Модифікований фермент dmo та трансгенна рослина, що його продукує

1. Молекула нуклеїнової кислоти, вибрана з групи, що складається з: a) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з SEQ ID NO:1; b) молекули нуклеїнової кислоти, що включає послідовність з SEQ ID NO:2; і c) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності з поліпептидом з SEQ ID NO:1, де поліпептид має дикамба-монооксигеназну активність і включає цистеїн у положенні, що відповідає положенню 112 амінокислоти з SEQ ID NO:1. 2. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, де молекула нуклеїнової кислоти кодує дикамбамонооксигеназу, що кодується плазмідою pKLP36TEV-TP-DMOc (ATCC Accession № PTA-7357). 3. Конструкція ДНК, що включає молекулу нуклеїнової кислоти, вибрану з групи, яка складається з: 2 (19) 1 3 94613 4 трансформації вихідної рослинної клітини і регенерації клітини у зазначену рослину, толерантну до дикамби. 18. Спосіб за п. 16, де рослину, толерантну до дикамби, одержують шляхом схрещування батьківської рослини з самою собою або з другою рослиною, де батьківська рослина і/або друга рослина включають трансформовану конструкцію і здійснюють відбір толерантної до дикамби рослини за наявністю конструкції за п. 3, яку вона успадковує від зазначеної батьківської рослини і/або від другої рослини. 19. Спосіб контролю росту бур'янів в оточенні зростаючої сільськогосподарської культури, що включає рослину за п. 12 або її насіння, причому спосіб включає застосування до оточення сільськогосподарської культури, що росте, ефективної для контролю росту бур'янів кількості гербіциду дикамба. 20. Спосіб за п. 19, де гербіцид дикамба застосовується на верхівках рослин з оточення сільськогосподарської культури, що росте. 21. Спосіб за п. 19, де кількість гербіциду дикамба не ушкоджує зазначену рослину за п. 12 або її насіння, і ушкоджує рослину такого ж генотипу, що і рослина за п. 12, позбавлена нуклеїнової кислоти за п. 1. 22. Спосіб одержання харчового, кормового або промислового продукту, що включає: a) одержання рослини за п. 12 або її частини; і b) приготування харчового, кормового або промислового продукту з рослини або її частини. 23. Спосіб за п. 22, де їжа або корм являють собою олію, борошно, зерно, крохмаль, порошок або білок. 24. Спосіб за п. 22, де промисловий продукт являє собою біопаливо, волокно, хімічні речовини для виробничих потреб, лікарський засіб або нутрицевтик. Рівень техніки У даній заявці заявлений пріоритет попередньої патентної заявки зі серійним номером U.S. 60/811152 від 6.06.2006 і попередньої патентної заявки зі серійним номером U.S. 11/758657 від 5.06.2007, опис яких повністю введений у даний опис за допомогою посилання. Галузь техніки Даний винахід стосується в основному галузі біотехнології. Більш конкретно, винахід стосується модифікованих ферментів дикамбамонооксигенази, здатних надавати толерантність до гербіциду дикамби в трансгенних організмах. Опис рівня техніки Способи одержання польових сільськогосподарських культур, таких як кукурудза, соя і бавовна, серйозно змінилися протягом останньої декади завдяки введенню таких властивостей, як стійкість до впливу комах і гербіцидна толерантність, за допомогою використання методів генетичної інженерії рослин. Зазначені зміни призвели в результаті до збільшення продуктивності на гектар, до зменшення вартості, збільшення гнучкості та ефективності режимів виробництва, зменшення використання пестицидів, і, у разі бавовни, стійкої до впливу комах, до поліпшення здоров'я фермерів. Таким чином, трансгенні сільськогосподарські культури набули широкого поширення, і зараз вирощуються на мільйонах акрів по всьому світу. Однак для продовження конкурентоздатності трансгенних сільськогосподарських культур на ринку потрібне введення додаткових властивостей. Хоча нові властивості, які поліпшують кількість та якість сільськогосподарських і садових культур, з'явилися і продовжують з'являтися з плином часу зі зростаючою швидкістю, при цьому існує попит на властивості, які поліпшують способи виробництва їжі, корму та інших продуктів. Наприклад, у той час як у даний момент є доступними трансгенні рослини, толерантні до обробок гербіцидами у вигляді гліфосфату, бромоксинілу, сульфонілсе човини, та іншими гербіцидами, існують пропуски стосовно контрольованих бур'янів і властивостей обробок, які можуть бути переадресовані у напрямку розвитку додаткових сільськогосподарських культур, толерантних до гербіцидів. Більше того, поява бур'янів, стійких до гербіцидів, відмічена вище, хоча в основному локалізована і така, що змінно виникає, накладає обмеження у вигляді необхідності додаткових або альтернативних заходів контролю бур'янів. У той час як трансгенна толерантність до гербіцидів довела цінність із комерційної точки зору, з'явилася, таким чином, необхідність того, щоб для рослин, толерантних до інших гербіцидів, уникали ризику підвищеної довіри до будь-якого єдиного гербіциду і збільшували властивості для регулювання важких для контролю видів бур'янів. Особливо необхідним є розвиток толерантності до гербіцидів, які є нешкідливими для навколишнього середовища та одночасно високоефективними при контролі бур'янів. Дикамба являє собою один такий приклад ефективного і нешкідливого для навколишнього середовища гербіциду, який використовувався фермерами протягом більше 40 років. Дикамба особливо використовується для контролю однорічних і багаторічних широколистих бур'янів і деяких трав'янистих бур'янів у сільськогосподарських культурах кукурудзи, сорго, дрібних зернових, у кормових культурах, культурах для сіна, культурах на пасовищах, у культурах цукрової тростини, спаржі, дерну і культур насіннєвої трави (Crop Protection Reference, 1995). На жаль, дикамба може ушкоджувати багато комерційних сільськогосподарських культур і дводольні рослини, такі як соя, бавовна, горох, картопля, соняшник і канола, які особливо чутливі навіть до низького рівня гербіциду. Незважаючи на це дикамба являє собою високоефективний засіб у контролі росту бур'янів, і, таким чином, є важливим інструментом у сільському господарстві. Недавно з Pseudomonas maltophilia був виділений ген, що кодує дикамба-монооксигеназу 5 (DMO), яка надає толерантність до дикамби (патент US № 7022896). DMO залучена до перетворення гербіциду дикамби (3,6-дихлор-о-анісової кислоти) у нетоксичну 3,6-дихлорсаліцилову кислоту. Зазначений ген описаний у патенті U.S. № 7022896, як такий, що забезпечує толерантність до дикамби в рослинах, що експресують ген DMO. Однак розробка варіантів зазначеного гена могла б принести величезну користь. Такі варіанти могли б потенційно мати різну ефективність експресії за певних умов навколишнього середовища. Таким чином, може бути вибраний варіант, який оптимізується для певного навколишнього середовища, для якого призначене його використання, і може демонструвати особливо корисні динамічні риси. Варіант, який демонструє конкретну ефективність при різних температурах або за різних умов рН, і таким чином, може бути вибраний для конкретного виду сільськогосподарської культури залежно від внутрішньоклітинних умов і/або від очікуваних умов росту сільськогосподарської культури. Суть винаходу В одному аспекті у винаході пропонується виділена послідовність нуклеїнової кислоти, вибрана з групи, що складається з: а) послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид із SEQ ID NO:1; b) послідовності нуклеїнової кислоти, що включає послідовність із SEQ ID NO:2; і с) послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, що має, принаймні, 90% ідентичності послідовності з поліпептидом із SEQ ID NO:1, де поліпептид має дикамба-монооксигеназну активність і включає цистеїн у положенні, що відповідає положенню 112 амінокислоти з SEQ ID NO:1. В інших втіленнях пропонується ДНК-вектор, що включає описану в даному описі нуклеїнову кислоту, що кодує DMO, функціонально зв'язану з промотором. Промотор може бути функціональним у рослинній клітині. У певних втіленнях послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує дикамбамонооксигеназу, може бути функціонально пов'язана з хлоропластним транзитним пептидом. В іншому аспекті у винаході пропонується послідовність поліпептиду, що має, принаймні, 90% ідентичності з SEQ ID NO:1, де поліпептид має дикамба-монооксигеназну активність і включає цистеїн у положенні, що відповідає положенню 112 амінокислоти з SEQ ID NO:1. Ще в одному аспекті у винаході пропонується клітина-хазяїн або тканина, трансформована описаною в даному описі нуклеїновою кислотою, що кодує дикамба-монооксигеназу. У певних втіленнях клітина-хазяїн може являти собою рослинну клітину. У наступних втіленнях зазначена рослинна клітина може бути визначена як клітина дводольної рослини або клітина однодольної рослини. У певних втіленнях клітина-хазяїн являє собою клітину рослин сої, бавовни, маїсу або ріпаку. У наступних втіленнях пропонується тканинна культура, що включає описану в даному описі трансгенну клітину. Ще в одному втіленні у винаході пропонується трансгенна рослина та її потомство, трансформовані описаною в даному описі нуклеїновою кислотою, що кодує дикамба-монооксигеназу. У певних 94613 6 втіленнях рослина може бути визначена як дводольна або однодольна рослина. У певних втіленнях рослина являє собою сою, бавовну, маїс або ріпак. Ще в одному аспекті винаходу пропонується спосіб одержання рослини, толерантної до дикамби, що включає введення в рослину запропонованої в даному описі трансформуючої конструкції. В одному втіленні способу введення трансформуючої конструкції може бути проведене шляхом стабільної трансформації однієї або більше рослинних клітин і регенерації однієї або більше клітин у рослину, толерантну до дикамби. В іншому втіленні рослина, толерантна до дикамби, може бути одержана шляхом схрещування батьківської рослини з самою собою або з іншою рослиною, де батьківська рослина і/або друга рослина включають трансформуючу конструкцію, і рослина, толерантна до дикамби, успадковує трансформуючу конструкцію від батьківської рослини і/або від другої рослини. Ще в одному аспекті у винаході пропонується спосіб виробництва їжі або корму, що включає: а) одержання рослини за винаходом, як пропонується в даному описі, або її частини; і b) приготування їжі або корму з рослини або її частини. В одному втіленні винаходу частиною рослини є насінина. У наступних визначених втіленнях їжа або корм являють собою олію, муку, білок, зерно, крохмаль або білок. В інших втіленнях корм включає фуражну або пасовищну рослину, таку як юган (hay). У винаході також пропонуються способи виробництва волокон, лікарських засобів, нутрицевтиків і хімічних речовин для виробничих потреб, включаючи біопалива, а також будь-який інший продукт, виділений із запропонованої в даному описі рослини. Ще в одному аспекті у винаході пропонується спосіб контролю росту бур'янів в оточенні сільськогосподарської культури, яка росте, що включає рослину за винаходом, як пропонується в даному описі, або її насіння, причому спосіб включає застосування до оточення сільськогосподарської культури, яка росте, кількості гербіциду дикамби, ефективної для контролю росту бур'янів. У певних втіленнях винаходу гербіцид дикамби може застосовуватися у верхніх ділянках рослин в оточенні сільськогосподарської культури, яка росте. У певних втіленнях кількість гербіциду дикамби не ушкоджує рослину за винаходом або її насіння та ушкоджує рослину такого самого генотипу, що і рослина, позбавлена пропонованої за винаходом нуклеїнової кислоти, що кодує DMO. Ще в одному втіленні винаходу пропонується рослина, яка включає пропоновану у винаході нуклеїнову кислоту, що кодує DMO, і, принаймні, ще одну іншу трансгенну кодуючу послідовність, що включає, наприклад, принаймні, дві, три, чотири, п'ять або більше таких кодуючих послідовностей. У конкретних втіленнях рослини включають трансген, що надає одну або більше додаткових корисних властивостей, таких як толерантність до гербіцидів або шкідників/комах. Наприклад, може бути забезпечена толерантність до одного або більше гербіцидів на додаток до дикамби, а також інші корисні властивості, як описано в даному описі 7 нижче. Таким чином, зокрема, у винаході пропонуються рослини, що включають нуклеїнову кислоту за даним винаходом, кодуючу DMO, "скомпоновану" у будь-якій бажаній комбінації з додатковими трансгенними властивостями. Короткий опис креслень Наступні малюнки утворюють частину даного опису і включені для додаткової демонстрації певних аспектів даного винаходу. Винахід можна краще зрозуміти з посиланням на один або більше з цих малюнків у