Трансгенна соєва рослина, що продукує арахідонову кислоту
Формула / Реферат
1. Трансгенна соєва рослина, що містить:
а) перший рекомбінантний конструкт, що містить принаймні одну регуляторну послідовність, функціонально зв'язану з полінуклеотидом, що кодує принаймні один дельта-8 десатуразний поліпептид,
б) другий рекомбінантний конструкт, що містить принаймні одну регуляторну послідовність, функціонально зв'язану з полінуклеотидом, що кодує принаймні один дельта-9 елонгазний поліпептид,
в) третій рекомбінантний конструкт, що містить принаймні одну регуляторну послідовність, функціонально зв'язану з полінуклеотидом, що кодує принаймні один дельта-5 десатуразний поліпептид,
г) зниження дельта-15 десатуразної активності відносно дикого типу або нетрансформованої рослини,
де трансгенна соєва рослина продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше 5 % усіх омега-3 жирних кислот, що мають принаймні вісімнадцять вуглецевих атомів та принаймні чотири подвійних зв'язки.
2. Насіння, одержане від трансгенної рослини за п. 1.
3. Олія, одержана із насіння трансгенної соєвої рослини за п. 1, яка містить:
а) перший рекомбінантний конструкт, що містить принаймні одну регуляторну послідовність, функціонально зв'язану з полінуклеотидом, що кодує принаймні один дельта-8 десатуразний поліпептид,
б) другий рекомбінантний конструкт, що містить принаймні одну регуляторну послідовність, функціонально зв'язану з полінуклеотидом, що кодує принаймні один дельта-9 елонгазний поліпептид,
в) третій рекомбінантний конструкт, що містить принаймні одну регуляторну послідовність, функціонально зв'язану з полінуклеотидом, що кодує принаймні один дельта-5 десатуразний поліпептид,
г) зниження дельта-15 десатуразної активності відносно дикого типу або нетрансформованої рослини,
де трансгенна соєва рослина продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше 5 % усіх омега-3 жирних кислот, що мають принаймні вісімнадцять вуглецевих атомів та принаймні чотири подвійних зв'язки.
4. Харчовий продукт або замінник харчового продукту, що містить олію за п. 3.
5. Фармацевтичний продукт, що містить олію за п. 3.
6. Харчовий продукт за п. 4, який відрізняється тим, що вибирається із групи, яка складається із висушених шляхом розпилення частинок їжі, висушених шляхом виморожування частинок їжі, м'ясних продуктів, зернових продуктів, закусок, запечених продуктів, екструдованих продуктів, смажених продуктів, натуральних продуктів для здорового харчування, молочних продуктів, замінників м'яса, замінників сиру, замінників молока, їжі для домашніх тварин, корму для тварин або корму для аквакультур.
7. Продукт із цільних насінин, виготовлений із насіння за п. 2.
8. Змішаний олійний продукт, що містить олію за п. 3.
9. Продукти, отримані шляхом гідрування, фракціонування, переестерифікації або гідролізу олії за п. 3.
10. Побічні продукти, одержані під час виробництва олії за п. 3.
11. Побічні продукти за п. 10, які відрізняються тим, що дані побічні продукти є частково обробленими побічними продуктами.
12. Трансгенна соєва рослина, що містить:
а) перший рекомбінантний конструкт, що містить принаймні одну регуляторну послідовність, функціонально зв'язану з полінуклеотидом, що кодує принаймні один дельта-8 десатуразний поліпептид,
б) другий рекомбінантний конструкт, що містить принаймні одну регуляторну послідовність, функціонально зв'язану з полінуклеотидом, що кодує принаймні один дельта-9 елонгазний поліпептид,
в) третій рекомбінантний конструкт, що містить принаймні одну регуляторну послідовність, функціонально зв'язану з полінуклеотидом, що кодує принаймні один дельта-5 десатуразний поліпептид,
г) зниження дельта-15 десатуразної активності відносно дикого типу або нетрансформованої рослини,
де трансгенна соєва рослина продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше 5 % гама-ліноленової кислоти.
13. Трансгенна соєва рослина за п. 12, яка відрізняється тим, що продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше або рівно 1 % гама-ліноленової кислоти.
14. Трансгенна соєва рослина за п. 12, яка відрізняється тим, що продукує насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше або рівно 1 % гама-ліноленової кислоти, і менше 1 % усіх омега-3 жирних кислот, що мають принаймні вісімнадцять вуглецевих атомів та принаймні чотири подвійних зв'язки.
15. Насіння, одержане від трансгенної рослини за пп. 12, 13 або 14.
16. Олія, одержана із насіння за п. 15.
17. Харчовий продукт або замінник харчового продукту, що містить олію за п. 16.
18. Фармацевтичний продукт, що містить олію за п. 16.
19. Харчовий продукт за п. 17, який відрізняється тим, що вказаний продукт вибирається із групи, що складається із висушених шляхом розпилення частинок їжі, висушених шляхом виморожування частинок їжі, м'ясних продуктів, зернових продуктів, закусок, запечених продуктів, екструдованих продуктів, смажених продуктів, натуральних продуктів, молочних продуктів, замінників м'яса, замінників сиру, замінників молока, їжі для домашніх тварин, корму для тварин або корму для аквакультур.
20. Харчовий продукт за п. 17, який відрізняється тим, що вказаний продукт є напоєм.
21. Харчовий продукт за п. 17, який відрізняється тим, що даний харчовий продукт є дитячою сумішшю.
22. Харчовий продукт за п. 17, який відрізняється тим, що даний харчовий продукт є харчовою добавкою.
23. Харчовий продукт або замінник харчового продукту, що містить насіння за п. 15.
24. Харчовий продукт за п. 23, який відрізняється тим, що даний продукт вибирається із групи, що складається із висушених шляхом розпилення частинок їжі, висушених шляхом виморожування частинок їжі, м'ясних продуктів, зернових продуктів, закусок, запечених продуктів, екструдованих продуктів, смажених продуктів, натуральних продуктів, молочних продуктів, замінників м'яса, замінників сиру, замінників молока, їжі для домашніх тварин, корму для тварин або корму для аквакультур.
25. Продукт із цільних насінин, виготовлений із насіння за п. 15.
26. Змішаний олійний продукт, що містить олію за п. 16.
27. Продукти, отримані шляхом гідрування, фракціонування, переестерифікації або гідролізу олії за п. 15.
28. Побічні продукти, одержані під час виробництва олії за п. 15.
29. Побічні продукти за п. 28, які відрізняються тим, що дані побічні продукти є частково обробленими побічними продуктами.
Текст
Реферат: Винахід належить до трансгенної соєвої рослини, яка трансформована для продукування арахідонової кислоти, рекомбінантних конструкційних елементів, використаних у таких перетвореннях, способів виробництва арахідонової кислоти в соєвій рослині та використання олій і насіння, що одержані із такої трансформованої рослини, у різновиді харчових та кормових застосувань. UA 102063 C2 (12) UA 102063 C2 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Дана заявка оголошує пріоритет попередньої заявки США за номером 60/889373 від 12 лютого 2007 року, на яку у данному тексті зроблено повне посилання. Галузь винаходу Даний винахід стосується галузі біотехнології. Більш конкретно, цей винахід стосується олійних рослин, котрі були трансформовані для продукування високих рівнів арахідонової кислоти (омега-6 жирна кислота) та зниженого вмісту омега-3 жирних кислот. Рівень техніки Двома головними сімействами поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) є омега-3 жирні кислоти, такі як ейкозапентаенова кислота (ЕПК) та омега-6 жирні кислоти, такі як арахідонова кислота (АРК; цис-5, 8, 11, 14-ейкозатетраенова). АРК є важливим попередником у виробництві ейкозаноїдів (наприклад, простагландинів, тромбоксанів, простацикліну та лейкотриєнів). Крім того, АРК визнана як: (1) незамінна довголанцюгова поліненасичена жирна кислота (ПНЖК); (2) основна омега-6 жирна кислота, що знайдена у людському мозку; та, (3) важливий компонент материнського молока і багатьох молочних сумішей, що базується на її ролі у початковому розвитку неврологічної та зорової систем. Дорослі легко одержують АРК із їжі, такої як м'ясо, яйця та молоко. Дорослі також можуть синтезувати АРК із дієтичної гамма-ліноленової кислоти, хоча й з низькою ефективністю. Комерційними джерелами АРК олії звичайно слугують високорафінований та очищений риб'ячий жир або ферментація (наприклад, з використанням мікроорганізмів із родів Mortierella (ниткоподібний гриб), Entomophthora, Pythium та Porphyridium (червоні водорості)). Найбільшу увагу привертає те, що корпорація Martek Biosciences Corporation (Columbia, MD) виробляє ® грибкову олію, що містить АРК (ARASCO ; дивись патент США за номером 5658767), яка у значній мірі вільна від ЕПК і що отримана із або Mortierella alpina або Pythium insidiuosum. Одним із головних ринків для цієї олії є дитячі молочні суміші. На жаль, є кілька утруднень, пов'язаних із комерційним виробництвом ПНЖК (таких як АРК) із природних джерел. Природні джерела ПНЖК, такі як риба, мають тенденцію мати у значній мірі гетерогенні склади олій. Олії, одержані із цих джерел, можуть потребувати значного очищення для виділення однієї або кількох потрібних ПНЖК або для виробництва олії, збагаченої однією або кількома ПНЖК. Природні джерела також піддаються неконтрольованим флуктуаціям щодо їх наявності. Рибні запаси можуть піддаватись природним змінам або можуть виснажуватись через надмірний вилов риби. Риб'ячі жири мають неприємні смаки та запахи, котрих важко, якщо взагалі можливо, позбутись без значних економічних витрат у бажаному продукті, і це може зробити такі продукти неприйнятними як харчові добавки. Тваринні жири, і, зокрема, риб'ячі жири, можуть накопичувати забруднення із навколишнього середовища. Погодні умови та хвороби можуть спричинити флуктуації виходів як від рибних, так і рослинних джерел. Розширені поставки АРК із риби та через хімічний синтез недостатні для комерційних потреб. Тому являє інтерес знайти альтернативні засоби, що дають можливість виробляти комерційні кількості АРК. Біотехнологія з використанням олійних рослин пропонує привабливий шлях для виробництва АРК у безпечний та економічно ефективний спосіб. 1. Сумісна заявка правонаступника заявника, що знаходиться на розгляді, включає наступне: (1) PCT публікація за номером WO 04/071467 (опублікована 26 серпня 2004 року; реєстр уповноваженого за No. BB-1538) стосується виробництва ПНЖК в рослинах; (2) PCT публікація за номером WO 04/071178 (опублікована 26 серпня 2004 року; реєстр уповноваженого за No. BB-1531) стосується анексинових промоторів та їх застосування в експресії трансгенів у рослинах; (3) PCT публікація за номером WO 05/047479 (опублікована 26 травня 2005 року; реєстр уповноваженого за No. CL-2432) розкриває дельта-15 десатуразу із Fusarium moniliforme; (4) заявка США за номером 11/601563 (від 16 листопада 2006 року, опублікована 24 травня 2007 року; реєстр уповноваженого за No. BB-1562) розкриває дельта-9 елонгазу із Eulgena gracilis; (5) патентна заявка США за номером 11/737772 (від 20 квітня 2007 року; реєстр уповноваженого за No. BB-1566) розкриває дельта-8 десатуразу із Pavlova lutheri; (6) патентна заявка США за номером 11/748629 (від 15 травня 2007 року, опублікована 20 грудня 2007 року; реєстр уповноваженого за No. CL-3486) розкриває дельта-5 десатуразу із Eulgena gracilis; та (7) патентна заявка США за номером 11/876115 (від 22 жовтня 2007 року; реєстр уповноваженого за No. BB-1574) розкриває дельта-8 десатуразу із Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491. Стислий виклад винаходу У першому варіанті даний винахід стосується трансгенної олійної рослини, що продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % 1 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 арахідонової кислоти і менше 5 % усіх омега-3 жирних кислот, що мають принаймні вісімнадцять вуглецевих атомів та принаймні чотири подвійних зв'язки. У другому варіанті даний винахід стосується трансгенної олійної рослини, що продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше 1 % усіх омега-3 жирних кислот, що мають принаймні вісімнадцять вуглецевих атомів та принаймні чотири подвійних зв'язки. У третьому варіанті даний винахід стосується трансгенної олійної рослини, що продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше 5 % гамма-ліноленової кислоти. У четвертому варіанті даний винахід стосується трансгенної олійної рослини, що продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше або рівно 1 % гамма-ліноленової кислоти. У п'ятому варіанті даний винахід стосується трансгенної олійної рослини, що продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше або рівно 1 % гамма-ліноленової кислоти, і менше 1 % усіх омега3 жирних кислот, що мають принаймні вісімнадцять вуглецевих атомів та принаймні чотири подвійних зв'язки. Даний винахід також стосується насіння, одержаного від таких трансгенних олійних рослин, так само як і олії, отриманої із цього насіння. Олійні рослини, котрі можуть бути трансформовані, можуть бути вибрані із групи, яка складається із сої, видів Brassica, соняшника, маїсу, бавовни, льону та сафлору. Олії даного винаходу можуть бути введені у харчовий продукт або харчовий аналог, Медичний харчовий продукт або медичний харчовий аналог, фармацевтичний продукт, напій, дитячу суміш, харчову добавку, їжу для домашніх тварин, корм для тварин або корм для аквакультур. Харчові продукти, що містять такі олії, можуть бути вибрані із групи, яка складається із висушених шляхом розпилення частинок їжі, висушених шляхом виморожування частинок їжі, м'ясних продуктів, зернових продуктів, закусок, запечених продуктів, екструдованих продуктів, смажених продуктів, натуральних продуктів, молочних продуктів, аналогів м'яса, аналогів сиру, аналогів молока, їжі для домашніх тварин, корму для тварин або корму для аквакультур. Насіння, одержане від таких трансгенних олійних рослин, може бути введене в їжу для домашніх тварин, корм для аквакультур та/або корм для тварин. Являють також інтерес усі насіннєві продукти, виготовлені із насіння даного винаходу, змішані олійні продукти, що містять олію даного винаходу, продукти, отримані шляхом гідрування, фракціонування, перетерифікації або гідролізу олії теперішнього винаходу, побічній продукт(и), одержані підчас виробництва олії даного винаходу, та частково оброблені побічні продукти, отримані підчас виробництва олії теперішнього винаходу. Біологічні депозити Наступні плазміди зберігаються в Американському зібранні типових культур (АЗТК), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, і мають наступні позначення, номери доступу та дати вкладення (Таблиця 1). Таблиця 1 АЗТК депозити Плазміда pKR72 pKR275 pKКЕ2 45 50 Номер доступу PTA-6019 PTA-4989 PTA-4987 Дата вкладення 28 травня 2004 року 30 січня 2003 року 30 січня 2003 року Стислий опис малюнків та лістинги послідовностей Даний винахід може бути краще зрозумілим із наступного детального опису та супровідних малюнків і лістингу послідовностей, котрі утворюють частину даної заявки. ФІГ. 1 являє собою репрезентативний омега-3 та омега-6 жирнокислотний шлях, запроваджений для конверсії міристинової кислоти через різні інтермедіати у докозагексаенову кислоту. ФІГ. 2 являє собою карту плазміди pKR1084 (дивись також ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:7). ФІГ. 3 являє собою карту плазміди BC-Tpom_ALS (дивись також ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:10). 2 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ФІГ. 4 являє собою карту плазміди BC-Tpom_ALSrev (дивись також ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВNO:11). ФІГ. 5 являє собою карту плазміди BC-Tpom_Ann-EgD5_ALS (дивись також ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВNO:17). ФІГ. 6 являє собою карту плазміди BC-Tpom_Ann-EgD5_ALSrev (дивись також ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВNO:18). ФІГ. 7 являє собою карту плазміди KS263 (дивись також ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВNO:20). ФІГ. 8 являє собою карту плазміди BC-ELfad3_ALS (дивись також ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВNO:27). ФІГ. 9 являє собою карту плазміди BC-Tpom_Ann-ELfad3_ALS (дивись також ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВNO:29). ФІГ. 10 являє собою карту плазмід HPfad3ABA’_ALS (дивись також ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВNO:39). ФІГ. 11 являє собою карту плазміди BC-Tpom_Ann-HPfad3ABA’_ALS (дивись також NO:26). ФІГ. 12 показує комбінації конструкційних елементів для генерації арахідонової кислоти (АРК) у сої. ФІГ. 13 показує хроматограму ліпідного профілю клітинного екстракту Euglena gracilis, як описано у Прикладах. ФІГ. 14 являє собою карту плазміди pKKE2 (дивись також ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:40). ФІГ. 15 являє собою карту плазміди pKR973 (дивись також ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:41). ФІГ. 16 являє собою карту плазміди pKR1005 (дивись також ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:44). ФІГ. 17 показує профілі жирних кислот для зародків із події 4838-4-18 з найвищими рівнями арахідонової кислоти (дивись Приклад 13). ФІГ. 18 показує хроматограму ліпідного профілю клітинного екстракту Euglena anabaena, як описано у Прикладах. ФІГ. 19 являє собою карту плазміди pKR1183. ФІГ. 20 являє собою карту плазміди pKR1253. ФІГ. 21 являє собою карту плазміди pKR1255. ФІГ. 22 являє собою карту плазміди pKR1189. ФІГ. 23 являє собою карту плазміди pKR1229. ФІГ. 24 являє собою карту плазміди pKR1249. ФІГ. 25 являє собою карту плазміди pKR1193. ФІГ. 26 показує жирнокислотні профілі для п'яти подій з найнижчим середнім вмістом АЛК (середнє із 5 проаналізованих соматичних зародків сої) сумісно з подією (2148-3-8-1), що має жирнокислотний профіль, типовий для зародків дикого типу для даного експерименту. Жирні кислоти ідентифікуються як 16:0 (пальмітат), 18:0 (стеаринова кислота), 18:1 (олеїнова кислота), ЛК, та АЛК. Склади жирних кислот виражені як ваговий відсоток (ваг. %) від загальної кількості жирних кислот. ФІГ. 27 показує жирнокислотні профілі для п'яти подій, що мають найвищий середній вміст ДГЛК (середнє із 5 проаналізованих соматичних зародків сої). Жирні кислоти ідентифікуються як 16:0 (пальмітат), 18:0 (стеаринова кислота), 18:1 (олеїнова кислота), ЛК, АЛК, ЕДК, ЕРК, ДГЛК та ЕТК. Склади жирних кислот виражені як ваговий відсоток (ваг. %) від загальної кількості жирних кислот. ФІГ.28 показує усереднені жирнокислотні профілі (середнє із 10 соматичних зародків сої) для 20 подій