Стійка до бактерій трансгенна рослина, яка містить дисфункціональні білки t3ss

Реферат: Винахід належить до вектора експресії нуклеїнової кислоти, який містить нуклеотидну послідовність, що кодує секретований домінантний негативний білок Hrp або білок транслокону і послідовність промотору, здатну запускати транскрипцію вказаної нуклеотидної послідовності в рослинній клітині, причому вказаний вектор додатково містить додаткову нуклеотидну послідовність, кодуючу сигнальний пептид ендоплазматичного ретикулуму, що знаходиться вище та в межах вказаної нуклеотидної послідовності, кодуючої вказаний домінантний негативний білок Hrp або білок транслокону, причому вказаний домінантний негативний білок Hrp або білок транслокону опосередковує складання нефункціонального комплексу голки, а також до застосування зазначеного вектора для одержання рослин з підвищеною резистентністю до бактеріального патогену. UA 113843 C2 (12) UA 113843 C2 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід, в певних варіантах свого здійснення, стосується стійких до бактерій рослин і способів створення таких рослин. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Ralstonia solanacearum (Rs), широко розповсюджена грамнегативна ґрунтова патогенна бактерія, що відноситься до β-підрозділу протеобактерій, викликає летальне зів'янення більше ніж 200 видів рослин, в тому числі економічно важливих сільськогосподарських культур, таких як томати, картопля і банани. Ця бактерія проникає в коріння рослин через рани, окупує судини ксилеми і швидко поширюється через судинну систему на надземні частини рослини. Швидко 10 виявляються популяції з понад 10 бактеріальних клітин на сантиметр стебла. Основним фактором вірулентності Rs є екзополісахарид (ЕПС), довгий (понад 106 Да) полімер цукру, який закупорює ксилему, викликає симптоми зів'янення і зрештою призводить до загибелі рослини. Rs демонструє дивовижну здатність секретувати понад 100 білків. Наприклад, система секреції II типу (T2SS) секретує фактори, які включають пектинази, що руйнують клітинну стінку рослини, ендоглюканази, а пізніше і вірулентний ЕПС (Фіг. 1A-C). Система секреції III типу (T3SS) секретує ефекторні білки (T3E), які сприяють інфекції, в клітини хазяїна, щоб оптимізувати внутрішнє середовище хазяїна і пригнітити захисні реакції після зараження (Фіг. 1A-C). Система секреції III типу (T3SS) – це складний молекулярний комплекс, який використовується грамнегативними бактеріями для того, щоб "впорснути" (переміщувати) бактеріальні білки (ефектори) в евкаріотичні клітини. Для цього T3SS має зібратись в мультибілковий комплекс, який складається з різних частин: базального тільця, яке з'єднує дві бактеріальні мембрани, зв'язані з цитоплазматичним бульбо подібним розширенням; прикріпленої голчастої структури, що нагадує молекулярний шприц (інжектисома/пілус), і дистальної голчастої кінцевої структури, яка реорганізується згодом в "транслокон" – білковий комплекс, який вводиться в мембрану клітини хазяїна. Пілус є складеним тільки з однієї білкової субодиниці. Певна кількість субодиниць олігомеризуються в структуру пілуса. Така голчаста структура забезпечує транспорт бактеріальних білків по внутрішньому каналу, трубці, голки на їх шляху до клітини-хазяїна (Фіг. 1A-C). Таким чином, головним позаклітинним компонентом T3SS є голка, яка відходить від зовнішньо-мембранної частини апарату і через яку проходить канал діаметром 25 Å, що утворює секреторну трубку (параметри спіралі голки: 5,5 субодиниць на оберт, аксіальний підйом спіралі становить 4,6 Å на субодиницю). Голка формується як спіральний комплекс з великої кількості (порядку 100-150) копій єдиного невеликого (9 кДа) білка. Не зважаючи на те, що спостерігається низький ступінь гомології між головними послідовностями будівельних блоків пілуса більшості грамнегативних бактерій, вважається, що в своїй більшості вони поділяють певну структурну гомологію. У бактерій, патогенних для рослин, T3SS кодується генами hrp (реакції гіперчутливості і патогенності), які одержали таку назву в зв'язку з тим, що вони необхідні бактеріям, щоб індукувати захворювання у чутливих до них рослин і викликати реакцію гіперчутливості у резистентних рослин. Hrp гени були виявлені майже у всіх основних грамнегативних бактеріальних патогенів рослин (наприклад, Pseudomonas syringae, Xanthomonas spp., Ralstonia solanacearum і Erwinia spp.), що підтверджує центральну роль T3SS в опосередкуванні різноманітних взаємодій рослина-бактерія. Отже, типово, позаклітинний пілус T3SS складається шляхом поетапної полімеризації основного компонента (наприклад, HrpY у R. solanacearum, HrpA у P. syringae і E. amylovora, HrpE у Xanthomonas campestris, MxiH у Shigella, PrgI у Salmonella і YscF у Yersinia). Як вже зазначалось, хоча основна функція ефекторів III типу полягає в стимулюванні чутливості рослин, певні ефектори розпізнаються білками резистентності рослини, які запускають захисні реакції, включаючи реакцію гіперчутливості. Один зі способів, запропонованих для подолання летального зараження рослин грамнегативними бактеріями, передбачає посилення імунітету рослин до таких патогенів. В патентній заявці США № 20090258825 (He et al.) описані композиції і способи для посилення захисних механізмів рослин проти патогенів (наприклад, бактеріальних патогенів). У відповідності до запропонованого в цій заявці підходу, посилення імунітету рослин проти вірулентного білка HopM1 Pseudomonas syringae досягається за рахунок підвищення активності асоційованого з ATMIN захисного білка рослин, такого як ATMIN7. В патентній заявці США № 20090044296 (Beer et al.) описані способи поліпшення росту рослин або надання рослинам резистентності до хвороб шляхом використання молекул нуклеїнових кислот, здатних збільшувати або зменшувати експресію молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, що взаємодіє з HrpN (наприклад, HIPM). Описаний спосіб аналізу 1 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 делецій показав, що 198-амінокислотна N-термінальна ділянка HrpN (harpin) Erwinia amylovora, перший безклітинний індуктор реакції гіперчутливості, який відіграє вирішальну роль у вірулентності цього патогену, є необхідною для взаємодії з HIPM. Крім того, зів'янення, викликане бактеріями, важко контролювати через ґрунтове походження збудників. В рослинах, інфікованих Rs, розвиток захворювання залежить від активності систем секреції білка типів II і III, і мутації в одній з цих систем приводять до появи непатогенних бактерій [Poueymiro et al., Curr. Opin. Microbiol. (2009) 12:44-52]. Roine і співавтори [Roine et al., FEBS Letters (1997) 417(2): 168-172] показали, що очищений HrpA, структурний білок пілусів Pseudomonas syringae pv. томатів DC3000 вже сам по собі є достатнім для утворення нитчастих структур, які піддаються самостійному складанню. Taira і співавтори [Taira et al., Mol Microbiol. (1999) 34(4):737-44] генерували мутації в гені hrpA шляхом вставки (наприклад, вставки пентапептидів) і створили мутантні бактерії, які експресують такий ген. У відповідності до їх ідей, карбокси-кінцева ділянка hrpA є вирішальною для збирання пілуса і для взаємодії бактерій з враженою рослиною. Крім того, Wei і співавтори [Wei et al., PNAS (2000) 97(5):2247–2252] ідентифікували три одиничні амінокислотні мутації в карбоксильній кінцевій ділянці HrpA, які впливають на секрецію або регуляторну функцію білка HrpA. Ці результати продемонстрували суттєву роль структурного гену пілуса Hrp для секреції білка і скоординованої регуляції системи секреції III типа у Pseudomonas syringae. Більше того, Lee і співавтори [Lee et al., J. Bio. Chem. (2005) 280: 21409-17] встановили, що деякі індуковані пентапептидом нефункціональні білки HrpA, коли вони експресуються в бактеріях, чинять сильний домінантно-негативний вплив на функцію HrpA дикого типу, блокуючи здатність Pseudomonas syringae викликати відповідь рослини-хазяїна, і спричинюють до хвороби in vivo. Домінантно-негативні мутанти HrpA були також здатними перешкоджати самостійному складанню HrpA дикого типу в пілус in vitro. Weber і співавтори [Weber and Koebnik, J. Bacteriology (2005) 187(17): 6175-6186] провели аналіз графіків гідрофобності білків кількох пілусів Hrp, таких як HrpE і HrpA від Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria і HrpY від R. Solanacearum, і виявили спільну організацію доменів. Ці дані дозволяють припустити, що патогенні для рослин бактерії, коли перед ними поставало завдання подолати бар'єр стінки рослинної клітини, незалежно утворювали структурно подібні білки. Weber і співавтори далі повідомляють, що мутанти зі вставками пентапептидів в Cтермінальній ділянці HrpE пригнічують складання пілуса Hrp у X. campestris pv. Vesicatoria. Морфологічні дослідження виявили інсерційних мутантів з вкороченими пілусами Hrp. Цей домінантно-негативний ефект наводить на думку, що мутантний варіант може перешкоджати складанню пілуса Hrp. Патентна заявка США № 20100249234 (Yang et al.) описує способи зниження вірулентності бактерій, такі як система HrpX/HrpY-типу або система T3SS-типу. Даний спосіб передбачає контактування бактерії з ефективною кількістю інгібіторної сполуки фенілпропаноїдного типу. Патентна заявка США № 20100099674 (Elofsson et al.) розкриває способи зниження вірулентності бактерій в рослині шляхом пригнічення системи секреції III типу за допомогою Nзаміщеного 7-хінолілметиламіну, зокрема такого, який є далі заміщеним в 5-тій і 8-мій позиціях хінолінового кільця. Додатково рівень техніки включає патентну заявку США № 20050076406. СУТЬ ВИНАХОДУ У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, тут пропонується вектор експресії нуклеїнової кислоти, який містить послідовність нуклеїнових кислот, кодуючу домінантно-негативний білок T3SS і діючий в цис-положенні регуляторний елемент, здатний запускати транскрипцію цієї послідовності нуклеїнових кислот в рослинній клітині; при цьому домінантно-негативний білок T3SS опосередковує складання нефункціонального голкового комплексу. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, тут пропонується виділений полінуклеотид, який містить нуклеотидну послідовність, кодуючу SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10 або 12. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, тут пропонується вектор експресії, який містить полінуклеотид, що включає нуклеотидну послідовність, кодуючу SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10 або 12. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, тут пропонується клітина-хазяїн, яка містить вектор експресії нуклеїнової кислоти. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, тут пропонується генетично модифікована рослина, яка містить вектор експресії нуклеїнової кислоти. 2 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, тут пропонується генетично модифікована рослина, яка експресує екзогенний полінуклеотид, кодуючий домінантно-негативний білок T3SS, як наведено в SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10 або 12. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, тут пропонується спосіб одержання рослини, що має підвищену резистентність до бактеріальних патогенів у порівнянні з немодифікованою рослиною, який включає введення в рослину або рослинну клітину вектора експресії нуклеїнової кислоти, завдяки чому одержується рослина, що має підвищену резистентність до бактеріальних патогенів у порівнянні з немодифікованою рослиною. Спосіб оцінки резистентності рослини до бактеріального патогена, який включає: (а) експресію в рослині екзогенної нуклеотидної послідовності, кодуючої домінантно-негативний білок T3SS і активний в цис-положенні регуляторний елемент, здатний запускати транскрипцію цієї нуклеотидної послідовності в рослинній клітині; (б) піддавання рослини дії бактеріального патогена; (в) порівняння перебігу захворювання в одержаній рослині з рослиною дикого типу, вирощеною і зараженою бактеріальним патогеном в таких самих умовах, оцінюючи у такий спосіб резистентність даної рослини до цього бактеріального патогена. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, нуклеотидна послідовність містить SEQ ID №№: 1, 3, 5, 7, 9 або 11. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, нуклеотидна послідовність містить SEQ ID №№: 20-65. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, нуклеотидна послідовність кодує поліпептид, наведений в SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10 або 12. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, вектор експресії додатково містить нуклеотидну послідовність, кодуючу сигнальний пептид ендоплазматичного ретикулуму, що знаходиться вище цієї нуклеотидної послідовності. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, діючий в цис-положенні регуляторний елемент містить послідовність промотору. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, промоторна послідовність є конститутивним промотором. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, цим конститутивним промотором є промотор CaMV 35S. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, домінантнонегативний білок T3SS одержують шляхом введення мутації, вибраної з групи, яка складається з вставки, делеції і заміщення. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, мутація вставкою включає вставний блокуючий елемент. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, білок T3SS є структурним білком T3SS. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, структурний білок T3SS є білком HRP. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, білок T3SS вибирається з групи, яка складається з білка HrpY Ralstonia solanacearum, білка HrpA Pseudomonas syringae, білка HrpA Erwinia amylovora, білка HrpE Xanthomonas campestris, білка HrpA Erwinia pyrifoliae і білка HrpE Xanthomonas oryzae. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, білок T3SS представляє собою білок транслокону Ralstonia solanacearum. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, білок транслоконі Ralstonia solanacearum вибирається з групи, яка складається з PopF1 і PopF2. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, клітинахазяїн є рослинною клітиною. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, рослина має підвищену резистентність до бактеріального патогену порівняно з немодифікованою рослиною. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, бактеріальним патогеном є грамнегативна бактерія. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, ця грамнегативна бактерія вибирається з групи, яка складається з Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora, Xanthomonas campestris і Xanthomonas oryzae. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, грамнегативна бактерія належить до виду Proteobacteria. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, 3 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Proteobacteria представляє собою Ralstonia solanacearum. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, рослина вибирається з групи, яка складається з сільськогосподарської рослини, декоративної рослини і дерева. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, рослиною є рослина Solanaceae. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, рослина вибирається з групи, яка складається з томату, картоплі, баклажану, банану, солодкого перцю, оливи, яблуні, груші, піраканти, квітучої дикої яблуні, глоду, кизилу, айви, горобини, арабідопсису, герані, імбиру, тютюну і евкаліпту. У відповідності до одного аспекту певних варіантів здійснення даного винаходу, рослиною є рослина томату. Коли не вказується інше, всі технічні та/або наукові терміни, використані в даному документі, мають те саме значення, яке є зрозумілим для звичайного спеціаліста в галузі, до якої відноситься цей винахід. Оскільки при практичному застосуванні і тестуванні варіантів здійснення цього винаходу можуть використовуватись способи і матеріали, подібні або еквівалентні описаним в даному документі способам і матеріалам, далі описуються показові способи та/або матеріали. У випадку конфлікту вирішальним буде опис до патенту, включаючи наведені в ньому визначення. Крім того, наведені матеріали, способи і приклади є тільки ілюстративними і не задумувались для обов'язкового обмеження винаходу. КОРОТКИЙ ОПИС МАЛЮНКІВ Певні варіанти здійснення цього винаходу є описаними тут, тільки в якості прикладу, з посиланням на супроводжуючі малюнки. Що стосується безпосередньо малюнків, то слід зазначити, що показані на них деталі наведені в якості прикладу і з метою ілюстративного розгляду варіантів здійснення даного винаходу. В цьому відношенні опис винаходу разом з малюнками робить очевидним для спеціаліста в цій галузі те, як втілити на практиці варіанти здійснення даного винаходу. На малюнках: Фіг. 1A представляє собою зображення, що ілюструє систему секреції II типу (T2SS), систему секреції III типу (T3SS) і пілуси IV типу у грамнегативних бактерій. Це зображення є адаптованим з Donnenberg M.S., Nature (2000) 406: 768-774. Фіг. 1B-C представляє собою зображення, адаптовані з Buttner and He, Plant Physiology (2009) 150: 1656-64, які ілюструють комплекс T3SS в патогенній бактерії рослини (Фіг. 1B) і тварини (Фіг. 1C). Секреторний апарат з'єднує обидві бактеріальні мембрани і є зв'язаним з цитоплазматичною АТФазою. Патогенні бактерії рослини поділяють пілус, який ймовірно пробиває стінку рослинної клітини. Патогенні бактерії тварини мають коротку голку, що є з'єднаною через так званий кінцевий комплекс (відсутній у рослинних патогенів) з транслоконом. Транслокон формує канал в плазматичній мембрані і забезпечує транспорт ефекторних білків в цитоплазму клітини-хазяїна. Фіг. 2A-F представляє собою зображення, що ілюструють білок HrpY Ralstonia solanacearum (Rs), зіставлений з мономером MxiH голки T3SS Shigella (SEQ ID №: 15, Фіг. 2A), структурні моделі білка MxiH Shigella (Фіг. 2B-E) і повну структуру голки (Фіг. 2F). Зображення структури MxiH і голки є адаптованими з Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33. Фіг. 3A-E – це зображення, що ілюструють вставні блокуючі елементи (IBE) 1 (Фіг. 3A, SEQ ID №: 2) і 2 (Фіг. 3C, SEQ ID №: 4) домінантно-негативних білків T3SS, передбачувану модель структури IBE1 і 2 T3SS (Фіг. 3B і 3D, відповідно), модель взаємодії з голкою і каналом голки (Фіг. 3E) і рослинні сигнали секреції з sp|Q56YT0|LAC3_At лаккази або tr|Q6TDS6|Q6TDS6_GOSAR секреторної лаккази Gossypium arboreum (SEQ ID №: 16 і 17, відповідно). Зображення 3B, 3D і 3E є адаптованими з Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33. Фіг. 4A-С – це зображення, що ілюструють вставний блокуючий елемент 3 (IBE3) домінантно-негативного білка T3SS (Фіг. 4A, SEQ ID №: 6), передбачувану модель структури IBE3 T3SS (Фіг. 4B) і модель взаємодії з голкою (Фіг. 4C). Зображення 4B і 4C є адаптованими з Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33. Фіг. 5A-C – це зображення, що ілюструють вставний блокуючий елемент 4 домінантнонегативного білка T3SS (Фіг. 5A, SEQ ID №: 8), передбачувану модель цього блокуючого елемента (Фіг. 5C) і голку (Фіг. 5B). Зображення 5B і 5C є адаптованими з Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33. Слід зазначити, що дуплікована хвостова ділянка може взаємодіяти з різними мономерами, розриваючи і блокуючи канал голки. Фіг. 6A-D – це зображення, що ілюструють вставні блокуючі елементи 5 (Фіг. 6A, SEQ ID №: 10) і 6 (Фіг. 6C, SEQ ID №: 12) домінантно-негативного білка T3SS і передбачувану модель 4 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 структури IBE5 і 6 T3SS (Фіг. 6B і 6D, відповідно). Слід зазначити, що "головка" і кінцеві α-спіралі білка HrpY розриваються пролінами, і такі деформації можуть блокувати канал голки і порушувати функціональність голки. Зображення 6B і 6D є адаптованими з Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33. Фіг. 7A-C – це зображення, що ілюструють різні домінантні негативні білки HrpY Ralstonia solanacearum (Rs). На Фіг. 7A зображена карта клонування T-ДНК. Кожний вставний блокуючий елемент (IBE) було клоновано вниз до промотору CaMV 35S і ввех до термінатору NOS з використанням сайтів XbaI і SacI. На Фіг. 7B показана модель взаємодії з голкою, а на Фіг. 7C – різні мутантні варіанти HrpY (SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10 і 12). Зображення 7B є адаптованим з Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33. Фіг. 8 – це зображення, адаптоване з Taira et al., Mol Microbiol. (1999) 34(4):737-44; на ньому показані мутації вставки і їх положення в гені hrpA (SEQ ID №: 2). В короткому викладі, положення вставок у фрагменті з 496 пар основ BamHI±EcoRI, що кодує пілус HrpA, є відміченим кружками з номерами мутантів над ними. Кожна вставка складається з похідних від транспозону 10 пар основ і 5 пар основ вище мітки вставки, дуплікованої дистально до цих 10 пар основ. Амінокислотна послідовність (SEQ ID №: 19) є записаною під нуклеотидною послідовністю. Hrp-бокси в промоторі обведені рамкою; передбачувана ділянка сайту зв'язування рибосоми є підкресленою. Сайти обробки аміно-термінального білка є поміченими стрілками нижче амінокислотної послідовності. Поміщені в рамку номери мутацій зі стрілками вказують початкову і кінцеву точки чотирьох делеційних мутацій. Фіг. 9 представляє собою зіставлення варіантів поліпептиду HrpY Ralstonia solanacearum (тобто, незначні відмінності між штамами, SEQ ID №№: 14 і 70-86). Фіг. 10A-C ілюструють аналіз методом ПЛР і напівкількісної ЗТ-ПЛР рослин томату, що експресують мутант 6 білка HrpY, який забезпечує резистентність до зів'янення (WiltR). Рослини томату були трансформовані конструкціями, що несуть мутант 6 HrpY, а потім їх аналізували методами геномної ПЛР і напівкількісної ЗТ-ПЛР. Були виявлені випадки експресії цих мутантів HrpY. Фіг. 11A-C представляють результати аналізу методом ПЛР і напівкількісної ЗТ-ПЛР рослин томату, що експресують мутант 1 HrpY, який забезпечує резистентність до зів'янення (WiltR). Рослини томату були трансформовані конструкціями, що несуть мутант 1 HrpY, а потім їх аналізували методами геномної ПЛР і напівкількісної ЗТ-ПЛР. Були виявлені випадки експресії цих мутантів HrpY. Фіг. 12A-C представляють результати аналізу методом ПЛР і напівкількісної ЗТ-ПЛР рослин томату, що експресують мутант 2 HrpY, який забезпечує резистентність до зів'янення (WiltR). Рослини томату були трансформовані конструкціями, що несуть мутант 2 HrpY, а потім їх аналізували методами геномної ПЛР і напівкількісної ЗТ-ПЛР. Були виявлені випадки експресії цих мутантів HrpY. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід в певних варіантах свого здійснення стосується рослин, резистентних до бактерій, і способів створення таких рослин. Принципи і дія даного винаходу можуть бути краще зрозумілими з посиланням на малюнки і супроводжуючі описи. Перед тим, як детально описувати хоча б один варіант здійснення даного винаходу, слід зрозуміти, що цей винахід не обов'язково обмежується своїм застосуванням в деталях, наведених в наступному описі або ілюстрованих Прикладами. Цей винахід може бути реалізований в інших варіантах, або може використовуватись на практиці або здійснюватись різними способами. Також має бути зрозумілим, що фразеологія і термінологія, використані в даному документі, призначались для опису і не повинні сприйматись як такі, що обмежують винахід. Доводячи певні варіанти даного винаходу до практичного здійснення, винахідники створили бактеріальні домінантні негативні білки системи секреції III типу (T3SS), які експресуються в рослинних клітинах і секретуються з них. Нові домінантні негативні білки T3SS за цим винаходом включаються в структуру голки T3SS під час її складання і блокують канал бактеріальної голки, захищаючи рослини у такий спосіб від бактеріального зараження. Конструкція домінантних негативних білків T3SS за цим винаходом базується на збереженні і використанні нативних сайтів взаємодії між субодиницями білків T3SS (наприклад, HrpY) при включенні злитих під час трансляції блокуючих канал поліпептидів або деформуючих структур білка T3SS (наприклад, α-спіралей HrpY), які перешкоджають секреції бактеріальних ефекторів з бактерій в рослинні клітини. Рослинні сигнали секреції, додані до цього, забезпечують експресію домінантних негативних білків в рослинних клітинах, секрецію з рослинних клітин і 5 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 доступність домінантних негативних білків T3SS під час складання бактеріального пілуса в безпосередній