комбінації з детальним описом певних втілень, представлених у даному описі. Фіг. 1. Схема касети, використаної для генетичної інженерії гена дикамба-монооксигенази (DMOc) для експресії у вищих рослинах із використанням промотору FLt36 з вірусу хлоротичної смугастості арахісу, із використанням енхансерної послідовності трансляції (лідер TEV) із вірусу гравіювання тютюну, і ділянки термінації з малої субодиниці гена Rubisco гороху. Інша версія гена DMOc, одержана з використанням генетичної інженерії, містила ділянку, що кодує транзитний пептид, із малої субодиниці гена Rubisco гороху для локалізації DMO у хлоропластах, між енхансерною ділянкою трансляції TEV і кодуючою ділянкою для DMOc. Фіг. 2. Панелі блотів ДНК, РНК і білка, що демонструють присутність і експресію одержаного за допомогою генетичної інженерії гена DMO у генерації Т1 трансгенних рослин тютюну. Доріжки Q-V показують зразки ДНК, мРНК і DMO, виділені з різних генерацій Т1 трансгенних рослин тютюну. Екстракти з нетрансгенної рослини тютюну показані на доріжці WT, у той час як доріжка Ох демонструє гідролізований за допомогою рестрикції продукт клонованої конструкції гена DMO (верхня панель) і надпродукування в Е. coli приблизно 37 кДа ферменту DMO (нижня панель). Велика субодиниця приблизно 55 кДа Rubisco була детектована за допомогою білкового блоту шляхом додавання антитіл Rubisco до антисироватки DMO, і детектування Rubisco було як внутрішній стандарт для порівняння загального завантаження білка в кожну доріжку. Однакові кількості РНК завантажували в кожну доріжку, що оцінювали за допомогою забарвлювання етидіум бромідом дубліката гелю. Стрілки вказують локалізацію смуги ДНК, мРНК або білка, відповідної DMO. Фіг. 3. Ефект обробки за допомогою дикамби в кількості 2,2 кг/га двох Т1 рослин тютюну, одна містила одержаний за допомогою генетичної інженерії генів DMOc, позбавлений послідовності, що кодує хлоропластний транзитний пептид (праворуч), й інша була позбавлена гена DMOc (друга праворуч). Трансгенна рослина праворуч виявила слабке, якщо це взагалі мало місце, пошкодження, викликане від обробки за допомогою дикамби. Дві рослини зліва не були схильні до обробки за допомогою дикамби і являють собою нетрансгенну рослину (зліва) і трансгенну рослину, що містить ген DMOc (друга зліва). Фіг. 4. Утворення DCSA проти часу за допомогою DMOw. Фіг. 5. Визначення оптимального аналізу рН для DMOw. 94613 8 Фіг. 6. Визначення оптимального аналізу температури для DMOw. Фіг. 7. Визначення оптимального значення рН для DMOc. Фіг. 8. Визначення оптимального значення температури для DMOc. Фіг. 9. Підсумовування оптимальних температурних і рН умов для DMOc і DMOw. Фіг. 10. Кінетика стійкого стану для DMOw. Фіг. 11. Кінетика стійкого стану для DMOc. Фіг. 12. Ефекти попередньої інкубації DMOc протягом 45 хвилин при 30°С у розчині 50 мМ TRIS рН 7,5 і 100 мМ KPІ рН 7,0. Фіг. 13. DMOc-аналізи з ферментом проводили протягом одного тижня і зберігали при 4°С у буфері TRIS (два аналізи зліва; аналізи перед зберіганням і після зберігання, відповідно), і в буфері KРі (два аналізи праворуч; аналізи перед зберіганням і після зберігання, відповідно). Фіг. 14. Конструкція гена дикамбамонооксигенази, одержана за допомогою генетичної інженерії для гомологічної рекомбінації та експресії в хлоропластах тютюну. Фіг. 15. Демонстрація гомопластидного статусу хлоропластного геному трансгенних ліній тютюну, трансформованих геном DMO, сконструйованим для гомологічної рекомбінації та експресії в хлоропластах тютюну. На лівій панелі показана конструкція для інтеграції DMO в хлоропласти шляхом гомологічної рекомбінації (як показано на Фіг. 14). Смуга вище лівої позначеної послідовності вказує фрагмент ДНК, ампліфікований для одержання міченого дигоксигеніном гібридизаційного зонда. На панелях праворуч показані ДНК-блоти: Доріжка 1 містить маркери за розміром. Доріжка 2 містить ДНК із нетрансгенних рослин тютюну. Доріжки 3-11 містять ДНК, виділену з трансгенних рослин відразу після першого раунду селекції і регенерації в присутності спектиноміцину (верхня панель), і після декількох раундів селекції і регенерації, коли одержують очевидну гомопластидність хлоропластного геному (нижня панель). ДНК для ДНК-блот аналізів виділяли з трансгенних і нетрансгенних рослин і піддавали рестриктному гідролізу ферментом ВатН І перед розділенням за допомогою електрофорезу і гібридизацією ДНК-блота з міченим фрагментом ДНК, комплементарним до "лівої послідовності-мішені" трансформуючого вектора з хлоропластним геномом (тобто гібридизаційним зондом, міченим дигоксигеніном). 5,6-т.п.о. фрагмент ДНК відповідає фрагменту ДНК хлоропластів, що містить ген DMO, і 3,3-т.п.о. фрагмент ДНК відповідає гомологічному нативному фрагменту ДНК хлоропластів, позбавленому вставленої конструкції гена DMO. Фіг. 16. Т1 генерація гомопластидних рослин тютюну, що містять кодований у хлоропластах ген дикамба-монооксигенази, оброблених за допомогою дикамби на рівні 28 кг/га (рослини 1-2 і рослини 3-4 були виділені з двох незалежно трансформованих R0 рослин). Фіг. 17. Експресія DMO і чутливість і стійкість до обробки за допомогою дикамби в нетрансгенних і трансгенних рослинах тютюну, що містять ген DMO в хлоропластному геномі. Білковий блот гіб 9 ридизували з DMO-антитілами: Доріжка 1 містить очищений білок DMO. Доріжка 2 є пустою, і Доріжка 3 містить білкові екстракти з нетрансгенних рослин тютюну. Доріжки 4 і 8 містять білки, виділені з "хибнопозитивних" рослин тютюну, що демонструють стійкість до антибіотиків під час селекції на спектиноміцині, але позбавлені інтактного гена DMO. Доріжки 5-7 містять екстракти трансгенних рослин, що експресують DMO, кодований геном DMO, інтегрованим у хлоропластний геном. S являє собою рослини, чутливі до дикамби при 0,56 кг/га; R являє собою рослини, стійкі до дикамби при 0,56 кг/га. Майже однакові кількості екстрактів завантажували в доріжки 4-8, що оцінювали за кількістю великої субодиниці білка Rubisco, який детектувався за допомогою Rubisco-антитіл, у той час як значно більшу кількість білка з нетрансгенних рослин завантажували в доріжку 3. Стрілками зазначене положення білка DMO. Фіг. 18. Порівняння ділянки поліпептидної послідовності DMO дикого типу з консервативними ділянками інших залізо-сірчаних оксигеназ, яке показує, що DMO є унікальною із низьким ступенем ідентичності з відомими ферментами, але W112 (стрілка) є консервативним в інших залізосірчаних оксигеназах, і межує з двома консервативними доменами, Rieske негемінового Fe (SEQ ID NO:4-23). Детальний опис винаходу У винаході пропонуються варіанти дикамбамонооксигенази (DMO), які включають цистеїн у положенні, що відповідає положенню 112 у DMO, показані в SEQ ID NO:1, позначені в даному описі як DMOc. Було продемонстровано, що за допомогою DMOc одержують високий рівень толерантності до гербіциду дикамби при експресії в трансгенних рослинах. Результати виявилися несподіваними, оскільки інше положення амінокислоти є висококонсервативним в інших залізосірчаних оксигеназах. Із 78 проаналізованих послідовностей залізо-сірчаних оксигеназ із 45 зразків, всі з 52 послідовностей оксигеназ з ідентичністю, що становить, принаймні, 15%, містили амінокислоту W у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 112 із SEQ ID NO:1, незважаючи на те, що найбільша ідентичність становила тільки 38%. Зазначене положення також межує з двома консервативними функціональними доменами (Фіг. 18). Тому високий рівень толерантності до гербіциду, одержаний за допомогою DMOc, виявився несподіваним. Аналіз параметрів Міхаеліса-Ментена для DMOc стосовно незміненої послідовності (DMOw; патент U.S. № 7022896) виявив, що ферменти відрізнялися за каталітичною ефективністю: DMOc був у п'ять разів більш ефективніший, ніж DMOw, і, мабуть, DMOc має вищий порядок оновлення і більш тісне зв'язування з субстратом. Крім того, DMOc функціонував краще за умов, що відповідають нижчим значенням рН і вищим температурам стосовно нативного. Одержані результати вказують на потенціал для селекції DMO-варіантів для використання в конкретній трансгенній рослині на основі очікуваних умов використання, таких як умови сільськогосподарської культури, яка зрос 94613 10 тає. Таким чином, один аспект винаходу включає ідентифікацію оточення сільськогосподарської культури, яка зростає, принаймні, для першого виду сільськогосподарської культури, та ідентифікацію ферменту DMO, найбільш відповідного для зазначеного оточення на основі динаміки, наприклад, DMOc і DMOw. Наприклад, фахівець у даній галузі може в конкретних втіленнях вибрати послідовність, що кодує DMOc, для використання в рослинах, які представляють умови, що відповідають нижчим значенням рН у рослині, і/або у разі росту в умовах із вищими температурами стосовно інших видів рослин або умов росту, відповідно. Дикамба може застосовуватися шляхом введення в ґрунт (передпосівне введення), шляхом зрошування ґрунту (досходове введення) і шляхом обробки сходів (післясходова обробка), у той час як рівень толерантності до дикамби може відрізнятися в різний час протягом росту рослини. Як зазначено вище, толерантність до екстремально високого рівня гербіциду дикамби була одержана в трансгенних рослинах, що експресують DMOc. У разі рослини тютюну, наприклад, яка звичайно є чутливою навіть до дуже низького рівня дикамби, були сконструйовані трансгенні рослини, що експресують DMOc, які були толерантні до обробки за допомогою дикамби в кількості 5,6 кг/га або вище, наприклад, у 10-20 раз вище, ніж звичайна рекомендована польова доза для контролю широколистих бур'янів. Коли ген DMOc був вставлений у хлоропластний геном рослин тютюну, одержали толерантність до дикамби, що становить, принаймні, 2,8 кг/га. Також були сконструйовані трансгенні рослини сої, томата і Arabidopsis thaliana, що несуть ген, кодований в ядрі DMOc, і виявили толерантність до високого рівня дикамби. Наприклад, внаслідок вставки DMOc в ядерний геном рослин сої одержують толерантність до обробок у кількості 2,8 кг/га, таким чином, дозволяючи використання дикамби для контролю бур'янів у полях із рослинами, експресуючими DMOc. Таким чином, було продемонстровано, що DMOc є ефективним у надаванні толерантності до дикамби без необхідності додаткових кодуючих послідовностей, таких як фередоксину або редуктази з P. maltophilia, штаму DI-6. Модифікований ген DMO успадковувався стабільно, згідно з правилом Менделя, без видимої втрати пенетрантності або експресії. У той час як одержували трохи вищий рівень експресії рослин із хлоропластним транзитним пептидом, трансгенні рослини з DMO, позбавлені послідовності, що кодує хлоропластний транзитний пептид, також демонстрували високий рівень післясходової толерантності до дикамби. А. Нуклеїнові кислоти і рекомбінантні конструкції 1. Дикамба-монооксигеназа (DMO) В одному втіленні даного винаходу пропонуються конструкції ДНК, які включають нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептид дикамбамонооксигенази, який включає цистеїн у положенні, що відповідає положенню 112 з SEQ ID NO:1. Типова послідовність, що кодує DMO, пропонується в даному описі у вигляді SEQ ID NO:2. Зазначена послідовність додатково до включення цистеїну 11 в положенні 112 з SEQ ID NO:1 включає додатковий кодон GCC (аланін), що йде за старт-кодоном ATG, із додаванням сайту рестрикції Nco І стосовно до нативної кодуючої послідовності, що полегшує клонування. Таким чином, поліпептид у SEQ ID NO:1 також включає додатковий залишок Ala, що йде безпосередньо за Met, що кодується старткодоном. Послідовність транзитного пептиду вирізали з плазміди за допомогою Bgl II і EcoR І, і потім клонували за сайтами BamH І і EcoR І у вектор pBluescript II KS+. Зазначену конструкцію використали як матрицю в реакції ПЛР із праймерами, за допомогою яких додавали сайти рестрикції Nco І до кожного кінця послідовності, що кодує транзитний пептид. Гідроліз ПЛР-продукту за допомогою Nco І давав можливість вставлення послідовності, що кодує транзитний пептид, у сайт ініціюючого кодону ATG модифікованого гена DMO. Таким чином, в одному втіленні винаходу пропонуються послідовності, що кодують поліпептид із SEQ ID NO:1, включаючи, але не обмежуючись, SEQ ID NO:2. Як добре відомо з рівня техніки, гомологічні послідовності і похідні зазначених послідовностей можуть бути легко одержані і використані. Наприклад, може бути використана нуклеїнова кислота, яка кодує поліпептид DMO, що має, принаймні, 90% ідентичності послідовності з поліпептидом DMOc з SEQ ID NO:1, включаючи, принаймні, приблизно, %: 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або більше