з найвищими АРК. Жирні кислоти ідентифікуються як 16:0 (пальмітат), 18:0 (стеаринова кислота), 18:1 (олеїнова кислота), ЛК, АЛК, ЕДК, СКК, ДГЛК, АРК, ЕРК, ЮН, ЕТК та ЕПК. Склади жирних кислот виражені як ваговий відсоток (ваг. %) від загальної кількості жирних кислот. Жирні кислоти, перелічені як "інші", включають: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), СТК, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) або 20:2 (8,11) та ДПК. ФІГ. 29 показує фактичні жирнокислотні профілі для кожного соматичного зародка сої із однієї події (AFS 5416-8-1-1) із середнім АРК вмістом 17.0 % та середнім EПК вмістом 1.5 %. Жирні кислоти ідентифікуються як 16:0 (пальмітат), 18:0 (стеаринова кислота), 18:1 (олеїнова кислота), ЛК, АЛК, ЕДК, СКК, ДГЛК, АРК, ЕРК, ЮН, ЕТК та ЕПК. Склади жирних кислот виражені як ваговий відсоток (ваг. %) від загальної кількості жирних кислот. Жирні кислоти, перелічені як "інші", включають: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), СТК, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) або 20:2 (8,11) та ДПК. Фіг. 30 показує усереднені жирнокислотні профілі (середнє із 9 або 10 соматичних зародків сої) для 20 подій з найвищими АРК. Жирні кислоти ідентифікуються як 16:0 (пальмітат), 18:0 (стеаринова кислота), 18:1 (олеїнова кислота), ЛК, АЛК, ЕДК, СКК, ДГЛК, АРК, ЕРК, ЮН, ЕТК та ЕПК. Склади жирних кислот виражені як ваговий відсоток (ваг. %) від загальної кількості жирних 3 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислот. Жирні кислоти, перелічені як "інші", включають: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), STA, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) або 20:2 (8,11) та ДПК. ФІГ. 31 показує ліпідні профілі для маси T2 насіння арабідопсису (Arabidopsis) для 19 трансформованих подій. Жирні кислоти ідентифікуються як 16:0 (пальмітат), 18:0 (стеаринова кислота), 18:1 (олеїнова кислота), ЛК, АЛК, 20:1 (ейкозенова кислота), ЕДК, ДГЛК, ЕРК, ЕТК та ЕПК. Склади жирних кислот виражені як ваговий відсоток (ваг. %) від загальної кількості жирних кислот. Жирні кислоти, перелічені як "інші", включають: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), СТК, 20:0 (арахінова кислота), 20:2 (7,11) або 20:2 (8,11), СКК та ЮП. ФІГ. 32 показує ліпідні профілі окремих T2 насінин арабідопсису, трансформованих pKR1193 для експресії Euglena anabaena дельта-9 елонгази з Euglena anabaena дельта-8 десатуразою та Euglena anabaena дельта-5 десатуразою в арабідопсисі. Жирні кислоти ідентифікуються як 16:0 (пальмітат), 18:0 (стеаринова кислота), 18:1 (олеїнова кислота), ЛК, ГЛК, АЛК, СТК, 20:1 (ейкозенова кислота), ЕДК, ДГЛК, ЕРК, ЕТК та ЕПК і ДПК; і, склади жирних кислот, перелічених на ФІГ. 32, виражені як ваговий відсоток (ваг. %) від загальної кількості жирних кислот. Для ФІГ. 32 жирні кислоти, перелічені як "інші", включають: 18:3 (5,9,12), 20:0 (арахінова кислота), 20:2 (7,11) або 20:2 (8,11) та 22:0. Описи послідовностей підсумовують Лістинг послідовностей, що додається. Лістинг послідовностей містить однолітерні коди для символів нуклеотидних послідовностей та одно- та трилітерні коди для амінокислот, як визначено у стандартах IUPAC-IUB, що описані у Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) та у Biochemical Journal 219(2):345-373 (1984). ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:1 являє собою нуклеотидну послідовність KS129. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:2 являє собою нуклеотидну послідовність PKR457. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:3 являє собою нуклеотидну послідовність pKR606. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:4 являє собою нуклеотидну послідовність pKR277. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:5 являє собою нуклеотидну послідовність pKR804. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:6 являє собою нуклеотидну послідовність pKR953. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:7 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1084. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:8 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1002. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:9 являє собою нуклеотидну послідовність РКR226. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:10 являє собою нуклеотидну послідовність BC-Tpom_ALS. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:11 являє собою нуклеотидну послідовність BC-Tpom_ALSrev. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:12 являє собою нуклеотидну послідовність pKR132. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:13 являє собою нуклеотидну послідовність олігонуклеотиду EgD5-5Not. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:14 являє собою нуклеотидну послідовність олігонуклеотиду EgD5-3Not. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:15 являє собою нуклеотидну послідовність pKR268. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:16 являє собою нуклеотидну послідовність Ann-EgD5. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:17 являє собою нуклеотидну послідовність BC-Tpom_AnnEgD5_ALS. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:18 являє собою нуклеотидну послідовність BC-Tpom_AnnEgD5_ALSrev. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:19 являє собою нуклеотидну послідовність KS133. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:20 являє собою нуклеотидну послідовність KS263. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:21 являє собою нуклеотидну послідовність ELfad3-5Not. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:22 являє собою нуклеотидну послідовність ELfad3-3Not. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:23 являє собою нуклеотидну послідовність ELVISLIVES/fad3 кластера ELfad3Not. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:24 являє собою нуклеотидну послідовність pKR179. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:25 являє собою нуклеотидну послідовність BC-ELfad3. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:26 являє собою нуклеотидну послідовність BC-Tpom_AnnHPfad3ABA’_ALS. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:27 являє собою нуклеотидну послідовність BC-ELfad3_ALS. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:28 являє собою нуклеотидну послідовність Ann-ELfad3. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:29 являє собою нуклеотидну послідовність BC-Tpom_AnnELfad3_ALS. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:30 являє собою нуклеотидну послідовність HPfad3-1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:31 являє собою нуклеотидну послідовність HPfad3-2. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:32 являє собою нуклеотидну послідовність HPfad3AB. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:33 являє собою нуклеотидну послідовність HPfad3-3. 4 UA 102063 C2 5 10 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:34 являє собою нуклеотидну послідовність HPfad3-4. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:35 являє собою нуклеотидну послідовність HPfad3A". ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:36 являє собою нуклеотидну послідовність HPfad3ABA". ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:37 являє собою нуклеотидну послідовність BC-HPfad3ABA". ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:38 являє собою нуклеотидну послідовність Ann-HPfad3ABA". ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:39 являє собою нуклеотидну послідовність HPfad3ABA’_ALS. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:40 являє собою нуклеотидну послідовність pKKE2. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:41 являє собою нуклеотидну послідовність pKR973. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:42 являє собою нуклеотидну послідовність олігонуклеотидного праймера oEugEL1-1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:43 являє собою нуклеотидну послідовність олігонуклеотидного праймера oEugEL1-2. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:44 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1005. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:45 являє собою нуклеотидну послідовність pKR906. 15 Таблиця 2 Зведення нуклеїновокислотних та амінокислотних послідовностей різних ПНЖК генів біосинтетичного шляху Організм та ген Euglena gracilis дельта-9 елонгаза Pavlova lutheri дельта-8 десатураза Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491 дельта-8 десатураза Mortierella alpina дельта-5 десатураза Euglena gracilis дельта-5 десатураза Saprolegnia diclina дельта-17 десатураза Fusarium moniliforme дельта-15 десатураза 20 25 30 35 Скорочення EgD9elo PavD8 Нуклеїновокислотна ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO: та амінокислотна ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO: ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:46 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:47 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:48 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:49 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:50 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:51 TpomD8 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:52 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:53 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:54 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:55 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:56 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:57 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:58 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:59 MaD5 EgD5 SdD17 FmD15 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:60 являє собою нуклеотидну послідовність SMART IV олігонуклеотиду. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:61 являє собою нуклеотидну послідовність адапторного праймера із набору Invitrogen 3'-RACE. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:62 являє собою нуклеотидну послідовність TpomNot-5. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:63 являє собою нуклеотидну послідовність TpomNot-3. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:64 являє собою нуклеотидну послідовність pLF114-10. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:65 являє собою нуклеотидну послідовність pKR271. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:66 являє собою нуклеотидну послідовність pKR886r. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:67 являє собою нуклеотидну послідовність pKR72. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:68 являє собою нуклеотидну послідовність oCon-1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:69 являє собою нуклеотидну послідовність oCon-2. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:70 являє собою нуклеотидну послідовність модифікованого Kti/NotI/Kti3'Salb3' кластера. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:71 являє собою нуклеотидну послідовність pKR970. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:72 являє собою нуклеотидну послідовність PvDES5’Not-1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:73 являє собою нуклеотидну послідовність PvDES3’Not-1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:74 являє собою нуклеотидну послідовність pLF113. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:75 являє собою нуклеотидну послідовність pKR287. 5 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:76 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1155. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:77 являє собою нуклеотидну послідовність pKR952. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:78 являє собою нуклеотидну послідовність праймераM13F. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:79 являє собою амінокислотну послідовність Pavlova sp. CCMP459 C20-PUFA елонгази (НЦБІ номер доступу AAV33630 (GI 54307108; CDS AY630573) ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:80 являє собою нуклеотидну послідовність 5" кінця кДНК інсерту eeg1c.pk016.e6.f. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:81 являє собою нуклеотидну послідовність eeg1c.pk016.e6.f. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:82 являє собою нуклеотидну послідовність кодонової ділянки eeg1c.pk016.e6.f. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:83 являє собою виведену амінокислотну послідовність ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:82, на яку також посилаються як на амінокислотну послідовність Euglena gracilis DHA синтази 1 (EgDHAsyn1)). ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:84 являє собою амінокислотну послідовність дельта-4 жирнокислотної десатурази із Euglena gracilis ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:85 являє собою амінокислотну послідовність C20PUFA елонгази 2 із Ostreococcus tauri. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:86 являє собою амінокислотну послідовність C20PUFA елонгази 2 із Thalassiosira pseudonana. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:87 являє собою нуклеотидну послідовність дельта-4 десатурази із Thraustochytrium aureum. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:88 являє собою амінокислотну послідовність дельта-4 десатурази із Schizochytrium aggregatum. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:89 являє собою амінокислотну послідовність дельта-4 десатурази із Thalassiosira pseudonana. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:90 являє собою амінокислотну послідовність дельта-4 десатурази із Isochrysis galbana. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:91 являє собою нуклеотидну послідовність EgDHAsyn1 C20 елонгазного домену. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:92 являє собою амінокислотну послідовність EgDHAsyn1 C20 елонгазного домену (EgDHAsyn1C20Elo1). ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:93 являє собою амінокислотну послідовність KNGK NG-мотиву. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:94 являє собою амінокислотну послідовність PENGA NGмотиву. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:95 являє собою амінокислотну послідовність PENGA NGмотиву. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:96 являє собою амінокислотну послідовність PCENGTV NGмотиву. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:97 являє собою нуклеотидну послідовність EgDHAsyn1 збагаченого проліном лінкера. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:98 являє собою амінокислотну послідовність EgDHAsyn1 збагаченого проліном лінкера. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:99 являє собою нуклеотидну послідовність pLF121-1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:100 являє собою нуклеотидну послідовність pLF121-2. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:101 являє собою нуклеотидну послідовність кодонової ділянки EaD9Elo1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:102 являє собою нуклеотидну послідовність кодонової ділянки EaD9Elo2. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:103 являє собою амінокислотну послідовність EaD9Elo1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:104 являє собою амінокислотну послідовність EaD9Elo2. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:105 являє собою нуклеотидну послідовність pLF119. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:104 являє собою нуклеотидну послідовність кодонової ділянки EaD5Des1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:107 являє собою амінокислотну послідовність EaD5Des1… ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:108 являє собою нуклеотидну послідовність EaD9-5Bbs. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:109 являє собою нуклеотидну послідовність EaD9-3злиття. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:110 являє собою нуклеотидну послідовність EgDHAsyn1Link5злиття. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:111 являє собою нуклеотидну послідовність MWG511. 6 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:112 являє собою нуклеотидну послідовність EgD9eloEgDHAsyn1Link. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:113 являє собою нуклеотидну послідовність pLF124. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:114 являє собою нуклеотидну послідовність KS366. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:115 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1177. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:116 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1179. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:117 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1183. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:118 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1237. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:119 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1252. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:120 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1253. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:121 являє собою нуклеотидну послідовність олігонуклеотиду oEAd5-1-1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:122 являє собою нуклеотидну послідовність олігонуклеотиду oEAd5-1-2. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:123 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1136. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:124 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1139. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:125 являє собою нуклеотидну послідовність pKR561. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:126 являє собою нуклеотидну послідовність олігонуклеотиду HPfad3A’-2. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:127 являє собою нуклеотидну послідовність олігонуклеотиду HPfad3ABA’-2. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:128 являє собою нуклеотидну послідовність pLF129. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:129 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1189. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:130 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1209. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:131 fad3c CDS. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:132 являє собою амінокислотну послідовність fad3c. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:133 являє собою нуклеотидну послідовність олігонуклеотиду fad3c-5. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:134 являє собою нуклеотидну послідовність олігонуклеотиду fad3c-3. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:135 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1213. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:136 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1218. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:137 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1210. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:138 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1219. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:139 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1225. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:140 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1229. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:141 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1249. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:142 являє собою нуклеотидну послідовність Euglena gracilis дельта-8 десатурази CDS (Eg5). ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:143 являє собою нуклеотидну послідовність векторспецифічного праймера pDonor222Eg5-1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:144 являє собою нуклеотидну послідовність D8DEG3-1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:145 являє собою нуклеотидну послідовність D8DEG3-2. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:146 являє собою нуклеотидну послідовність D8DEG3-3. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:147 являє собою нуклеотидну послідовність D8DEG3-4. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:148 являє собою нуклеотидну послідовність pHD23-1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:149 являє собою амінокислотну послідовність Euglena gracilis дельта-8 десатурази (NCBI No. доступу AAD45877). ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:150 являє собою нуклеотидну послідовність pLF118-3. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:151 являє собою нуклеотидну послідовність кодонової ділянки EaD8Des3. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:152 являє собою амінокислотну послідовність EaD8Des3. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:153 являє собою нуклеотидну послідовність олігонуклеотиду EaD8-5. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:154 являє собою нуклеотидну послідовність олігонуклеотиду EaD8-3. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:155 являє собою нуклеотидну послідовність pLF120-3. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:156 являє собою нуклеотидну послідовність oEAd9el1-1. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:157 являє собою нуклеотидну послідовність oEAd9el1-2. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:158 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1137. 7 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:159 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1140. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:160 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1173. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:161 являє собою нуклеотидну послідовність pKR393. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:162 являє собою нуклеотидну послідовність pKR407. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:163 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1176. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:164 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1178. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:165 являє собою нуклеотидну послідовність оліго oKti5. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:166 являє собою нуклеотидну послідовність оліго oKti6. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:167 являє собою нуклеотидну послідовність pKR193. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:168 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1174. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:169 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1186. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:170 являє собою нуклеотидну послідовність pKR1193. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:171 являє собою послідовність SeqE праймера. ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:172 являє собою послідовність SeqW праймера. Детальний опис винаходу На кожну із наведених у даному тексті робіт та інших матеріалів зроблено повне посилання. Як застосовується у данному тексті та у доданій формулі винаходу, сингулярні форми "a", "an", та "the" включають, якщо у контексті не зазначено інше, множинні посилання. Так, наприклад, посилання на "a plant" включає множину таких рослин, посилання на "a cell" включає одну або кілька клітин та їх еквівалентів, що відомі фахівцям у даній галузі, і т.д. У контексті даної заявки використаний ряд термінів та скорочень. Запроваджені наступні визначення. Термін "EgD9elo" стосується дельта-9 елонгази, виділеної із Euglena gracilis (ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NOs:46 та 47; дивись також сумісну заявку правонаступника заявника, що знаходиться на розгляді, за номером U.S. Application No. 11/601563 (від 16 листопада 2006 року, що опублікована 24 травня 2007 року; реєстр уповноваженого за No. BB-1562). Термін "PavD8" стосується дельта-8 десатуразного ензиму, виділеного із Pavlova lutheri (ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NOs:48 та 49; дивись також сумісну заявку правонаступника заявника, що знаходиться на розгляді, за номером U.S. Рatent Application No. 11/737772 (від 20 квітня 2007; реєстр уповноваженого за No. BB-1566). Термін "TpomD8" стосується дельта-8 десатуразного ензиму, виділеного із Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491 (ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NOs:50 та 51; дивись також сумісну заявку правонаступника заявника, що знаходиться на розгляді, за номером U.S. Patent Application No. 11/876115 (від 22 жовтня 2007 року; реєстр уповноваженого за No. BB-1574). 3. Термін "MaD5" стосується дельта-5 десатуразного ензиму, виділеного із Mortierella alpina (ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NOs:52 та 53; дивись також номер доступу GenBank AF067654 та патент США за номером 6075183). Термін "EgD5" стосується дельта-5 десатуразного ензиму, виділеного із Euglena gracilis (ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NOs:54 та 55; дивись також сумісну заявку правонаступника заявника, що знаходиться на розгляді, за номером U.S. Рatent Application No. 11/748629 (від 15 травня 2007 року, опублікована 20 грудня 2007 року; реєстр уповноваженого за No. CL-3486). Термін "SdD17" стосується дельта-17 десатуразного ензиму, виділеного із Saprolegnia diclina (ПОСЛІДОВНОСТІ КОДІВ NOs:56 та 57). Термін "FmD15" стосується дельта-15 десатуразного ензиму, виділеного із Fusarium moniliforme (ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NOs:58 та 59; дивись також сумісну заявку правонаступника заявника, що знаходиться на розгляді, за номером РСТ Publication No. WO 05/047479 (опублікована 26 травня 2005 року; реєстр уповноваженого за No. CL-2432). "Відкрита рамка зчитування" має скорочення ВРЗ. "Полімеразна ланцюгова реакція" має скорочення ПЛР. "Американське зібрання типових культур" має скорочення АЗТК. "Поліненасичена жирна кислота(и)” має скорочення ПНЖК. "Триацилгліцерини" мають скорочення ТАГ. Термін "жирні кислоти" стосується довголанцюгових аліфатичних кислот (алканових кислот) з варіюючими довжинами ланцюга, від приблизно C12 до C22 (хоча відомі кислоти як з довшими, так і коротшими довжинами ланцюгів). Домінуючі довжини ланцюгів лежать у межах від C16 до C22. Додаткові деталі, що стосуються відмінностей між "насиченими жирними кислотами" та "ненасиченими жирними кислотами", "мононенасиченими жирними кислотами" та "поліненасиченими жирними кислотами ” (або "ПНЖК"), та "oмега-6 жирними кислотами" (n-6 або n-6) і "омега-3 жирними кислотами" (n-3 або n-3) подані у РСТ публікації за номером WO 04/101757. 8 UA 102063 C2 5 10 Омега-3 жирні кислоти являють собою сімейство поліненасичених жирних кислот, котрі мають таку спільну рису як подвійний зв'язок вуглець-вуглець в омега-3 положенні. Термін омега-3 ("n-3, “ω-3) означає, що перший подвійний зв'язок існує як третій зв'язок вуглецьвуглець від кінцевого метильного кінця (омега) вуглецевого ланцюга. Важливими омега-3 жирними кислотами у харчуванні є наступні: альфа-ліноленова кислота (АЛК), ейкозапентаенова кислота (ЕПК) та докозагексаенова кислота (ДГК). Людський організм не може синтезувати омега-3 жирні кислоти de novo, але може синтезувати всі інші потрібні омега3 жирні кислоти із простішої омега-3 жирної кислоти АЛК. Таким чином, АЛК є незамінним нутрієнтом, що має одержуватись із їжі, і інші омега-3 жирні кислоти, котрі можуть бути або синтезовані із АЛК або отримані із їжі, також інколи називаються незамінними нутрієнтами. У Таблиці 3 нижче перелічені омега-3 жирні кислоти. Таблиця 3 Омега-3 жирні кислоти Загальна назва α-ліноленова кислота (АЛК) Стеаридонова кислота Ейкозатетраенова кислота Ейкозапентаенова кислота (EПК) Докозапентаенова кислота Докозагексаенова кислота (ДГК) 15 Назва ліпіду 18:3 (n-3) 18:4 (n-3) 20:4 (n-3) 20:5 (n-3) 22:5 (n-3) 22:6 (n-3) Хімічна назва Октадека-9,12,15-триєнова кислота Октадека-6,9,12,15-тетраенова кислота Ейкоза-8,11,14,17-тетраенова кислота Ейкоза-5,8,11,14,17-пентаенова кислота Докоза-7,10,13,16,19-пентаенова кислота Докоза-4,7,10,13,16,19-гексаенова кислота Омега-6 жирні кислоти є жирними кислотами, де термін "омега-6" означає, що перший подвійний зв'язок у вуглецевому каркасі жирної кислоти знаходиться в омега мінус 6 положенні; тобто положенні шостого вуглецю від кінця даної жирної кислоти. Лінолева кислота (18:2), омега-6 жирна кислота з найкоротшим ланцюгом, є незамінною жирною кислотою. Арахідонова кислота (20:4) є фізіологічно значимою n-6 жирною кислотою, і є попередником простагландинів та інших фізіологічно активних молекул. У Таблиці 4 подані омега-6 жирні кислоти. 20 Таблиця 4 Омега-6 жирні кислоти Загальна назва Лінолева кислота Гамма-ліноленова кислота (ГЛК) Ейкозадієнова кислота Дигомо-гамма-ліноленова кислота Арахідонова кислота(АРК) Докозадієнова кислота Адренова кислота Докозапентаенова кислота 25 30 35 Назва ліпіду 18:2 (n-6) 18:3 (n-6) 20:2 (n-6) 20:3 (n-6) 20:4 (n-6) 22:2 (n-6) 22:4 (n-6) 22:5 (n-6) Хімічна назва 9,12-октадекадієнова кислота 6,9,12-октадекатриєнова кислота 11,14-ейкозадієнова кислота 8,11,14-ейкозатриєнова кислота 5,8,11,14-ейкозатетраенова кислота 13,16-докозадієнова кислота 7,10,13,16-докозатетраенова кислота 4,7,10,13,16-докозапентаенова кислота Жирні кислоти описані у даному тексті за допомогою простої системи позначень "X:Y", де X є кількість вуглецевих атомів (C) у конкретній жирній кислоті, і Y – кількість подвійних зв'язків. Цифра після позначення жирної кислоти вказує на положення подвійного зв'язку від карбоксильного кінця жирної кислоти, з афіксом "c" для цис-конфігурації подвійного зв'язку (наприклад, пальмітинова кислота (16:0), стеаринова кислота (18:0), олеїнова кислота (18:1, 9c), петрозелінова кислота (18:1, 6c), ЛК (18:2, 9c, 12c), ГЛК (18:3, 6c, 9c, 12c) та АЛК (18:3, 9c, 12c, 15c)). Якщо не зазначено інше, 18:1, 18:2 та 18:3 стосуються, відповідно, олеїнової, ЛК та АЛК жирних кислот. Якщо спеціально не зазначено інше, подвійні зв'язки мають, як передбачається, цис- конфігурацію. Наприклад, подвійні зв'язки у 18:2 (9,12), як гадають, знаходяться у цисконфігурації. Номенклатура, що використовується для опису ПНЖК у даній заявці, подана у Таблиці 5 нижче. У стовпчику, позначеному "Стенографічне позначення", застосовується система омегапосилань для зазначення кількості вуглецевих атомів, кількості подвійних зв'язків та положення подвійного зв'язку, найближчого до омега вуглецевого атому, рахуючи від цього омега вуглецевого атому (що з цією метою позначений номером 1). Решта таблиці містить загальні 9 UA 102063 C2 назви омега-3 та омега-6 жирних кислот та їх попередників, скорочення, що будуть використані далі у даній специфікації, та хімічну назву кожної сполуки. Таблиця 5 Номенклатура поліненасичених жирних кислот та попередників ЛК ГЛК EДК Тетрадеканова Гексадеканова 9-гексадеканова Октадеканова цис-9-октадеканова цис-9,12-октадекадієнова цис-6,9,12-октадекатриєнова цис-11,14-ейкозадієнова Стеногра-фічне позначення 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 ω-6 18:3 ω-6 20:2 ω-6 ДГЛА або ГГЛА цис-8,11,14-ейкозатриєнова 20:3 ω-6 СКК АРК АЛК СТК ЕТрК або ЕРК ЕТК ЮП або ЮН ЕПК ДПК цис-5,11,14-ейкозатриєнова цис-5,8,11,14-ейкозатетраенова цис-9,12,15-октадекатриєнова цис-6,9,12,15-октадекатетраенова цис-11,14,17- ейкозатриєнова цис-8,11,14,17-ейкозатетраенова цис-5,11,14,17-ейкозатриєнова Цис-5,8,11,14,17-ейкозапетаенова цис-7,10,13,16,19-докозапентаенова цис-4,7,10,13,16,19докозагексаенова 20:3b ω-6 20:4 ω-6 18:3 ω-3 18:4 ω-3 20:3 ω-3 20:4 ω-3 20:4b ω-3 20:5 ω-3 22:5 ω-3 Загальна назва Міристинова Пальмітинова Пальмітолеї-нова Стеаринова Олеїнова Лінолева Гамма-ліноленова Ейкозадіє-нова Дигомо-гаммаліноленова Скіадонова Арахідонова Альфа-ліноленова Стеаридоно-ва Ейкозатриє-нова Ейкозатетра-енова Юніперонова Ейкозапента-енова Докозапента-енова Докозагекса-енова 5 10 15 20 25 30 Скорочення -ПК --- ДГК Хімічна назва 22:6 ω-3 Термін "арахідонова кислота" ("АРК") стосується омега-6 жирної кислоти, що має хімічну формулу C20H32O2. Вона також має назву 20:4 (n-6). Її систематична хімічна назва подана у Таблиці 5 вище. Вона є незамінним дієтичним компонентом для ссавців. Вільна кислота є попередником для біосинтезу простагландинів, тромбоксанів, похідних гідроксиейкозатетраенової кислоти, включаючи лейкотриєни. Всередині клітин дана кислота знаходиться в етерифікованій формі як головний ацильний компонент мембранних фосфоліпідів. У рослинах АРК знаходиться у невеликій кількості або зовсім відсутня. Як тут застосовується, АРК охоплює вільну кислоту та її похідні, наприклад, її етерифіковану форму. Термін "високорівневе продукування АРК" стосується трансгенної олійної рослини, що продукує зріле насіння, в якому повний насіннєвий жирнокислотний профіль містить принаймні 10 % АРК, або принаймні 15 % АРК, або принаймні 20 % АРК, або принаймні 25 % АРК. Структурна форма АРК не є лімітуючою; так, наприклад, АРК може існувати у насіннєвому жирнокислотному профілі як вільні жирні кислоти або в етерифікованих формах, таких як ацилгліцерини, фосфоліпіди, сульфоліпіди або гліколіпіди. Термін "знижений вміст омега-3 жирних кислот" стосується трагсгенної олійної рослини, що продукує зріле насіння, в якому повний насіннєвий жирнокислотний профіль містить менше 5 % загальної кількості омега-3 жирних кислот, або, краще, менше 1 % загальної кількості омега-3 жирних кислот, або будь-яке ціле число % між 5 % та 1 %, таке як 4 %, 3 % та 2 %. Термін "знижений вміст ГЛК" стосується трансгенної олійної рослини, що продукує зріле насіння, в якому повний насіннєвий жирнокислотний профіль містить менше 5 % загальної кількості ГЛК, або, краще, менше чи рівно 1 % загальної кількості ГЛК, або будь-яке ціле число % між 5 % та 1 %, таке як 4 %, 3 % та 2 %. Метаболічний шлях або біосинтетичний шлях, у біохімічному сенсі, може розглядатись як ряд хімічних реакцій, що відбуваються у клітині, котрі каталізуються ензимами, або для утворення метаболічного продукту, який використовується або зберігається клітиною, або для ініціації іншого метаболічного шляху (що був потім названий стадією генерації потоку). Багато із цих шляхів детально розроблені і включають покрокову модифікацію первинної речовини для її формування у продукт, який має бажану точну хімічну структуру. 10 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "ПНЖК біосинтетичний шлях" стосується метаболічного процесу, що перетворює олеїнову кислоту у ЛК, ЕДК, ГЛК, ДГЛК, AК, АЛК, СТК, ЕТрК, ETК, EПК, ДПК та ДГК. Цей процес добре описаний у літературі (наприклад, дивись РСТ публікацію за номером WO 06/052870). Спрощено кажучи, цей процес включає елонгацію вуглецевого ланцюга шляхом додавання вуглецевих атомів та десатурації молекули шляхом додавання подвійних зв'язків через ряд спеціальних десатураційних та елонгаційних ензимів (тобто "ензимів ПНЖК біосинтетичного шляху"), що присутні у мембрані ендоплазматичного ретикулума. Більш конкретно, "ензими ПНЖК біосинтетичного шляху" стосуються будь-якого із наступних ензимів (та генів, котрі кодують зазначені ензими), пов'язаних з біосинтезом ПНЖК, включаючи: дельта-4 десатуразу, дельта-5 десатуразу, дельта-6 десатуразу, дельта-12 десатуразу, дельта-15 десатуразу, дельта-17 десатуразу, дельта-9 десатуразу, дельта-8 десатуразу, дельта-9 елонгазу, С14/16 елонгазу, С16/18 елонгазу, С18/20 елонгазу та/або С20/22 елонгазу. Термін "омега-3/омега-6 жирнокислотний біосинтетичний шлях" стосується набору генів, котрі, при експресії за відповідних умов, кодують ензими, що каталізують продукування кожної або обох омега-3 та омега-6 жирних кислот. Типово, гени, що включені у біосинтетичний омега3/омега-6 жирнокислотний шлях, кодують ПНЖК ензими біосинтетичного шляху. Репрезентативний шлях ілюструється ФІГ. 1, запроваджуючи конверсію міристинової кислоти через різні інтермедіати до ДГК, що демонструє, у який спосіб обидві омега-3 та омега-6 жирні кислоти можуть продукуватись із спільного джерела. Даний шлях природно поділяється на дві частини, де в одній частині будуть генеруватись омега-3 жирні кислоти а в другій частині омега6 жирні кислоти. Термін "функціональний", як тут застосовується у контексті з омега-3/омега-6 жирнокислотним біосинтетичним шляхом, означає, що деякі (або всі) гени на даному шляху експресують активні ензими, забезпечуючи in vivo каталіз або конверсію субстрату. Слід розуміти, що "омега-3/омега-6 жирнокислотний біосинтетичний шлях" або "функціональнийl омега-3/омега-6 жирнокислотний біосинтетичний шлях" не передбачає, що потрібні всі ПНЖК ензимні гени біосинтетичного шляху, оскільки ряд жирнокислотних продуктів буде потребувати лише експресії підмножини генів цього шляху. Термін "шлях дельта-9 елонгаза/дельта-8 десатураза" стосується біосинтетичного шляху для продукування довголанцюгових ПНЖК. Цей шлях, як мінімум, включає дельта-9 елонгазу та дельта-8 десатуразу, запроваджуючи таким чином біосинтез ДГЛК та/або ЕТК із ЛК та AЛК, відповідно. З експресією інших десатураз та елонгаз можуть бути також синтезовані AРК, EПК, ДПК та ДГК. Цей шлях може мати переваги у деяких варіантах, оскільки біосинтез ГЛК та/або СТК виключений. Термін "проміжна жирна кислота" стосується будь-якої жирної кислоти, що отримана жирнокислотним метаболічним шляхом, що може перетворюватись далі до бажаного продукту цим шляхом під дією ензимів іншого метаболічного шляху. Наприклад, коли ЕПК продукується з використанням дельта-9 елонгаза/дельта-8 десатуразного шляху, можуть утворитись EДК, EТрК, ДГЛК, ETК та AРК, і їх вважають "проміжними жирними кислотами", оскільки ці жирні кислоти можуть бути конвертовані далі у ЕПК під дією ензимів іншого метаболічного шляху. Термін "побічна жирна кислота" стосується будь-якої жирної кислоти, що одержана на жирнокислотному метаболічному шляху, що не є ані продуктом призначення даного шляху, ані "проміжною жирною кислотою" даного шляху. Наприклад, коли ЕПК одержується з використанням дельта-9 елонгаза/дельта-8 десатуразного шляху, під дією дельта-5 десатурази на EДК або EТрК, відповідно, можуть також утворитись скіадонова кислота (СКК) та юніперонова кислота (ЮП). Вони вважаються "побічними жирними кислотами", оскільки не можуть бути конвертовані далі до ЕРА під дією ензимів іншого метаболічного шляху. Термін "fad3" стосується гена, що кодує (тобто спричинює виробництво) дельта-15 або омега-3 десатуразу. Конкретно, дельта-15 десатуразний ензим конвертує лінолеву кислоту у альфа-ліноленову кислоту. FAD3 та або fad3 стосується будь-якого із трьох fad3 генів із сої. Першим ідентифікованим рослинним омега-3 десатуразним геном був fad3 із Arabidopsis (Yadav et al., Plant Physiol. 