близькості до стінки рослинної клітини. Таким чином, наприклад і як показано в розділі "Приклади", що йде далі, автори даного винаходу створили вставні блокуючі елементи каналу голки T3SS (IBE-T3SS) грамнегативних бактерій. IBE-T3SS Ralstonia solanacearum (SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10 і 12) були створені з використанням структурних модифікацій білка HrpY (SEQ ID №: 14), будівельного блочного мономера голки Rs. Винахідники створили також вектори експресії, що містять ці IBE-T3SS, для трансформації рослинних клітин. Більше того, винахідники наглядно продемонстрували трансформацію рослин томату мутантами 1, 2 і 6 білка HrpY Ralstonia solanacearum та їх експресію (дивись Фіг. 11A-C, 12A-C і 10A-C, відповідно). Додатково, винахідники припустили над-експресію модифікованих білків транслокону Rs (PopF1) в трансгенних рослинах. Над-експресія цих білків приводить до зупинки складання T3SS через взаємодії з "недозрілою" голкою і, відповідно, до його деактивації. Таким чином, модифіковані білки PopF1 вбудовуються у ворота транслокону і блокують його. Взяті разом, ідеї цього винаходу можуть слугувати могутнім інструментом в галузі сільськогосподарських трансгенних технологій для створення рослин, резистентних до бактерій. Таким чином, у відповідності до одного аспекту даного винаходу, пропонується спосіб одержання рослини з підвищеною резистентністю до бактеріального патогену порівняно з немодифікованою рослиною, який включає введення в рослину або рослинну клітину вектора експресії нуклеїнових кислот, в результаті чого одержують рослину з підвищеною резистентністю до бактеріального патогену порівняно з немодифікованою рослиною. Термін "рослина", як він тут використовується, охоплює рослини цілком, їх предків і потомство, а також частини рослини, включаючи насіння, пагони, стебла, корінці (в тому числі, бульби) і рослинні клітини, тканини і органи. Така рослина може бути в будь-якій формі, включаючи суспензійні культури, ембріони, ділянки меристеми, тканини калюсу, листя, гаметофіти, спорофіти, пилок і мікроспори. Рослини, що є особливо придатними для способів за цим винаходом, включають всі рослини, які належать до надродини Viridiplantae (Зелені рослини), зокрема однодольні і дводольні рослини, в тому числі фуражні культури і кормові бобові, декоративні рослини, сільськогосподарські культури, дерева або чагарники, вибрані з наступного списку: Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Каллусandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia vilosa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, амарант, артишок, спаржа, броколі, брюссельська капуста, капуста, канола, морква, цвітна капуста, селера, листова капуста, льон, кормова капуста, сочевиця, олійний рапс, окра, цибуля, картопля, рис, соєві боби, солома, цукровий буряк, цукрова тростина, соняшник, томат, гарбуз, чай, дерева. В якості альтернативи для способів за цим винаходом можуть бути використані водорослі та інші рослини, що не відносяться до 6 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 надродини Viridiplantae (Зелені рослини). У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, така рослина є рослиною Solanaceae (Пасльонові). У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, така рослина є рослиною Solanum (Пасльон). У відповідності до іншого конкретного варіанту здійснення рослиною Solanum є томат (Lycopersicum esculentum). У відповідності до іншого конкретного варіанту здійснення рослина включає картоплю (Solanum tuberosum); томат (Lycopersicum esculentum); баклажан (Solanum melongena); банан (Musa spp); герань (Pelargonium); імбир (Zingiber officinale); тютюн (Nicotiana tabacum); солодкий перець (Capsicum spp); маслину (Olea europea), арабідопсис, евкаліпт, яблуню, квітучу дику яблуню, грушу, піраканту, глід, кизильник, айву або горобину. Як він тут використовується, термін "бактеріальний патоген" стосується будь-якого типу вірулентного бактеріального виду або штаму, який інфікує рослину, і включає, не обмежуючись ними, Pseudomonas spp., штами, споріднені з Erwinia, Ralstonia solanacearum і Xanthomonas campestris. Такою бактерією можуть бути Pseudomonas spp., включаючи P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fluorescens, P. marginalis, Pseudomonas syringae, P. tolaasii, P. agarici і P. viridiflava. Такою бактерією можуть бути штами, споріднені з Erwinia, в тому числі Dickeya dadantii (Erwinia chrysanthemi), Erwinia carotovora, Erwinia atroseptica і Erwinia amylovora. Такою бактерією можуть бути штами, споріднені з Xanthomonas campestris, в тому числі Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) і Xanthomonas oryzae. У відповідності до одного варіанту здійснення даного винаходу, такою бактерією є грамнегативна бактерія. У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, цією грамнегативною бактерією є вид Proteobacteria. У відповідності до іншого конкретного варіанту здійснення, такою Proteobacteria є Ralstonia solanacearum. У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, грамнегативна бактерія вибирається з групи, яка складається з Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora, Erwinia Psidii, Erwinia pyrifoliae, Xanthomonas campestris і Xanthomonas oryzae. Як він тут використовується, термін "підвищена резистентність" стосується зниження вірулентності бактерії і, відповідно, зниження чутливості рослини-хазяїна у порівнянні з немодифікованою рослиною, зараженою таким самим бактеріальним патогеном. У відповідності до суті даного винаходу, зниження бактеріальної вірулентності забезпечується експресією домінантних негативних білків, які асоціюються з бактеріальною вірулентністю (наприклад, комплексу голки, як докладно буде описано далі) і можуть впливати на будь-який етап життєвого циклу бактерії, коли вона є асоційованою з хазяїном, включаючи без обмеження адгезію, інвазію, реплікацію, уникнення захисних механізмів хазяїна і передачу новому хазяїну. Підвищена резистентність до бактеріальних патогенів може проявлятись у формі ослаблених симптомів у хазяїна і, відповідно, може виявлятись шляхом моніторингу хазяїна на знижену реакцію на відповідну бактерію. Підвищена резистентність може проявлятись як ослаблення симптомів, пов'язаних з бактеріальними патогенами, щонайменше на приблизно 1 %, щонайменше на приблизно 5 %, щонайменше на приблизно 10 %, щонайменше на приблизно 20 %, щонайменше на приблизно 30 %, щонайменше на приблизно 40 %, щонайменше на приблизно 50 %, щонайменше на приблизно 60 %, щонайменше на приблизно 70 %, щонайменше на приблизно 80 %, щонайменше на приблизно 90 % або щонайменше на приблизно 100 %, що можна оцінити будь-яким аналізом, відомим спеціалістам в цій галузі, шляхом порівняння з відповідним контролем (наприклад, немодифікованою рослиною, вирощеною в таких самих умовах). Способи за цим винаходом здійснюються шляхом введення в рослину вектору експресії нуклеїнових кислот, що містить послідовність нуклеїнових кислот, кодуючу домінантний негативний білок T3SS, і діючий в цис-положенні регуляторний елемент, здатний запускати транскрипцію цієї послідовності нуклеїнових кислот в рослинній клітині, де домінантний негативний білок T3SS опосередковує складання нефункціонального комплексу голки. Термін "T3SS", як він тут використовується, стосується системи секреції III типу (яку називають також TTSS) бактерій (наприклад, грамнегативних), яка звичайно функціонує як голкоподібна структура для секреції білків безпосередньо з бактеріальної клітини. Комплекс голки T3SS звичайно бере свій початок в цитоплазмі бактерії, перетинає дві мембрани і виступає з клітини (дивись, наприклад, Фіг. 1A). Та частина, яка закріплена в мембрані, є основою (або базальним тілом) T3SS. Позаклітинна частина є голкою (її називають також 7 UA 113843 C2 5 10 пілусом). Кінцевою структурою, яка слугує "воротами" до клітини-хазяїна, є транслокон (дивись Фіг. 1B-C). Так званий внутрішній стрижень з'єднує голку з основою. Як він тут використовується, термін "білок T3SS" стосується білка, який складає комплекс секреції T3SS. Він включає структурні білки, тобто ті, з яких будуються основа, внутрішній стрижень, голка, кінцева частина або транслокон. Сама голка типово складається з великої кількості одиниць єдиного білка T3SS. Таким чином, більшість різних білків T3SS є тими, з яких складається основа, і ті, які секретуються в клітину хазяїна. У відповідності до одного варіанту здійснення даного винаходу, білок T3SS є білком, з якого складається голчаста структура T3SS, таким як HRP білок (білок реакції гіперчутливості і патогенності). Типові білки HRP включають, не обмежуючись ними, білок HrpY Ralstonia solanacearum, білок HrpA Pseudomonas syringe, білок HrpA Erwinia amylovora, білок HrpA Erwinia pyrifoliae і білок HrpE Xanthomonas campestris (типові білки дивись в Таблиці 1, далі, включеній сюди з Buttner and He, Plant Physiology (2009) 150:1656-1664). Таблиця 1. Типові білки T3SS Білок HrpA HrpK HrpA HrpK1 HrpY PopF1 PopF2 HrpExcv HrpFxcv HrpFxoo HrpA Передбачувана функція білка Білок пілуса Білок транслокона Білок пілуса Білок транслокона Білок пілуса Білок транслокона Вид бактерій Erwinia amylovora Білок пілуса Білок транслокона Xanthomonas spp. Білок пілуса Erwinia pyrifoliae Pseudomonas syringae pv tomato Ralstonia solanacearum де xcv-X. campestris pv vesicatoria, xoo – X. oryzae pv oryzae 15 20 25 30 35 40 У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, поліпептид білка HrpY Ralstonia solanacearum дикого типу відповідає SEQ ID №: 14. У відповідності до іншого варіанту здійснення, поліпептид білка HrpY Ralstonia solanacearum включає варіанти, такі як наведені в SEQ ID №№: 70-86. У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, поліпептид білка HrpA Pseudomonas syringae дикого типу відповідає SEQ ID №: 19. У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, поліпептид білка HrpA Erwinia amylovora дикого типу відповідає SEQ ID №: 88. У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, поліпептид білка HrpE Xanthomonas campestris дикого типу відповідає SEQ ID №: 90. У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, поліпептид білка HrpE Xanthomonas oryzae дикого типу відповідає SEQ ID №: 92. У відповідності до іншого варіанту здійснення, білок T3SS представляє собою білок транслокона, такий як білки транслокона PopF1 або PopF2 Ralstonia solanacearum (SEQ ID №№: 67 і 69, відповідно). У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, поліпептид білка HrpA Erwinia pyrifoliae дикого типу відповідає SEQ ID №: 100. Вираз "домінантний негативний білок T3SS", як він тут використовується, стосується білка T3SS, що має продукт структурно зміненого гену, який взаємодіє з білком T3SS дикого типу, секретованим від бактерій, але опосередковує утворення нефункціонального комплексу голки (наприклад, такого, що є нездатним або має знижену здатність порівняно з білком дикого типу проникати в клітину-хазяїна або транспортувати ефекторні білки в клітину-хазяїна). Такий бактеріальний нефункціональний комплекс голки може бути структурно деформованим (наприклад, частково або повністю блокованим або викривленим у такий спосіб, який робить його менше здатним переносити ефекторні білки в клітину-хазяїна) або може складатись 8 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 частково або не складатись взагалі. Типово домінантний негативний білок T3SS за цим винаходом знижує інфекційність і патогенність бактерій. Способи оцінки інфекційності є добре відомими в даній галузі. Таким чином, домінантний негативний білок T3SS порушує складання і функціональність комплексу голки і, відповідно, патогенність бактерій приблизно на 5 %, приблизно на 10 %, приблизно на 20 %, приблизно на 30 %, приблизно на 40 %, приблизно на 50 %, приблизно на 60 %, приблизно на 70 %, приблизно на 80 %, приблизно на 90 % або приблизно на 100 % у порівнянні з бактеріями, що мають голчасту структуру, складену з білків T3SS дикого типу. Варто зазначити, що, у відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, домінантний негативний білок експресується екзогенно в бактерію рослинною клітиною. Типово, домінантний негативний білок T3SS кодується геном, що містить одну або більше мутацій в кодуючій послідовності білка