ідентичності з такою послідовністю. Також може використовуватися нуклеїнова кислота, яка демонструє, принаймні, 90% ідентичності послідовності з послідовністю нуклеїнової кислоти, представленою у вигляді SEQ ID NO:2, включаючи, принаймні, приблизно, %: 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або більше ідентичності з такою послідовністю, і яка кодує DMO, що включає цистеїн у положенні 112. В одному втіленні ідентичність послідовності визначають із використанням пакету програмного забезпечення Аналізу Послідовності з пакету GCG Wisconsin (Accelrys, San Diego, CA), MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wis. 53715) зі стандартними параметрами. Зазначена програма вибирає подібні послідовності шляхом оцінки ступеня подібності або ідентичності. Полінуклеотидна молекула, яка експресує поліпептид DMO, може бути одержана за допомогою методів, добре відомих із рівня техніки, беручи до уваги даний опис. Варіанти DMO, представлені в даному описі, здатні до деградації декамби, можна, таким чином, одержати та оцінити на предмет активності згідно з описаною в даному описі методологією. Такі послідовності також можуть бути ідентифіковані, наприклад, з придатних організмів, включаючи бактерії, які піддають деградації дикамби (патент U.S. № 5445962; Krueger et al., 1989; Cork and Krueger, 1991; Cork and Khalil, 1995). Один спосіб виділення клонованої послідовності DMO являє собою гібридизацію нуклеїнової кислоти, наприклад, із бібліотекою, сконструйованою на основі організму-джерела, або спосіб на основі РТПЛР із використанням мРНК з організму-джерела і праймерів на основі описаної послідовності DMO. Таким чином, винахід охоплює використання гібридизації нуклеїнових кислот за жорстких умов з 94613 12 описаною в даному описі послідовністю, що кодує DMO. Фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що умови можуть бути замінені на менш жорсткі шляхом збільшення концентрації солі і зменшення температури. Таким чином, умовами гібридизації легко маніпулювати, і, таким чином, зазначені умови, як правило, являють собою метод вибору залежно від бажаних результатів. Прикладом умов високої жорсткості є 5Х SSC, 50% формамід і 42°С. При проведенні відмивання за зазначених умов, наприклад, протягом 10 хвилин, ті послідовності, що не загібридизувалися з конкретною послідовністюмішенню за зазначених умов, можуть бути видалені. Таким чином, одне втілення винаходу включає застосування нуклеїнової кислоти, що кодує DMO, яку визначають як послідовність, що гібридизується з нуклеїновою кислотою згідно з SEQ ID NO:2 за умов відмивання в 5Х SSC, 50% формаміді і при 42°С протягом 10 хвилин. Варіанти також можуть бути хімічно синтезовані з використанням полінуклеотидних послідовностей DMO, описаних в даному описі, згідно з методами, добре відомими з рівня техніки. Наприклад, послідовності ДНК можуть бути синтезовані за допомогою хімії фосфоамідитів в автоматичному ДНК-синтезаторі. Хімічний синтез має ряд переваг. Зокрема, хімічний синтез є бажаним, оскільки кодони, переважні для організму-хазяїна, в якому послідовність ДНК буде експресуватися, можуть бути використані для оптимізації експресії. Приклад зазначеної послідовності, яка оптимізується для експресії в дводольних рослинах із використанням кодонів, що використовуються в Arabidopsis thaliana, являє собою послідовність DMO, представлену в SEQ ID NO:3. Поліпептид із передбаченими амінокислотами Ala, Thr, Cys у положеннях 2, 3, 112, відповідно, представлений у SEQ ID NO:1. Залишок Ala в положенні 2 був доданий стосовно дикого типу DMO внаслідок вставки кодону для аланіну безпосередньо після ініціюючого кодону ATG для полегшення створення векторної конструкції, як пояснено нижче. Немає необхідності змінювати всі кодони для одержання поліпшеної експресії, але переважно змінювати, принаймні, кодони, що рідко використовуються в організмі-хазяїні, на кодони, переважні для організму-хазяїна, наприклад, на кодони, що частіше використовуються в організмі-хазяїні, і які, як правило, легше транслюються, ніж рідкісні, непереважні кодони. Високий рівень експресії може бути одержаний шляхом зміни більше приблизно 50% непереважних кодонів, найпереважніше, принаймні, приблизно 80% непереважних кодонів на кодони, переважні для організму-хазяїна. Переважні кодони більшості клітин-хазяїнів є відомими (РСТ WO 97/31115; РСТ WO 97/11086; ЕР 646643; ЕР 553494; і патенти U.S. №№ 5689052; 5567862; 5567600; 5552299 і 5017692). Переважні кодони інших клітин-хазяїнів можуть бути встановлені за допомогою методів, відомих із рівня техніки. Також, при використанні хімічного синтезу послідовність молекули ДНК або її білок, що кодується, можуть бути легко змінені, наприклад, для оптимізації експресії (наприклад, виключення повторних структур мРНК, які перешкоджають транскрипції 13 або трансляції), можуть бути надані унікальні сайти рестрикції у відповідних положеннях і можуть бути делетовані сайти розщеплення протеазами. Модифікація і зміни можуть бути зроблені зі збереженням ферментативної активності з поліпептидною послідовністю білка, такою як послідовності DMO, представлені в даному описі. Подальше являє собою обговорення, в основі якого лежить зміна амінокислот білка зі створенням еквівалентного або навіть поліпшеного модифікованого поліпептиду і відповідних кодуючих послідовностей. У конкретних втіленнях винаходу послідовності DMO можуть бути змінені таким чином і застосовані в способах за винаходом. Амінокислотні зміни можуть бути досягнуті шляхом зміни кодонів послідовності ДНК. Відомо, наприклад, що певні амінокислоти можуть бути замінені на інші амінокислоти в білковій структурі без помітної втрати здатності інтерактивного зв'язування з такими структурами, як сайти зв'язування на молекулах субстрату. Завдяки зазначеній інтерактивній здатності і природі білка, яка визначає біологічну функціональну активність зазначеного білка, у білковій послідовності можуть бути зроблені певні заміни амінокислотних послідовностей, і, звичайно, у відповідній послідовності кодуючої ДНК, і, проте, буде одержаний білок із подібними властивостями. Таким чином, передбачається, що в описаних у даному описі пептидних послідовностях DMO і у відповідних послідовностях кодуючої ДНК можуть бути зроблені різноманітні зміни без помітної втрати їх біологічного застосування або активності. При здійсненні зазначених змін може враховуватися гідропатичний індекс амінокислот. Важливість гідропатичного індексу амінокислот у надаванні білку інтерактивної біологічної функції, як правило, зрозуміла з рівня техніки (Kyte et al., 1982). Вважається, що відносний гідропатичний характер амінокислоти робить внесок у вторинну структуру внаслідок одержуваного білка, яка, в свою чергу, визначає взаємодію білка з іншими молекулами, наприклад, ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антитілами, антигенами і з подібними. Кожну амінокислоту оцінювали на основі характеристик її гідрофобності і заряду на предмет гідропатичного індексу (Kyte et al., 1982), який складає: ізолейцин (+4,5); валін (+4,2); лейцин (+3,8); фенілаланін (+2,8); цистеїн/цистин (+2,5); метіонін (+1,9); аланін (+1,8); гліцин (-0,4); треонін (- 0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролін (-1,6); гістидин (-3,2); глутамат (3,5); глутамін (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагін (3,5); лізин (-3,9); і аргінін (-4,5). Із рівня техніки відомо, що амінокислоти можуть бути замінені на інші амінокислоти, що мають подібний гідропатичний індекс або коефіцієнт, і все одно призводять у результаті до одержання білка з подібною біологічною активністю, тобто до одержання біологічно функціонального еквівалентного білка. При здійсненні таких змін є переважною заміна амінокислот, чиї гідропатичні індекси становлять ±2, особливо переважною є заміна амінокислот, чиї гідропатичні індекси становлять ±1, і найбільш переважною є заміна амінокислот, 94613 14 чиї гідропатичні індекси становлять ±0,5. У цьому випадку спостереження того, що DMO, що має заміну триптофану в положенні 112 на цистеїн, має біологічну активність і призводить до одержання внаслідок рослин, толерантних до високого рівня дикамби, виявилося несподіваним, представляючи різні гідропатичні індекси між нативними і зміненими амінокислотами, і таким чином, не використовувалося фахівцями в даній галузі для створення функціональних варіантів згідно з відомим рівнем техніки. Із рівня техніки зрозуміло, що заміна подібних амінокислот може бути ефективно здійснена на основі гідрофільності. Патент U.S. № 4554101 встановлює, що найбільша локальна середня гідрофільність білка, на яку впливає гідрофільність його сусідніх амінокислот, корелює з біологічною властивістю білка. Як детально описано в U.S. патенті 4554101, для залишків амінокислот були визначені наступні значення гідрофільності: аргінін (+3,0); лізин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серин (+0,3); аспарагін (+0,2); глутамін (+0,2); гліцин (0); треонін (-0,4); пролін (-0,5±1); аланін (-0,5); гістидин (-0,5); цистеїн (-1,0); метіонін (-1,3); валін (-1,5); лейцин (-1,8); ізолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенілаланін (-2,5); триптофан (-3,4). Зрозуміло, що амінокислота може бути замінена на іншу амінокислоту, що має подібне значення гідрофільності, і все одно буде одержаний біологічно еквівалентний білок. При таких змінах є переважною заміна амінокислот, чиї значення гідрофільності становлять ±2, особливо переважною є заміна амінокислот, чиї значення гідрофільності становлять ±1, і найбільш переважною є заміна амінокислот, чиї значення гідрофільності становлять ±0,5. Типові заміни, які беруть до уваги зазначені та інші з вищезазначених характеристик, добре відомі фахівцеві в даній галузі з рівня техніки, і включають: аргінін і лізин; глутамат і аспартат; серин і треонін; глутамін і аспарагін; і валін, лейцин і ізолейцин. Крім того, активність DMOc була несподіваною, представляючи сильно відмінні гідрофільні значення між зміненими і нативними амінокислотами, і зазначена заміна не використовувалася фахівцями в даній галузі для створення функціональних варіантів згідно з відомим рівнем техніки. Модифікація послідовності DMO згідно з винаходом може проводитися з розглядом консервативних доменів всередині ферменту. Наприклад, нижче демонструється, що фермент DMO містить функціональні домени, такі як залізо-сірчаний кластер Rieske і сайт зв'язування для вільного заліза (дивіться, наприклад, Фіг. 18). Таким чином, зазначена інформація, об'єднана зі знанням із рівня техніки, що розглядає функціональні домени і модифікацію білків, як правило, може використовуватися в рамках даного винаходу для одержання модифікованих ферментів DMO, що проте зберігають ферментативну активність (дивіться, наприклад, Mason and Cammack, 1992; Jiang et ah, 1996). 2. Трансформуючі конструкції Полінуклеотид, що кодує DMO, який застосовується згідно з винаходом, звичайно вводиться в 15 клітину у вигляді конструкції, що включає елементи контролю експресії, необхідні для контролю експресії. Методи функціонального зв'язування елементів контролю експресії з кодуючими послідовностями добре відомі з рівня техніки (Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989). Послідовності контролю експресії являють собою послідовності ДНК, залучені будь-яким способом у контроль транскрипції. Придатні послідовності контролю експресії і методи їх використання добре відомі з рівня техніки. Промотор, зокрема, може використовуватися разом або за відсутності енхансерних елементів, 5'-нетрансльованої ділянки, транзитного або сигнального пептидів для напрямку білка або продукту РНК в органелу рослини, зокрема, у хлоропласти, і 3'-нетрансльовані ділянки, такі як сайти поліаденілювання. Фахівцеві в даній галузі буде відомо, що різноманітні енхансери, промотори, інтрони, транзитні пептиди, послідовності напрямку сигналу і 5'- і 3'-нетрансльовані ділянки (UTR), використовуються в дизайні ефективних векторів для експресії в рослинах, таких як ті, що описані, наприклад, у патентній заявці U.S. 2003/01403641. Промотори, придатні для цього та інших застосувань, добре відомі з рівня техніки. Приклади, що описують такі промотори, включають патент U.S. № 6437217 (промотор RS81 маїсу), патент U.S. № 5641876 (промотор актину рису), патент U.S. № 6426446 (промотор RS324 маїсу), патент U.S. № 6429362 (промотор PR-1 маїсу), патент U.S. № 6232526 (промотор A3 маїсу), патент U.S. № 6177611 (конститутивні промотори маїсу), патенти U.S. №№ 5322938, 5352605, 5359142 і 5530196 (промотор 35S), патент U.S. № 6433252 (промотор L3 олеозину маїсу), патент U.S. № 6429357 (промотор актину 2 рису, а також інтрон актину 2 рису), патент U.S. № 5837848 (промотор, специфічний для кореня), патент U.S. №6294714 (промотори, індуковані світлом), патент U.S. № 6140078 (промотори, індуковані сіллю), патент U.S. № 6252138 (промотори, індуковані патогеном), патент U.S. № 6175060 (промотори, індуковані дефіцитом фосфору), патент U.S. №6635806 (промотор гамма-коіксину) і патентну заявку U.S. із серійним № 09/757089 (промотор альдолази хлоропластів маїсу). Додаткові промотори, які можуть знайти своє застосування, являють собою промотор нопалін-синтази (NOS) (Ebert et al., 1987), промотор октопін-синтази (OCS) (який переноситься на плазмідах, що індукують пухлину, з Agrobacterium tumefaciens), промотори колімовіруса, такі як промотор 19S вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV) (Lawton et al., 1987), промотор 35S CaMV (Odell et al., 1985), промотор 35S вірусу мозаїки норичника (Walker et al., 1987), промотор синтази сахарози (Yang et al., 1990), промотор комплексу гена R (Chandler et al., 1989) і промотор гена, що кодує білок зв'язування з хлорофілом а/b, і т.