103:467-476 (1993)), і принаймні три версії цього гена були ідентифіковані у геномі сої, GmFAD3A (номер доступу GenBank AY204710), GmFAD3B (номери доступу GenBank AY204711 та L22964) і GmFAD3C (номер доступу GenBank AY204712) (Bilyeu et al., Crop Sci. 43:1833-1838 (2003); Anai et al., Plant Sci. 168:1615-1623 (2005)). Була ідентифікована соя зі зниженими рівнями АЛК (низький альфа-ліноленовий вміст або "низький лін"), спричиненими мутаціями в одному або кількох fad3 генах (огляд дивись у Bilyeu et al., Crop Sci. 46:1913-1918 (2006)). Мутації в GmFAD3A та GmFAD3C у соєвій лінії CX1512-44, з рівнями АЛК близько 3 %, та у всіх трьох FAD3 генах, що давали сою з рівнями АЛК близько 1 % від 11 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 загальної кількості жирних кислот (наприклад, лінія A29 (Ross et al., Crop Sci. 40:383-386 (2000)), були охарактеризовані на молекулярному рівні (дивись Bilyeu et al., 2006)). Терміни "знижувати рівень регуляції або зниження рівня регуляції", як тут використовується, стосується зниження або послаблення рівня експресії гена або полінуклеотиду. Зниження рівня регуляції будь-якої комбінації fad3 генів у створеній методами генної інженерії рослині сої з використанням описаних тут способів спричиняє продукування рослиною сої зрілого насіння, що має олійний профіль, який складається із низьких рівнів ліноленової кислоти (соя низького вмісту лін). З іншого боку, методами генної інженерії може бути створений геном рослини сої з підвищеною експресією fad3 генів, результатом чого буде олійний профіль, де рівень ліноленової кислоти складає приблизно 50 % від загальної кількості жирних кислот в олії, одержаної із таких трансгенних соєвих рослин. Терміни "триацилгліцерин", "олія" та "ТАГ" стосуються нейтральних ліпідів, що складаються із трьох жирних ацильних залишків, етерифікованих до молекули гліцерину (і такі терміни будуть використані у взаємозамінний спосіб у даній заявці). Такі олії можуть містити довголанцюгові ПНЖК, так само як і коротші насичені та ненасичені жирні кислоти і насичені жирні кислоти з довшими ланцюгами. Таким чином, "олійний біосинтез" загалом стосується синтезу ТАГ у клітині. "Відсоток (%) ПНЖК у сукупних ліпідних та олійних фракціях" стосується відсотку ПНЖК відносно загальної кількості жирних кислот у цих фракціях. Терміни "сукупна ліпідна фракція" або "ліпідна фракція" обидва стосуються сумарної кількості всіх ліпідів (тобто нейтральних та полярних) усередині олійного організму, включаючи, таким чином, ті ліпіди, що локалізовані у фосфатидилхоліновій (ФХ) фракції, фосфатидилетаноламіновій (ФE) фракції та триацилгліцериновій (ТАГ або олійній) фракції. Проте, терміни "ліпід" та "олія" будуть використовуватись у теперішній специфікації у взаємозамінний спосіб. Терміни "ефективність конверсії" та "відсоток конверсії субстрату" стосуються ефективності, з якою конкретний ензим (наприклад, десатураза) може перетворити субстрат у продукт. Ефективність конверсії вимірюється згідно з наступною формулою: ([продукт]/[субстрат + продукт])*100, де "продукт" включає проміжний продукт та всі продукти, отримані на цьому шляху. "Десатураза" являє собою поліпептид, що може піддавати десатурації, тобто запроваджувати подвійний зв'язок, в одній або кількох жирних кислотах з утворенням жирної кислоти або попередника, що являють інтерес. Незважаючи на використання у даній специфікації системи омега-посилань для посилання на жирні кислоти, більш зручно зазначати активність десатурази шляхом лічби від карбоксильного кінця субстрату з використанням дельта-системи. Особливий інтерес являють тут дельта-8 десатурази, котрі піддають десатурації жирну кислоту між восьмим та дев'ятим вуглецевим атомом, понумерованим від карбоксил-термінального кінця молекули, і котрі можуть, наприклад, каталізувати конверсію EДК у ДГЛК та/або EТрК у ЕТК. Інші корисні жирнокислотні десатурази включають, наприклад, (1) дельта-5 десатурази, котрі каталізують конверсію ДГЛК у АК та/або ЕТК у ЕПК; (2) дельта-6 десатурази, котрі каталізують конверсію ЛК у ГЛК та/або AЛК у СТК; (3) дельта-4 десатурази, котрі каталізують конверсію ДПК у ДГК; (4) дельта-12 десатурази, котрі каталізують конверсію олеїнової кислоти у ЛК; (5) дельта-15 десатурази, котрі каталізують конверсію ЛК у AЛК та/або ГЛК у СТК; (6) дельта-17 десатурази, котрі каталізують конверсію АК у ЕПК та/або ДГЛК у ЕТК; і (7) дельта-9 десатурази, котрі каталізують конверсію пальмітату у пальмітолеїнову кислоту (16:1) та/або стеарату в олеїнову кислоту (18:1). У даній галузі на дельта-15 та дельта-17 десатурази також інколи посилаються як на "омега-3 десатурази", "w-3 десатурази", та/або "n-3 десатурази", виходячи із їх здатності конвертувати омега-6 жирні кислоти у свої омега-3 аналоги (наприклад, перетворення ЛК у AЛК та AРК у EПК, відповідно). У деяких варіантах найбільш бажано емпіричним чином визначити специфічність конкретної жирнокислотної десатурази шляхом перетворення придатного хазяїна геном у жирнокислотну десатуразу та визначення її впливу на жирнокислотний профіль даного хазяїна. Термін "елонгазна система" стосується набору із чотирьох ензимів, котрі відповідальні за елонгацію жирнокислотного вуглецевого ланцюга з утворенням жирної кислоти, що на два вуглецевих атоми довша, ніж жирнокислотний субстрат, на який діє дана елонгазна система. Більш конкретно, процес елонгації відбувається в асоціації з жирнокислотною синтазою, згідно з чим СоА є ацильним носієм (Lassner et al., Plant Cell 8:281-292 (1996)). На першій стадії, що, як було встановлено, є субстрат-специфічною і лімітована швидкістю, малоніл-СоА конденсується з довголанцюговим ацил-СоА з утворенням діоксиду вуглецю (СО2) та -кетоацил-СоА (де ацильна складова подовжена на два вуглецеві атоми). Наступні реакції включають відновлення до -гідроксиацил-СоА, дегідратацію до еноїл-СоА та друге відновлення з утворенням 12 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 елонгованого ацил-СоА. Прикладами реакцій, що каталізуються елонгазними системами, є конверсія ГЛК у ДГЛК, СТК у ЕТК, ЛК у EДК, AЛК у EТрК та ЕПК у ДПК. Для цілей даної заявки на ензим, що каталізує першу реакцію конденсації (тобто конверсію малоніл-СоА та довголанцюгову ацил-CvoA у -кетоацил-СоА), будемо посилатись, загалом, як на "елонгазу". Загалом, селективність елонгаз щодо субстрату дещо широка, але обмежується як довжиною ланцюга так і ступенем ненасичення. Відповідно, елонгази можуть мати різні специфічності. Наприклад, С14/16 елонгаза буде утилізувати С14 субстрат (наприклад, міристинову кислоту), С16/18 елонгаза буде утилізувати С16 субстрат (наприклад, пальмітат), С18/20 елонгаза буде утилізувати С18 субстрат (наприклад, ГЛК, СТК) і С20/22 елонгаза буде утилізувати С20 субстрат (наприклад, ЕПК). У подібний спосіб "дельта-9 елонгаза" здатна каталізувати конверсію ЛК у ЕДК та/або AЛК у EТрК. Важливо зазначити, що деякі елонгази мають широку специфічність, і, отже, окремий ензим може бути здатним каталізувати кілька елонгазних реакцій. Так, наприклад, "дельта-9 елонгаза" може також діяти як С16/18 елонгаза, С18/20 елонгаза та/або С20/22 елонгаза, і може мати змінені, проте не найкращі, специфічності щодо дельта-5 та дельта-6 жирних кислот, таких як ЕПК та/або ГЛК, відповідно. Як тут застосовується, "нуклеїнова кислота" означає полінуклеотид і включає одно- або двохланцюговий полімер деоксирибонуклеотидної або рибонуклеотидної основ. Нуклеїнові кислоти можуть також включати фрагменти та модифіковані нуклеотиди. Таким чином, терміни "полінуклеотид", "нуклеїновокислотна послідовність", "нуклеотидна послідовність" та "нуклеїновокислотний фрагмент" використовуються тут у взаємозамінний спосіб і являють собою полімер РНК або ДНК, що є одно- або двохланцюговим, який містить, при потребі, синтетичні, неприродні або змінені нуклеотидні основи. На нуклеотиди (що звичайно знаходяться у своїй 5’-монофосфатній формі) посилаються однолітерним позначенням у наступний спосіб: "A" стосується аденілату або деоксиаденілату (для РНК або ДНК, відповідно), "C" стосується цитиділату або деоксицитиділату, "G" стосується гуанілату або деоксигуанілату, "U" стосується уридату, "T" стосується деокситимідилату, "R" стосується пуринів (А або G), "Y" стосується піримідинів (С або Т), "K" стосується G або Т, "H" стосується А або С, або Т, "I" стосується інозину, і "N" стосується будь-якого нуклеотиду. Терміни "субфрагмент, що є функціонально еквівалентним" та "функціонально еквівалентний субфрагмент" використовуються тут у взаємозамінний спосіб. Ці терміни стосуються ділянки або субпослідовності фрагменту ізольованої нуклеїнової кислоти, в якій здатність змінювати експресію гена або утворювати деякий фенотип зберігається, кодує чи не кодує даний фрагмент або субфрагмент активний ензим. Наприклад, даний фрагмент або субфрагмент може бути використаний у конструюванні химерних генів для продукування бажаного фенотипу у трансформованій рослині. Химерні гени можуть бути створені для застосування у супресії шляхом зв'язування фрагменту нуклеїнової кислоти або її субфрагменту, кодує чи не кодує він активний ензим, у змістовій або антизмістовій орієнтації щодо рослинної промоторної послідовності. Термін "збережний домен" або "мотив" означає набір амінокислот, що консервуються у специфічних положеннях уздовж вибудованої послідовності еволюційно споріднених протеїнів. Хоча амінокислоти в інших положеннях можуть варіювати між гомологічними протеїнами, амінокислоти, котрі сильно законсервовані у специфічних положеннях, відповідають амінокислотам, що є незамінними за структурою, стабільністю або активністю протеїну. Оскільки вони характеризуються високим ступенем консервації у вибудованих послідовностях родини протеїнових гомологів, їх можна використовувати як ідентифікатори, або "сигнатури" для визначення того, чи належить протеїн зі знов визначеною послідовністю до попередньо ідентифікованої протеїнової родини. Терміни "гомологія", "гомологічний", "подібний у значній мірі" та "такий, що відповідає у значній мірі" застосовуються тут у взаємозамінний спосіб. Вони стосуються фрагментів нуклеїнової кислоти, де зміни в одній або кількох нуклеотидних основах не впливають на здатність даного фрагменту нуклеїнової кислоти опосередковувати генну експресію або створювати певний фенотип. Ці терміни також стосуються модифікацій фрагментів нуклеїнової кислоти даного винаходу, таких як делеція або інсерція одного або кількох нуклеотидів, що суттєво не змінюють функціональні властивості результуючого фрагменту нуклеїнової кислоти відносно первинного, немодифікованого фрагменту. Таким чином, фахівцям у даній галузі зрозуміло, що даний винахід охоплює більше, ніж специфічні ілюстративні послідовності. Більш того, фахівцеві у даній галузі зрозуміло, що у значній мірі схожі нуклеїновокислотні послідовності, які охоплюються даним винаходом, також визначаються за їх здатністю гібридизуватись (за помірно жорстких умов, наприклад, 0,5X SSC, 0,1 % SDC, 60 °C) з послідовностями, що тут наведені як приклад, або з будь-якою ділянкою розкритих тут 13 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотидних послідовностей, і котрі функціонально еквівалентні розкритим тут будь-яким нуклеїновокислотним послідовностям. Умови жорсткості можуть бути відрегульовані для проведення скринінгу помірно схожих фрагментів, таких як гомологічні послідовності із віддалено споріднених організмів, сильно схожих фрагментів, таких як гени, котрі дублюють функціональні ензими із тісно споріднених організмів. Пост-гібридизаційні промивки визначають умови жорсткості. Термін "селективно гібридизує" включає посилання на гібридизацію за жорстких умов гібридизації нуклеїновокислотної послідовності з визначеною нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню у помітно більшій мірі (наприклад, принаймні з двократним перевищенням щодо фону), ніж її гібридизація з нуклеїновокислотними послідовностями, що не є мішенями, і суттєве виключення нуклеїнових кислот, що не є мішенями. Селективно гібридизовані послідовності, типово, мають приблизно принаймні 80 % ідентичність послідовності, або 90 % ідентичність послідовності, до і включаючи 100 % ідентичність послідовності (тобто повну комплементарність) між собою. Термін "жорсткі умови" або "жорсткі умови гібридизації" включає посилання на умови, за яких зонд буде селективно гібридизований зі своєю послідовністю-мішенню. Умови жорсткості залежать від послідовності і будуть відмінними за різних обставин. Шляхом контролю жорсткості умов гібридизації та/або умов промивки можуть бути ідентифіковані послідовності-мішені, котрі на 100 % комплементарні із зондом (гомологічне зондування). Як альтернатива, умови жорсткості можуть бути відрегульовані таким чином, що має місце деяка невідповідність у послідовностях, так що виявляються менші ступені подібності (гетерологічне зондування). Загалом, зонд має довжину менше приблизно 1000 нуклеотидів, при потребі, менше 500 нуклеотидів. Типово, жорсткими умовами будуть такі, де концентрація солі складає менше приблизно 1,5 M Na іонів, типово, приблизно від 0,01 to 1,0 M Na іонів (або інших солей) при pH від 7,0 to 8,3, і температура дорівнює принаймні приблизно 30 °C для коротких зондів (наприклад, 10-50 нуклеотидів) і принаймні приблизно 60 °C для довгих зондів (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть також досягатись шляхом додавання дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Ілюстративні умови низької жорсткості включають гібридизацію з буферним розчином від 30 до 35 % формаміду, 1 M NaCl, 1 % НДС (натрій додецилсульфат) при 37 °C, та промивку у 1X-2X SSC (20X SSC=3,0 M NaCl/0,3 M тринатрійцитрату) при 50-55 °C. Ілюстративні умови помірної жорсткості включають гібридизацію у 40-45 % формаміду, 1 M NaCl, 1 % НДС при 37 °C, та промивку у 0,5X-1X SSC at 55-60 °C. Ілюстративні умови високої жорсткості включають гібридизацію у 50 % формаміду, 1 M NaCl, 1 % НДС при 37 °C, та промивку у 0.1X SSC при 60-65 °C. Специфічність є, типово, функцією пост-гібридизаційних промивок, критичними чинниками є іонна сила та температура кінцевого промивного розчину. Для ДНК-ДНК гібридів Tm можна апроксимувати із рівняння Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138:267-284 (1984): Tm=81.5 °C+16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% форма) - 500/L; де M відповідає молярності моновалентних катіонів, %GC є відсотком гуанозинового та цитозинового нуклеотидів у даній ДНК, % форма являє собою відсоток формаміду у гібридизаційному розчині, і L відповідає довжині гібриду у базових парах. Tm являє собою температуру (за визначених іонній силі та pH), при якій 50 % комплементарної послідовності-мішені гібридизується з цілком узгодженим зондом. Tm знижується на приблизно 1 °C на кожен 1 % невідповідності; таким чином, Tm, умови гібридизації та/або промивки можуть бути відрегульовані таким чином, щоб гібридизація здійснювалась до потрібної ідентичності послідовностей. Наприклад, якщо проводиться пошук послідовностей з >90 % ідентичністю, Tm може бути знижена на 10 °C. Загалом, умови жорсткості вибираються таким чином, щоб бути на приблизно 5 °C нижче, ніж точка теплового плавлення (Tm) для специфічної послідовності та її комплементу при визначених іонній силі та pH. Проте, за сильно жорстких умов можуть використовуватись гібридизація та/або промивка при температурах на 1, 2, 3, або 4 °C нижче, ніж теплова точка плавлення (T m); за помірно жорстких умов можуть використовуватись гібридизація та/або промивка при температурах на 6, 7, 8, 9, або 10 °C нижче, ніж теплова точка плавлення (T m); за умов низької жорсткості можуть використовуватись гібридизація та/або промивка при температурах на 11, 12, 13, 14, 15, або 20 °C нижче, ніж теплова точка плавлення (T m). З використанням зазначеного рівняння, гібридизаційних та промивних композицій і бажаної T m рядовим фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, яким чином досягти варіацій жорсткості умов гібридизації та/або потрібних умов промивки. Якщо бажана міра невідповідності призводить до T m менше 45 °C (водний розчин) або 32 °C (формамідний розчин), перевага віддається тому, щоб підвищити концентрацію SSC, так що може бути використана вища температура. Детальним посібником по гібридизації 14 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїнових кислот є робота Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); та Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). Зазначені умови гібридизації та/або промивки можуть застосовуватись протягом принаймні 10, 30, 60, 90, 120, або 240 хвилин. "Ідентичність послідовності" або "ідентичність" у контексті нуклеїновокислотних або поліпептидних послідовностей стосується нуклеїновокислотних основ або амінокислотних залишків у двох послідовностях, котрі є однаковими при їх групуванні на максимальну відповідність по визначеній області порівняння. Таким чином, "відсоток ідентичності послідовності" стосується величини, що визначається шляхом порівняння двох оптимально згрупованих послідовностей по області порівняння, де ділянка полінуклеотидної або поліпептидної послідовності в області порівняння може включати добавки або делеції (тобто, гепи), у порівнянні з еталонною послідовністю (що не містить додатків або делецій), для оптимального групування даних двох послідовностей. Відсоток обчислюється шляхом визначення кількості положень, в яких ідентична нуклеїновокислотна основа або амінокислотний залишок зустрічаються в обох послідовностях, з одержанням кількості положень, що збігаються, діленням кількості положень, що збігаються, на загальну кількість положень в області порівняння та множенням результатів на 100 з одержанням відсотку ідентичності послідовності. Корисні приклади відсотку ідентичностей послідовності включають, проте не обмежуючись цим, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % або 95 %, або будь-який цілий відсоток від 50 % до 100 %. Ці ідентичності можуть бути визначені з використанням будь-яких програм, що тут описані. Групування послідовностей та відсоток ідентичності або подібні розрахунки можуть бути проведені з використанням різновиду методів порівняння, розроблених для виявлення гомологічних послідовностей, включаючи, проте не обмежуючись цим, MegAlign™ програму обчислювального біоінформативного пакету LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). У контексті даної заявки стане зрозумілим, що коли для аналізу використовуються програми секвенірування, результати цього аналізу будуть базуватись на "значеннях за умовчанням" використаної програми, якщо не зазначено інше. Як застосовується у даному тексті, "значення за умовчанням" являють собою будь-який набір значень або параметрів, що завантажуються з програмою при першій ініціалізації. "Метод групування Clustal V" відповідає методу групування, маркованому Clustal V (що описаний Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al. (1992) Comput. Appl. Biosci. 