дикого типу, таких як мутація вставки, мутація делеції або мутація заміщення. Ці мутації можуть включати зміну єдиної нуклеїнової кислоти в нуклеотидній послідовності білка T3SS дикого типу (наприклад, включення бета перервної амінокислоти, такої як пролін або його синтетичний аналог), або, в інших випадках, зміни 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 25 або більше нуклеїнових кислот. Як варіант, мутація може включати вставку єдиного пептиду (довжиною 3, 4, 5, 10 амінокислот) або кількох пептидів (наприклад, пентапептидну вставку) в білок T3SS. Типові одиничні амінокислотні мутації, які можуть бути введені в пептиди за цим винаходом, включають заміщення гліцину в позиції 23 гену hrpA на аланін, заміщення аланіну в позиції 54 гену hrpA на глютамінову кислоту, заміщення лізину в позиції 93 гену hrpA на ізолейцин, заміщення аспарагінової кислоти в позиції 95 гену hrpA на серин, заміщення ізолейцину в позиції 101 гену hrpA на треонін, заміщення ізолейцину в позиції 111 гену hrpA на пролін. Типові пентапептидні вставки, які можуть вводитись в пептиди за цим винаходом, відповідають SEQ ID №№: 20-65 (дивись Таблицю 2 далі). Слід зазначити, що мутації можуть вводитись в ген T3SS в будь-якій позиції, приводячи до утворення домінантного негативного білка. Показові позиції вставок і делецій нуклеїнових кислот є показаними для гену HrpA, дивись Фіг. 8 і в Таблиці 2 далі [Taira et al., Mol Microbiol. (1999) 34(4):737-44]. Як вже згадувалось і у відповідності до конкретного варіанту здійснення, домінантний негативний білок T3SS за цим винаходом є таким, що підтримує сайти взаємодії білок-білок, що дозволяє йому зв'язуватись з високою афінністю зі спорідненим бактеріальним білком дикого типу і формувати голчасту структуру, однак внаслідок мутацій в домінантних негативних білках результуюча голчаста структура є нефункціональною. Таким чином, даний винахід припускає будь-яку мутацію в гені T3SS, яка робить голчастий комплекс нефункціональним. У відповідності до одного варіанту здійснення даного винаходу, мутація вставки включає наявність вставного блокуючого елемента (IBE). Домінантні негативні білки T3SS, що містять IBE, типово вступають у взаємодії субодиниця-субодиниця зі спорідненими білками при включенні трансляційно злитих вставних елементів, що блокують канал (наприклад, пептидів), або деформуючих структур білка T3SS (наприклад, α-спіралей HrpY), які не дозволяють бактеріальним ефекторам секретуватись з бактерій в рослинні клітини (дивись Приклад 1 в розділі "Приклади" далі). У відповідності до одного варіанту здійснення цього аспекту даного винаходу, нуклеотидна послідовність кодує пептид, який відповідає SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10 або 12. У відповідності до іншого варіанту здійснення, такі домінантно-негативні білки T3SS є здатними зупиняти складання T3SS шляхом взаємодій з недозрілою голкою (наприклад, домінантні негативні білки транслокона взаємодіють з голкою передчасно, тим самим перешкоджаючи складанню T3SS, та інактивують її (дивись Приклад 3 в розділі "Приклади" далі)). 9 UA 113843 C2 Таблиця 2. Типові пентапептидні вставки і позиції вставок і делецій нуклеїнових кислот в гені HrpA Пентапептид SEQ ID №: 20 SEQ ID №: 21 SEQ ID №: 22 SEQ ID №: 23 SEQ ID №: 24 SEQ ID №: 25 SEQ ID №: 26 SEQ ID №: 27 SEQ ID №: 28 SEQ ID №: 29 SEQ ID №: 30 SEQ ID №: 31 SEQ ID №: 32 SEQ ID №: 33 SEQ ID №: 34 SEQ ID №: 35 SEQ ID №: 36 SEQ ID №: 37 SEQ ID №: 38 SEQ ID №: 39 SEQ ID №: 40 SEQ ID №: 41 SEQ ID №: 42 SEQ ID №: 43 SEQ ID №: 44 SEQ ID №: 45 SEQ ID №: 46 SEQ ID №: 47 SEQ ID №: 48 SEQ ID №: 49 SEQ ID №: 50 SEQ ID №: 51 MRPHS GAAAI CGRIG CGRSA GAAAV CGRIG CGRSG VRPQQ GAAAQ NAAAV TAAAN MRPHS TAAAA LRPHT CGRTF VRPHL MRPQG CGRTG CGRSD VRPQS VAAAS DAAAV NAAAA CGRTS MRPHA VRPQQ CGRTQ CGRKE NAAAM DAAAM AAAAN VRPHQ 10 Позиція вставки 8 9 19 39 49 52 58 59 61 70 72 86 91 122 138 139 148 153 163 166 176 177 183 186 197 204 206 226 227 230 235 238 248 249 252 264 271 308 314 319 322 330 345 357 365 UA 113843 C2 SEQ ID №: 52 SEQ ID №: 53 SEQ ID №: 54 SEQ ID №: 55 SEQ ID №: 56 SEQ ID №: 57 SEQ ID №: 58 SEQ ID №: 59 SEQ ID №: 60 SEQ ID №: 61 SEQ ID №: 62 SEQ ID №: 63 SEQ ID №: 64 SEQ ID №: 65 5 10 15 20 25 30 AAAAG MRPHS TAAAS CGRTN AAAAT AAAAT CGRTA AAAAT MRPQT AAAAN CGRNA CGRIS YAAAS CGRSY 369 383 384 388 405 408 409 411 413 417 418 430 432 433 451 453 455 461 464 479 493 Позиції делецій 138-177 138-204 137-249 138-264 Послідовності нуклеїнових кислот, у відповідності до цього аспекту даного винаходу, можуть бути комплементарними полінуклеотидними послідовностями (кДНК), геномними полінуклеотидними послідовностями та/або змішаними полінуклеотидними послідовностями (наприклад, комбінацією представлених вище). Як він тут використовується, вираз "комплементарна полінуклеотидна послідовність" стосується послідовності, що є результатом зворотної транскрипції інформаційної РНК з використанням зворотної транскриптази або будь-якої іншої, залежної від РНК ДНК-полімерази. Така послідовність може бути згодом ампліфікована in vivo або in vitro з використанням залежної від ДНК ДНК-полімерази. Як він тут використовується, вираз "геномна полінуклеотидна послідовність" стосується послідовності, одержаної (виділеної) з хромосоми, так що вона представляє собою суміжну частину хромосоми. Як він тут використовується, вираз "змішана полінуклеотидна послідовність" стосується послідовності, яка щонайменше частково є комплементарною і щонайменше частково геномною. Змішана послідовність може включати певні екзональні послідовності, необхідні для кодування поліпептиду за цим винаходом, а також вставлені між ними певні інтронні послідовності. Ці інтронні послідовності можуть бути з будь-якого джерела, включаючи інші гени, і типово будуть включати збережені послідовності сигналів сплайсингу. Такі інтронні послідовності можуть додатково включати діючі в цис-положенні регуляторні елементи експресії, що докладніше буде описано далі. У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, послідовність нуклеїнових кислот містить вставку, таку як наведена в SEQ ID №№: 1, 3, 5, 7, 9 і 11. Конструкції, використовувані в способах за цим винаходом, можуть створюватись із застосуванням технології рекомбінантної ДНК, широко відомої спеціалістам в цій галузі. Генні конструкції можуть бути вставленими у вектори, які можуть бути комерційно доступними, придатні для трансформації в рослинах і придатні для експресії гену, що становить інтерес, в трансформованих клітинах. Генетична конструкція може бути вектором експресії, в якому гетерологічна нуклеотидна послідовність є функціонально зв'язаною з діючим в цис-положенні регуляторним елементом, який забезпечує експресію в рослинних клітинах. 11 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 Як він тут використовується, вираз "діючий в цис-положенні регуляторний елемент" стосується полінуклеотидної послідовності, переважно промотору, який зв'язує діючий в трансположенні регулятор і регулює транскрипцію кодуючої послідовності, розміщеної далі по ходу транскрипції. Як він тут використовується, вираз "функціонально зв'язаний" стосується такого функціонального позиціонування цис-регуляторного елемента (наприклад, промотору), щоб забезпечувалась регуляція експресії вибраної нуклеотидної послідовності. Наприклад, промоторна послідовність може розміщуватись вище вибраної нуклеотидної послідовності по відношенню до напрямку транскрипції і трансляції. Переважно, промотором в конструкції нуклеїнової кислоти за цим винаходом є рослинний промотор, який слугує для спрямовування експресії молекули гетерологічної нуклеїнової кислоти в рослинних клітинах. Слід зазначити, що нові послідовності нуклеїнових кислот, кодуючі вставні елементи, такі як наведені в SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10 або 12, пропонуються самі по собі або як частина вектору експресії нуклеїнової кислоти для експресії в бактеріях або рослинних клітинах. Як він тут використовується, термін "рослинний промотор" стосується промоторної послідовності, включаючи будь-які додаткові регуляторні елементи, додані до неї або уже включені до неї, здатної викликати, надавати, активувати або посилювати експресію в рослинній клітині, тканині або органі, переважно в клітині, тканині або органі однодольної або дводольної рослини. Такий промотор може мати рослинне, бактеріальне, вірусне, грибкове або тваринне походження. Такий промотор може бути конститутивним, тобто здатним підтримувати високий рівень експресії генів в багатьох рослинних тканинах, специфічним до тканини, тобто здатним підтримувати експресію генів в конкретній рослинній тканині або тканинах, індуцибельним, тобто здатним підтримувати експресію генів під впливом стимулу, або химерним, тобто утвореним з частин щонайменше двох різних промоторів. Прикладами конститутивних промоторів є промотори CaMV35S і CaMV19S, промотор FMV34S, промотор паличкоподібного баднавірусу цукрової тростини, промотор CsVMV, актиновий промотор ACT2/ACT8 Arabidopsis, убіквітиновий промотор UBQ1 Arabidopsis, тіоніновий промотор BTH6 з листя ячменю і актиновий промотор рису. У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, промотором є конститутивний промотор, такий як CaMV 35S. Інші типові промотори, придатні для способів за певними варіантами цього винаходу, є представленими в Таблицях 3, 4, 5 і 6. Таблиця 3 Типові конститутивні промотори для застосування при здійсненні певних варіантів цього винаходу Джерело McElroy et al, Plant Cell, 2: 163171, 1990 Odell et al, Nature, 313: 810-812, 1985 Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456-462, 1997 de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992 Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992 Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994 Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992 An et al, Plant J. 10(1);107-121, 1996 Вид експресії конститутивний Генне джерело актин конститутивний CAMV 35S конститутивний CaMV 19S конститутивний GOS2 конститутивний убіквітин конститутивний циклофілін рису конститутивний гістон H3 маїсу конститутивний актин 2 35 12 UA 113843 C2 Таблиця 4 Типові промотори для переважної експресії в насінні для застосування при здійсненні певних варіантів цього винаходу Джерело Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990. Pearson' et al., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992. Ellis, et al.Plant Mol. Biol. 10: 203214, 1988 Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987 Matzke et al Plant Mol Biol, 143).323-32 1990 Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996 Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2, Albanietal, Plant Cell, 9: 171-184, 1997 EMBO3:1409-15, 1984 Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996 Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998 EP99106056.7 Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998 Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998 Wu et al, Plant Cell Physiology 398) 885-889, 1998 Sato et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122 Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997 Вид експресії Генне джерело насіння специфічні для насіння гени насіння альбумін бразильського горіха насіння легумін насіння глютелін (рису) насіння зеїн насіння napA ендосперма LMW і HMW пшениці, глютенін1 насіння SPA пшениці ендосперма ендосперма гліадини a, b і g пшениці ltrl промотор ячменю ендосперма хордеїн B1, C, D ячменю ендосперма DOF ячменю ендосперма Biz2 ендосперма синтетичний промотор ендосперма проламін рису NRP33 ендосперма глобулін Glb-1 рису зародок OSH1 рису Trans Res 6:157-68, 1997 ендосперма Plant J 12:235-46, 1997 PMB 32:1029-35, 1996 Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999 Wu et al, J. Biochem., 123:386, 1998 Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992 ендосперма ендосперма альфа-глобулін рису REB/OHP1 АДФ-глюкоза пірофосфатаза рису родина генів ESR маїсу гамма-кафірин сорго зародок KNOX зародок і алейрон олеозин рису насіння (зародок і суха частина насіння) олеозин соняшника ендосперма 13 UA 113843 C2 Таблиця 5 Типові специфічні для квітів промотори для застосування при здійсненні певних варіантів цього винаходу Вид експресії квіти Джерело www.salus.medium.edu/m mg/tierney/html Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95109, 1990. Twell et al. Mol. Gen Genet. 