д. Особливо корисними для застосування в даному винаході можуть бути промотори CaMV35S (патенти U.S. №№ 5322938; 5352605; 5359142; і 5530196), FMV35S (патенти U.S. №№ 6051753; 5378619), промотор PC1SV (наприклад, патент 94613 16 U.S. № 5850019 і SEQ ID NO:24) і промотори AGRtu.nos (GenBank Accession V00087; Depicker et al., 1982; Bevan et al., 1983). Може бути одержана користь при експресії гетерологічних генів із використанням послідовності, що кодує транзитний пептид. Транзитні пептиди, як правило, стосуються пептидних молекул, які, при зв'язуванні з білком, що цікавить, спрямовують білок в конкретну тканину, клітину, субклітинну локалізацію або клітинну органелу. Приклади включають, але не обмежені ними, хлоропластні транзитні пептиди, сигнали ядерної локалізації і вакуольні сигнали. Хлоропластний транзитний пептид, зокрема, застосовується в даному винаході для спрямування експресії ферменту DMO у хлоропластах. Очікується, що функція DMO буде полегшена ендогенними редуктазами і фередоксинами, виявленими в рослинній клітині, для деградації дикамби. Хлоропласти рослини особливо багаті редуктазами і фередоксинами. Відповідно, у переважному втіленні для одержання трансгенних рослин, толерантних до дикамби, може застосовуватися послідовність, що кодує пептид, яка буде спрямовувати оксигеназу, деградуючу дикамби, у хлоропласти. Альтернативно або додатково, гетерологічна редуктаза і/або фередоксин також можуть експресуватися в клітині. ДНК, що кодує послідовність, яка спрямовує в хлоропласти, може, переважно, розташовуватися вище (5') за послідовність, що кодує DMO, але може також розташовуватися нижче (3') кодуючої послідовності, або одночасно вище і нижче кодуючої послідовності. Хлоропластний транзитний пептид (СТР), зокрема, може бути сконструйований для зшивання з N-кінцем білків, які повинні бути спрямовані в хлоропласти рослини. Більшість білків із локалізацією в хлоропластах експресуються з ядерних генів у вигляді попередників і спрямовуються в хлоропласти за допомогою СТР, який видаляється під час стадій імпорту. Приклади хлоропластних білків включають малу субодиницю (RbcS2) рибулоза-1,5біфосфат карбоксилази, фередоксин, оксидоредуктазу фередоксину, світлозбираючий комплексний білок І і білок II, і тіоредоксин F. Було продемонстровано in vivo та in vitro, що нехлоропластні білки можуть спрямовуватися в хлоропласти шляхом використання білкових зшивань зі СТР і що СТР є достатнім для спрямування білка в хлоропласти. Наприклад, було показано, що введення відповідного транзитного пептиду, такого як Arabidopsis thaliana EPSPS СТР (Klee et al., 1987) і Petunia hybrida EPSPS CTP (della-Cioppa et al., 1986), спрямовує гетерологічні послідовності білка EPSPS у хлоропласти в трансгенних рослинах. Інші типові послідовності для спрямування в хлоропласти включають сигнальну послідовність cabm7 маїсу (Becker et al., 1992; РСТ WO 97/41228) і сигнальну послідовність глутатіон-редуктази гороху (Creissen et al., 1991; РСТ WO 97/41228). У даному винаході можуть бути особливо корисними AtRbcS4 (CTP1; патент U.S. №5728925), AtShkG (CTP2; Klee et al, 1987), AtShkGZm (СТР2синтетичний; дивіться SEQ ID NO:14 із 17 WO04009761) і PsRbcS (Coruzzi et al, 1984), наприклад, відносно експресії поліпептиду DMO. Послідовність 5'-UTR, яка функціонує як лідерна послідовність трансляції, являє собою генетичний елемент ДНК, локалізований між промоторною послідовністю гена і кодуючою послідовністю. Лідерна послідовність трансляції присутня в повністю процесованій мРНК вище за послідовність старту трансляції. Лідерна послідовність трансляції може впливати на процесинг первинного транскрипта в мРНК, на стабільність мРНК або ефективність трансляції. Приклади лідерних послідовностей трансляції включають серед інших лідери білка теплового шоку маїсу і петунії (патент U.S. № 5362865), лідери білка оболонки рослинних вірусів, лідери рослинних вірусів rubisco (Turner and Foster, 1995). У даному винаході послідовності 5'-UTR, які, зокрема, виявили корисне застосування, являють собою GmHsp (патент U.S. № 5659122), PhDnaK (патент U.S. № 5362865), AtAnt1, TEV (Carrington and Freed, 1990) і AGRtunos (GenBank Accession V00087; Bevan et al, 1983). 3'-нетрансльована послідовність, 3'-ділянка термінації транскрипції або ділянка поліаденілювання стосуються молекул ДНК, пов'язаних з кодуючою ділянкою і локалізованих нижче кодуючої ділянки гена, і включають полінуклеотиди, які забезпечують сигнал поліаденілювання та інші регуляторні сигнали, здатні впливати на транскрипцію, процесинг мРНК або експресію гена. Сигнал поліаденілювання функціонує в рослинах із метою викликати вставку поліаденілатних послідовностей до 3'-кінця попередника мРНК. Послідовність поліаденілювання може бути виділена з природного гена, із багатьох рослинних генів або з генів ТДНК. Прикладом 3'-ділянки термінації транскрипції є 3'-ділянка нопалін-синтази (nos 3'; Fraley et al., 1983). Використання різних 3'-нетрансльованих ділянок було описане (Ingelbrecht et al., 1989). Молекули поліаденілювання з гена RbcS2 Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al., 1984) і AGRtu.nos (Rojiyaa et al., 1987, Genbank Accession E01312) можуть мати конкретне корисне застосування у винаході. Одиниця експресії молекули полінуклеотиду, що кодує DMO, може бути зв'язана з другою полінуклеотидною молекулою в одиниці експресії, що містить генетичні елементи для здатного до детекції/кількісного визначення маркера або для гена, що надає бажану властивість. Гени, що звичайно використовуються для скринінгу передбачувано трансформованих клітин включають глюкуронідазу (GUS), -галактозидазу, люциферазу і хлорамфенікол ацетилтрасферазу (Jefferson, 1987; Teeri et al., 1989; Koncz et al., 1987; De Block et al., 1984), зелений флуоресцентний білок (GFP) (Chalfie et al., 1994; Haseloff et al., 1995; і РСТ заявка WO 97/41228). Друга полінуклеотидна молекула може включати, але не обмежена ним, ген, який діє як маркер селекції. Другий або додатковий ген може забезпечувати бажану характеристику, асоційовану з рослинною морфологією, фізіологією, ростом і розвитком, урожаєм, посиленням живлення, стійкі 94613 18 стю до захворювань або шкідників, або толерантністю до навколишнього середовища або до хімічних речовин, і може включати генетичні елементи, що включають стійкість до гербіцидів (патенти U.S. №№ 6803501; 6448476; 6248876; 6225114; 6107549; 5866775; 5804425; 5633435; 5463175), що збільшують урожай (патенти U.S. №№ RE38,446; 6716474; 6663906; 6476295; 6441277; 6423828; 6399330; 6372211; 6235971; 6222098; 5716837), елементи контролю комах (патенти U.S. №№ 6809078; 6713063; 6686452; 6657046; 6645497; 6642030; 6639054; 6620988; 6468523; 6326351; 6313378; 6284949; 6281016; 6248536; 6242241; 6221649; 6177615; 6156573; 6153814; 6110464; 6093695; 5959091;5942664; 5942658, 5880275;5763245; 5763241), елементи стійкості до грибкових захворювань (патенти U.S. №№ 6653280; 6573361; 6506962; 6316407; 6215048; 5516671; 5773696; 6121436; 6316407; 6506962), елементи стійкості до вірусів (патенти U.S. №№ 6617496; 6608241; 6015940; 6013864; 5850023; 5304730), елементи стійкості до нематод (патент U.S. № 6228992), елементи стійкості до бактеріальних захворювань (патент U.S. № 5516671), елементи росту і розвитку рослини (патенти U.S. №№ 6723897; 6518488), елементи для одержання крохмалю (патенти U.S. №№ 6538181; 6538179; 6538178; 5750876; 6476295), елементи для одержання модифікованих олій (патенти U.S. №№ 6444876; 6426447; 6380462), елементи для одержання продуктів з високим вмістом олій (патенти U.S. №№ 6495739; 5608149; 6483008; 6476295), елементи вмісту модифікованих жирних кислот (патенти U.S. №№ 6828475; 6822141; 6770465; 6706950; 6660849; 6596538; 6589767; 6537750; 6489461; 6459018), елементи для одержання продуктів з високим вмістом білка (патент U.S. № 6380466), елементи для дозрівання плодів (патент U.S. № 5512466), елементи для посилення харчування тварин і людини (патенти U.S. №№ 6723837; 6653530; 6541259; 5985605; 6171640), елементи для біополімерів (патенти U.S. №№ RE37543; 6228623; 5958745 і U.S. патентна публікація № US20030028917), елементи для стійкості до стресу навколишнього середовища (патент U.S. № 6072103), елементи для лікарських пептидів і секретованих пептидів (патенти U.S. №№ 6812379; 6774283; 6140075; 6080560), елементи для поліпшення властивостей процесингу (патент U.S.№ 6476295), елементи для поліпшення гідролізованості (патент U.S. № 6531648) елементи для низького вмісту рафінози (патент U.S. № 6166292), елементи для промислового одержання ферменту (патент U.S. № 5543576), елементи для поліпшення смаку (патент U.S. № 6011199), елементи для фіксації азоту (патент U.S. № 5229114), елементи для одержання гібридного насіння (патент U.S. № 5689041), елементи для одержання волокна (патент U.S. № 6576818; 6271443; 5981834; 5869720) та елементи для одержання біопалива (патент U.S. № 5998700). Будь-які з зазначених та інші генетичні елементи, методи і трансгени можуть використовуватися у винаході, а також братися до уваги фахівцями в даній галузі з точки зору даного опису. Одиниця 19 експресії може бути представлена у вигляді Т-ДНК між ділянками правої межі (RB) і лівої межі (LB) першої плазміди разом із другою плазмідою, що несе трансферні та інтеграційні функції для Т-ДНК в Agrobacterium. Конструкції також можуть містити кістяк плазмідних ДНК сегментів, які забезпечують реплікативну функцію і селекцію за допомогою антибіотика в бактеріальних клітинах, наприклад, точку початку реплікації з Escherichia coli, таку як огі322, точку початку реплікації для широкої межі організмів-хазяїнів, таку як oriV або oriRi, і кодуючу ділянку для маркера селекції, такого як Spec/Strp, який кодує Тn7 аміноглікозид аденілтрансферазу (aadA), що надає стійкість до спектиноміцину або стрептоміцину, або ген маркера селекції гентаміцину (Gm, Gent). Для трансформації рослин штам бактерій-хазяїнів часто являє собою Agrobacterium tumefaciens ABI, C58 або LBA4404. Однак інші штами, відомі фахівцеві в даній галузі трансформації рослин, можуть функціонувати в даному винаході. 