослин. 9. Множина рослин за п. 4, де в зазначеній множині відсутні резервні рослини. 10. Множина рослин за п. 4, де зазначені резервні рослини розташовані блоками або смугами. 11. Суміш насіння, яка містить резервне насіння від резервних рослин, що не містять B.t.-білки, і множину насіння за п. 2, де зазначене насіння містить ДНК, яка кодує зазначений інсектицидно активний білок Cry3Aa і зазначений інсектицидно активний білок Cry6Aa, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 40 % усього насіння у суміші. 12. Суміш насіння за п. 11, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 30 % усього насіння у суміші. 13. Суміш насіння за п. 11, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 20 % усього насіння у суміші. 14. Суміш насіння за п. 11, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 10 % усього насіння у суміші. 15. Суміш насіння за п. 11, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 5 % усього насіння у суміші. 16. Спосіб керування розвитком стійкості до Cry-білка у комахи, яка являє собою кукурудзяного кореневого жука, який включає висівання насіння за будь-яким з пунктів 11-15 для одержання множини рослин за будь-яким з пп. 3-10 і контактування комахи, яка являє собою кукурудзяного кореневого жука з множиною рослин за пунктами 3-10. 17. Множина рослин за будь-яким з пп. 3-10, де зазначені рослини займають більше ніж 10 акрів (40,5 га). 18. Рослина за п. 1, де зазначена рослина являє собою рослину маїсу. 19. Рослинна клітина рослини за п. 1, де рослинна клітина містить інсектицидно активний білок Cry3Aa і інсектицидно активний білок Cry6Aa. 20. Рослинна клітина рослини за п. 19, де зазначений білок Cry3Aa вибраний з групи, що складається з SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2, і зазначений білок Cry6Aa являє собою SEQ ID NO:3. 21. Рослинна клітина рослини за п. 19, де зазначений білок Cry3Aa містить послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2, і зазначений білок Cry6Aa містить SEQ ID NO:3. 22. Спосіб боротьби з кукурудзяним кореневим жуком приведенням у контакт зазначеної комахи з інсектицидним білком Cry3Aa і інсектицидним білком Cry6Aa, де зазначені інсектицидний білок Cry3Aa і інсектицидний білок Cry6Aa мають різні сайти зв'язування рецепторів в кишечнику кукурудзяного кореневого жука. 21 UA 114391 C2 22 UA 114391 C2 Комп’ютерна верстка М. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 23