Мутанти n-протеїну вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней

1. Фармацевтична композиція, що містить інфекційний агент РРСС, вибраний з групи, що складається з: a) генетично модифікованого вірусу РРСС, що містить N-протеїн, який був модифікований у області NLS-2, так що pat4, pat7 або pat8 фрагмент переривається делецією однієї або більше амінокислот або введенням неконсервативного амінокислотного заміщення, і де генетично модифікований вірус РРСС є атенуйованим; b) інфекційної молекули РНК, що кодує генетично модифікований вірус РРСС за а); та 2 (19) 1 3 89660 4 залишки в положеннях 43, 44 та 46 були делетоцини, і залишком, що відповідає положенню 45 Nвані, протеїну в SEQ ID NO: 6, є аспарагін, залишки в положеннях 44, 46 та 47 були делетообласть NLS-2, яка містить залишки, що відповівані, або дають залишкам 41-47 N-протеїну в SEQ ID NO: 6, залишки в положеннях 46-48 були делетовані. була щонайменше частково делетована, 6. Вакцина для захисту свиней від інфікування щонайменше один із залишків в положеннях 43-48 вірусом РРСС, що містить фармацевтичну компоN-протеїну в SEQ ID NO: 6 був делетований, зицію за будь-яким з пунктів 1-5 у кількості, ефекобидва залишки в положеннях 43 та 44 N-протеїну тивній для викликання імунного захисту від інфікув SEQ ID NO: 6 були делетовані, вання вірусом РРСС, та носій, прийнятний для залишки в положеннях, що відповідають положенветеринарного використання. ням 43, 44 та 46 N-протеїну в SEQ ID NO: 6, були 7. Спосіб захисту свиней від інфікування вірусом делетовані, РРСС, що включає щеплення тварини кількістю залишки в положеннях, що відповідають положенвакцини за пунктом 6, ефективною для викликання ням 44, 46 та 47 N-протеїну в SEQ ID NO: 6, були імунного захисту від інфікування вірусом РРСС. делетовані, або 8. Трансфектована клітина-хазяїн, що містить інзалишки в положеннях, що відповідають положенфекційний агент РРСС за пунктом 1. ням 46-48 N-протеїну в SEQ ID NO: 6, були деле9. Спосіб вироблення генетично модифікованого товані. та атенуйованого вірусу РРСС, що включає вве12. Спосіб за пунктом 11, де вірусом РРСС є Півнідення генетично модифікованого вірусу РРСС в чноамериканський вірус РРСС і N-протеїн згаданоклітину-хазяїна, здатну підтримувати реплікацію го вірусу включає амінокислотну послідовність, що РРСС, і згаданий вірус містить N-протеїн, який був є ідентичною SEQ ID NO: 6, за винятком того, що модифікований у області NLS-2, так що pat4, pat7 залишки в положеннях 43 та 44 є гліцинами, або pat8 фрагмент переривається делецією однієї залишки в положеннях 43 та 44 були делетовані, або більше амінокислот або введенням неконсерзалишки в положеннях 43, 44 та 46 були делетовативного амінокислотного заміщення, і де генетивані, чно модифікований вірус РРСС є атенуйованим, залишки в положеннях 44, 46 та 47 були делето10. Спосіб за пунктом 9, в якому генетично модивані, або фікованим РРСС вірусом є Північноамериканський залишки в положеннях 46-48 були делетовані. вірус РРСС або Європейський вірус РРСС. 13. Спосіб за пунктами 9-12, в якому клітиною11. Спосіб за пунктом 10, де область NLS-2 Nхазяїном, здатною підтримувати реплікацію РРСС, протеїну є модифікованою, так що: є клітина MARC-145. залишками в положеннях, що відповідають поло14. Спосіб за пунктами 9-12, в якому клітинаженням 43 та 44 N-протеїну в SEQ ID NO: 6, є гліхазяїн, здатна підтримувати