3. Одержання трансгенних клітин Одержання трансформованих рослинних клітин можна досягнути за допомогою будь-якого з методів, відомих із рівня техніки для введення трансгенів у клітини (дивіться, наприклад, публікацію Miki et al., 1993). Вважають, що приклади таких методів практично включають будь-який метод, за допомогою якого ДНК може бути введена в клітину. Методи, які були описані, включають електропорацію, як ілюструється в патенті U.S. № 5384253; бомбардування мікрочастинками, як ілюструється в патентах U.S. №№ 5015580; 5550318; 5538880; 6160208; 6399861; і 6403865; трансформацію, опосередковану Agrobacterium, як ілюструється в патентах U.S. №№ 5635055; 5824877; 5591616; 5981840; і 6384301; і трансформацію протопластів, як ілюструється в патенті U.S. № 5508184. За допомогою застосування методів, таких, як зазначені, клітини практично будь-якого виду рослини можуть бути стабільно трансформовані і селектовані згідно з винаходом, і зазначені клітини розвиваються в трансгенні рослини. Метод введення експресуючого вектора в рослини, що найбільш широко застосовується, оснований на природній системі трансформації з Agrobacterium (наприклад, Horsch et al., 1985). A. tumefaciens i A. rhizogenes являють собою патогенні ґрунтові бактерії, які генетично трансформують рослини. Плазміди Ті і Ri з A. tumefaciens і A. rhizogenes, відповідно, несуть гени, відповідальні за генетичну трансформацію (наприклад, Kado, 1991). Описи векторних систем Agrobacterium і методів для перенесення гена, опосередкованого Agrobacterium, представлені в численних посиланнях, які включають Miki et al., вище, Moloney et al., 1989, і патенти U.S. №№ 4940838 і 5464763. Інші бактерії, такі як Sinorhizobium, Rhizobium і Mesorhizobium, які в природі взаємодіють із рослинами, можуть бути модифіковані для опосередкування перенесення гена у багато різних рослин. Зазначені асоційовані з рослинами симбіотичні бактерії можуть бути зроблені компетентними для перенесення гена шляхом поглинання обох - зне 94613 20 шкодженої Ті-плазміди і придатного бінарного вектора (Brothers et al., 2005). В. Культура клітин тканин і регенерація рослини Одержання регенеруючої і трансформованої клітини в фертильній рослині можна досягнути шляхом першого культивування експлантата на ростовому середовищі і згодом на кореневому середовищі. Іноді експлантат може культивуватися на калюсному середовищі перед перенесенням на ростове середовище. Безліч середовищ і необхідних умов перенесення можуть бути реалізовані та оптимізовані для кожної рослинної системи для трансформації рослини та одержання трансгенних рослин. Отже, такі умови середовища і культивування можуть бути модифіковані або замінені еквівалентними компонентами живлення або подібними способами селекції та одержання випадків трансгенних рослин. Поживне середовище готують у вигляді рідини, але зазначена рідина може стати твердою шляхом додавання рідини до речовин, здатних забезпечувати тверду основу. Агар є самою звичайною речовиною, що використовується для цієї мети. Бактоагар, Hazelton агар, Gelrite і Gelgro являють собою певні типи твердої основи, які є придатними для росту рослинних клітин в культурі клітин тканин. Деякі типи клітин будуть рости і ділитися або в рідкій суспензії, або на твердому середовищі, або в обох типах середовищ. Реципієтні клітини-мішені включають, але не обмежені ними, клітини меристеми, калюс, незрілі зародки і гаметичні клітини, такі як клітини пилка мікроспор, спермій і яйцеклітини. Будь-яка клітина, з якої може бути регенерована фертильна трансгенна рослина, може бути використана в певних втіленнях. Наприклад, незрілі зародки можуть бути трансформовані з подальшою селекцією та ініціюванням калюсу і подальшою регенерацією фертильних трансгенних рослин. Безпосередня трансформація незрілих ембріонів уникає необхідності тривалої розробки реципієнтних клітинних культур. Меристематичні клітини (тобто рослинні клітини, які є здатними до тривалого клітинного поділу і характеризуються недиференційованим цитологічним проявом, звичайно виявляють у точках росту або тканинах у рослині, таких як кінці коріння, верхівки стовбура, бічні паростки і т.д.), також можуть бути використані у ролі реципієнтної рослинної клітини. Через їх недиференційований ріст і здатність до диференціації до органу і тотипотентності, суцільна трансформована рослина може бути одержана з єдиної трансформованої меристематичної клітини. Соматичні клітини являють собою клітини багатьох типів. Ембріогенні клітини являють собою один із прикладів соматичних клітин, які можуть бути індуковані до регенерації рослини за допомогою утворення зародка. Неембріогенні клітини являють собою такі клітини, які звичайно не реагують таким чином. Можуть використовуватися певні методи, які збагачують реципієнтні клітини всередині популяції клітин. Наприклад, розвиток калюсу типу II з подальшою ручною селекцією і культивуванням крихкої ембріогенної тканини, як правило, призво 21 дить у результаті до збагачення реципієнтних клітин для використання в них, наприклад, трансформації за допомогою бомбардування мікрочастинок. У певних втіленнях реципієнтні клітини селектуються після зростання в культурі. Культивовані клітини можуть бути вирощені або на твердих основах, або у формі рідких суспензій. У кожному випадку клітини можуть бути забезпечені поживними речовинами у формі середовища та умов навколишнього середовища, що контролюються. Для культур клітин тканин існує багато типів середовищ, що складаються з амінокислот, солей, цукрів, ростових регулювальників і вітамінів. Більшість із тих середовищ, що застосовуються в практиці винаходу, буде містити деякі подібні компоненти, у той час як середовища можуть відрізнятися в складі і пропорціях інгредієнтів згідно з відомими практичними застосуваннями культур клітин тканин. Наприклад, різні типи клітин звичайно ростуть у більше, ніж одному типі середовища, але демонструють різні швидкості росту і різні морфологічні риси залежно від ростового середовища. У деяких середовищах клітини виживають, але не діляться. Склад середовища також часто оптимізується на основі вибраних видів або типів клітин. Раніше було описано багато типів середовищ, придатних для культур рослинних клітин. Приклади зазначених середовищ включають, але не обмежені ними, середовище N6, описане в публікації Chu et al. (1975), і середовище MS (Murashige & Skoog, 1962). У деяких втіленнях може бути переважним використання середовища з трохи меншим співвідношенням амоній/азот, такого як N6, для стимулювання генерації реципієнтних клітин шляхом підтримування клітин у проембріональному стані здатними до тривалих поділів. Також може використовуватися рослинне середовище Woody (WPM) (Lloyd and McCown, 1981). Метод підтримування клітинних культур може робити внесок в їхнє застосування у ролі джерела реципієнтних клітин для трансформації. Ручна селекція клітин для перенесення в свіже культуральне середовище, частота перенесення в свіже культуральне середовище, склад культурального середовища і фактори навколишнього середовища, що включають, але не обмежені ними, якість і кількість світла і температуру, являють собою всі фактори для підтримування калюсу і/або суспензійних культур, які застосовуються як джерела реципієнтних клітин. Почергове використання каллюса середовищ різних культуральних умов може бути корисним у збагаченні реципієнтних клітин у культурі. Наприклад, клітини можуть культивуватися в суспензійній культурі, але переносяться на тверде середовище з регулярними інтервалами. Після періоду росту на твердому середовищі клітини можуть бути вручну селектовані для повернення в рідке культуральне середовище. Повторення зазначеної послідовності перенесень у свіже культуральне середовище можна використати для збагачення культури реципієнтними клітинами. Пропускання клітинних культур через фільтр 1,9 мм також можна застосовувати для підтриму 94613 22 вання рихлості калюсу або суспензійної культури і для збагачення клітинами, здатними до трансформації, коли використовують такі типи клітин. 3. Трансгенні рослини Після селекції трансгенної клітини, клітина може регенеруватися у фертильну трансгенну рослину з використанням методів, добре відомих із рівня техніки. Трансформовані рослини можуть бути згодом піддані аналізу для визначення присутності або відсутності конкретної нуклеїнової кислоти, що цікавить, у конструкції ДНК. Молекулярний аналіз може включати, але не обмежений ними, блоти за Саузерном (Southern, 1975) або ПЛР-аналізи, імунодіагностичні методи. Польові оцінки також можна використати. Зазначені та інші добре відомі методи можуть бути здійснені для підтвердження стабільності трансформованих рослин, одержаних описаними методами. Зазначені методи добре відомі фахівцеві в даній галузі (Sambrook et al., 1989). Таким чином, можуть бути одержані представлені в даному описі трансгенні рослини, які включають послідовність, що кодує DMO. Зокрема, економічно важливі рослини, що включають сільськогосподарські культури, дерева та інші рослини, можуть бути трансформовані за допомогою конструкцій ДНК за даним винаходом так, щоб вони були толерантні до дикамби або мали підвищену толерантність. Рослини, які в цей час вважаються толерантними до ауксинподібних гербіцидів, таким чином, можуть бути трансформовані для підвищення їхньої толерантності до гербіциду. Деякі необмежуючі приклади рослин, які можуть знайти застосування за винаходом, включають люцерну, ячмінь, боби, буряк, броколі, капусту, моркву, канолу, цвітну капусту, селеру, китайську капусту, зерно, бавовну, огірок, баклажан, цибулюпорей, салат, диню, вівсяне зерно, цибулю, горох, перець, арахіс, картоплю, гарбуз, редьку, рис, цукрову кукурудзу, сорго, сою, шпинат, сквош, цукровий буряк, соняшник, помідор, кавун і пшеницю. Як тільки одержана трансгенна рослина, що містить трансген, зазначений трансген може бути введений у будь-яку рослину, сумісну за статтю з першою рослиною, шляхом схрещування без необхідності будь-коли безпосередньо трансформувати другу рослину. Таким чином, при використанні в даному описі, термін "потомство" означає продукт будь-якої генерації батьківської рослини, одержаної згідно з даним винаходом, де потомство включає вибрану конструкцію ДНК, одержану згідно з винаходом. "Трансгенна рослина", таким чином, може являти собою рослину будь-якої генерації. "Схрещування" рослини для одержання лінії рослини, що має один або більш доданих трансгенів або алелей стосовно стартової лінії рослини, як описано в даному описі, визначається як методи, які призводять у результаті до введення конкретної послідовності в лінію рослини шляхом схрещування стартової лінії з донорною лінією рослин, яка включає трансген або алель за винаходом. Для досягнення зазначеного фахівець може, наприклад, здійснити наступні стадії: (а) насіння рослини першої батьківської рослини (стартової лінії) і другої батьківської рослини (лінії рослини 23 донора, яка включає бажаний трансген або алель); (b) виростити насіння першої і другої батьківських рослин до стану квітучих рослин; (с) запилити квітку з першої батьківської рослини за допомогою пилка з другої батьківської рослини; і (d) зібрати насіння, одержане на першій рослині, що несе фертилізовану квітку. У винаході також пропонуються тканини трансгенної рослини, що включають запропоновану в даному описі нуклеїнову кислоту, що кодує DMO. Тканини можуть бути безпосередньо трансформовані за допомогою нуклеїнової кислоти, що кодує DMO, або можуть успадкувати нуклеїнову кислоту від клітини-попередника. Тканини, запропоновані у винаході, зокрема, включають, але не обмежені ними, клітини, зародки, незрілі зародки, меристематичні клітини, незрілі китиці, мікроспори, пилок, листя, пиляки, коріння, кінці коріння, квіти і насіння. Таким чином, у винаході пропонуються будь-які такі тканини, які включають будь-яку частину рослини, що включає описану в даному описі нуклеїнову кислоту. Зокрема, насіння знаходить конкретне корисне застосування одночасно для комерційних або харчових застосувань у формі зерна, а також на плантаціях для вирощування додаткових сільськогосподарських культур. Приклади Наступні приклади включені для ілюстрації втілень винаходу. Фахівцеві в даній галузі потрібно брати до уваги, що методи, описані в прикладах, які йдуть за описаними методами, розроблені заявником для прийнятного практичного функціонування винаходу. Однак фахівцеві в даній галузі в світлі даного винаходу потрібно брати до уваги, що можуть бути зроблені багато змін у певних втіленнях, зазначені зміни описані і призводять до одержання подібного або схожого результату, не виходячи за рамки концепції, суті і меж винаходу. Більш конкретно, очевидно, що певні агенти, які пов'язані одночасно хімічно і фізіологічно, можуть бути замінені описаними в даному описі агентами, тоді як при цьому будуть досягнуті такі ж або подібні результати. Вважається, що всі такі подібні заміни і модифікації, очевидні фахівцям у даній галузі, будуть знаходитися в рамках суті, меж і концепції винаходу, як визначено у формулі винаходу, що додається. Приклад 1 Векторна конструкція для одержаного за допомогою генетичної інженерії гена DMO Послідовність, що кодує варіант DMOc, початково була одержана за допомогою ПЛРампліфікації з матриці DMOw. У зазначеному процесі ампліфікації ділянку, що кодує DMOw, ампліфікували з плазміди pPLH1, яка містила ген DMOw у вигляді 3,5-т.п.о. фрагмента Xho I/Sst І ДНК із P. maltophilia, штам DI-6. Для ДНК-ампліфикації застосовували 5'-праймер, за допомогою якого вставляли сайт рестрикції Nco І біля 5'-кінця ПЛРпродукту і кодон для аланіну, слідом за ініціюючим кодоном ATG, і застосовували 3'-праймер, який створює сайт рестрикції Xba І на 3'-кінці ПЛРпродукту (деталі процедури представлені нижче). Заміну 112W на 112С згодом ідентифікували за допомогою секвенування нуклеїнової кислоти. 