217:240-245 (1989) Генне джерело AtPRP4 халкон-синтаза (chsA) квіти пиляки LAT52 квіти apetala-3 Таблиця 6 Альтернативні промотори рису для застосування в здійсненні даного винаходу Експресія Ген шар перенесення клітин зародку + калюс шар перенесення клітин зародку слабка в корінцях насіння слабка в молодих квітах молоді тканини + калюс зародок + сильна в ендоспермі сильна в ендоспермі сильна в ендоспермі шар перенесення клітин зародку + калюс пагін сильна в ендоспермі сильна в ендоспермі сильна в ендоспермі зародок слабка дискримінація центр/ меристема пагону дуже слабка, специфічна в PRO # PR00001 металотієнін Mte припустимо бета-амілаза припустимо целюлоза синтаза ліпаза (припустимо) трансфераза (припустимо) пептидил проліл цис-транс (припустимо) невідомий білок prp (припустимо) нодулін (припустимо) інгібітор протеїнази Rgpi9 бета експансин EXPB9 структурний білок ізомераза PR00005 PR00009 PR00012 PR00014 PR00016 PR00019 PR00020 PR00029 PR00058 PR00061 PR00063 ксилозидаза (припустимо) проламін 10 кДа алерген RA2 проламін RP7 CBP80 фермент розгалуження крохмалю I металотіонеїн-подібний білок ML2 PR00069 PR00075 PR00076 PR00077 PR00078 PR00079 PR00080 припустимо каффеоїл-CoA 3-0 метилтрансфераза проламін RM9 проламін RP6 проламін RP5 алерген RA5 припустимо метионін амінопептидаза ras-подібний ГТФ-зв'язуючий білок бета експансин EXPB1 багатий на гліцин білок металотіонеїн-подібний білок (припустимо) ген RCc3 strong root uclacyanin 3-подібний білок PR00081 не АТФазна субодиниця 11 регуляторної PR00116 14 PR00087 PR00090 PR00091 PR00092 PR00095 PR00098 PR00104 PR00105 PR00108 PR00110 PR00111 UA 113843 C2 меристемі слабка в ендоспермі дуже слабка в пагоні сильна в листі сильна дискримінація центр / меристема пагону сильна конститутивна дуже слабка, специфічна меристемі сильна в ендоспермі сильна в ендоспермі алейрон + зародок не виявлена 5 PR00123 PR00126 в PR00129 PR00131 PR00133 в альфа-глобулін аланін амінотрансфераза Циклін A2 Циклін D2 Циклін D3 циклофилін 2 сахароза синтаза SS1 (ячмінь) інгібітор трипсину ITR1 (ячмінь) убіквітин 2 з інтроном WSI18 гомолог HVA22 (припустимо) EL2 аквапорин PR00135 PR00136 PR00138 PR00139 PR00140 PR00141 PR00146 PR00147 PR00149 PR00151 PR00156 PR00157 PR00169 група білков з високою рухливістю зворотно глікозильований білок RGP1 цитозольний MDH RAB21 CDPK7 Cdc2-1 сахароза синтаза 3 OsVP1 OSH1 PR00170 PR00171 PR00173 PR00175 PR00176 PR00177 PR00197 PRO0198 PRO0200 припустимо хлорофілаза OsNRT1 EXP3 транспортер фосфату OjPT1 олеозин 18 кДа убіквітин 2 без інтрону RFL дельта інтрон UBI маїсу глютелін-1 фрагмент промотору проламіну RP6 4xABRE глютелін OSGLUA3 BLZ-2_коротка форма (ячмінь) BLZ-2_довга форма (ячмінь) PRO0208 PRO0210 PRO0211 PRO0216 PRO0218 PRO0219 PRO0220 PRO0221 PRO0223 PRO0224 PRO0225 PRO0226 PRO0227 PR00228 дуже слабка в меристемі дуже слабка в молодих рослин PR00117 PR00122 GOS2 GOS9 хітиназа Cht-3 пагін і насіння помірна конститутивна слабка в ендоспермі сильна конститутивна зародок і стрес помірна конститутивна молодих рослинах сильна конститутивна слабка конститутивна пагін зародок і стрес частки 26S протеасоми припустимо 40S рибосомальний білок попередник хлорофіл a/b- зв'язуючого білка (Cab27) припустимо протохлорофилід редуктаза металотіонеїн RiCMT меристемі Конструкція нуклеїнової кислоти за цим винаходом може включати також додаткову послідовність нуклеїнових кислот, кодуючу сигнальний пептид ендоплазматичного ретикулуму, що дозволяє транспортувати домінантний негативний пропептид T3SS в ендоплазматичний ретикулум і далі по секреторному шляху. Такий сигнальний пептид є типово зв'язаним в каркасі аміно-кінця поліпептиду (тобто, розміщується до поліпептиду) і спрямовує закодований поліпептид в секреторний шлях клітини і його кінцеву секрецію з неї (наприклад, в апопласт). Типові сигнальні послідовності для секреції, які спрямовують поліпептиди через ЕР в позаклітинний простір, включають рослинний лідерний секреторний пептид від 15 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 sp|Q56YT0|LAC3_At лаккази (SEQ ID №: 16) і рослинний лідерний секреторний пептид від tr|Q6TDS6|Q6TDS6_GOSAR (SEQ ID №: 17). Додаткові типові сигнальні пептиди, які можуть бути використані за цим винаходом, включають сигнальну послідовність спорідненого білка патогенезу тютюну (PR-S) (Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8:217-221), сигнальну послідовність лектину (Boehn et al., 2000, Transgenic Res, 9(6):477-86), сигнальну послідовність з багатого на гідроксипролін глікопротеїну від Phaseolus vulgaris (Yan et al., 1997, Plant Physiol. 115(3):915-24 і Corbin et al., 1987, Mol Cell Biol 7(12):4337-44), сигнальну послідовність пататину картоплі (Iturriaga, G et al., 1989, Plant Cell 1:381-390 и Bevan et al., 1986, Nuc. Acids Res. 41:4625-4638) і сигнальну послідовність альфаамілази ячменю (Rasmussen and Johansson, 1992, Plant Mol. Biol. 18(2):423-7). У відповідності до одного варіанту здійснення цього винаходу, конструкція нуклеїнової кислоти за цим винаходом може додатково включати енхансер трансляції, такий як енхансер трансляції омега. Послідовності нуклеїнових кислот поліпептидів в певних варіантах здійснення цього винаходу можуть бути оптимізованими для експресії в рослинах. Приклади таких модифікацій послідовностей включають, не обмежуючись ними, змінений контент G/C, більше наближений до того, який типово трапляється у видів рослин, що становлять інтерес, а також видалення кодонів, які нетипово трапляються у видів рослин, що звичайно називаються оптимізацією кодонів. Термін "оптимізація кодонів" стосується вибору відповідних нуклеотидів ДНК для використання в структурному гені або його фрагменті, який наближається до частоти зустрічальності кодонів в рослині, що становить інтерес. Відповідно, термін оптимізований ген або послідовність нуклеїнових кислот стосується гену, в якому нуклеотидну послідовність нативного або природного гену було модифіковано для того, щоб використати статистичнопреференційні або статистично-сприятливі кодони в даній рослині. Нуклеотидну послідовність типово досліджують на рівні ДНК, а кодуючу ділянку оптимізують для експресії у виді рослин, визначеному за допомогою будь-якої доцільної методики, наприклад такої, як описано у Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). У відповідності до цієї методики, стандартне відхилення частоти використання кодонів, міра ухилу частоти використання кодонів, може обчислюватись наступним чином. Спочатку визначають квадратичне пропорційне відхилення частоти використання кожного кодону нативного гену по відношенню до цього показника для рослинних генів з високою експресією, а потім обчислюють середнє квадратичне відхилення. Використовувана формула має такий вигляд: 1 SDCU=n = 1 N [ (Xn-Yn) / Yn] 2 / N, де Xn – це частота використання кодону n в рослинних генах з високою експресією, Yn – частота використання кодону n в гені, що становить інтерес, N – загальна кількість кодонів в гені, що становить інтерес. Таблицю частоти використання кодонів від генів з високою експресією дводольних рослин було складено з використанням даних Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498). Інший спосіб оптимізації послідовності нуклеїнових кислот у відповідності до преференційної частоти використання кодонів для конкретного типу рослинних клітин базується на безпосередньому використанні, без здійснення будь-яких додаткових статистичних обчислень, таблиць для оптимізації кодонів, таких як доступні он-лайн таблиці в базі даних Codon Usage Database банку ДНК-послідовностей NIAS (Національний інститут агробіологічних наук), Японія (www.kazusa.or.jp/codon/). База даних щодо частоти використання кодонів містить таблиці використання кодонів для низки різних видів, причому всі ці таблиці були статистично вивірені на основі даних, представлених в Genbank. Застосовуючи вказані таблиці для визначення найбільш преференційних або найбільш сприятливих кодонів для кожної амінокислоти у конкретного виду (наприклад, рису), можна оптимізувати кодони природної нуклеотидної послідовності, кодуючої білок, що становить інтерес, для цього конкретного виду рослин. Це досягається шляхом заміни кодонів, які статистично рідко трапляються в геномі даного конкретного виду, відповідними кодонами, у відношенні амінокислоти, які є статистично більше поширеними. Тим не менше, один або більше менш преференційних кодонів можуть бути вибрані для видалення існуючих сайтів рестрикції, створення нових сайтів в потенційно корисних з'єднаннях (на 5’- і 3’-кінцях, щоб додати сигнальний пептид або касети термінації, внутрішні сайти, які могли б використовуватись для розрізання і з'єднання фрагментів докупи для одержання правильної послідовності повної довжини) або для ліквідації нуклеотидних послідовностей, які можуть негативно впливати на стабільність або експресію мРНК. Природна кодуюча нуклеотидна послідовність може сама по собі, до всякої модифікації, містити низку кодонів, які відповідають статистично преференційному кодону в рослинах 16 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 конкретного виду. Таким чином, оптимізація кодонів нативної нуклеотидної послідовності може включати визначення того, які кодони в межах цієї нативної нуклеотидної послідовності не являються статистично преференційними по відношенню до конкретної рослини, і зміну таких кодонів у відповідності до таблиці частоти використання кодонів для цієї конкретної рослини для створення похідного з оптимізованим набором кодонів. Модифікована нуклеотидна послідовність може бути повністю або частково оптимізованою у відношенні частоти використання кодонів в рослині за умови, що білок, кодований цією модифікованою нуклеотидною послідовністю, продукується на рівні, вищому ніж білок, кодований відповідним природним або нативним геном. Створення синтетичних генів шляхом зміни частоти використання кодонів є описаним, наприклад, в патентній заявці PCT 93/07278. Отже, певні варіанти здійснення даного винаходу охоплюють вищеописані послідовності нуклеїнових кислот, їх фрагменти, послідовності, гібридизовані з ними, гомологічні їм послідовності, ортологічні їм послідовності, послідовності, кодуючі подібні поліпептиди з іншою частотою використання кодонів, змінені послідовності, що характеризуються мутаціями, такими як делеції, вставки або заміщення одного або більше нуклеотидів, природних або індукованих людиною, в тому числі випадковими або спрямованими. Рослинні клітини можуть трансформуватись стабільно або тимчасово конструкціями нуклеїнових кислот за певними варіантами здійснення цього винаходу. В разі стабільної трансформації молекула нуклеїнової кислоти за певними варіантами здійснення цього винаходу інтегрується в рослинний геном і, як така, представляє собою стабільну і наслідувану ознаку. В разі тимчасової трансформації молекула нуклеїнової кислоти експресується клітиною, трансформованою але не інтегрованою в геном, і, як така, представляє собою тимчасову ознаку. Існують різні методи введення чужорідних генів в однодольні і дводольні рослини (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276). Основні методи здійснення стабільної інтеграції екзогенної ДНК в рослинну геномну ДНК включають два основних підходи: (i) Перенесення гену, опосередковане Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rogers в Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, ред. Schell, J., и Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) с. 2-25; Gatenby, в Plant Biotechnology, ред. Kung, S. і Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) с. 93-112. (ii) пряме поглинання ДНК: Paszkowski et al., в Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes ред. Schell, J., и Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) с. 52-68; включаючи методи прямого введення ДНК в протопласти, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. ДНК вводиться з використанням піддавання рослинних клітин короткому електричному шоку: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Введення ДНК в рослинні клітини за допомогою бомбардування