8:189-191), який можна знайти у програмі MegAlign обчислювального біоінформативного пакету LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Для множинних групувань значення за умовчанням відповідають GAP PENALTY=10 та GAP LENGTH PENALTY=10. Параметрами за умовчанням для парних групувань та обчислення відсотку ідентичності протеїнових послідовностей з використанням методу Clustal V є KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 та DIAGONALS SAVED=5. Для нуклеїнових кислот цими параметрами є KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 and DIAGONALS SAVED=4. Після групування послідовностей з використанням програми Clustal V можливо одержати "відсоток ідентичності" шляхом візуалізації таблиці "відхилень послідовностей" у тій самій програмі. "Метод групування BLASTN" являє собою алгоритм, запроваджений Національним центром біотехнологічної інформації (НЦБІ) для порівняння нуклеотидних послідовностей з використанням параметрів за умовчанням. Фахівцям у даній галузі добре зрозуміло, що корисними в ідентифікації поліпептидів відносно інших видів є багато рівнів ідентичності послідовності, де такі поліпептиди мають таку саму або схожу функцію чи активність. Корисні приклади відсотку ідентичності включають, проте не обмежуючись цим, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % або 95 %, або будьякий цілий відсоток від 50 % до 100 %. Дійсно, будь-яка цілочислова амінокислотна ідентичність від 50 до 100 % може бути корисною в описі даного винаходу, така як 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 %. Крім того, являє інтерес будь-який повномасштабний або частковий комплемент цього ізольованого нуклеотидного фрагменту. "Ген" стосується фрагменту нуклеїнової кислоти, що експресує специфічний протеїн, включаючи регуляторні послідовності, котрі передують (5" некодуючим послідовностям) та йдуть за (3" некодуючими послідовностями) кодуючою послідовністю. "Нативний ген" стосується 15 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гена, який існує у природі зі своїми власними регуляторними послідовностями. "Химерний ген" стосується будь-якого гена, що не є нативним геном, який містить регуляторну та кодуючу послідовності, котрі разом у природі не існують. Відповідно, химерний ген може включати регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, котрі одержуються із різних джерел, або регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, котрі одержуються із одного джерела, але розташовані у спосіб, відмінний від того, що існує у природі. "Сторонній" ген стосується гена, що звичайно не існує в організмі хазяїна, але який вводиться в організм хазяїна шляхом переносу гена. Сторонні гени можуть включати нативні гени, уведені у не-нативний організм, або химерні гени. "Трансген" являє собою ген, що введений у геном шляхом процедури трансформації. Термін "геном", як він застосовується до рослинних клітин, охоплює не тільки хромосомну ДНК, знайдену всередині ядра, але й органоїдну ДНК, знайдену всередині субклітинних компонентів (наприклад, мітохондріальних, пластидних) клітини. "Кодон-оптимізований ген" являє собою ген, що має свою частоту використання кодону, замислену для імітації частоти переважного використання кодону клітини хазяїна. "Алель" являє собою одну із кількох альтернативних форм гена, що займає даний локус на хромосомі. Коли всі алелі, присутні у даному локусі на хромосомі, є однаковими, ця рослина є гомозиготною у цьому локусі. Якщо алелі, присутні у даному локусі на хромосомі, відмінні, ця рослина є гетерозиготною у цьому локусі. “Кодуюча послідовність" стосується ДНК послідовності, що кодує специфічну амінокислотну послідовність. "Регуляторні послідовності" стосуються нуклеотидних послідовностей, розташованих "угору по течії" (від 5" некодуючих послідовностей), всередині або "вниз по течії" (від 3" некодуючих послідовностей) кодуючої послідовності, і котрі впливають на транскрипцію, РНК процесінг або стабільність, або трансляцію асоційованої кодуючої послідовності. Регуляторні послідовності можуть включати, проте не обмежуючись цим, промотори, трансляційні сигнальні послідовності, інтрони, поліаденілувальні розпізнавальні послідовності, РНК процесінгові сайти, ефекторні зв'язувальні сайти та структури типу "стеблопетля". "Промотор" стосується ДНК послідовності, здатної контролювати експресію кодуючої послідовності або функціональної РНК. Промоторна послідовність складається із найближчих та більш віддалених "верхніх" елементів, на останні елементи часто посилаються як на енхансери. Відповідно, "енхансер" являє собою ДНК послідовність, що може стимулювати промоторну активність, і може бути природним елементом промотору або гетерологічним елементом, що введений для підсилення рівня або тканинної специфічності промотору. Промотори можуть бути отримані у своїй повноті із нативного гена, або можуть складатись із різних елементів, одержаних від різних промоторів, що існують у природі, або навіть включати сегменти синтетичної ДНК. Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що різні промотори можуть спрямовувати експресію гена у різних тканинах або типах клітин, або на різних стадіях розвитку, або діяти як реакція на різні умови навколишнього середовища. Крім того, визнано, що оскільки у більшості випадків точні границі регуляторних послідовностей визначені не повністю, ДНК фрагменти деяких варіацій можуть мати ідентичну промоторну активність. На промотори, що спричиняють експресію гена у більшості типів клітин у більшості випадків, звичайно посилаються як на "конститутивні промотори". Нові промотори різних типів, корисні у рослинних клітинах, постійно відкривають; множинні приклади можна знайти у компіляції Okamuro, J.K., та Goldberg, R.B. Biochemistry of Plants 15:1-82 (1989). "Трансляційна лідерна послідовність" стосується полінуклеотидної послідовності, що локалізована між промоторною послідовністю гена та кодуючою послідовністю. Трансляційна лідерна послідовність присутня у підданій повному процесінгу мРНК угору від трансляційної старт послідовності. Трансляційна лідерна послідовність може впливати на процесінг первинного транскрипту до мРНК, мРНК стабільність або трансляційну ефективність. Приклади трансляційних лідерних послідовностей описані в літературі (Turner, R. And Foster, G.D., Mol. Biotechnol. 3:225-236 (1995)). "3" некодуючі послідовності", "транскрипційний термінатор" або "термінуючі послідовності" стосуються ДНК послідовностей, розташованих вниз від кодуючої послідовності, і включають поліаденілувальні розпізнавальні послідовності та інші послідовності, що кодують регуляторні сигнали, здатні впливати на мРНК процесінг або експресію гена. Сигнал поліаденілування звичайно характеризується впливом на додавання трактів поліаденілової кислоти до 3" кінця мРНК попередника. Використання різних 3" некодуючих послідовностей ілюструється Ingelbrecht, I.L., et al. Plant Cell 1:671-680 (1989). "РНК транскрипт" стосується продукту, що є результатом каталізованої РНК полімеразою транскрипції ДНК послідовності. Коли РНК транскрипт є досконалою комплементарною копією 16 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ДНК послідовності, на нього посилаються як на основний транскрипт. На РНК транскрипт посилаються як на зрілу РНК, коли РНК послідовність отримана в результаті посттранскрипційного процесінгу основного транскрипту. "Матрична РНК" або "мРНК" стосується РНК, що є без інтронів і що може бути трансльована у протеїн даною клітиною. "кДНК" стосується ДНК, що комплементарна до та синтезована із мРНК матриці з використанням ензимної ревертази. кДНК може бутиодноланцюговою або може бути конвертована у двохланцюгову форму з використанням фрагменту Klenow ДНК полімерази І. "Змістова" РНК стосується РНК транскрипту, що включає мРНК і може бути трансльована у протеїн всередині клітини або in vitro. "Антизмістова РНК" стосується РНК транскрипту, що комплементарний до всього або частини таргетного первинного транскрипту або мРНК, і що блокує експресію таргетного гена (U.S. Patent No. 5,107,065). Комплементарність антизмістової РНК може бути з будь-якою частиною специфічного генного транскрипту, тобто 5" некодуючою послідовністю, 3’некодуючою послідовністю, інтронами або кодуючою послідовністю. "Функціональна РНК" стосується антизмістової РНК, рибозимної РНК або іншої РНК, що не може транслюватись, але ще має вплив на клітинні процеси. Терміни "комплемент" або "зворотний комплемент" використовуються тут у взаємозамінний спосіб щодо мРНК транскриптів, і визначають, як мається на думці, антизмістову РНК даного месиджу. Термін "зчеплений у діючий спосіб" стосується асоціації нуклеїновокислотних послідовностей на окремому нуклеїновокислотному фрагменті, так що функція однієї регулюється іншою. Наприклад, промотор зчеплений у діючий спосіб із кодуючою послідовністю, коли він здатен регулювати експресію цієї кодуючої послідовності (тобто дана кодуюча послідовність знаходиться під транскрипційним контролем промотора). Кодуючі послідовності можуть бути зчеплені у діючий спосіб з регуляторними послідовностями у змістовій або антизмістовій орієнтації. В іншому прикладі ділянки комплементарної РНК даного винаходу можуть бути зчеплені у діючий спосіб, прямо або опосередковано, 5" з таргетною мРНК, або 3" з таргетною мРНК, або всередині таргетної мРНК, або перша комплементарна ділянка 5" і її комплемент 3" з таргетною мРНК. Стандартна рекомбінантна ДНК і методи молекулярного клонування, що тут застосовані, добре відомі у даній галузі і у більш повній мірі описані у роботі Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989). Способи перетворення добре відомі фахівцям у даній галузі і описані нижче. "ПЛР" або "полімеразна ланцюгова реакція" являє собою метод синтезу великих кількостей специфічних ДНК сегментів і складається із ряду повторних циклів (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Типово, двохланцюгова ДНК піддається тепловій денатурації, два праймери, комплементарні до 3" границь даного таргетного сегменту, загартовуються при низькій температурі і потім розтягаються при проміжній температурі. Одна група із таких трьох послідовних кроків називається "циклом". Термін "рекомбінантний" стосується штучної комбінації двох відокремлених у різний спосіб сегментів послідовності, наприклад, шляхом хімічного синтезу або маніпуляції ізольованими сегментами нуклеїнових кислот методами генної інженерії. Терміни "плазміда", "вектор" та "касета" стосуються екстрахромосомного елемента, що часто несе гени, котрі не є частиною центрального метаболізму даної клітини, і, звичайно, у формі кругових двохланцюгових ДНК фрагментів. Такі елементи можуть бути автономними реплікаційними послідовностями, геномними інтегруючими послідовностями, фаговими або нуклеотидними послідовностями, лінійними або круговими, одно- або двохланцюгової ДНК або РНК, отриманими із будь-якого джерела, де ряд нуклеотидних послідовностей був об'єднаний або рекомбінований в унікальну конструкцію, що здатна вводити фрагмент промотору та ДНК послідовність для вибраного генного продукту разом із відповідною 3" нетрансльованою послідовністю у клітину. "Трансформаційна касета" стосується специфічного вектора, що містить сторонній ген і має елементи на додаток до стороннього гена, які полегшують трансформацію індивідуальної хазяйської клітини. "Експресійна касета" стосується специфічного вектора, що містить сторонній ген і має елементи на додаток до стороннього гена, які дозволяють здійснювати підсилену експресію цього гена у сторонньому хазяїні (тобто дискретного фрагмента нуклеїнової кислоти, в який може бути введена нуклеїновокислотна послідовність або фрагмент). Терміни "рекомбінантний конструкт", "експресійний конструкт", "химерний конструкт", "конструкт" та "рекомбінантний ДНК конструкт" використовуються тут у взаємозамінний спосіб. Рекомбінантний конструкт включає штучну комбінацію фрагментів нуклеїнової кислоти, наприклад, регуляторну та кодуючу послідовності, що разом у природі не зустрічаються. 17 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Наприклад, химерний конструкт може включати регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, що отримані із різних джерел, або регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, отримані із одного джерела, але розташовані у спосіб, відмінний від того, що є у природі. Такий конструкт може використовуватись сам по собі або у сполученні з вектором. Якщо використовується вектор, вибір вектора залежить від способу, що буде використаний для трансформації хазяйських клітин, як це добре відомо фахівцям у даній галузі. Наприклад, може бути використаний плазмідний вектор. Досвідчений фахівець добре обізнаний щодо генетичних елементів, котрі мають бути присутніми на векторі для успішної трансформації, селекції та розмноження клітин хазяїна, які включають будь-який із ізольованих фрагментів нуклеїнової кислоти даного винаходу. Досвідчений фахівець також визнає, що різні незалежні трансформаційні події дадуть різні рівні та види експресії (Jones et al., EMBO J. 4:2411-2418 (1985); De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics 218:78-86 (1989)), і тому ці множинні події мають бути піддані скринінгу для отримання ліній, котрі показують бажані рівень експресії та вид. Такий скринінг може проводитись, серед інших, за методом саузерн аналізу ДНК, норзерн аналізу мРНК експресії, імуноблоттінгового аналізу експресії протеїну або фенотипного аналізу. Термін "експресія", як тут використовується, стосується утворення функціонального кінцевого продукту (наприклад, мРНК або протеїну [як попередника, так і зрілого]). Термін "уведений" означає запровадження нуклеїнової кислоти (наприклад, експресійного конструкту) або протеїну у клітину. Уведений включає посилання на вбудовування нуклеїнової кислоти в еукаріотичну або прокаріотичну клітину, де дана нуклеїнова кислота може бути вбудована у геном клітини, і включає посилання на тимчасове впровадження нуклеїнової кислоти або протеїну у дану клітину. Уведений включає посилання на стабільні або перехідні методи трансформації, так само як і на статеве схрещування. Таким чином, "уведений" у контексті впровадження фрагменту нуклеїнової кислоти (наприклад рекомбінантний ДНК конструкт/експресійний конструкт) у клітину означає "трансфекцію" або "трансформацію" або "трансдукцію", і включає посилання на вбудовування фрагменту нуклеїнової кислоти в еукаріотичну або прокаріотичну клітину, де даний фрагмент нуклеїнової кислоти може бути вбудований у геном клітини (наприклад, хромосомну, плазмідну, пластидну або мітохондральну ДНК), конвертований в автономний реплікон, або тимчасово експресований (наприклад, трансфекована мРНК). "Зрілий" протеїн стосується поліпептиду, що піддавався пост-трансляційному процесінгу (тобто такого, із якого були вилучені будь-які пре- або пропептиди, присутні у первинному трансляційному продукті). "Попередниковий" протеїн стосується первинного продукту трансляції мРНК (тобто з ще присутніми пре- та пропептидами). Пре- та пропептиди можуть бути, проте не обмежуючись цим, сигналами внутрішньоклітинної локалізації. Термін "мультизим" стосується окремого поліпептиду, що має принаймні дві незалежних та роздільних ферментативних активності. Краще, коли даний мультизим містить першу ферментативну активність, зчеплену з другою ферментативною активністю. Термін "злитий протеїн" застосовується у взаємозамінний спосіб з терміном "мультизим". Так, "злитий протеїн" стосується окремого поліпептиду, що має принаймні дві незалежних та роздільних ферментативних активності. Термін "гібридний ген" стосується полінуклеотиду або гена, що кодує мультизим. Гібридний ген може бути сконструйований шляхом зчеплення принаймні двох ДНК фрагментів, де кожен ДНК фрагмент кодує незалежну і роздільну ферментативну активність. Приклад гібридного гена описаний нижче у Прикладі 21 (гібрид1-ГГЛК синтаза гібридний ген), який був створений шляхом зчеплення Euglena anabaena дельта-9 елонгази (EaD9Elo1; ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:101) та Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491 дельта-8 десатурази (TpomD8; ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:50) з використанням збагаченого проліном лінкера Euglena gracilis DHAsynthase 1. (EgDHAsyn1Link; ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:97). "ДГК синтаза" є іншим прикладом мультизиму. Конкретно, ДГК синтаза включає C20 елонгазу, зчеплену з дельта-4 десатуразою. Термін "зчеплення" стосується з'єднання або зв'язування принаймні двох поліпептидів, що мають незалежні та роздільні ферментативні активності. Термін "лінкер" стосується зв'язку або зчіпки між двома або кількома поліпептидами, кожен із яких має незалежну та роздільну ферментативну активність. Зчеплення, використане для формування мультизиму, складається, як мінімум, із одного поліпептидного зв'язку. В іншому аспекті дане зчеплення може складатись із одного амінокислотного залишку, такого як пролін, або поліпептиду. Було б бажаним, коли б дане 18 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зчеплення було поліпептидом, щоб воно мало принаймні один проліновий амінокислотний залишок. Приклад лінкеру показаний у ПОСЛІДОВНІСТЬ КОДІВ NO:97 (збагачений проліном лінкер EgDHAsyn1). Джерело промотору, вибраного для драйву експресії мультизимної кодуючої послідовності, не є важливим, оскільки він має достатню транскрипційну активність для експресії здатної до трансляції мРНК до потрібних фрагментів нуклеїнової кислоти у потрібній тканині хазяїна у коректний час. Для практичного втілення даного винаходу можуть бути використані як гетерологічні, так і негетерологічні (тобто ендогенні) промотори. Наприклад, придатні промотори включають, проте не обмежуючись цим, альфа первинну субодиницю бета конгліцинінового промотору, кунітц (Kunitz) трипсин інгібітор 3 промотор, анексиновий промотор, гліциніновий Gy1 промотор, бета субодиницю бета конгліцинінового промотору, P34/Gly Bd m 30K промотор, альбуміновий промотор, Leg A1 промотор та Leg А2 промотор. "Стабільна трансформація'стосується перенесення фрагменту нуклеїнової кислоти у геном організму хазяїна, включаючи ядерний та органеларний геноми, що дає генетично стійку спадковість. На відміну від цього, "тимчасова трансформація" стосується перенесення фрагменту нуклеїнової кислоти у ядро або органелу, що містить ДНК, або організм хазяїна, що дає експресію гена без інтеграції або стабільної спадковості. На хазяйські організми, що містять трансформовані фрагменти нуклеїнової кислоти, посилаються як на "трансгенні" організми. Як тут застосовується, "трансгенний" стосується рослини або клітини, що містить у своєму геномі гетерологічний полінуклеотид. Краще, коли гетерологічний полінуклеотид стабільно інтегрований у даному геномі, так що даний полінуклеотид передається наступним генераціям. Даний гетерологічний полінуклеотид може бути інтегрований у геном окремо або як частина експресійного конструкту. Трансгенний, як застосовується у данному тексті, включає будь-яку клітину, клітинну лінію, калюс, тканину, частину рослини або рослину, генотип якої змінений присутністю гетерологічної нуклеїнової кислоти, включаючи як ті трансгеники, що змінені у зазначений спосіб, так і ті, що були створені шляхом статевих схрещувань або вегетативного розмноження із первинного трансгеника. Термін "трансгенний", як тут застосовується, не охоплює зміну генома (хромосомну або екстра-хромосомну) з допомогою звичайних методів селекції рослин або шляхом природних подій, таких як випадкове перехресне запліднення, нерекомбінантна вірусна інфекція, нерекомбінантна бактеріальна трансформація, нерекомбінантна транспозиція або спонтанна мутація. "Антизмістове інгібування" стосується створення антизмістових РНК транскриптів, здатних піддавати супресії експресію таргетного протеїну. "Косупресія" стосується продукування змістових РНК трапнскриптів, здатних приглушувати експресію ідентичних або у значній мірі схожих сторонніх або ендогенних генів (патент США за номером 5231020). Косупресійні конструкти в рослинах були попередньо розроблені шляхом зосередження уваги на гіперекспресії нуклеїновокислотної послідовності, яка має гомологію з ендогенною мРНК, у змістовій орієнтації, що спричинило редукцію всіх РНК, котрі гомологічні з гіперекспресованою послідовністю (Vaucheret et al., Plant J. 16:651-659 (1998); Gura, Nature 404:804-808 (2000)). Загальна ефективність цього феномену низька, і ступінь РНК редукції широко варіює. У недавній роботі описано використання "шпилькових" структур, котрі включають всю або частину мРНК кодуючої послідовності у комплементарній орієнтації, що дає потенційну структуру "стебло-петля" для експресованої РНК (РСТ публікація за номером WO 99/53050, опублікована 21 жовтня 1999 року; РСТ публікація за номером WO 02/00904, опублікована 3 січня 2002 року). Це підвищує частоту косупресії у відновлених трансгенних рослинах. Інша варіація описує використання рослинних вірусних послідовностей для спрямування супресії або "заглушення" найближчих мРНК кодуючих послідовностей (РСТ публікація за номером WO 98/36083, опублікована 20 серпня 1998 року). Обидва ці косупресивні явища не були висвітлені у механістичний спосіб, хоча генетичне свідчення почало розкривати цю складну ситуацію (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757 (1998)). "Знижувальна регуляція" може здійснюватись за допомогою будь-яких технологій косупресії, РНКi, антизмістових РНК або мiРНК (мікро РНК), міРНК являють собою регуляторні агенти, що складаються із приблизно 22 рибонуклеотидів. міРНК мають високу ефективність в інгібуванні експресії ендогенних генів. Дивись, наприклад, роботу Javier et al., Nature 425:257-263 (2003), на яку у даному тексті зроблено посилання. Термін "Евгленофікові" ("Euglenophyceae") стосується групи одноклітинних безбарвних або фотосинтетичних флагелатів ("евгленоїдів"), що знайдені існуючими у прісноводних, морських, ґрунтових та паразитних середовищах. Даний клас характеризується окремими одноклітинними організмами, де більшість є вільноплаваючою і має два джгутики (один із яких може бути неспливаючим), котрі виникають із передньої інвагінації, відомої як резервуар. Фотосинтетичні 19 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 евгленоїди містять від одного до множини трав'янистозелених хлоропластів, котрі варіюють від крихітних дисків до розширених пластинок або стрічок. Асиміляція нутрієнта безбарвними евгленоїдами залежить від осмотрофії або фаготрофії. Приблизно 1000 видів було описано та класифіковано на приблизно 40 родів та 6 рядів. Приклади Евгленофікових включають, проте не обмежуючись цим, наступні роди: Eutreptiella та Tetruetreptia. Термін "рослина" стосується цілих рослин, рослинних органів, рослинних тканин, насіння, рослинних клітин, насінин та їх потомства. Рослинні клітини включають, без обмеженняn, клітини із насіння, суспензійних культур, зародків, мерістематичних ділянок, калюсної тканини, листя, коренів, пагінців, гаметофітів, спорофітів, пилку та мікроспор. "Потомство" включає будь-яку наступну генерацію рослини. Даний винахід стосується продукування арахідонової кислоти в олійних рослинах. Більш конкретно, даний винахід стосується трансгенного соєвого насіння та насіння арабідопсису, що містить принаймні 10 % арахідонової кислоти і має знижений вміст омега-3 жирних кислот. Даний винахід також стосується трансгенного соєвого та арабідопсисного насіння, що містить принаймні 10 % арахідонової кислоти, має знижений вміст омега-3 жирних кислот та знижений вміст гамма-ліноленової кислоти. Даний винахід стосується трансгенних олійних рослин, що здатні продукувати зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10 % арахідонової кислоти (АРК, 20:4, омега-6) і менше 5 % усіх омега-3 жирних кислот, що мають принаймні вісімнадцять вуглецевих атомів та принаймні чотири подвійних зв'язки. Являє також інтерес трансгенна олійна рослина, що продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше 1 % усіх омега-3 жирних кислот, що мають принаймні вісімнадцять вуглецевих атомів та принаймні чотири подвійних зв'язки. У ще одному аспекті даний винахід стосується трансгенної олійної рослини, що продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше 5 % гамма-ліноленової кислоти. У ще одному аспекті даний винахід стосується трансгенної олійної рослини, що продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше або рівно 1 % гамма-ліноленової кислоти. У ще одному аспекті даний винахід стосується трансгенної олійної рослини, що продукує зріле насіння, де загальний насіннєвий жирнокислотний профіль включає принаймні 10,0 % арахідонової кислоти і менше або рівно 1 % гамма-ліноленової кислоти, і менше 1 % усіх омега3 жирних кислот, що мають принаймні вісімнадцять вуглецевих атомів та принаймні чотири подвійних зв'язки. Накопичення цієї специфічної поліненасиченої жирної кислоти (ПНЖК) може здійснюватись шляхом уведення будь-якого із двох різних функціональних омега-3/омега-6 жирнокислотних біосинтетичних шляхів. На першому шляху застосовуються, окрім усього, протеїни з дельта-6 десатуразною, C18/20 елонгазною та дельта-5 десатуразною активностями у хазяїні для високорівневої рекомбінантної експресії, де АРК олія також містить ГЛК. На другому шляху застосовуються, окрім усього, протеїни з дельта-9 елонгазною, дельта-8 десатуразною та дельта-5 десатуразною активностями, і у такий спосіб дають можливість вироблення АРК олії, що не містить будь-яких ГЛК. Виробництво високих рівнів АРК зі зниженим вмістом омега-3 жирних кислот (тобто, ЕПК) може проводитись, проте не обмежуючись цим, за будь-яким із вищезазначених шляхів у сполученні зі знижувальним регулюванням fad3 гена, що кодує ензим, що має дельта-15 десатуразну активність. Крім того, схрещування сої, що експресує обидва шляхи вироблення АРК, з трансгенною або нетрансгенною соєю типу "низький лін" (дивись вище) може бути застосовано для зниження вмісту омега-3 жирних кислот, таких як ЕПК. Крім того, уведення будь-якого із шляхів у рослину-хазяїна, що природно не виробляє високі рівні АЛК, таку як кукурудза, соняшник або сафлор, може також бути використане для продукування АРК з низьким вмістом омега-3 жирних кислот. "Дельта-15 десатураза" стосується жирнокислотної десатурази, що каталізує утворення подвійного зв'язку між вуглецевими положеннями 3 та 4 (пронумерованими від метального кінця), (тобто тими, що відповідають вуглецевим положенням 15 та 16 (пронумерованим від карбонільного вуглецю) жирноацильного ланцюга довжиною 18 вуглецевих атомів та вуглецевими положеннями 13 та 14 (пронумерованими від карбонільного вуглецю) жирноацильного ланцюга довжиною 16 вуглецевих атомів). Знижувальна регуляція fad3 гена описана у патенті США за номером 5952544, що виданий Browse et al. 14 вересня 1999 року. ПНЖК, такі як АРК, або їх похідні, одержані згідно з розкритою тут технологією, можуть бути використані як дієтичні замінники або добавки, особливо у дитячих сумішах, для пацієнтів, що 20 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 піддаються внутрішньовенному годуванню або для запобігання чи лікування порушень харчування. Як альтернатива, очищені ПНЖК (або їх похідні) можуть бути введені у кулінарні олії, жири або маргарини, складені у такий спосіб, що при нормальному застосуванні реципієнт отримає потрібну кількість дієтичної добавки. ПНЖК можуть також бути введеними у дитячі суміші, харчові добавки або інші харчові продукти і можуть знайти застосування як протизапальні або знижуючі холестерин агенти. При потребі, дані композиції можуть використовуватись для фармацевтичних цілей (для людини або у ветеринарії). У цьому випадку ПНЖК застосовуються, загалом, перорально, але можуть застосовуватись за будь-якою схемою, за якою вони можуть успішно абсорбуватись, наприклад, парентерально (наприклад, підшкірно, внутрішньом'язово або внутрішньовенно), ректально, вагінально або місцево (наприклад, як мазь або лосьон для шкіри). Поповнення раціонів людини або тварини ПНЖК, виробленими рекомбінантними засобами, може забезпечити підвищені рівні доданих ПНЖК, так само як їх метаболітів. Наприклад, лікування ЕПК може не тільки підвищити рівні ЕПК, але також і рівні нижчих продуктів ЕПК, таких як ейкозаноїди (тобто простагландіни, лейкотриєни, тромбоксани). Складні регуляторні механізми можуть зробити бажаним комбінування різних ПНЖК або додавання різних кон'югатів ПНЖК з метою запобігання, контролю або переборювання таких механізмів для досягнення потрібних рівнів специфічної(них) ПНЖК у даного суб'єкта. Біосинтез АРК (омега-6 жирних кислот): Метаболічний процес, де олеїнова кислота конвертується у АРК, включає елонгацію вуглецевого ланцюга шляхом додавання вуглецевих атомів та десатурацію даної молекули шляхом додавання подвійних звязків. Це потребує ряду спеціальних десатураційних та елонгаційних ферментів. Проте, як видно із Фіг.1, для цього існують два альтернативних шляхи. Конкретно, обидва шляхи потребують первинної конверсії олеїнової кислоти у ЛК (18:2), першу із омега-6 жирних кислот, за допомогою дельта-12 десатурази. Потім, з використанням "дельта-6 десатураза/дельта-6 елонгазного" шляху для біосинтезу АРК ПНЖК формуються у наступний спосіб: (1) ЛК конвертується у ГЛК під дією дельта-6 десатурази; (2) ГЛК конвертується у ДГЛК під дією C18/20 елонгази; і (3) ДГЛК конвертується у АРК під дією дельта-5 десатурази. Як альтернатива, "дельта-9 елонгаза/дельта-8 десатуразний шлях" може бути застосований до продукування АРК у наступний спосіб: (1) ЛК конвертується у ЕДК дельта-9 елонгазою; (2) ЕДК конвертується у ДГЛК дельта-8 десатуразою; та (3) ДГЛК конвертується у АРК дельта-5 десатуразою. Фахівець у даній галузі зможе ідентифікувати різні гени-кандидати, що кодують кожен із ензимів, потрібних для біосинтезу АРК. Корисні десатуразні та елонгазні послідовності можуть бути отримані із будь-якого джерела, наприклад, виділені із природного джерела (із бактерій, водоростей, грибів, рослин, тварин, і т.д.), вироблені за напівсинтетичною схемою або синтезовані de novo. Хоча конкретне джерело десатуразних та елонгазних генів, уведених у хазяїна, не є критичним, міркування щодо вибору специфічного поліпептиду, що має десатуразну або елонгазну активність, включають: (1) специфічність субстрату даного поліпептиду; (2) чи є даний поліпептид або його компонент ензимом, що лімітує швидкість; (3) чи є дана десатураза або елонгаза незамінною для синтезу потрібної ПНЖК; та/або (4) кофактори, які потребує даний поліпептид. Експресований поліпептид має, краще, параметри, сумісні з біохімічним оточенням його локації у клітині хазяїна (дивись PCT публікацію за No. WO 04/101757 щодо додаткових подробиць). У додаткових варіантах буде також корисним розглянути ефективність конверсії кожної конкретної десатурази та/або елонгази. Більш конкретно, оскільки кожен ензим у рідких випадках функціонує зі 100 % ефективністю щодо конверсії субстрату у продукт, кінцевий ліпідний профіль неочищених олій, вироблених у хазяйській клітині, буде, типово, являти собою суміш різних ПНЖК, що складається із бажаної омега-3/омега-6 жирної кислоти, так само як і різних верхніх проміжних ПНЖК. Таким чином, ефективність конверсії, що забезпечує кожен ензим, також являє собою змінну при оптимізації біосинтезу потрібної жирної кислоти, котру слід брати до уваги у плані кінцевого потрібного ліпідного продукту. Беручи до уваги викладені вище міркування, гени-кандидати, що мають відповідні десатуразні та елонгазні активності, можуть бути ідентифіковані згідно з загальнодоступною літературою (наприклад, GenBank), патентною літературою, та експериментальним аналізом мікроорганізмів, котрі здатні виробляти ПНЖК. Наприклад, наступні номери доступу до даних GenBank стосуються прикладів загальнодоступних генів, придатних для АРК біосинтезу: AY131238, Y055118, AY055117, AF296076, AF007561, L11421, NM_031344, AF465283, AF465281, AF110510, AF465282, AF419296, AB052086, AJ250735, AF126799, AF126798 (дельта 21 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6 десатурази); AF390174 (дельта-9 елонгаза); AF139720 (дельта-8 десатураза); AF199596, AF226273, AF320509, AB072976, AF489588, AJ510244, AF419297, AF07879, AF067654, AB022097 (дельта-5 десатурази); AAG36933, AF110509, AB020033, AAL13300, AF417244, AF161219, AY332747, AAG36933, AF110509, AB020033, AAL13300, AF417244, AF161219, X86736, AF240777, AB007640, AB075526, AP002063 (дельта-12 десатурази); AF338466, AF438199, E11368, E11367, D83185, U90417, AF085500, AY504633, NM_069854, AF230693 (дельта-9 десатурази); та NP_012339, NP_009963, NP_013476, NP_599209, BAB69888, AF244356, AAF70417, AAF71789, AF390174, AF428243, NP_955826, AF206662, AF268031, AY591335, AY591336, AY591337, AY591338, AY605098, AY605100, AY630573 (C14/16, C16/18 та C18/20, елонгази). Подібно до цього, патентна Література запроваджує багато додаткових ДНК послідовностей генів (та/або подробиць, що стосуються кількох із вищезазначених генів та способів їх виділення), включених у вироблення ПНЖК [наприклад, WO 02/077213 (дельта-9 елонгази); WO 00/34439 та WO 04/057001 (дельта-8 десатурази); патент США за номером 5968809 (дельта-6 десатурази); патент США за номером. 