94613 24 Для створення вектора, трансформуючого рослини, кодуючу ділянку гена DMOc вставляли з використанням сайтів Nco І і Xba І, доданих до 5'- і 3'-кінців, відповідно, у вектор pRTL2 (Carrington and Freed, 1990), за допомогою чого зшиваючи кодуючу ділянку з векторним енхансерним елементом трансляції (TEV-лідер) із вірусу гравіювання тютюну. 5'-сайт Nco І вводили разом із додаванням GCC-кодону (аланін) слідом за старт-кодоном ATG, і створювали сайт рестрикції Xba І на 3'-кінці ділянки кодону з використанням спеціально створених ПЛР-праймерів. Щоб дати можливість доставки DMOc у хлоропласти, ділянку, що кодує хлоропластний транзитний пептид, із субодиниці гена Rubisco гороху (Coruzzi et al., 1983) вміщували вище ділянки, що кодує DMO, щоб дати можливість спрямування білка в хлоропласти. Послідовність, що кодує транзитний пептид, яку несе в собі фрагмент Bgl II і EcoR І, клонували за сайтами BamH І і EcoR І вектора pBluescript II KS+. Одержану конструкцію використали як матрицю в ПЛРреакції, за допомогою якою вставляли сайт Nco І з обох кінців, 3' і 5', послідовності транзитного пептиду. Ампліфікований продукт клонували за сайтом Nco І вектора pRLT2 так, щоб послідовність транзитного пептиду розташовувалася безпосередньо перед кодуючою послідовністю і в рамці з кодуючою послідовністю гена DMO. Касету, що складається з TEV-лідера, ділянки транзитного пептиду і послідовностей ДНК, що кодує DMO, вирізали з вектора pRTL2 за сайтами Xho І і Xba І, і клонували у вектор pKLP36 (U.S. 5850019; Фіг. 5) із використанням тих самих сайтів рестрикції для зв'язування касети з PClSV-промотором і полі-Апослідовністю PsRbcS2-E9. Новий вектор позначали як pKLP36-TEV-TP-DMOc (також позначений як pKLP36-DMOc) і депонували в Американську Типову Колекцію Клітинних Культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA від 2.02.2006, і привласнили унікальний номер АТСС Accession № РТА-7357. Вектор pKLP36-DMOc використали для трансформації рослин тютюну, Arabidopsis і томата. Для трансформації сої DMOc-касету вирізали з pKLP36-TEV-TP-DMOc у вигляді сегмента EcoR І/Асс І і клонували в гідролізований pΡΖΡ101 за EcoR І/Асе І (Hajdukiewicz et al., 1994) для одержання правої та лівої меж. Зазначений вектор (касета pΡΖΡ101+DMOc) потім різали за допомогою Seal, і DMOc-касету клонували в бінарний вектор pPTN200 (дивіться нижче), похідну pPZP201 (Hajdukiewicz et al., 1994), який містить обмежувальну касету, фланковану лівою і правою межами Т-ДНК, і дає можливість селекції регенеруючих трансформантів у присутності гербіциду Баста. Новий бінарний вектор із двома Т-ДНК визначили pPTN348 і використали для трансформації сої. Вектор pPTN200 одержували спершу за допомогою клонування елемента nos промотор-bar з pGPTV-bar (Becker et al., 1992) у вигляді сегмента Pstl/BamHI в pPZP201 (дивіться Hajdukiewicz et al., 1994), і одержану в результаті плазміду назвали pPTN193. nos-термінатор з pE7113-GUS (дивіться Mitsuhara et al., 1996) клонували в pPTN193 нижче 25 елемента nos промотор-bar для одержання barкасети. Ферменти рестрикції та інші ферменти одержували або на фірмі Fermentas, або на Invitrogen. DIG-11-dUTP (мічений за допомогою лужного металу), CSPD (готовий до використання), DIG III маркери молекулярної маси, антидигоксигенін-АР (Fab-фрагменти) і блокуючий реагент були одержані з Roche. Розчин предгібридизації, ULTRAhyb, був одержаний з Ambion. DIG-РНК маркер молекулярної маси І був одержаний із Roche. Антикролячі IgG, антитіло, зв'язане з пероксидазою (осляче) і мембрана Hybond ECL (нітроцелюлоза) були одержані з Amersham Biosciences. ДНК, РНК і білкові блоти, методи рекомбінантної ДНК та інші процедури молекулярної біології проводили з використанням стандартних методів (Ausubel et al., 1995). Приклад 2 Одержання та аналіз трансгенних рослин Тютюн, томат, сою і Arabidopsis використали для трансгенної експресії одержаного за допомогою генетичної інженерії гена DMOc і для підтвердження толерантності до дикамби в рослинах, що експресують ген. Послідовність, що кодує DMOc, у бінарному векторі рKLР36 вводили в A. tumefaciens штам С58С1, що містить знешкоджену Ті-плазміду рМР90 (Koncz and Schell, 1986) за допомогою триплоїдного батьківського схрещування (Ditta 1980). Одержані в результаті транскон'юганти використали для трансформації тютюну (cv Xanthi) і томата (cv Rutgers) із використанням протоколу для листового диска, описаного в публікації Horsch et al. (Horsch 1985). Arabidopsis thaliana трансформували за допомогою методу квіткової рідини (Clough and Bent, 1998). Трансформацію видів сої Thorne і NE-3001 проводили за допомогою системи трансформації, опосередкованої сім'ядольним-вузлом Agrobacterium (Zhang et al., 1999). За допомогою опосередкованого Agrobacterium перенесення гена DMOc в ядерний геном рослин тютюну одержували декілька незалежно виділених генерацій Т1 рослин. Рослини тестували на присутність і експресію гена DMOc з використанням аналізів за допомогою ДНК, РНК і білкових блотів. Фіг. 2 ілюструє, що хоча всі трансгенні рослини (доріжки 1-6) у зазначеному аналізі містили одні й ті ж фрагменти ДНК після гідролізу ферментами рестрикції у вигляді клонованого гена DMO (доріжка 8), рівень транскриптів мРНК і білка DMO істотно варіювався серед трансформантів. Наприклад, рослина, чиї екстракти зображені в доріжці 5, показали відносно високий рівень DMO мРНК, але при цьому дуже низький рівень ферменту. Навпаки, майже однаковий рівень DMO мРНК в екстрактах, показаний у доріжці 3, поєднувався з високим рівнем експресії DMO. Однак було показано, що випадки сильної експресії однаковим чином могли бути одержані за допомогою зазначеного методу. Рослини в теплиці обприскували розчинником і дикамбою комерційного класу (Clarity; BASF) із використанням трекового розпилювача зі стислим повітрям, із механічним приводом, вентиляторним відділенням 8002Е, переміщенням сопла зі швид 94613 26 кістю 1,87 миль/годину. Добавки включають: 28% сечовину, нітрат амонію 1,25% об./об. і неіонну поверхнево-активну речовину 1,0% об./об. Застосовували розчин, що містить дикамбу в різних концентраціях 182 л/га (40 галонів на акр). Плантації полів сої обприскували за допомогою гербіциду Clarity в кількості 2,8 кг/га (2,5 фунт/акр). Рослини тютюну, подібно до більшості дводольних рослин, досить чутливі до обробки за допомогою дикамби. Зазначена властивість була проілюстрована за допомогою порівняння нетрансгенних рослин тютюну - необроблених або оброблених за допомогою підвищеної кількості дикамби. Симптоми пошкодження гербіциду легко детектували після обприскування за допомогою дикамби в кількості на рівні 0,017 кг/га. Симптоми були досить серйозними при кількостях 0,28 кг/га і 0,56 кг/га, які являють собою рівні гербіциду, що звичайно використовуються для контролю бур'янів при застосуванні в сільському господарстві. Післясходова обробка трансгенних рослин тютюну, що містять DMOc, гербіцидом у кількості 5,6 кг/га (у 10-20 раз вище звичайних доз) викликала слабкі симптоми пошкодження, якщо вони були, у той час як нетрансгенна рослина зазнавала серйозного пошкодження. Зменшення пошкодження нижнього листя трансгенних рослин може бути подвоєне при обприскуванні рослин за допомогою розчину розчинника, що містить поверхневоактивну речовину, що використовується у ролі носія при застосуванні дикамби. Листя, одержане після обробки трансгенних рослин за допомогою дикамби, демонструвало відсутність видимих ознак пошкодження. Трансгенні рослини томата, що несуть одержаний за допомогою генетичної інженерії ген DMOc, також показували відсутність пошкодження, при обприскуванні розчином із високим рівнем дикамби, у зазначеному конкретному випадку складовою - спочатку 0,56 кг/га, і згодом 5,6 кг/га. Arabidopsis thaliana, експресуючі ген DMOc, також виявляли сильну толерантність до обробки дикамби. У даному дослідженні пропонується застосовувати концентрацію дикамби з дозою 1,12 кг/га. Несподіваним відкриттям виявилося спостереження того, що рослини тютюну, трансформовані геном DMOc, позбавленим ділянки, що кодує транзитний пептид, також є толерантними до післясходових обробок за допомогою дикамби в концентраціях, які в середньому були тільки трохи нижчими за концентрації, якими обробляли рослини, що несуть гени DMOc із ділянками, які кодують транзитний пептид. У даному дослідженні проводили порівняння обробок дикамбою двох рослин тютюну генерації Т1 із використанням кількості дикамби 2,2 кг/га, одна рослина несе ген DMOc, позбавлений хлоропластного транзитного пептиду, й інша повністю позбавлена гена DMOc завдяки генетичній сегрегації. Остання рослина мала абсолютну чутливість до пошкодження, викликаного обробкою за допомогою дикамби, і гинула внаслідок обробки (Фіг. 3). Трансгенна рослина, що несе ген DMOc, позбавлений транзитного пептиду, мала абсолютну толерантність до обробки за допомогою дикамби в кількості 2,2 кг/га. Генетичні дослідження успадкування гена 27 DMOc у трансгенних рослинах тютюну також демонстрували, що зазначена властивість у вигляді присутності гена DMOc успадковувалася в більшості рослин відповідно до звичайного правила Менделя, і підтримувався початковий рівень експресії щодо толерантності до гербіциду. Для сої було одержано більше 50 Ro випадків трансгенної сої і зібрані генерації насіння - Т1, Т2 і Т3. Оскільки використали систему бінарного вектора Agrobacterium tumefaciens, були одержані обидві трансгенні рослини - ті, що несуть ген маркера, і вільні від маркера трансгенні рослини, що містять ген DMOc. У кожному випадку більшість ліній трансгенної сої показувала істотну толерантність до обробки за допомогою дикамби в кількостях 2,8 кг/га і 5,6 кг/га в умовах теплиці, і рослини показували сильну толерантність до дикамби в кількості 2,8 кг/га (найбільший рівень, що тестується) протягом двох років польових випробувань. Одержані результати передбачають широку межу безпеки для трансгенної сої та інших сільськогосподарських культур, що несуть ген DMOc, разом із високоефективним контролем широкого спектра широколистих бур'янів. Високий рівень стійкості до дикамби в трансгенних рослинах сої, що несуть ген DMO, вказує на здатність застосування дикамби на соєвих полях із метою сильного пригнічення конкуруючого росту широколистих бур'янів без супутнього пошкодження сільськогосподарської культури. Крім того, сільськогосподарські культури, стійкі до дикамби, можуть бути важливим доповненням до існуючих у цей час способів контролю бур'янів із застосуванням трансгенних толерантних до гербіциду сільськогосподарських культур. Тобто вони можуть являти собою цінний внесок у стратегії контролю існуючих у цей час стійких до гербіцидів бур'янів і в стратегії пригнічення появи додаткових стійких до гербіцидів бур'янів, які, зрештою, можуть загрожувати тривалому застосуванню і вартості існуючих у цей час гербіцидів і стійких до гербіцидів сільськогосподарських культур. Приклад 3 Надекспресія, очищення і порівняння DMOw і DMOc Ферментативні властивості А. Клонування і надекспресія Послідовності, що кодують білок DMO дикого типу (DMOw) і варіант (DMOc), клонували з плазмід pMON95900DMO (DMOw) і pMON58499DMO (DMOc) у вектор pET28b (Novagen, San Diego, CA) і трансформували в клітини Escherichia coli BL21 (Novagen, San Diego, CA). Клітини вирощували в 1 літрі середовища Luria-Bertani при 37°С до поглинання 0,4-0,6 при 600 нм. Експресію білка індукували за допомогою додавання 50 мкМ Fe(NH4)SO4, 100 мкМ Na2S і 1 мМ ізопропіл-бетатіогалактопіранозиду (IPTG), і клітини переводили на температуру 15°С. Після інкубації протягом 4872 годин при 15°С, клітини збирали за допомогою центрифугування при 10000g протягом 20 хвилин. Для подальшого використання клітини зберігали при температурі -20°С. Вихід експресії білка в Е. coli для DMOw і DMOc був різним. У той час як вихід DMOw стано 94613 28 вив приблизно 100-150 мг очищеного білка на літр середовища LB, вихід DMOc виявився в 10 разів нижчим або приблизно 10-15 мг очищеного білка на літр. Одержаний результат не був передбачений, оскільки Е. coli не має рідких кодонів для цистеїну, й існує тільки один кодон для триптофану, але гетерологічна здатність одержання білків в Е. coli була показана в обох випадках незалежно від виходу. Кількість білка в тілах включення була низькою в обох випадках, що передбачає присутність білка головним чином у розчинній фракції. Рекомбінантний білок DMOw, що містить Hisфрагмент, з Pseudomonas maltophilia, штаму DI-6, і рекомбінантний білок DMOc, що вмістить Hisфрагмент, експресований в Е. coli штаму BL21, були очищені до гомогенного стану за допомогою колонкової хроматографії Ni-NTA. Клітини суспендували в лізуючому