часточками, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; з використанням систем мікропіпеток: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; трансформація клітинних культур, ембріонів або калюсної тканини за допомогою скляних волокон или ниткоподібних кристалів з карбіду кремнію (патент США № 5,464,765) або з використанням прямої інкубації ДНК з пилком, що проростає, DeWet et al. в Experimental Manipulation of Ovule Tissue, ред. Chapman, G. P. і Mantell, S. H. і Daniels, W. Longman, London, (1985) с. 197-209; і Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715719. Системи Agrobacterium включають використання плазмідних векторів, які містять визначені сегменти ДНК, що інтегруються в рослинну геномну ДНК. Методи щеплення з рослинними тканинами варіюють в залежності від виду рослини і системи доставки Agrobacterium. Широко використовуваним підходом є метод листкових дисків, який може бути застосований до будьякого тканинного експлантату, що є хорошим джерелом для початку диференціації цілої рослини (Horsch et al. в Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) с. 1-9). Додатковий підхід використовує систему доставки Agrobacterium в комбінації з вакуумною інфільтрацією. Система Agrobacterium є особливо доцільною для створення трансгенних дводольних рослин. Існують різні методи прямого перенесення ДНК в рослинні клітини. При електропорації протопласти на короткий час піддають дії сильного електричного поля. При мікроін'єкції ДНК механічно вводять безпосередньо в клітини за допомогою дуже тонких мікропіпеток. При 17 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бомбардуванні мікрочасточками ДНК адсорбується на дрібних часточках, наприклад на кристалах сульфату магнію або часточках вольфраму, і ці фізично прискорені мікрочасточки попадають в клітини або тканини рослини. Після стабільної трансформації рослини слідує етап розмноження. Найпоширенішим методом розмноження рослин є розмноження насінням. Поновлення шляхом насіннєвого розмноження, однак, має той недолік, що через гетерозиготність спостерігається відсутність стабільності в потомстві, оскільки насіння продукується рослинами з генетичною мінливістю, яка визначається правилами Менделя. В основному, кожна насінина є генетично відмінною і кожна буде рости зі своїми власними специфічними ознаками. Відповідно, краще, коли трансформована рослина одержується такою, щоб регенерована рослина мала ідентичні ознаки і характеристики материнської трансгенної рослини. Отже, краще, щоб трансформована рослина регенерувалась шляхом мікророзмноження, яке забезпечує швидку і стійку репродукцію трансформованих рослин. Мікророзмноження – це процес вирощування нового покоління рослин з єдиного кусочка тканини, взятого з вибраної материнської рослини або рослини потрібного сорту. Цей процес забезпечує масову репродукцію рослин, які мають преференційну тканину, що експресує злитий білок. Рослини нового покоління, що одержуються, є генетично ідентичними оригінальній (вихідній) рослині і мають всі її характеристики. Мікророзмноження забезпечує масову продукцію якісного рослинного матеріалу за короткий період часу і пропонує швидку мультиплікацію вибраних сортів при збереженні характеристик оригінальної трансгенної або трансформованої рослини. Перевагами клонування рослин є швидкість розмноження, а також якість і стабільність одержаних рослин. Мікророзмноження представляє собою багатостадійний процес, який вимагає зміну культурального середовища або умов росту між стадіями. Так, процес мікророзмноження включає чотири основні стадії: стадія перша - початкове культивування тканини; стадія друга примноження тканинної культури; стадія третя - диференціація і формування рослини; і стадія четверта - тепличне культивування і загартовування. Під час першої стадії початкового культивування тканини тканинна культура встановлюється і сертифікується відсутність контамінації. Під час другої стадії початкову тканинну культуру примножують до одержання достатньої кількості зразків тканини для цілей виробництва. Під час третьої стадії зразки тканини, вирощені на другій стадії, ділять і вирощують як окремі проростки. На четвертій стадії трансформовані проростки переносять в теплицю для загартовування, де стійкість рослин до дії світла поступово підвищується так, щоб вони могли рости в природному середовищі. Хоча в теперішній час перевагу віддають стабільній трансформації, тимчасова трансформація клітин листка, клітин меристеми або цілої рослини також може передбачатись певними варіантами здійснення цього винаходу. Тимчасова трансформація може здійснюватись будь-яким з вищеописаних методів прямого перенесення ДНК або за допомогою вірусної інфекції з використанням модифікованих рослинних вірусів. Показано, що придатні для трансформації рослин-хазяїв віруси включають CaMV, TMV і BV. Трансформація рослин з використанням рослинних вірусів є описаною в патенті США № 4,855,237 (BGV), EP-A 67,553 (TMV), опублікованій заявці Японії № 63-14693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667 (BV); та в публікації Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, рр. 172-189 (1988). Використання часток псевдовірусу для експресії чужорідної ДНК в багатьох хазяях, включаючи рослини, є описаним в WO 87/06261. Використання вірусів рослинної РНК для введення і експресії невірусних екзогенних нуклеотидних послідовностей в рослинах є продемонстрованим в наведених вище джерелах, а також в публікаціях Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; і Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76. Коли вірус є ДНК-вірусом, потрібні модифікації можуть вноситись в самий вірус. Як варіант, вірус можна спочатку клонувати в бактеріальну плазміду для легкості конструювання бажаного вірусного вектору з чужорідною ДНК. Потім можна виділити вірус з плазміди. Коли вірус є ДНКвірусом, бактеріальну точку початку реплікації можна приєднати до вірусної ДНК, після чого вона зможе реплікуватись в бактеріях. Транскрипція і трансляція даної ДНК будуть забезпечувати синтез білка оболонки, який, в свою чергу, буде поміщати в капсид вірусну ДНК. Коли вірус є РНК-вірусом, то такий вірус загалом клонується як кДНК і вводиться в плазміду. Цю плазміду потім використовують для одержання всіх конструкцій. Потім шляхом транскрибування вірусної послідовності плазміди і трансляції вірусних генів продукують РНК-вірус, щоб одержати 18 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білок (білки) оболонки, який поміщає в капсид цю вірусну РНК. Конструювання РНК-вірусів рослин для введення і експресії в рослинах невірусних екзогенних нуклеотидних послідовностей, таких як ті, що включені в конструкцію в певних варіантах здійснення цього винаходу, є продемонстрованим вищенаведеними джерелами, а також в патенті США № 5,316,931. В одному варіанті здійснення пропонується рослинна вірусна нуклеїнова кислота, в якій нативну кодуючу послідовність білка оболонки було замінено на ненативну кодуючу послідовність рослинного вірусного білка оболонки і ненативний промотор, переважно субгеномний промотор ненативної кодуючої послідовності білка оболонки, здатний експресуватись в рослині-хазяїні для забезпечення упаковки рекомбінантних вірусних часток в рослині-хазяїні і підтримання системної інфекції в хазяїні цією рекомбінантної рослинною вірусною нуклеїновою кислотою. Як варіант, ген білка оболонки можна інактивувати вставкою в нього ненативної нуклеотидної послідовності, так щоб продукувався білок. Рекомбінантна рослинна вірусна нуклеїнова кислота може містити один або більше додаткових субгеномних промоторів. Всі ненативні субгеномні промотори є здатними забезпечувати транскрипцію і експресію суміжних генів або нуклеотидних послідовностей в рослині-хазяїні, але не здатні до рекомбінації один з одним і з нативними субгеномними промоторами. Ненативні (чужорідні) нуклеотидні послідовності можуть вводитись суміжно з нативним рослинним вірусним субгеномним промотором або суміжно з нативними і ненативними рослинними вірусними субгеномними промоторами, коли вводиться більше ніж одна нуклеотидна послідовність. Ненативні нуклеотидні послідовності транскрибуються або експресуються в рослині-хазяїні під контролем субгеномного промотору з утворенням бажаних продуктів. В другому варіанті здійснення пропонується рекомбінантна рослинна вірусна нуклеїнова кислота така ж, як в першому варіанті, за виключенням того, що нативну кодуючу послідовність білка оболонки розміщують суміжно з одним з ненативних субгеномних промоторів білка оболонки, замість ненативної кодуючої послідовності білка оболонки. В третьому варіанті здійснення пропонується рекомбінантна рослинна вірусна нуклеїнова кислота, в якій нативний ген білка оболонки є розміщеним суміжно з його субгеномним промотором і в яку були вставлені один або більше ненативних субгеномних промоторів. Ці вставлені ненативні субгеномні промотори є здатними викликати транскрипцію і експресію суміжних генів в рослині-хазяїні, але не здатні до рекомбінації один з одним, а також з нативними субгеномними промоторами. Ненативні нуклеотидні послідовності можуть вставлятись суміжно з ненативними субгеномними рослинними вірусними промоторами, так що вказані послідовності транскрибуються або експресуються в рослині-хазяїні під контролем субгеномних промоторів з утворенням бажаного продукту. В четвертому варіанті здійснення пропонується така ж рекомбінантна рослинна вірусна нуклеїнова кислота, як в третьому варіанті, за виключенням того, що нативну кодуючу послідовність білка оболонки замінено на ненативну кодуючу послідовність білка оболонки. Вірусні вектори є поміщеними в капсид білками оболонки, кодованими рекомбінантною рослинною вірусною нуклеїновою кислотою з утворенням рекомбінантного рослинного вірусу. Рекомбінантна рослинна вірусна нуклеїнова кислота або рекомбінантний рослинний вірус використовуються для зараження відповідних рослин-хазяїв. Рекомбінантна рослинна вірусна нуклеїнова кислота є здатною до реплікації в хазяїні, системного розповсюдження в хазяїні, транскрипції або експресії чужорідних генів (виділених нуклеїнових кислот) в хазяїні з продукцією бажаного білка. На додачу до вищеописаного, молекула нуклеїнової кислоти в певних варіантах здійснення цього винаходу може також бути введеною в геном хлоропласта, забезпечуючи експресію в хлоропласті. Методика введення екзогенних нуклеотидних послідовностей в геном хлоропласта є відомою. Ця методика включає наступні процедури. По-перше, рослинні клітини обробляються хімічними реагентами для зменшення кількості хлоропластів на клітину до приблизно одного. Потім екзогенну нуклеїнову кислоту вводять в клітини за допомогою бомбардування мікрочастками з метою введення в хлоропласти принаймні однієї молекули екзогенної нуклеїнової кислоти. Цю екзогенну нуклеїнову кислоту вибирають так, щоб вона могла інтегруватись в геном хлоропласта шляхом гомологічної рекомбінації, яка легко здійснюється ферментами, наявними в хлоропластах. З цією метою екзогенна нуклеїнова кислота має включати, крім гену, що становить інтерес, щонайменше один фрагмент нуклеїнової кислоти, одержаний з геному даного хлоропласта. Крім того, екзогенна нуклеїнова кислота має включати селективний маркер, який в послідовних процедурах відбору слугує для того, щоб переконатись, що всі або суттєво всі копії хлоропластних геномів після такого відбору 19 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 включають цю екзогенну нуклеїнову кислоту. Більш докладно ця методика є описаною в патентах США №№ 4,945,050 і 5,693,507, які включені в даний документ за посиланням. Отже, поліпептид може бути синтезований за допомогою системи експресії хлоропласта і інтегруватись у внутрішню мембрану хлоропласта. У відповідності до одного додаткового аспекту цього винаходу, пропонується клітина-хазяїн, яка містить вектор експресії нуклеїнової кислоти за цим винаходом. "Клітина-хазяїн" за цим винаходом стосується нової індивідуальної клітини, одержаної в результаті введення в клітину вектору експресії нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, кодуючу домінантний негативний білок T3SS. У відповідності до конкретного варіанту здійснення, клітина-хазяїн представляє собою рослинну клітину. Клітина-хазяїн може містити конструкцію нуклеїнової