реплікацію РРСС, цини, міститься у живій свині. залишками в положеннях, що відповідають положенням 43 та 44 N-протеїну в SEQ ID NO: 6, є глі Даний винахід забезпечує генетично модифікований вірус РРСС та полінуклеотиди, що його кодують. Також він забезпечує вакцини, що містять генетично модифікований вірус та полінуклеотиди. Репродуктивно-респіраторний синдром свиней (РРСС) характеризується викиднями, народженнями мертвого плоду та іншими репродуктивними проблемами у свиноматок та у підсвинок, а також респіраторними захворюваннями у молодих свиней. Збудником хвороби є вірус РРСС, член сімейства Arteriviridae та підкласу Nidovirales. Наприкінці 1980 років у Північній Америці та у Європі майже одночасно з'явились два окремих генотипи вірусу. Вірус РРСС на даний час ендемічно розповсюджений у майже всіх країнах, де розводять свиней, та вважається однією з хвороб, пов'язаною із високими економічними втратами, що впливають на виробництво свинини у всьому світі. На даний час, комерційно доступні вакцини проти РРСС включають модифіковані живі та вбиті (інактивовані) вакцини. Вбиті вакцини критикувалися за неспроможність викликати стійкий імунітет до гетерологічних штамів вірусу РРСС. Модифіковані живі вакцини атенуюються шляхом серійного пасажу у клітинній культурі, доки не втратиться вірулентність. Модифіковані живі вакцини виявля ють більш широкий захист, ніж вбиті вакцини, проте вони можуть сприяти утворенню ряду небезпечних факторів, включаючи залишкову вірулентність, зараження нещеплених свиней, та генетичну реверсію до вірулентності. Через антигенні зміни, що відбуваються протягом процесу атенуації, такі вакцини можуть також втрачати деяку здатність до захисту від вірулентних польових штамів вірусу РРСС. Тому існує невідкладна потреба у нових та вдосконалених модифікованих живих вакцинах для захисту від РРСС. Фігура 1. (А) Креслення, де вказано положення та послідовність мутації NLS у нуклеокапсидному протеїні Р129. (В) Мікрофотографії клітин MARK145, що були фіктивно інфіковані, інфіковані Р129 та інфіковані P129-GG. У верхньому рядку показані типові бляшки з використанням фазовоконтрастної мікроскопії, а у нижньому - флуоресцентне забарвлення інфікованих осередків антитіл з використанням FITC-кон'югованого моноклонального антитіла SDOW17. Відмітьте відсутність нуклеокапсидного забарвлення у ядрах та ядерцях клітин, інфікованих P129-GG. Фігура 2. (А) Кількість свиней із віремією через 0-28 днів після інфікування, по групах лікування (7 свиней у групі). (В) Середнє значення вірусного 5 89660 6 титру у сироватках свиней через 0-28 днів після SEQ ID NO: 24 P129-d43/44F інфікування, по групах лікування. (С) Середні знаSEQ ID NO: 25 P129-d43/44/46F чення рівнів антитіл ELISA (співвідношення S/P) у SEQ ID NO: 26 P129-d44/46/47F сироватках свиней через 0-28 днів після інфікуSEQ ID NO: 27 P129-d46/47/48F вання, по групах лікування (D) повторне титруванSEQ ID NO: 28 P129-d43/44R ня сироваток показано на Фігурі 2С, усі проби були SEQ ID NO: 29 P129-d43/44/46R розведені 1:5 до початку аналізу з метою більш SEQ ID NO: 30 P129-d44/46/47R чіткого виділення проб, що мають більш високі SEQ ID NO: 31 P129-d46/47/48R титри. (Е) Середні значення титрів нейтралізації Винахід забезпечує генетично модифікований сироваток у інфікованих свиней протягом чотивірус РРСС, що був модифікований в області NLSрьох-тижневого вивчення. 