буфері (100 мМ NaPi рН 8,0, 300 мМ NaCl і 10 мМ імідазол) і руйнували за допомогою ультразвуку. Клітинний лізат центрифугували при 55000g протягом 1 години. Супернатант завантажували в колонку Ni-NTA, яку промивали за допомогою промиваючого буфера (100 мМ NaPi pH 8,0, 300 мМ NaCl і 20 мМ імідазол) для видалення білків, які неспецифічно приєднувалися до смоли. Білок, що містить His-фрагмент, елюювали за допомогою елююючого буфера (100 мМ NaPi pH 8,0, 300 мМ NaCl і 250 мМ імідазол). Для очищення білка DMOw було достатньо ступінчастого градієнта для одержання ферменту зі ступенем чистоти 95%, у той час як для DMOc був необхідний лінійний градієнт концентрації імідазолу від 20 до 250 мМ для досягнення такого ж рівня ступеню чистоти. Фермент, який елюювали з колонки, мав ступінь чистоти, що становить приблизно 95%, за оцінками за допомогою білкових блотів (вестернблотів) ферменту після фракціонування за розміром за допомогою SDS-поліакриламідного гельелектрофорезу. Єдина основна смуга, мігруюча на рівні, що відповідає білку з молекулярною масою 40 кДа (37,3 кДа ферменти DMO плюс 3 кДа Hisфрагмента), вказувала на надпродукцію коректного білка. В. Аналізи для DMOc і DMOw, і стаціонарна кінетика Концентрації білка визначали за допомогою аналізу за Бредфордом, використовуючи як стандарт кролячий IgG. Білки розділяли за допомогою SDS-PAGE і забарвлювали за допомогою кумасісинього. Активність DMO вимірювали таким чином: за допомогою утворення DCSA, яку розділяли за допомогою ВЕРХ (Waters Corporation, Milford, MA) із використанням колонки Discovery C18 (Supelco, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Час утримування для DCSA становив 8 хвилин і для дикамби - 9,5 хвилини. Для досліджень кінетики, DCSA детектували та оцінювали кількісно за допомогою флуоресцентного випромінювання при 420 нм (довжина хвилі збудження 310 нм) після розділення на колонці ВЕРХ із реакційної суміші. Набір концентрацій DCSA (12 і 24 мкМ) використали як стандарти кількісної оцінки. Використали маточний розчин дикамби (100, 200, 400, 800, 1000, 2000, 5000 і 10000 мкМ), 0,1 Μ KРі рН 7,2, 0,1 Μ FeSO4, 0,1 Μ NADH і 1 Μ MgCl2. 29 94613 Аналізи здійснювали при 30°С протягом 20 хвилин, і реакцію зупиняли шляхом додавання 40 мкл H2SO4. Для вимірювань активності, DMO об'єднували із надлишком очищених фередоксину і редуктази з P. maltophilia штаму DI-6. Оскільки аналіз вимірювання активності DMO являв собою дискретний аналіз, було важливо встановити час, протягом якого потрібно провести аналіз для того, щоб одержати значущі кінетичні параметри. Тому аналіз потрібно було провести за початкових умов, поки кількість DCSA, що одержується, залишалася лінійною протягом часу проведення аналізу (Фіг. 4). На основі результатів передбачили, що аналіз може бути проведений в інтервалі часу від 20 до 30 хвилин, і весь цей час зберігати лінійність. На Фіг. 5 показано, що оптимальне значення рН для здійснюваного аналізу в присутності буфера 0,1 Μ KРі становило 7,2, і було виявлено, що оптимальне значення температури становило приблизно 37°С (Фіг. 6). С. Аналіз кінетичних даних Параметри Міхаеліса-Ментена визначали шляхом підбору даних для нелінійного рівняння стаціонарного стану (рівняння 1). Дані аналізували з використанням Сигма-графіка 8.0 (Jandel Scientific). Рівняння 1 Vo=Vmax*[S]/(Km+[S]) Оптимальні значення рН і температури також визначали для DMOw і DMOc. Оптимальне значення рН вимірювали при 30°С протягом 20 хвилин, і визначення оптимального значення температури вимірювали також протягом 20 хвилин при рН 7,2 для обох форм ферменту. Результати підсумовані на Фіг. 7-9, і обговорюються нижче. 30 Дослідження показали, що DMOw і DMOc відрізняються за кінетичними властивостями. Наприклад, параметри Міхаеліса-Ментена, розраховані для DMOw і DMOc, складали: для DMOw, Km=49±7 мкМ і Vmax=633±24 нмоль/хв/мг, і для DMOc, Km=20,5±5 мкМ і Vmax=676±37 нмоль/хв/мг. Одержані результати показані на Фіг. 10 і 11 і підсумовані в таблиці 1 нижче. Крім того, за допомогою двох додаткових аналізів для DMOw і DMOc одержували подібні результати (таблиці 2 і 3). Як можна помітити, у прояві каталітичної ефективності ферменти DMOw і DMOc мають різні властивості: відповідно до зазначених аналізом DMOc являє собою фермент, у п'ять разів кращий, ніж DMOw. Профіль рН для DMOc відрізняється від профілю рН DMOw. По-перше, мабуть, DMOc є чутливим до буферних систем (TRIS проти KPі), що використовуються в порівнянні з DMOw (Фіг. 9, 12 і 13). По-друге, DMOc демонструє стійку активність у широкій межі рН при проведенні аналізу в буфері KPі в порівнянні з буфером TRIS, коли активність DMOc зменшується зі збільшенням одиниць рН. Температурні профілі для DMOc, інкубованого в буфері KPі або в буфері TRIS, єподібними. При погляді на температурні профілі для зазначених двох форм ферменту можна помітити, що DMOw функціонує краще при 37°С, тоді як DMOc функціонує краще при трохи менших температурах (Фіг. 9). На Фіг. 9 зазначена більш низька оптимальна температура для DMOc, який може рано застосовуватися в трансгенних рослинах у сезон росту. Таблиця 1 Фермент DMOw DMOc Vmax (Ед./мг) -3 63310 -3 676±3710 Km (M) -6 49±710 -6 20±510 -1 Kcat (с ) 36,63 70,41 -1 -1 Kcat/Km (M c ) 5 7,4710 5 35,2110 Таблиця 2 Підсумовування параметрів Міхаеліса-Ментена для DMOw № дослідження 1 2 3 Rsqr 0,983 0,988 0,987 Vmax (нмоль/хв/мг) 633±24 583±18 590±19 Km (мкМ) 49±7 46±5 46±5,5 Таблиця 3 Підсумовування параметрів Міхаеліса-Ментена для DMOc № дослідження 1 2 Rsqr 0,933 0,948 Приклад 4 Аналіз консервативних ділянок DMO з використанням біоінформатики Vmax (нмоль/хв/мг) 713±43 676±37 Km (мкМ) 21±6 20±5 Аналіз з використанням біоінформатики проводили для порівняння поліпептидної послідовності DMO з іншими залізо-сірчаними оксигеназамиі для ідентифікації консервативних ділянок. Спочат 31 ку, для аналізу вибирали 78 послідовностей на основі е-величини відсікання 1е-08, і 70% перекривання з послідовністю DMO при порівнянні послідовності. Подальший аналіз цих 78 послідовностей виявив присутність двох доменів, які були ідентифіковані в інших дослідженнях, що включають домени Rieske і негемінового Fe (Herman et al., 2005). Із зазначених 78 послідовностей, 68 містили обидва домени, у той час як 10 містили тільки один із зазначених доменів. 68 молекул із двома доменами використали для подальшого аналізу мотивів. Порівняння 68 молекул, що містять обидва домени з різним рівнем ідентичності, виявляло новий мотив WXWX. У той час як деякі послідовності не містили мотиву, філогенетичний аналіз показав, що молекули без мотиву попадають в певні філогенетичні гілки у філогенетичному дереві, які не належать до тієї ж групі, що і молекули з мотивом. Зазначені послідовності без мотиву були, таким чином, видалені з вихідного набору даних, залишалися 52 послідовності для яких повторювали порівняння для подальшого аналізу. Повторне порівняння 52 послідовностей показало консервативну ділянку навколо двох залишків W, що містить наступний формат: WX1WX2G (W являє собою Trp, G являє собою залишок Gly, Χ1 являє собою неполярний залишок, і X2 являє собою будь-яку амінокислоту). У цьому випадку другий залишок W відповідає положенню 112 з SEQ ID NO:1. Ділянка WXG з мотиву WX1WX2G недавно була опублікована, і було виявлено, що білки, що містять мотив WXG, пов'язані з системами клітинної секреції (Desvaux et al., 2005). Триптофан (W) і цистеїн (С) являють собою залишки, які значно відрізняються за розміром. W являє собою великий залишок, у той час як С являє собою відносно невеликий залишок. Оскільки обидва W і С являють собою полярні амінокислоти, вони розділяють деякі загальні характеристики, такі як віддача протонів. Оскільки залишок W кодується за допомогою TGG, і Cys кодується за допомогою TGC і TGT, то певні перетворення в третій букві (GC або GТ) можуть призвести до одержання місенс-мутації, яка змінює W на С, або С на W. Такі перетворення були ідентифіковані в природі, і такі мутації змінювали біофункції та активність (дивіться, наприклад, ген BRCA1 у спадковому раковому захворюванні грудей і яєчників (Xiaoman and Jinghe, 1999); дефіцит фактора коагуляції XII (Wada et al., 2003), і мутація ліпопротеїн-ліпази при гіперліпопротеїнанемії типу І (Hoffmann et al., 2000)). Таким чином, вищезазначені результати вказують на те, що DMO є унікальним ферментом і має низьку ідентичність із відомими ферментами, W112 є консервативним в інших споріднених залізо-сірчаних оксигеназах. Крім того, положення 112 пов'язане з двома консервативними функціональними доменами (Фіг. 18). Далі, перетворення W у С звичайно впливає на біоактивність. Відкриття того, що з DMOc є функціональним ферментом із кінетичними параметрами, які перевищують кінетичні параметри ферменту дикого типу DMOw, і забезпечує високий рівень толерантності до дика 94613 32 мби при експресії в трансгенних рослинах, виявилося особливо несподіваним. Приклад 5 Одержання високого рівня стійкості до дикамби за допомогою білка, що кодується в хлоропластах DMO Для визначення того, чи може DMO функціонувати виключно всередині хлоропластів, і для дослідження можливості обмеження "поширення гена" через перенесення пилка, були створені конструкції на основі вектора pFMDV1 (наприклад, Svab et al., 1990), щоб допустити інтеграцію гена DMOc у хлоропластний геном тютюну шляхом гомологічної рекомбінації і допустити виділення трансформантів із використанням селекції на стійкість до антибіотика (Фіг. 14). У зазначеній конструкції ділянка, що кодує ген DMOc, справляється за допомогою промотору хлоропластного гена psbA, що містить повну 5'-UTR послідовність гена. Вихідні ДНК-блот аналізи трансгенних рослин, стійких до антибіотиків, (Фіг. 15А) продемонстрували присутність у хлоропластних геномах обох ділянок - трансгена DMOc (смуга 5,6 т.п.о.) і ділянки нативного гена (смуга 3,3 т.п.о.), заміщеного за допомогою гомологічної інтеграції гена DMOc (тобто хлоропласти були гетеропластидними для нативного гена і трансгена DMOc). Повторна регенерація і селекція трансгенних рослин на середовищі, що містить антибіотик, призвела в результаті до очевидного одержання гетеропластидних хлоропластів, що несуть фрагмент гена DMOc, але не заміщена ділянка нативного гена (Фіг. 15В). Генерації Т1, Т2 і Т3 потомства з двох незалежно виділених трансформантів хлоропластів тестували на толерантність до обробки за допомогою дикамби в різних дозах. Всі зазначені генерації демонстрували високий рівень толерантності. Дійсно трансформанти хлоропластного геному виявляли відсутність видимого пошкодження (на відміну від "пошкодження за допомогою тільки розчинника" для нижнього листя) при обприскуванні дикамбою з дозою 28 кг/га (25 фунт/акр) (Фіг. 16), і спостерігалося тільки тимчасове пошкодження, коли рослини обробляли екстремально високими дозами дикамби, що становлять 112 і 224 кг/га. При зазначених екстремально високих рівнях дози початкові пошкодження були викликані, головним чином, поверхнево-активними речовинами та іншими компонентами розчинника, в якому здійснювалася доставка дикамби; тканини, що виросли з пошкодженої верхівки, демонстрували фенотипи від майже нормального до нормального, і показували відсутність сповільнення швидкості росту після початкової зупинки росту і зберігали здатність одержання насіння в звичайній кількості та зі звичайною якістю. Результати були сумісні з можливістю того, що відновлений фередоксин у хлоропластах тютюну може бути донором електронів для DMO, необхідних для окислення дикамби до DCSА. Як прямий тест зазначеної можливості, визначали здатність очищеного фередоксину шпинату підтримувати перетворення дикамби в DCSA в присутності та за відсутності DMO, очищеного з P. maltophilia, штаму DI-6, або одержаного за допомогою надпродукції 33 94613 та очищення з Е. coli (таблиця 4). Результати продемонстрували, що відновлений фередоксин зі шпинату або з Clostridium був цілком здатний до донорства електронів для DMO in vitro за вимірюваннями або за допомогою деградації дикамби або за вимірюванням появи DCSA. 34 Таблиці 4А-В. Очищена дикамбамонооксигеназа може утилізувати відновлений фередоксин хлоропластів або відновлений фередоксин із Clostridium у ролі джерела електронів для каталізу in vitro перетворення дикамби в 3,6дихлорсаліцилову кислоту. Таблиця 4А Деградація дикамби Тип Реакції (Фep+Peд)DI-6+NADH (Окси+Фep+Peд)DI-6+NADH (Окси)DI-6+(Ферр)шпинат+(Фер:Окислений)шпинат+NАDРН (Окси)DI-6+(Фер:Oкислений)шпинат+NАDРН (Окси)DI-6+(Фер)шпинат+(Фер:Окислений)шпинат+Nо NADPH (Окси)DI-6+(Фер)clostridium+(Фер:Окислений)шпинат+NADPH (Ферр)clostridium+(Фер:Окислений)шпинат+NADPH