кислоти у вигляді молекули з позахромосомною (епісомною) реплікацією або, як варіант, може включати химерний ген, інтегрований в ядерний або пластидний геном клітини-хазяїна. У відповідності до подальшого аспекту цього винаходу, пропонується генетично модифікована рослина, що містить вектор експресії нуклеїнової кислоти за цим винаходом. У відповідності до подальшого аспекту цього винаходу, пропонується генетично модифікована рослина, що експресує екзогенний полінуклеотид, кодуючий домінантний негативний білок T3SS, як його наведено в SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10 або 12. У відповідності до одного конкретного варіанту здійснення, генетично модифікована рослина, що експресує домінантний негативний білок T3SS, володіє підвищеною резистентністю до бактеріального патогену у порівнянні з немодифікованою рослиною (як описувалось тут раніше). Слід зауважити, що, коли йдеться про генетично модифіковану рослину або рослинну клітину, автори цього винаходу мають на увазі також потомство, одержане від них. Потомство, одержане при схрещуванні або трансформації рослин, може відбиратись за наявністю екзогенної мРНК та/або поліпептидів за допомогою зондів для нуклеїнової кислоти або білкових зондів (тобто, антитіл). Як варіант, в експресії домінантних негативних білків T3SS за цим винаходом можна переконатись шляхом оцінки підвищеної резистентності до бактеріальних патогенів, заражаючи генетично модифіковану рослину і рослину дикого типу (тобто, немодифіковану рослину того ж типу) і порівнюючи перебіг захворювання у цих рослин (наприклад, спостерігаючи за зів'яненням рослин). Даний винахід пропонує також способи оцінки резистентності рослини до бактеріального патогену. Такий спосіб включає: а) експресію в рослині екзогенної нуклеотидної послідовності, кодуючої домінантний негативний білок T3SS, і діючий в цис-положенні регуляторний елемент, здатний запускати транскрипцію цієї нуклеотидної послідовності в рослинній клітині; б) піддавання рослини дії бактеріального патогену; і в) порівняння перебігу захворювання в цій рослині з рослиною дикого типу, вирощеною і зараженою бактеріальним патогеном в таких самих умовах. Бактеріальні патогени, як їх тут описано, можуть викликати широке коло захворювань у рослин. Так, наприклад, R. solanacearum може спричинювати до зів'янення, P. agarici може зумовлювати слабкі гіменіальні пластинки (наприклад, в печерицях двоспорових грибах), P. tolaasii може призводити до бактеріальної плямистості (наприклад, в грибах, що культивуються), X. Campestris обумовлює появу чорної гнилизни (наприклад, у хрестоцвітих, таких як капуста і арабідопсис), X. oryzae може викликати бактеріальне скручування (наприклад, в рисі), E. amylovora може приводити до бактеріального опіку (наприклад, яблук і груш), E. carotovora може спричинювати до появи бактеріальної м'якої гнилизни. Так, наприклад, при зів'яненні симптоми типово оцінюються на щоденній основі впродовж 24 тижнів оцінювачем (від якого вид обробки є прихованим) з використанням шкали захворюваності від 0 до 4 балів, де 0 означає відсутність хвороби, 1 означає зів'янення від 1 % до 25 % листків, 2 означає зів'янення від 25 % до 50 % листків, 3 означає зів'янення від 51 % до 75 % листків і 4 означає зів'янення від 76 % до 100 % листків. Як він тут використовується, термін "приблизно" означає  10 %. 55 Терміни "включає", "такий, що включає", "містить", "такий, що містить", "має" і слова, споріднені з ними значенням, означают "включає якийсь елемент, але може включати також інші елементи". Термін "складається з" означає "включає тільки перелічені елементи". Термін "складається суттєво з" означає, що композиція, спосіб або структура можуть 20 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включати додаткові елементи, стадії та/або частини, але тільки тоді, коли ці додаткові елементи, стадії та/або частини не мають суттєвого впливу на основні і нові характеристики заявленої композиці, способу або структури. При використанні однини припускається також використання множини за виключенням випадків, коли з контексту з очевидністю випливає інше. Наприклад, термін "сполука" або "щонайменше, одна сполука" може означати множину сполук, включаючи їх суміші одна з одною. В цій заявці різні варіанти здійснення винаходу можуть бути представлені у форматі діапазону. Слід розуміти, що опис у форматі діапазону є використаним тільки для зручності і стислості, і це не потрібно сприймати як жорстке обмеження об'єму даного винаходу. Відповідно, подання у вигляді діапазону має розглядатись як таке, що включає всі можливі піддіапазони, а також всі окремі чисельні значення всередині діапазону. Наприклад, опис діапазону, такий як від 1 до 6, має вважатись таким, що включає піддіапазони, такі як від 1 до 3, від 1 до 4, від 1 до 5, від 2 до 4, від 2 до 6, від 3 до 6 і т.д., а також окремі числа в цьому діапазоні, наприклад 1, 2, 3, 4, 5 і 6. Це застосовується незалежно від ширини діапазону. Коли б в даному документі не вказувався числовий діапазон, мається на увазі, що він включає будь-яке наведене число (дробове або ціле) в межах вказаного діапазону. Вирази "в межах/в діапазоні між" першим вказаним числом і другим вказаним числом і "починаючи з/від" першого вказаного числа "до" другого вказаного числа використовуються в даному документі взаємозамінно і включають перше і друге вказані числа, а також всі дробові і цілі значення між ними. Як він тут використовується, термін "спосіб" стосується методів, засобів, методик і процедур для виконання даного завдання, включаючи, але не обмежуючись ними, ті методи, засоби, методики і процедури, які або є відомими, або можуть бути легко розроблені з відомих методів, засобів, методик і процедур, використовуваних практикуючими спеціалістами хімічної, фармакологічної, біологічної, біохімічної і медичної галузей. Слід розуміти, що певні ознаки винаходу, які для ясності є описаними в контексті окремих варіантів, можуть також пропонуватись в комбінації в єдиному варіанті здійснення. І навпаки, різні ознаки винаходу, описані для стислості в рамках одного варіанту здійснення, можуть також пропонуватись окремо, або в будь-якій доцільній підкомбінації, або, коли доцільно, в будь-якому іншому описаному варіанті здійснення цього винаходу. Конкретні ознаки, описані в контексті різних варіантів здійснення, не повинні розглядатись як суттєві ознаки цих варіантів, коли тільки даний варіант здійснення винаходу є нефункціональним без цих елементів. Різні варіанти здійснення і аспекти даного винаходу, як було окреслено вище і як заявлено в розділі формула винаходу далі, знаходять експериментальне підтвердження в наступних прикладах. ПРИКЛАДИ Посилання тепер робиться на наступні приклади, які разом з вищенаведеними описами ілюструють даний винахід, не обмежуючи його. Загалом, використана тут номенклатура і лабораторні процедури, застосовані в даному винаході, включають молекулярні, біохімічні, мікробіологічні методики і технології рекомбінантних ДНК. Ці методики докладно описані в літературі. Дивись, наприклад, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" книги I-III під ред. Ausubel, R. M., (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al., (ред.) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", кн. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методології як наведено в патентах США №№ 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 і 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", книги I-III Cellis, J. E., ред. (1994); "Current Protocols in Immunology" книги I-III Coligan J. E., ред. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8е видання), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell & Shiigi (ред.), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); доступні імунологічні аналізи докладно описані в патентній і науковій літературі, дивись, наприклад, патенти США №№ 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 і 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ред. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., і Higgins S. J., ред. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., і Higgins S. J., ред. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ред. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) і "Methods in Enzymology" томи 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And 21 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); які всі включені в даний документ за посиланням в повному об'ємі. Інші загальні посилання наведені в тексті цього документу. Вважається, що методики в даному документі є добре відомими в цій галузі і представлені тут для зручності читача. Вся інформація, що міститься тут, є включеною в даний документ за посиланням. ПРИКЛАД 1 Одержання і експресія вставних блокуючих елементів каналів голки секреторної системи типу III (T3SS) Ralstonia solanacearum в рослинах МАТЕРІАЛИ І ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ПРОЦЕДУРИ Синтез генів, експресія з урахуванням частоти використання кодонів Варіанти системи T3SS-IBE були розроблені на основі тривимірної моделі голки T3SS від Shigela flexneri (MxiH), описаної раніше [Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33], яка представляє собою гіпотетичну модель природної структури HrpY (Фіг. 2A-F). Гени вставного блокуючого елемента HrpY Ralstonia solanacearum (Rs) (hY-IBE) були синтезовані штучним шляхом і оптимізовані для частоти використання кодонів цільової рослини. Специфічні для рослини лідерні пептиди секреції були зрощені до 5" кожного hY-IBE, щоб транспортувати і локалізувати зрілі білки в апопласті або клітинній стінці. Клонування в бінарному векторі і трансформація: Синтетичні фрагменти, які складались з кодуючих ділянок 1-6 IBE з 5’-кінцевим нетрансльованим енхансером, були клоновані далі по відношенню до конститутивного промотору CaMV 35S і ближче по відношенню до термінатору NOS у вектор трансформації рослин, що базується на плазміді pBI121 (NCBI genebank ID# AF485783) з використанням сайтів рестрикції XbaI і SacI (Фіг. 7А). Протокол агротрансформації було використано для рослин томату, арабідопсису і евкаліпту, як раніше було описано для рослин тютюну [дивись, наприклад, Svab, Z., P. Hajdukiewicz and P. Maliga. (1975) Transgenic tobacco plants by co-cultivation of leaf disks with pPZP Agrobacterium binary vectors. "Methods in Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual", P. Maliga, D. Klessig, A. Cashmore, W. Gruissem and J. Varner, eds. Cold Spring Harbor Press: 55-77] і для рослин евкаліпту [Spokevicius AV., Van Beveren K., Leitch MA and Bossinger G. (2005) Agrobacteriummediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Reports, Volume 23(9), 617-624]. Трансформація рослин томату Рослини томату було трансформовано, як описувалось раніше [Qiu et al., Scientia Horticulturae 112 (2007) 172-175]. В короткому викладі: Рослинний матеріал Насіння томату L. esculentum cv M82 було поверхнево простерилізоване впродовж 30 с в 70 % спирті, промите стерилізованою водою впродовж 10 с, а потім простерилізоване впродовж 10 хвилин в 1 % розчині гіпохлориту і двічі промите стерилізованою водою впродовж 30 хвилин перед висіванням в Середовище А (як описано в Таблиці 7 далі). Насіння було висіяне у вегетаційний контейнер Magenta і пророщувалось при температурі 24 °C при 16-годинному періоді світла і 8-годинному періоді темряви. Сім'ядолі сіянців, які наполовину випростались, були використані після 4-5 днів проростання. Середовище, антибіотики і гормони Середовище MSB5 (M0404) було придбане у вигляді порошку у Sigma Chemical Co. і зберігалось при 2-8 °C. Сахарозу і глюкозу зберігали при кімнатній температурі. Канаміцин, карбенцилін, цефотаксим, ріфаміцин, ZR, IAA, IBA додатково використовувались в живильних середовищах (як описано в Таблиці 7 далі). 