5972664 та патент США за номером 6075183 (дельта-5 десатурази); WO 94/11516, патент США за номером 5443974, WO 03/099216 та WO 05/047485 (дельта-12 десатурази); WO 91/13972 та патент США за номером 5057419 (дельта-9 десатурази); і, WO 00/12720, патент США за номером 6403349, патент США за номером 6677145, U.S. 2002/0139974A1, U.S. 2004/0111763 (C14/16, C16/18 та C18/20 елонгази)]. На кожен із цих патентів та заявок у даному тексті зроблені повні посилання. Передбачається, що попереднє обговорення, як мається на думці, є ілюстративним і не має обмежувального характеру. Відповідно, придатними для модифікації генома олійної рослини можуть бути множинні інші гени, одержані із різних джерел, що кодують: (1) дельта-6 десатурази, C18/20 елонгази та дельта-5 десатурази (і, при потребі, інші гени, що кодують дельта-9 десатурази, дельта-12 десатурази, C14/16 елонгази та/або C16/18 елонгази); або (2) дельта-9 елонгази, дельта-8 десатурази та дельта-5 десатурази (і, при потребі, інші гени, що кодують дельта-9 десатурази, дельта-12 десатурази, C14/16 елонгази та/або C16/18 елонгази). У деяких випадках може бути бажаним мінімізувати кількість побічних жирних кислот. Відносний надлишок побічних жирних кислот може бути знижений шляхом підвищення повної дельта-8 десатуразної активності. Один підхід до мінімізації побічних жирних кислот буде полягати в експресії більше однієї дельта-8 десатурази (тобто такої самої або відмінної дельта8 десатурази). Наприклад, скіадонова кислота (СКК) та/або юніперонова кислота (ЮП) [які звичайно знаходять у насіннєвих ліпідах голонасінніх рослин (Wolff et al., Lipids 35(1):1-22 (2000)), таких як рослини із родини Pinaceae (сосна)] можуть розглядатись як побічні жирні кислоти дельта-6 десатураза/дельта-6 елонгазного шляху або дельта-9-елонгаза/дельта-8 десатуразного шляху. Хоча ці жирні кислоти, як вважається, самі по собі мають різні оздоровчі властивості (Nakane et al., Biol. Pharm. Bull. 23: 758-761 (2000)), їх присутність як побічних жирних кислот у розробленому методами генної інженерії ПНЖК шляху, такому як у олійній культурі, може бути небажаною, у залежності від застосування. Термін "дельта-6 десатураза/дельта-6 елонгазний шлях" також стосується біосинтетичного шляху для продукування довголанцюгових ПНЖК. Цей шлях, як мінімум, включає дельта-6 десатуразу та дельта-6 елонгазу, чим забезпечується можливість біосинтезу ДГЛК та/або ЕТК із ЛК та АЛК, відповідно. При експресії інших десатураз та елонгаз можуть також бути синтезовані АРК, ЕПК, ДПК та ДГК. Випадково, дельта-6 елонгаза може подовжити жирні кислоти, інші, ніж передбачувану жирну кислоту. Наприклад, дельта-6 елонгаза перетворює, загалом, ГЛК у ДГЛК, проте, деякі дельта-6 елонгази можуть також перетворювати непередбачені субстрати, такі як ЛК або АЛК у ЕДК або ЕТрК, відповідно. На дельта-6 десатураза/дельта-6 елонгазному шляху, ЕДК та ЕТрК можуть розглядатись як “”побічні жирні кислоти", як визнчено нижче. Додавання дельта-8 десатурази до дельта-6 десатураза/дельта-6 елонгазного шляху може запровадити засоби для перетворення "побічних жирних кислот" ЕДК та ЕТрК назад у "проміжні жирні кислоти" (як визначено нижче), відповідно, ДГЛК та ЕТК. Рослинні системи експресії, касети та вектори і трансформація Промотор являє собою ДНК послідовність, що спрямовує клітинний механізм рослини на продукування РНК із суміжної кодуючої послідовності вниз (3') від промотора. Промоторна ділянка впливає на швидкість, стадію розвитку та тип клітини, в якій РНК транскрипт даного гена вироблений. РНК транскрипт піддається процесінгу з виробленням мРНК, що слугує матрицею для трансляції РНК послідовності в амінокислотну послідовність кодованого поліпептиду. 5' нетрансльована лідерна послідовність являє собою ділянку мРНК угору від ділянки, що кодує протеїн, яка може відігравати роль в ініціації та трансляції мРНК. 3' транскрипційнотермінаційна/поліаденілувальна сигнальна послідовність являє собою нетрансльовану ділянку 22 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вниз від кодуючої протеїн ділянки, що функціонує у рослинній клітині, спричиняючи термінацію РНК транскрипту та додавання поліаденілатних нуклеотидів до 3" кінця РНК. Джерело промотору, вибраного для драйву експресії кодуючої послідовності, не є важливим, оскільки він має достатню транскрипційну активність для реалізації даного винаходу шляхом експресії здатної до трансляції мРНК до потрібних фрагментів нуклеїнової кислоти у потрібній тканині хазяїна у коректний час. Для практичного втілення даного винаходу можуть бути використані як гетерологічні, так і негетерологічні (тобто ендогенні) промотори. Наприклад, придатні промотори включають, проте не обмежуючись цим, альфа первинну субодиницю бета конгліцинінового промотора, кунітц трипсин інгібіторний 3 промотор, анексиновий промотор, гліциніновий Gy1 промотор, бета субодиницю бета конгліцинінового промотора, P34/Gly Bd m 30K промотор, альбуміновий промотор, Leg A1 промотор та Leg А2 промотор. Анексиновий, або Р34 промотор описаний у РСТ публікації за номером WO 04/071178 (опублікована 26 серпня 2004 року). Рівень активності анексинового промотору порівнянний з рівнем багатьох відомих сильних промоторів, таких як: (1) CaMV 35S промотор (Atanassova et al., Plant Mol. Biol. 37:275-285 (1998); Battraw and Hall, Plant Mol. Biol. 15:527-538 (1990); Holtorf et al., Plant Mol. Biol. 29:637-646 (1995); Jefferson et al., EMBO J. 6:3901-3907 (1987); Wilmink et al., Plant Mol. Biol. 28:949-955 (1995)); (2) Arabidopsis олеозинові промотори (Plant et al., Plant Mol. Biol. 25:193-205 (1994); Li, Texas A&M University Ph.D. dissertation, pp. 107-128 (1997)); (3) Arabidopsis убіквітинові екстензійні протеїнові промотори (Callis et al., J. Biol. Chem. 265(21):12486-93 (1990)); (4) томатний убіквітиновий генний промотор (Rollfinke et al., Gene. 211(2):267-76 (1998)); (5) соєвий теплошоковий протеїновий промотор (Schoffl et al., Mol. Gen. Genet. 217(2-3):246-53 (1989)); та (6) маїсовий Н3 гістонний генний помотор (Atanassova et al., Plant Mol. Biol. 37(2):275-85 (1989)). Іншою корисною особливістю анексинового промотору є його профіль експресії в насінні, що розвивається. Анексиновий промотор найбільш активний у насінні, що розвивається, на ранніх стадіях (до 10 діб після запилення), і у значній мірі спокійний на пізніх стадіях. Профіль експресії анексинового промотору відрізняється від профілю багатьох специфічних щодо насіння промоторів, наприклад, протеїнових промоторів зберігання насіння, котрі часто запроваджують найвищу активність на пізніх стадіях розвитку (Chen et al., Dev. Genet. 10:112-122 (1989); Ellerstrom et al., Plant Mol. Biol. 32:1019-1027 (1996); Keddie et al., Plant Mol. Biol. 24:327-340 (1994); Plant et al., (supra); Li, (supra)). Анексиновий промотор має більш звичайний профіль експресії, але лишається відмінним від інших відомих специфічних до насіння промоторів. Таким чином, анексиновий промотор буде дуже привабливим кандидатом, коли на ранній стадії розвитку потрібна гіперекспресія або супресія гена у зародку. Наприклад, може виникнути проблема в гіперекспресії гена, що регулює ранній розвиток зародку, або гена, включеного у метаболізм до визрівання насіння. Після ідентифікації відповідного промотору, придатного для експресії кодуючої послідовності, даний промотор потім зчіплюють у діючий спосіб у змістовій орієнтації з використанням звичайних засобів, що добре відомі фахівцям у даній галузі. Стандартні методи рекомбінантної ДНК та молекулярного клонування, що тут застосовані, добре відомі у даній галузі і більш у повній мірі описані у роботі Sambrook, J. Et al., In Molecular nd Cloning: A Laboratory Manual; 2 ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, 1989 (у подальшому, "Sambrook et al., 1989") або Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K., Eds.; In Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley and Sons: New York, 1990 (у подальшому "Ausubel et al., 1990"). Наприклад, гібридний ген може бути сконструйований шляхом зчеплення принаймні двох ДНК фрагментів у каркасі у такий спосіб, щоб не вводити термінуючий кодон (злиття у каркасі). Результуючий гібридний ген буде таким, що кожен ДНК фрагмент кодує незалежну і роздільну ферментативну активність. Коли рекомбінантний конструкт створений, він може потім бути введений у потрібну рослинну клітину з використанням методів, що добре відомі звичайним фахівцям у даній галузі (наприклад, трансфекція, трансформація та електропорація). Рослинними клітинами, яким віддається перевага, є олійні рослинні клітини. Потім трансформована рослинна клітина культивується та регенерується за придатних умов, що дозволяють здійснювати експресію довголанцюгової ПНЖК, що потім, при потребі, відновлюється та очищається. Рекомбінантні конструкти даного винаходу можуть бути введені в одну рослинну клітину; або, як альтернатива, кожний конструкт може бути введений в окремі рослинні клітини. Експресія у рослинній клітині може проводитись у тимчасовий або стабільний спосіб як описано вище. 23 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Потрібна довголанцюгова ПНЖК може бути експресована у насінні. Крім того, в обсяг даного винаходу входить насіння або частини рослини, отримані із таких трансформованих рослин. Частини рослин включають диференційовані та недиференційовані тканини, включаючи, проте не обмежуючись цим, наступні: корені, стебла, пагони, листя, пилок, насіння, пухлинну тканину та різні форми клітин і культур (наприклад, окремі клітини, протопласти, зародки та калюсну тканину). Дана рослинна тканина може бути у рослині або в рослинному органі, тканині або клітинній культурі. Термін "рослинний орган" стосується рослинної тканини або групи тканин, що складають морфологічно та функціонально відмінну частину рослини. Термін "геном" стосується наступного: (1) увесь комплемент генетичного матеріалу (гени та некодуючі послідовності), присутній у кожній клітині організму або вірусу, або органели; (2) повний набір хромосом, успадкований як (гаплоїдна) одиниця від одного предка. Таким чином, даний винахід також стосується способу трансформації клітини, який включає трансформування клітини рекомбінантним конструктом даного винаходу і селекцію цих клітин, трансформованих рекомбінантним конструктом даного винаходу. Також являє інтерес спосіб продукування трансформованої рослини, що включає трансформування рослинної клітини полінуклеотидами даного винаходу та регенерацію рослини із трансформованої рослинної клітини. Способи трансформування дводольних рослин (головним чином, шляхом використання Agrobacterium tumefaciens) та одержання трансгенних рослин опубліковані, серед інших, для: бавовни (патент США за номером 5004863; патент США за номером 5159135); сої (патент США за номером 5569834; патент США за номером 5416011); Brassica (патент США за номером 5463174); арахісу (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15:653-657 (1996); McKently et al., Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995)); папайi (Ling, K. Et al., Bio/technology 9:752-758 (1991)); та гороху (Grant et al., Plant Cell Rep. 15;254-258 (1995)). Щодо огляду інших загальних методів перетворення рослин дивись роботу Newell, C.A. (Mol. Biotechnol. 16:53-65 (2000)). В одному із цих методів трансформації використовується Agrobacterium rhizogenes (Tepfler, M. and Casse-Delbart, F. Microbiol. Sci. 4:24-28 (1987)). Перетворення сої з використанням прямої доставки ДНК та PEG злиття опубліковано у РСТ публікації за номером WO 92/17598, електропорації (Chowrina, G.M. et al., Mol. Biotechnol 3:17-23 (1995); Christou, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3962-3966 (1987)), мікроін'єкції та бомбардування частинками (McCabe, D.E. et al., Bio/Technology 6:923 (1988); Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988)). Існує множина методів регенерації рослин із рослинної тканини. Конкретний метод регенерації буде залежати від вихідної рослинної тканини та конкретного виду рослини, що має регенеруватись. Регенерація, розвиток та культивування рослин із окремих рослинних протопластних трансформантів або із різних трансформованих експлантатів добре відомі у даній галузі (Weissbach and Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic: San Diego, CA (1988)). Ця регенерація та процес росту звичайно включають стадії селекції трансформованих клітин та культивування даних індивідуальних клітин через звичайні стадії ембріонального розвитку через кореневу проросткову стадію. Трансгенні зародки та насіння регенеруються у подібний спосіб. Результуючі трансгенні кореневі пагони потім вирощуються у відповідному середовищі рослинного росту, такому як ґрунт. Краще, коли регенеровані рослини самозапилюються, запроваджуючи гомозиготні трансгенні рослини. По-іншому, пилок, одержаний від регенерованих рослин, схрещується з рослинами, що вирощені із насіння агрономічно важливих ліній. Навпаки, пилок від рослин цих важливих ліній використовується для запилення регенерованих рослин. Трансгенна рослина даного винаходу, що містить потрібний поліпептид, культивується з використанням методів, що добре відомі фахівцям у цій галузі. На додаток до обговорених вище процедур, практикам знайомі стандартні ресурсні матеріали, котрі описують специфічні умови та процедури для конструювання, маніпуляції та виділення макромолекул (наприклад, ДНК молекул, плазмід і т.д.), генерації фрагментів рекомбінантної ДНК та рекомбінантних експресійних конструктів, та скринінгу і виділення клонів. Дивись, наприклад, Samdrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor: NY (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor: NY (1995); Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, Vol.1, Cold Spring Harbor: NY (1998); Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, Vol.2, Cold Spring Harbor: NY (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer: NY (1997). Приклади олійних рослин включають, проте не обмежуючись цим, сою, види Brassica, соняшник, маїс, бавовну, льон та сафлор красильний. Насіння, одержане від таких рослин, також підпадає під обсяг даного винаходу, так само як і олія, отримана із такого насіння. 24 UA 102063 C2 5 10 15 20 Вибір комбінації застосованих касет для вироблення АРК залежить, частково, від ПНЖК профілю та/або профілю десатурази/елонгази клітин олійної рослини, що має трансформуватись, та довголанцюгової ПНЖК, що має трансформуватись. Очищення та процесінг ПНЖК олій ПНЖК можуть бути знайдені у рослинах-хазяях як вільні жирні кислоти або в етерифікованих формах, таких як ацилгліцерини, фосфоліпіди, сульфоліпіди або гліколіпіди, і можуть бути екстраговані із клітин-хазяїв з використанням різновиду засобів, що добре відомі у даній галузі. Одним із оглядів способів екстракції, аналізу якості та стандартів придатності для дріжджевих ліпідів є огляд Z. Jacobs (Critical Reviews in Biotechnology, 12(5/6):463-491 (1992)). Стислий огляд процесінгу "вниз за течією" є також у роботі A. Singh and O. Ward (Adv. Appl. Microbiol., 45:271-312 (1997)). Загалом, засоби для очищення ПНЖК можуть включати екстракцію органічними розчинниками, обробку ультразвуком, екстракцію флюїдом у надкритичному стані (наприклад, з використанням діоксиду вуглецю), омилення та фізичні засоби, такі як пресування або їх комбінації. Додаткові подробиці можна знайти у PCT публікації за номером WO 04/101757. Способи виділення насіннєвих олій добре відомі у даній галузі: (Young et al., Processing of Fats and Oils, In The Lipid Handbook, Gunstone et al., eds., Chapter 5 pp 253-257; Chapman & Hall: London (1994)). Наприклад, соєва олія виробляється з використанням ряду кроків, включаючи екстракцію та очищення харчового олійного продукту із олійного насіння. Соєві олії та соєві побічні продукти виробляються з використанням узагальнених кроків, представлених у Таблиці 6. Таблиця 6 Узагальнені кроки для виробництва соєвої олії та її побічних продуктів Крок процесу Видалені домішки та/або одержані побічні продукти Процес #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 30 35 40 Дезодорація # 10 25 Соєве насіння Екстракція олії Знесмолювання Лужне або фізичне рафінування Водна промивка Вибілювання (гідрування) (фракціонування охолодженням) Олійні продукти Мукаl Лецитин Смоли, вільні жирні кислоти, пігменти Мило Колер, мило, метал Стеарин Вільні жирні кислоти, токофероли, стерини, летючі речовини Більш конкретно, насіння сої піддається очищенню, темперуванню, лущенню та вальцюванню, підвищуючи у такий спосіб ефективність екстракції олії. Екстракція олії звичайно проводиться розчинником (наприклад, гексаном), але також може досягатись комбінацією фізичного тиску та/або екстракцією розчинником. Результуюча олія називається сирою олією. Сира олія може бути знесмолена шляхом гідрування фосфоліпідів та інших полярних і нейтральних ліпідних комплексів, що полегшує їх відокремлення від тригліцеридної фракції, що не гідрується (соєва олія). Результуючі лецитинові смоли можуть додатково оброблятись для виготовлення комерційно важливих лецитинових продуктів, котрі використовуються у різновиді харчових та промислових продуктів як емульсіфікатори та речовини, що запобігають злипанню. Знесмолена олія потім може піддаватись рафінуванню для видалення домішок (головним чином, жирних кислот, пігментів та залишкових смол). Рафінування здійснюється шляхом додавання каустичного агента, який реагує з вільною жирною кислотою з утворенням мила та гідратів фосфатидів і протеїнів у сирій олії. Вода використовується для вимивання слідів мила, що утворилось підчас рафінування. Побічний мильний продукт може використовуватись безпосередньо у тваринних кормах або може піддаватись підкисленню для відновлення вільних жирних кислот. Забарвлення позбавляються шляхом адсорбції вибілюючою землею, що вилучає більшість хлорофілу та каротинових сполук. Рафінована олія може бути гідрована, з утворенням, у результаті, жирів з різними властивостями плавлення та текстурами. Фракціонування охолодженням може бути використано для вилучення стеарину із гідрованої олії шляхом кристалізації за ретельно контрольованих умов охолодження. Дезодорація 25 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (головним чином, шляхом парової дистиляції у вакуумі) є останнім кроком і призначена для вилучення сполук, котрі надають запах або аромат олії. Інші цінні побічні продукти, такі як токофероли та стерини, можуть бути видалені підчас процесу дезодорації. Дезодорований дистилят, що містить ці побічні продукти, може бути проданий для виробництва натурального вітаміну Е та інших високоцінних фармацевтичних продуктів. Рафіновані, вибілені (гідровані, фракціоновані) та дезодоровані олії та жири можуть запаковуватись і прямо продаватись або додатково перероблятись у більш спеціалізовані продукти. Більш детальне посилання на обробку соєвого насіння, виробництво соєвої олії та використання побічних продуктів можна знайти у роботі Erickson, Practical Handbook of Soybean Processing and Utilization, The American Oil Chemists" Society and United Soybean Board (1995). Соєва олія є рідкою при кімнатній температурі, оскільки вона має відносно низький вміст насичених жирних кислот у порівнянні з оліями, такими як кокосова, пальмова, пальмовим маслом та какао маслом. Рослинні олії, що містять ПНЖК, котрі були рафіновані та/або очищені, можуть бути піддані гідруванню, даючи в результаті жири з різними властивостями плавлення та структурами. Багато перероблених жирів (включаючи спреди, кондитерські жири, тверді масла, маргарини, хлібопекарні жири і т.