Деградація дикамби (%) 0 86 83 НВ НВ 82 НВ Таблиця 4В Утворення DCSA Тип реакції (Фep+Peд)DI-6+NADH (Окси+Фep+Peд)DI-6+NADH (Окси)DI-6+(Ферр)шпинат+(Фер:Окислений)шпинат+NАDРН (Окси)DI-6+(Фер:Oкислений)шпинат+NАDРН (Окси)DI-6+(Фер)шпинат+(Фер:Окислений)шпинат+Nо NADPH (Окси)DI-6+(Фер)clostridium+(Фер:Окислений)шпинат+NADPH (Ферр)clostridium+(Фер:Окислений)шпинат+NADPH Утворення DCSA (%) НВ 100 95 2,5 1,2 90 1,5 НВ - не визначено У той час як результати, подані на Фіг. 2, показали, що рівень, який одержується DMO варіювався та іноді рівень DMOc не виявляв тісної кореляції з рівнем толерантності до дикамби, при цьому результати демонструють здатність послідовно одержувати високий рівень толерантності до дикамби. Показана продукція DMOc для трансформантів з обох джерел - із гена DMOc з ядерною локалізацією, і з гена gene DMOc з локалізацією в хлоропластах. В ядерних трансформантах було відсутнім створення виключно високого рівня тотального білка DMOc стосовно тотального білка, і кількість DMOc у хлоропластних трансформантах не мала значних відмінностей, й іноді була нижчою, ніж в ядерних трансформантах. Оцінки відносної ферментативної активності в безклітинних екстрактах зразків тканини листа показували, що більший відсоток DMOc, одержаного в хлоропластах, є активним, у порівнянні з DMOc, синтезованим в цитоплазмі і штучно перенесеним у хлоропласти. У всіх рослинах аналізована толерантність до дикамби досягалася без співтрансформації генами фередоксину або редуктази. Результати демонструють, що рослини містили одну або більше молекул, які могли перенести необхідні електрони на DMO, щоб допустити перетворення дикамби в 3,6дихлорсаліцилову кислоту (DCSA). Початкове спрямування DMO у хлоропласти з використанням послідовності транзитного пептиду проводили з метою потенційної утилізації відновленого фередоксину, доступного у великих кількостях у хлоропластах. Щодо цього цікаво помітити, що трансформація рослин тютюну конструкцією гена DMOc, позбавленої послідовності, що кодує хлоропластний пептид, призводила в результаті до несподіваного одержання рослин, які були толерантними до післясходової обробки дикамбою. Результати з обмеженої кількості випробувань із невеликою кількістю рослин генерації Т1, проте показували, що рівень толерантності, одержаний із вказаними трансгенними рослинами, був у середньому трохи нижчим, ніж рівень толерантності, одержаний із рослинами тютюну, продукованими DMOc, що містить транзитний пептид. Зазначені спостереження викликали цікаві питання щодо молекул у трансгенних рослинах, які можуть бути продуктивними донорами електронів для DMO. Той факт, що гомопластидні хлоропласти, продукуючі всередині себе DMO з гена DMOc, інтегрованого в хлоропластний геном, показують стійкість до екстремально високого рівня дикамби (Фіг. 16), і той факт, що очищений білок DMO може функціонувати in vitro разом із відновленим фередоксином хлоропластів шпинату (таблиця 4), обидва передбачають, що хлоропластний фередоксин може продуктивно взаємодіяти з DMO, допускаючи перенесення електронів. Однак джерело електронів для DMO, про 35 дукованого з ядерних генів, позбавлених послідовності, що кодує хлоропластний транзитний пептид, залишається невідомим. Припущення, що фередоксини відсутні поза хлоропластами рослини, повинно допустити можливість того, що невідомий цитоплазматичний білок може забезпечувати DMO стійким постачанням електронами. Альтернативно, DMO сам по собі може містити надмірний хлоропластний транзитний пептид, який допускає вхід достатньої кількості DMO в хлоропласти для забезпечення захисту від дикамби, що просувається в клітину після обробки за допомогою дикамби. Всі композиції і/або способи, описані і заявлені в даному описі, можуть бути зроблені і здійснені без надмірного експериментування в світлі даного опису. У той час як композиції і способи даного винаходу були описані у вираженні переважних втілень, фахівцеві в даній галузі буде очевидно, що можуть застосовуватися варіації до композицій і/або способів, і в стадіях або в послідовності стадій способу, описаного в даному описі, не виходячи за рамки концепції, суті і меж винаходу. Більш конкретно, буде очевидно, що певні агенти, які пов'язані одночасно хімічно і фізіологічно, можуть бути замінені описаними в даному описі агентами, тоді як при цьому будуть досягнуті такі ж або подібні результати. Всі такі подібні заміни і модифікації, очевидні фахівцям у даній галузі, будуть знаходитися в рамках суті, меж і концепції винаходу, як визначено у формулі винаходу, що додається. Посилання Посилання, наведені нижче, введені в даний опис за допомогою посилання у такому ступені, щоб вони додавали, пояснювали, забезпечували опис рівня техніки або щоб вони пояснювали методологію, методи і/або композиції, що застосовуються в даному описі. U.S. патент № 4554101; патент U.S. № 4940838; патент U.S. № 5015580; патент U.S. № 5017692 патент U.S. № 5229114; патент U.S. № 5304730; патент U.S. № 5322938; патент U.S. № 5352605; патент U.S. № 5359142; патент U.S. № 5362865; патент U.S. № 5378619; патент U.S. № 5384253; патент U.S. № 5445962; патент U.S. № 5463175; патент U.S. № 5464763; патент U.S. № 5508184; патент U.S. № 5512466; патент U.S. № 5516671; патент U.S. № 5530196; патент U.S. № 5538880; патент U.S. № 5543576; патент U.S. № 5550318; патент U.S. № 5552299; патент U.S. № 5567600; патент U.S. № 5567862; патент U.S. № 5591616; патент U.S. № 5633435; патент U.S. № 5635055; патент U.S. № 5641876; патент U.S. № 5659122; патент U.S. № 5689041; патент U.S. № 5689052; патент U.S. № 5716837; патент U.S. № 5728925; патент U.S. № 5750876; патент U.S. № 5763241; патент U.S. № 5763245; патент U.S. № 5773696; патент U.S. № 5804425; патент U.S. № 5824877; патент U.S. № 5837848; патент U.S. № 5850019; патент U.S. № 5850023 патент U.S. № 5866775; патент U.S. № 5869720; патент U.S.№ 5880275; патент U.S. № 5942658; патент U.S. № 5942664; патент U.S. № 5958745; патент U.S. № 5959091; патент U.S. № 5981834; патент U.S. № 5981840; патент U.S. № 5985605; патент U.S. № 94613 36 5998700; патент U.S. № 6011199; патент U.S. № 6013864; патент U.S. № 6015940; патент U.S. № 6023013; патент U.S. № 6051753; патент U.S. № 6063597; патент U.S. № 6063756; патент U.S. № 6072103; патент U.S. № 6080560; патент U.S. № 6093695; патент U.S. № 6107549; патент U.S. № 6110464; патент U.S. № 6121436; патент U.S. № 6140075; патент U.S. № 6140078; патент U.S. № 6153814; патент U.S. № 6156573; патент U.S. № 6160208; патент U.S. № 6166292; патент U.S. № 6171640; патент U.S. № 6175060; патент U.S. № 6177611; патент U.S. № 6177615; патент U.S. № 6215048; патент U.S. № 6221649; патент U.S. № 6222098; патент U.S. № 6225114; патент U.S. № 6228623; патент U.S. № 6228992; патент U.S. № 6232526; патент U.S. № 6235971; патент U.S. № 6242241; патент U.S. № 6248536; патент U.S. № 6248876; патент U.S. № 6252138; патент U.S. № 6271443; патент U.S. № 6281016; патент U.S. № 6284949; патент U.S. № 6294714; патент U.S. № 6313378; патент U.S. № 6316407; патент U.S. № 6326351; патент U.S. № 6372211; патент U.S. № 6380462; патент U.S. № 6380466; патент U.S. № 6384301; патент U.S. № 6399330; патент U.S. № 6399861; патент U.S. № 6403865; патент U.S. № 6423828; патент U.S. № 6426446; патент U.S. № 6426447; патент U.S. № 6429357; патент U.S. № 6429362; патент U.S. № 6433252; патент U.S. № 6437217; патент U.S. № 6441277; патент U.S. № 6444876; патент U.S. № 6448476; патент U.S. № 6459018; патент U.S. № 6468523; патент U.S. № 6476295; патент U.S. № 6483008; патент U.S. № 6489461; патент U.S. № 6495739; патент U.S. № 6501009; патент U.S. № 6506962; патент U.S. № 6518488; патент U.S. № 6521442; патент U.S. № 6531648; патент U.S. № 6537750; патент U.S. № 6537756; патент U.S. № 6538109; патент U.S. № 6538178; патент U.S. № 6538179; патент U.S. № 6538181; патент U.S. № 6541259; патент U.S. № 6555655; патент U.S. № 6573361; патент U.S. № 6576818; патент U.S. № 6589767; патент U.S. № 6593293; патент U.S. № 6596538; патент U.S. № 6608241; патент U.S. № 6617496; патент U.S. № 6620988; патент U.S. № 6635806; патент U.S. № 6639054; патент U.S. № 6642030; патент U.S. № 6645497; патент U.S. № 6653280; патент U.S. № 6653530; патент U.S. № 6657046; патент U.S. № 6660849; патент U.S. № 6663906; патент U.S. № 6686452; патент U.S. № 6706950; патент U.S. № 6713063; патент U.S. № 6716474; патент U.S. № 6723837; патент U.S. № 6723897; патент U.S. № 6770465; патент U.S. № 6774283; патент U.S. № 6803501; патент U.S. № 6809078; патент U.S. № 6812379; патент U.S. № 6822141; патент U.S. № 6828475; патент U.S. № 7022896; U.S. патентна заявка 2003/0028917; U.S. патентна заявка 2003/0135879; U.S. патентна заявка 2003/01403641; патент U.S. № 09/757089; патент U.S. № RE37,543; патент U.S. № RE38446. Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, New York, 1995. Becker et al. Plant Mol. Biol., 20:1195-1197, 1992. Becker et al., Plant Mol. Biol., 20:49, 1992. Bevan et al., NAR, 11:369, 1983. 37 Brothers et al., Nature, 433:630, 2005. Carrington and Freed, J. of Virology 64:15901597, 1990. Carrington and Freed, J. Virology, 64:1590, 1990. Chalfie et al., Science, 263:802, 1994. Chandler et al., Plant Cell, 1:1175-1183,1989. Chang et al., J. Biol. Chem., 31; 278(44):4282142828, 2003. Chu et al., Scientia Sinica, 18:659, 1975. Clough and Bent, Plant J., 16:735, 1998. Cork and Khalil, Adv. Appl. Microbiol, 40:289, 1995. Cork and Krueger, Adv. Appl. Microbiol, 38:1, 1991. Coruzzi et al., EMBO J., 3:1671, 1984. Coruzzi et al., J. Biol. Chem., 258:1399-1402, 1983. Creissen et al., Plant J., 2:129, 1991. Crop Protection Reference, Chemical & Pharmaceutical Press, Inc., NY, 11th Ed., 1803-1821, 1995. De Block et al., EMBO J., 3:1681, 1984. della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6873-6877, 1986. Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet., 1:561, 1982. Desvaux et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1745:223-253, 2005. Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(12):7347-7351, 1980. Ebert et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:57455749, 1987. EP Appln. 553494. EP Appln. 646643. Fraley et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4803, 1983. Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Biol., 25:989-994, 1994. Haseloff et al., TIG, 11:328-329, 1995. Herman et al., J. Biol. Chem., 280:24759-24767, 2005. Hoffmann et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 85(12):4795-498, 2000. Horsch et al., Science, 227:1229, 1985. Ingelbrecht et al., Plant Cell, 1:671, 1989. Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep., 5:387, 1987. Jiang et al., J. Bacteriol., 178:3133-3139, 1996. Kado, Crit. Rev. Plant. Sci, 10:1, 1991. Klee et al., Mol Gen. Genet., 210:437-442, 1987. Koncz and Schell, Mol. Gen. Genet, 204:383 396, 1986. 94613 38 Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84:131, 1987. Krueger et al, J. Agric. Food Chem, 37:534, 1989. Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol, 157(1): 105-132, 1982. Lawton et al. Plant Mol. Biol, 9:315-324, 1987. Lloyd and McCown, Proc. Int. Plant Prop. Soc, 30:421, 1981. Maniatis, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 1982. Mason, JR, and Cammack, R, Annu. Rev. Microbiol. 46:277-305, 1992. Miki et al. In: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson (Eds.), CRC Press, 67-88, 1993. Mitsuhara et al. Plant Cell Physiol. 37:49-59, 1996. Moloney et al. Plant Cell Reports, 8:238, 1989. Murashige and Skoog, Physiol. Plant, 15:473497, 1962. Odell et al. Nature, 313:810-812, 1985. PCT Appln. WO 04009761. PCT Appln. WO 95/24492. PCT Appln. WO 97/11086. PCTAppln. WO 97/31115. PCTAppln. WO 97/41228. Rojiyaa et al., (JP 1987201527-A), 1987. Sambrook et al., In: Molecular cloning: a nd laboratory manual, 2 Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Southern, Mol. Biol., 98:503, 1975. Svab et al., Plant Mol. Biol., 14:197, 1990. Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(21):8526-8530, 1990. Teeri et al., EMBO J., 8:343, 1989. Turner and Foster, Molec. Biotechn., 3:225, 1995. Wada et al., Thromb. Haemost, 90(1):59-63, 2003. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6624-6628, 1987. Xiaoman and Jinghe, Chin. Med. Sci. J., 14(4): 195-199, 1999. Yang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:41444148, 1990. Zhang et al., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 56:37-46, 1999. 39 94613 40 41 94613 42 43 94613 44 45 94613 46 47 94613 48 49 94613 50 51 94613 52 53 94613 54 55 94613 56 57 94613 58 59 94613 60