22 UA 113843 C2 Таблиця 7: Рослинні середовища, використані в протоколі трансформації томатів (взято з Qiu et al., Scientia Horticulturae 112 (2007) 172-175) Склад різних середовищ Солі MSB5 Середовище A, 0,5× B, 1× B1, 1× C, 1× D, 1× E, 1× Н Н Н Н 1% Н Агар (Daichin) (%) 0,60 0,60 Н 0,60 0,60 0,60 pH 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 IAA 0,1 мг/л + + + ZR 2 мг/л + + + IBA 0,1 мг/л + Цефотаксим 500 мг/л + + + Карбеницилін 500 мг/л + Канаміцин (мг/л) 100 30 Глюкоза 5 10 15 20 25 30 Бактеріальні штами і плазміди Для експериментів з трансформації були використані агробактерії (Agrobacterium), які містили ген, що становить інтерес. Бінарним вектором, використаним в даному дослідженні, був pBI121, який містив ген nptII як маркер селекції; використані в цьому дослідженні штами Agrobacterium містили маркер для селекції на ріфампіцині. Бактерії вирощували впродовж ночі в LB середовищі (середовище Лурія-Бертані) з антибіотиком (ріфампіцин 30 мг/л, канаміцин 100 мг/л), потім їх розводили до оптичної щільності OD600=0,2 і доводили до очікуваного показника оптичної щільності OD600 в LB середовищі без антибіотиків. Бактеріальні суспензії центрифугували при 4000 об/хв. впродовж 15 хвилин в 50-мл пробірці Falcon. Бактерії ресуспендували в середовищі B1 і використовували для експериментів з кокультивації. Протокол трансформації Сім'ядолі готувались наступним чином: відрізання сім'ядолі від сіянців здійснювали з максимальною обережністю, щоб уникнути проблеми з пошкодженням тканин. Виділені сім'ядолі розрізались тільки на базальній і латеральній стороні і поміщались верхньою стороною догори в Середовище B (описане в Таблиці 7 вище). Приблизно 50 експлантатів поміщались в одну чашку Петрі і інкубувались впродовж ночі. Наступного дня експлантати акуратно занурювались в культуру Agrobacterium inoculum в чашці Петрі на 20 хвилин. Потім їх просушували на стерильному папері і переносили в нове Середовище B. Через 72 години експлантати переносились в чашки Петрі, що містили Середовище С (описане в Таблиці 7 вище). Після інкубації впродовж наступних 72 годин експлантати переносились на селективне Середовище D (описане в Таблиці 7 вище). Кожні 3 тижні експлантати пересівались на таке ж середовище. Приблизно через 6-8 тижнів проростки вирізались з живильного середовища і переносились на Середовище E (описане в Таблиці 7 вище). Частота трансформації виражалась як відсоток кількості сім'ядоль, проростки від яких були одержані, по відношенню до загальної кількості інкубованих експлантатів. Експресія і підтвердження клонування: Інтеграція в рослинний геном і експресія T3SS-IBE аналізувались з використанням звичайних методів молекулярної біології, таких як ПЛР, ЗТ-ПЛР [як описано раніше, дивись, наприклад, Sambrook J. and Russell DW., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (January 15, 2001)], зі специфічними 1-6 праймерами IBE і вестерн-аналізом з поліклональним анти-IBE антитілом. Зокрема, праймерами для ПЛР, використаними для мутанта 1 HrpY, були прямий праймер 23 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 TCTCTTTGCTCTCCTTTATAGCCCTAC і зворотний праймер TCGCAGCGTCTAACATATCTTGTTGTC (SEQ ID №№: 95-96, відповідно); праймерами для ПЛР, використаними для мутанта 2 HrpY, були прямий праймер GTCACATGGTTCGTTGGTGTACTCTTC і зворотний праймер CATCTGGGTTCTATTCAGCGCATTTTG (SEQ ID №№: 97-98, відповідно); а праймерами для ПЛР, використаними для мутанта 6 HrpY, були прямий праймер GTCTTGTTCCTGTCTACCTTGCTCC і зворотний праймер GAGATTAGGTCTTTCGCAGCTTTGG (SEQ ID №№: 93-94, відповідно). Біотестування: Трансгенні рослини були піддані біотестуванню для оцінки рівня резистентності кожної трансгенної лінії у порівнянні з диким типом (тобто таким, що не експресує ген IBE). Були застосовані три методи біологічного тестування: 1. Просочений ґрунт. Непошкоджені рослини віком 19-21 день заражали шляхом поливу 8 ґрунту бактеріальною суспензією до кінцевої щільності приблизно 1×10 КУО/г ґрунту з наступною інкубацією при 28 °C. Контрольні рослини піддавали удаваному зараженню стерильною водою. Симптоми зараження оцінювались щоденно оцінювачем, необізнаним про вид обробки рослин, за шкалою від 0 до 4 балів, де 0 вказує на відсутність хвороби, 1 відповідає 1-25 % зів'янення листків, 2 відповідають 25-50 % зів'янення листків, 3 відповідають 51-75 % зів'янення листків, 4 відповідають 76-100 % зів'янення листків. Кожний дослід включав 16 рослин на одну групу, і досліди повторювались щонайменше тричі. 2. Зараження черенків. Нижні листки непошкоджених рослин віком 19-21 день відрізали і 8 капали на зріз черенка 2 мкл бактеріальної суспензії з кінцевою концентрацією 1×10 КУО/мл. Контрольні рослини піддавали удаваному зараженню стерильною водою. Симптоми зараження оцінювались щоденно оцінювачем, необізнаним про вид обробки рослин, за шкалою від 0 до 4 балів, де 0 вказує на відсутність хвороби, 1 відповідає 1-25 % зів'янення листків, 2 відповідають 25-50 % зів'янення листків, 3 відповідають 51-75 % зів'янення листків, 4 відповідають 76-100 % зів'янення листків. Кожний дослід включав 16 рослин на одну групу, і досліди повторювались щонайменше тричі. 3. Зараження стебла. Непошкоджені рослини віком 19-21 день заражали шляхом вертикального надрізання стебла стерильним ножем. В надріз довжиною 1 см і глибиною 0,5 см 8 ін'єктували 100 мкл бактеріальної суспензії з кінцевою щільністю приблизно 1×10 КУО/мл. Контрольні рослини піддавали удаваному зараженню стерильною водою. Симптоми зараження оцінювались щоденно оцінювачем, необізнаним про вид обробки рослин, за шкалою від 0 до 4 балів, де 0 вказує на відсутність хвороби, 1 відповідає 1-25 % зів'янення листків, 2 відповідають 25-50 % зів'янення листків, 3 відповідають 51-75 % зів'янення листків, 4 відповідають 76-100 % зів'янення листків. Кожний дослід включав 16 рослин на одну групу, і досліди повторювались щонайменше тричі. Результати Винахідники сконструювали експресовані рослиною блокуючі елементи для каналу голки секреторної системи типу III (T3SS) Ralstonia solanacearum (Rs) (вставні блокуючі елементи T3SS або T3SS-IBE) для захисту рослин від зів'янення, використовуючи структурні модифікації білка HrpY, формоутворюючого мономеру голки. Структурно модифікований HrpY (SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10 і 12, а також зображений докладно на Фіг. 2A-F, 3A-D, 4A-C, 5A-C і 6A-D), експресований в трансгенних рослинах (сільськогосподарських і деревних), вводили в нативний пілус Rs, інактивуючи його функціонально і попереджуючи або знижуючи зараження бактеріями Rs трансгенних рослин у порівнянні з рослинами дикого типу. Трансгенна рослина, яка експресує T3SS-IBE, виділяє T3SS-IBE назовні клітини, де T3SS-IBE збирається в пілусі атакуючого Rs, що робить пілус нефункціональним або дисфункціональним. У бактерії зі структурно модифікованим білком рослинного походження, вставленим в пілус, T3SS перейде в нефункціональний стан, а отже вона буде нездатною подолати природний захист рослини. Такі трансгенні резистентні рослини є здатними протистояти зараженню Rs. Варіанти T3SS-IBE були розроблені на основі тривимірної моделі голки T3SS від Shigela flexneri (MxiH), як описано раніше [Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33]. На базі цієї моделі були сплановані структурні модифікації HrpY Ralstonia, генеруючі модифіковані мономери голки T3SS, які вводяться в структуру голки і блокують канал цієї голки, трубку, в якій пектинази, що руйнують стінку рослинної клітини, ендоглюканази, вірулентні екзополісахариди і ефекторні білки транслокуються в стінку або через стінку клітини-хазяїна (Фіг. 1A-C). Таким чином, структурно модифікований пілус містить білкові домени, які розміщуються в каналі пілуса і здатні функціонально і фізично блокувати цей канал. Такий структурно нестабільний пілус також закінчує своє складання раніше, що має своїм результатом відносно короткий пілус, а це ще 24 UA 113843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 більше шкодить його функціональності і здатності переносити білки в рослину. Ця раціональна конструкція базується на збереженні і використанні нативних сайтів взаємодії субодиницясубодиниця HrpY при включенні трансляційно злитого пептиду, що блокує канал, та/або деформуванні структур альфа-спіралей. Рослинні сигнали секреції були включені в ці T3SS-IBE, щоб забезпечити секрецію з рослинної клітини в позаклітинний простір. Як було описано в розділі "Матеріали і експериментальні процедури" раніше, резистентні до зів'янення (WiltR) рослини томату були створені шляхом трансформації рослин томату конструкціями, що несуть мутанти HrpY 1, 2 або 6 Ralstonia solanacearum (SEQ ID №№: 1, 3 и 11, відповідно). Ці рослини аналізувались далі з використанням геномної ПЛР і напівкількісної ЗТ-ПЛР із залученням специфічних праймерів для мутанта 1 HrpY (SEQ ID №№: 95-96), мутанта 2 HrpY (SEQ ID №№: 97-98) або мутанта 6 HrpY (SEQ ID №№: 93-94). Була визначена експресія мутантів 1, 2 або 6 HrpY в трансформованих рослинах томату (дивись Фіг. 11A-C, 12A-C і 10A-C, відповідно). ПРИКЛАД 2 Одержання і експресія T3SS-IBE різних бактерій в рослинах Крім IBE, описаних в Прикладі 1 вище, з використанням викладених там методів були розроблені та ідентифіковані інші IBE для інших грамнегативних бактерій. Наприклад, IBE розроблялись мапуванням ділянок зв'язування структуроутворюючих білків пілуса, ідентифікацією пептидів-кандидатів, які зв'язуються з нативним пілусом і інтегруються в нього під час формування пілуса in vivo, модифікацією пептида-кандидата для того, щоб зробити канал нездатним до секреції ефекторних білків, і одержанням модифікованих можливих IBE. Модифікації можуть включати ті, що базуються на будь-якому з наступних принципів: Концептуально, нативні білки можна модифікувати на основі одного або більше з кількох різних підходів, включаючи наступні: 1. Додавання трансляційного злиття до N-термінальної ділянки нативного білка як в IBE 1, 2 і 3 з (IBE 1&3) або без (IBE 2) і перед (IBE 1) або після (IBE 3) нативного N-термінального домену (дивись Фіг. 3A-D, 4A-C і 7C). 2. Додавання трансляційного злиття до С-термінальної ділянки нативного білка як в IBE 4 з амінокислотним містком, який дозволяє ротаційний рух фрагменту трансляційного злиття, або без нього (дивись Фіг. 5A-C і 7C). Таким містком може бути, наприклад, один або більше залишків гліцину або аланіну. 3. Додавання амінокислоти проліну у випадкових точках по довжині нативної послідовності структуроутворюючого блока, як в IBE 5 або 6 (дивись Фіг. 6A-D і 7C). 4. Пентапептидні вставки. ПРИКЛАД 3 Одержання і експресія модифікованих білків транслокону Ralstonia solanacearum (PopF1) в рослинах Інший підхід, застосований авторами цього винаходу, полягає в над-експресії модифікованих білків і білків дикого типу (wt) транслокону Rs (наприклад, PopF1 або PopF2) в трансгенних рослинах. PopF1 і PopF2 є структуроутворюючими елементами воріт голки і відіграють важливу роль у вірулентності і реакції гіперчутливості у рослин дикого типу Wt, а модифіковані білки PopF1/F2 зупиняють складання T3SS внаслідок взаємодій з незрілою голкою. Контрольоване видовження голки у бактерій і білки транслокону в нормі виділяються на завершальній стадії процесу. Трансгенні білки транслокону, які взаємодіють з голкою передчасно, перешкоджають контрольованому послідовному складанню T3SS і інактивують її. Таким чином, модифіковані білки PopF1/F2 включаються у ворота транслокону і блокують або структурно деформують їх, спричинюючи до їх нефункціональності. Взяті в сукупності, викладені тут ідеї забезпечують експорт білків дикого типу і модифікованих білків PopF1 в апопласт/клітинну стінку трансгенними рослинами. Хоча цей винахід було описано спільно з конкретними варіантами його здійснення, ймовірно, що численні альтернативи, модифікації і варіації будуть очевидними для спеціалістів в даній галузі. Відповідно, існує намір охопити всі такі альтернативи, модифікації і варіації, які знаходяться в межах духу і широкого об'єму формули винаходу, що додається. Всі публікації, патенти і заявки на патенти, згадані в цьому описі, є включеними в нього у всій їх повноті в тій самій мірі, як в разі, коли б кожна окрема публікація, патент або заявка на патент були специфічно і індивідуально вказані як включені сюди за посиланням. Крім того, цитування або ідентифікація будь-якого джерела в даній заявці не повинне витлумачуватись як визнання того, що таке джерело було доступним в якості існуючого рівня техніки по відношенню до даного винаходу. До тієї міри, в якій використані заголовки розділів, вони не повинні витлумачуватись як обов'язкове обмеження. 25 UA 113843 C2 26 UA 113843 C2 27 UA 113843 C2 28