д.) потребують різних ступенів твердості при кімнатній температурі і можуть вироблятись лише шляхом зміни фізичних властивостей вихідної олії. У найбільш загальному випадку це досягається шляхом каталітичного гідрування. Гідрування являє собою хімічну реакцію, в якій водень додається до подвійних зв'язків ненасиченої жирної кислоти за допомогою каталізатора, такого як нікель. Наприклад, високоолеїнова соєва олія містить ненасичену олеїнову, ЛК та ліноленову жирні кислоти, і кожна з них може гідруватись. Гідрування має два головних ефекти. По-перше, окиснювальна стійкість олії підвищується в результаті відновлення ненасичених жирних кислот. По-друге, фізичні властивості олії змінюються, оскільки жирнокислотні модифікації підвищують точку плавлення, що дає напівтвердий або твердий жир при кімнатній температурі. Існує багато змінних, котрі впливають на реакцію гідрування, що у свою чергу змінює склад кінцевого продукту. Робочі умови, що включають тиск, температуру, тип каталізатора та концентрацію, перемішування та конструкцію реактора, знаходяться серед найбільш важливих параметрів, котрі можуть контролюватись. Умови селективного гідрування можуть бути використані для гідрування більш насичених жирних кислот у порівнянні з менш насиченими кислотами. Дуже легке або щіткове гідрування часто застосовується для підвищення стабільності рідких олій. Подальше гідрування перетворює рідку олію на фізично твердий жир. Ступінь гідрування залежить від потрібної продуктивності та характеристик плавлення, що передбачаються для кінцевого продукту. Рідкі олії (що використовуються у виробництві хлібопекарських продуктів, твердих жирів та олій, які застосовуються для операцій смаження та обсмажування у торгівлі) та основна сировина для виробництва маргарину знаходяться серед великої множини можливих олійних та жирових продуктів, які одержуються шляхом гідрування. Більш детальний опис гідрування та продуктів гідрування можна знайти у роботі Patterson, H.B.W., Hydrogenation of Fats and Oils: Theory and Practice. The American Oil Chemists" Society (1994). Гідровані олії стали у деякій мірі контроверсійними через присутність транс-жирнокислотних ізомерів, що виникають в результаті процесу гідрування. Уживання великих кількостей трансізомерів зв'язується зі шкідливими для здоров'я ефектами, включаючи підвищені відношення ліпопротеїнів низької щільності до ліпопротеїнів високої щільності у плазмі крові та підвищений ризик коронарної хвороби серця. Олії, що містять ПНЖК, для використання у харчових продуктах Харчові композиції включають їжу або препарат для споживання людиною, включаючи для ентерального або парентерального споживання, котрі, коли їх уживають (a) живлять або відбудовують тканини чи постачають енергію та/або (b) зберігають, відновлюють або підтримують адекватний живильний статус чи метаболічну функцію. Такі композиції включають принаймні одну олію або кислоту, вироблені згідно з теперішнім винаходом, і можуть бути у твердій чи рідкій формі. Крім того, дана композиція може включати їстівні харчові макроелементи, вітаміни та мінерали у кількостях, придатних для досягнення передбачуваної цілі. Наприклад, кількості будуть варіювати, коли застосування передбачене для нормальних, здорових немовлят, дітей або дорослих, котрі мають спеціальні потреби, такі, що супроводжують деякі метаболічні стани. Приклади харчових макроелементів, котрі можуть бути додані до даної композиції, включають, проте не обмежуючись цим, їстівні жири, вуглеводні та протеїни. Приклади їстівних жирів включають, проте не обмежуючись цим, кокосову олію, соєву олію та моно- і дигліцериди. Як приклади вуглеводнів можуть бути зазначені глюкоза, їстівна лактоза та гідролізований 26 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 крохмаль. Приклади придатних протеїнів включають, проте не обмежуючись цим, соєві протеїни, піддану електродіалізу сироватку, піддане електродіалізу збиране молоко, молочну сироватку гідролізати цих білків. Приклади придатних вітамінів та мінералів включають, проте не обмежуючись цим, кальцій, фосфор, калій, натрій, хлорид, магній, марганець, залізо, мідь, цинк, селен, йод, та вітаміни A, E, D, C, і B комплекс. Приклади харчових композицій включають, проте не обмежуючись цим, дитячі суміші, дієтичні добавки та регідратовані композиції. У теперішній час ринок підтримує великий різновид провізії та продуктів харчування, що включає омега-3 та/або омега-6 жирні кислоти (зокрема, АРК, EПК та ДГК). Передбачається, що рослинні/насіннєві олії та змінені насіннєві олії даного винаходу, котрі містять ПНЖК, будуть діяти у їжі та харчових продуктах з користю для здоров'я. У порівнянні з іншими рослинними оліями, олії даного винаходу, як мається на думці, діють подібно до інших олій у харчових застосуваннях з фізичної точки зору (наприклад, частково гідровані олії, такі як соєва олія, широко застосовуються як інгредієнти для м'яких спреїв, маргарину та шортенінгів для випікання та смаження). Рослинні/насіннєві олії та змінені насіннєві олії, що містять омега-3 та/або омега-6 жирні кислоти, як тут описано, будуть придатні для застосування у різновиді харчів та харчових продуктів, включаючи, проте не обмежуючись цим, харчові аналоги, м'ясні продукти, круп'яні продукти, мучні продукти, закуски та молочні продукти. Крім того, рослинні/насіннєві олії та змінені насіннєві олії можуть бути використані у препаратах, що діють з користю для здоров'я у лікувальному харчуванні, включаючи медичне харчування, дієтичні добавки, дитячі суміші, так само як і фармацевтичні продукти. Фахівцеві у галузі обробки харчових продуктів та складання харчових рецептів зрозуміло, яким чином і у якій кількості та якості до їжі або харчового продукту можуть бути додані олії даного винаходу. На таку кількість будемо тут посилатись як на "ефективну" кількість, і вона буде залежати від конкретної їжі або харчового продукту, дієти, яку має доповнювати даний продукт, або медичного стану, який мається на думці скоригувати або вилікувати з допомогою медичного харчування. Харчові аналоги можуть бути виготовлені з використанням способів, що добре відомі фахівцям у даній галузі. Тут можна зазначити аналоги м'яса, аналоги сиру, аналоги молокаі таке подібне. Аналоги м'яса, виготовлені із сої, містять соєвий білок або тофу та інші інгредієнти, змішані для симуляції різних видів м'яса. Ці альтернативи м'яса продаються як заморожені, консервовані або висушені харчові продукти. Звичайно, вони можуть бути використані у той самий спосіб, що і їжа, яку вони замінюють. Альтернативи м'яса, виготовлені із сої, слугують чудовими джерелами протеїну, заліза та вітамінів В. Приклади аналогів м'яса включають, проте не обмежуючись цим, аналоги шинки, ковбасні аналоги, аналоги бекону і таке подібне. Харчові аналоги можуть бути класифіковані як імітація або замісники, у залежності від їх функціональних та складових характеристик. Наприклад, імітаційний сир має лише походити на сир, який він має заміщувати. Проте, продукт може, загалом, називатись замісником сиру, тільки якщо він є харчовим еквівалентом сиру, який він заміщує та задовольняє мінімуму вимог по складу для цього сиру. Таким чином, замісник сиру часто має більш високі рівні протеїну, ніж імітаційні сири, і має бути підкріплений вітамінами та мінералами. Молочні аналоги або немолочні харчові продукти включають, проте не обмежуючись цим, імітаційне молоко та немолочні заморожені десерти (наприклад, виготовлені із сої та/або соєвого білка). М'ясні продукти охоплюють широкий різновид продуктів. У США "м'ясо" включає "червоне м'ясо", що одержане із великої рогатої худоби, свиней та овець. На додаток до червоного м'яса є вироби із птиці, котрі включають курчат, індиків, гусей, рябчиків, качок та рибу і молюсків. Мається широкий асортимент висушених та перероблених м'ясних продуктів: свіжих, в'ялених та обсмажених, і в'ялених та випечених. Ковбаса та хот доги є прикладами перероблених м'ясних продуктів. Таким чином, термін "м'ясні продукти", як тут застосовується, включає, проте не обмежуючись цим, перероблені м'ясні продукти. Круп'яний харчовий продукт являє собою харчовий продукт, отриманий в результаті переробки круп'яного зерна. Круп'яне зерно стосується будь-якої рослини із родини трав, що дає їстівне зерно (насіння). Найбільш популярними є ячмінь, кукурудза, просо, овес, кіноа, рис, жито, сорго, тритикале, пшениця та канадський рис. Приклади круп'яних продуктів включають, проте не обмежуючись цим: ціле зерно, подрібнене зерно, крупу грубого помелу, муку, висівки, насіння, сніданкові пластівці, екструдовані харчові продукти, пасти і таке подібне. Випечені продукти включають будь-який із круп'яних харчових продуктів, згаданий вище, що був випечений або перероблений у спосіб, подібний до випікання (наприклад, підданий дії тепла для висушування та отвердіння). Приклади випечених продуктів включають, проте не 27 UA 102063 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обмежуючись цим: хліб, пироги, пончики, палички, пасти, хлібне кришиво, варені закуски, мінібісквіти, міні-крекери, міні-булочки та міні-кренделі. Як зазначалось вище, олії даного винаходу можуть бути використані як інгредієнт. Закусочні харчові продукти містять будь-який із описаних вище або нижче харчових продуктів. Смажений харчовий продукт включає будь-який із описаних вище або нижче харчових продуктів, що був підсмажений. Напій може бути у рідкій або у сухій порошковій формі. Повноцінним харчовим продуктом є будь-який харчовий продукт, що приносить користь здоров'ю. Багато харчових продуктів, що були одержані із олійного насіння, можуть розглядатись як повноцінні харчові продукти. Наприклад, тут можна згадати негазовані напої, такі як фруктові соки, свіжі, заморожені, консервовані або концентрати; ароматизовані або прості молочні напої і т.д. Живильні суміші для дітей та дорослих добре відомі у даній галузі і є у продажу (наприклад, Similac, Ensure, Jevity та Alimentum від фірми Ross Products Division, Abbott Laboratories). Дитячі суміші є рідинами або відновленими порошками, якими годують немовлят або малих дітей. "Дитяча суміш" визначена тут як ентеральний харчовий продукт, котрим можна замінити грудне молоко людини при годуванні немовлят і яка звичайно складається із бажаного відсотку жиру, змішаного з потрібним відсотком вуглеводів та білків у водному розчині (наприклад, дивись патент США за номером 4670285). Базуючись на світових дослідженнях складу та на рівнях, визначених експертними групами, усереднене грудне молоко людини, типово, містить приблизно 0,20-0,40 % сукупних жирних кислот (у припущенні приблизно 50 % калорій із жиру); і, загалом, відношення ДГК до АРК варіює від приблизно 1:1 до 1:2 (дивись, наприклад, рецепти Enfamil LIPIL (Mead Johnson & Company) та Similac Advance (Ross Products Division, Abbott Laboratories)). Дитячі суміші мають відігравати спеціальну роль у дитячих дієтах, оскільки вони часто є єдиним джерелом харчування для дітей; і, хоча годування груддю залишається найкращим способом харчуванням для дітей, дитяча суміш є важливим компонентом не тільки для виживання, але й розвитку дітей. Молочний продукт являє собою продукт, одержаний із молока. Аналог молока або немолочний продукт одержується із джерела, іншого, ніж молоко, наприклад, соєвого молока, як обговорювалось вище. Такі продукти включають, проте не обмежуючись цим, незбиране молоко, збиране молоко, продукти зі зшумованого молока, такі як йогурт або кисле молоко, вершки, масло, згущене молоко, зневоднене молоко, порошковий молочний замісник для кофе, порошковий вершковий замісник для кофе, морозиво, сир і т.д. Додатковими харчовими продуктами, в які можуть включатись олії даного винаходу, що містять ПНЖК, є, наприклад, жувальні гумки, конфетки та цукрова глазур, желатини та пудинги, тверді та м'які льодяники, джеми та желе, білий цукор-пісок, замінники цукру, солодкі пюре, десерти та сиропи, і змішані в сухому стані порошкові суміші. Олії, що містять ПНЖК, для використання у повноцінних харчових продуктах, Медичних харчових продуктах та фармацевтичних продуктах Повноцінним харчовим продуктом є будь-який харчовий продукт, що надає користі здоров'ю і включає функціональний харчовий продукт, медичний харчовий продукту, лікувальне харчування та дієтичні добавки. "Медичний харчовий продукт" являє собою їжу, що уживається під наглядом лікаря і призначена для спеціального дієтного лікування хвороби, для якої встановлені чіткі вимоги щодо харчування. Крім того, рослинні/насіннєві олії та змінені насіннєві олії даного винаходу можуть бути використані у стандартних фармацевтичних композиціях (наприклад, довголанцюгові ПНЖК, що містять олії, могли б бути легко введені у будь-який зі згаданих вище харчових продуктів, утворюючи у такий спосіб функціональні або медичні харчові продукти). Більш концентровані препарати, що містять ПНЖК, включають капсули, порошки, таблетки, м'які гелі, гелеві ковпачки, рідкі концентрати та емульсії, котрі можуть застосовуватись як дієтичні добавки до харчування людей або тварин, інших, ніж люди. Відповідно, фармацевтична композиція може містити одну або кілька жирних кислот та/або результуючих олій, так само як і добре відомі нетоксичний фармацевтично прийнятний носій, ад'ювант або наповнювач, такий як фосфатний буферний розчин, вода, етанол, поліоли, рослинні олії, змочувальний агент або емульсію, таку як емульсія вода/олія. Композиція може бути у рідкій або твердвй формі. Можливі схеми застосування включають пероральну, ректальну, парентеральну, місцеву і т.д. Дана схема застосування буде залежати від бажаного ефекта. 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюSoyabean plant producing arachidonic acid
Автори англійськоюDamude, Howard, G., Kinney, Anthony, J.
Назва патенту російськоюТрансгенное соевое растение, продуцирующее арахидоновую кислоту
Автори російськоюДамуд Ховард Дж., Кинни Энтони Дж.
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/82
Мітки: рослина, арахідонову, продукує, соєва, кислоту, трансгенна
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/431-102063-transgenna-soehva-roslina-shho-produkueh-arakhidonovu-kislotu.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Трансгенна соєва рослина, що продукує арахідонову кислоту</a>
Модифікований фермент dmo та трансгенна рослина, що його продукує
Номер патенту: 94613
Опубліковано: 25.05.2011
Автори: Фласінскій Станіслав, Вікс Дональд П., Думітру Разван, Клементе Томас Е., Фен Пол К.К.
МПК: C12N 15/82, A01H 5/00
Мітки: продукує, модифікований, трансгенна, фермент, рослина
Формула / Реферат:
1. Молекула нуклеїнової кислоти, вибрана з групи, що складається з:a) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з SEQ ID NO:1;b) молекули нуклеїнової кислоти, що включає послідовність з SEQ ID NO:2; іc) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності з поліпептидом з SEQ ID NO:1, де поліпептид має дикамба-монооксигеназну активність і включає цистеїн у...
Трансгенна рослина кукурудзи mir604
Номер патенту: 94893
Опубліковано: 25.06.2011
Автори: Чен Ерік, Штейнер Генрі-Йорк, Мегхіджі Мьоз
МПК: A01H 5/00, C12N 15/11, G01N 33/53, C12Q 1/68
Мітки: mir604, кукурудзи, трансгенна, рослина
Формула / Реферат:
1. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4 або комплементи SEQ ID NO: 1-4.2. Амплікон, який містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1.3. Рослина кукурудзи, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1.4. Рослина кукурудзи за п. 3, у якій після розщеплення геномної ДНК рослини рестриктазою KрnІ при гібридизації в строгих умовах з використанням...
Днк, яка включає промоторну послідовність (варіанти), і трансформована з її використанням трансгенна рослина
Номер патенту: 74535
Опубліковано: 16.01.2006
Автори: Ан Гунхйонг, Чунг Йонг-Йун, Лі Січул, Джеон Джонг-Сеонг
МПК: A01H 5/00, C12N 15/09, C07K 14/415, C12N 15/82
Мітки: яка, промоторну, трансформована, послідовність, днк, рослина, варіанти, трансгенна, включає, використанням
Формула / Реферат:
1. ДНК для експресії кодувальної послідовності, яка має нуклеотидну послідовність, яка на 50% або більше ідентична нуклеотидній послідовності SEQ ID NO: 2, і яка включає промоторну послідовність, яка має здатність забезпечувати експресію зв'язаної кодувальної послідовності специфічно в тапетумі, тканині ендотецію і сполучній тканині пиляків, але не в мікроспорах чи пилку, причому експресія кодувальної послідовності починається на стадії...
Стрес-толерантна трансгенна рослина пшениці
Номер патенту: 90279
Опубліковано: 26.04.2010
Автори: Макнейл Скотт Девід, Боувер Роберт Сіндікомб, Чемберлейн Дуглас Елан
МПК: C12N 15/29, A01H 5/00, C12N 15/82
Мітки: трансгенна, пшениці, рослина, стрес-толерантна
Формула / Реферат:
1. Стрес-толерантна рослина пшениці, яка відрізняється тим, що дана рослина пшениці була трансформована молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує орнітин-аміно-трансферазу (ОАТ).2. Стрес-толерантна рослина пшениці за п. 1, яка відрізняється тим, що молекулою нуклеїнової кислоти є молекула кДНК, яка має нуклеотидну послідовність, в основному, відповідну до тієї, що показана на фіг. 2 (SEQ ID N0:1), або її біологічно активний...
Однодольна трансгенна рослина, що містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що обумовлює толерантність до гліфосату
Номер патенту: 96578
Опубліковано: 25.11.2011
Автори: Лю Дунлун, Чо Хьон-же, Лу Алберт Л., Касл Лінда А., Олсон Пол Д., Маккатчен Біллі Фред, Хегстад Джеффрі М., Грін Джеррі М., Сондерз Девід В., Піплз Кеннет А., Мой Йорк, Вілкінсон Джек К., Хейзел Крістін Б., Гайда Ентоні Д., Джр., Мере Вейн Дж., Вон Джеймс Ф. Х., Хатчісон Джеймс М., Хекерт Мет'ю Дж., Клаус Джон С., Чікойн Тімоті К., Вогт Марк Д.
МПК: C12N 15/82, A01H 5/00
Мітки: кодує, обумовлює, толерантність, містить, полінуклеотид, однодольна, трансгенна, поліпептид, рослина, гліфосату
Формула / Реферат:
1. Однодольна трансгенна рослина, що містить полінуклеотид, який кодує поліпептид гліфосат-N-ацетилтрансферазу, де полінуклеотид функціонально зв'язаний з(а) промотором, який забезпечує експресію в рослині; та(б) принаймні однією копією енхансерної послідовності, що включає (і) нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 72 або 85, або(іі) нуклеотидну послідовність, яка принаймні на 90% ідентична...
Попередній патент: Спосіб деемульсації рідких водонафтових шламових систем
Наступний патент: Вузол з двох пар баків і літальна пускова установка, оснащена таким вузлом
Випадковий патент: Похідні 2"-деоксигігроміцину