2, області NoLS, та/або області NES нуклеокапсиСтислий опис послідовностей дного (N) протеїну, таким чином, щоб вірус, що SEQ ID NO: 1 Залишки 41-47 N протеїну ізоляодержують у результаті, РРСС, був атенуйований. ту VR2332 Північноамериканського вірусу РРСС Заявлений винахід додатково забезпечує інфекSEQ ID NO: 2 Послідовність області NoLS ційну молекулу РНК, що кодує генетично модифіVR2332 кований вірус, та ізольовану полінуклеотидну моSEQ ID NO: 3 Послідовність області NoLS Лелекулу, що містить ДНК послідовність, яка кодує лістад інфекційну молекулу РНК, описану вище. SEQ ID NO: 4 Область NES ізоляту VR2332 Винахід також забезпечує біологічно чисту куSEQ ID NO: 5 Область NES ізоляту Лелістад льтуру вказаних вірусів (тобто, таку, що головним SEQ ID NO: 6 Амінокислотна послідовність чином, не містить інших вірусів) та описує вірусний протеїну N ізоляту Р129 вектор, що містить ДНК послідовність, яка кодує SEQ ID NO: 7 Нуклеотидна послідовність ORF інфекційну молекулу РНК, що кодує генетично 7 (що кодує протеїн Ν), з ізоляту Р129 модифікований вірус РРСС, як описано вище. SEQ ID NO: 8 Праймер Ρ SHUTTLE FWD Заявлений винахід додатково забезпечує траSEQ ID NO: 9 Праймер P-SHUTTLE-REV нсфековану клітину-хазяїн, що містить будь-які з SEQ ID NO: 10 Мутагенний праймер вищевказаних вірусів, інфекційних молекул РНК, KK43/44GG-Fwd ізольованих полінуклеотидів або вірусних векторів, SEQ ID NO: 11 Мутагенний праймер описаних вище. KK43/44GG-REV Заявлений винахід додатково забезпечує вакSEQ ID NO: 12 Таблиця 8 мутантів з делецією. цину для захисту свиней від інфікування РРСС Амінокислотна послідовність області NLS2 дикого вірусом, ця вакцина містить генетично модифікотипу Р129: ваний вірус РРСС, описаний вище; описану вище SEQ ID NO: 13 Таблиця 8 мутантів з делецією. інфекційну молекулу РНК, що кодує генетично Нуклеотидна послідовність області NLS2 дикого модифікований вірус РРСС; описану вище ізольотипу Р129: вану полінуклеотидну молекулу (необов'язково у SEQ ID NO: 14 Таблиця 8 мутантів з делецією. вигляді плазміди), що кодує генетично модифікоАмінокислотна послідовність області NLS2 P129ваний вірус РРСС; або описаний вище вірусний GG: вектор, що кодує генетично модифікований вірус SEQ ID NO: 15 Таблиця 8 мутантів з делецією. РРСС; у кількості, ефективній для того, щоб виНуклеотидна послідовність області NLS2 P129кликати імунний захист від інфікування вірусом GG: РРСС; та носій, прийнятний для використання у SEQ ID NO: 16 Таблиця 8 мутантів з делецією. ветеринарних цілях. Амінокислотна послідовність NLS2 області P129Винахід додатково забезпечує мутації NLS-2, d43/44: стійкі до реверсій. Переважні втілення винаходу, SEQ ID NO: 17 Таблиця 8 мутантів з делецією. особливо для вакцин, міститимуть додаткові нукНуклеотидна послідовність NLS2 областіP129леотидні заміщення та/або делеції, призначені для d43/44: мінімізації можливості реверсії та для мінімізації SEQ ID NO: 18 Таблиця 8 мутантів з делецією. можливості мутації інших фланкуючих залишків у Амінокислотна послідовність NLS2 області P129основні залишки, такі, як лізин та аргінін, та, таким d43/44/46: чином, відновлення функціонального фрагменту SEQ ID NO: 19 Таблиця 8 мутантів з делецією. NLS в області. Нуклеотидна послідовність NLS2 області P129Заявлений винахід додатково забезпечує споd43/44/46: сіб захисту свиней від інфікування вірусом РРСС, SEQ ID NO: 20 Таблиця 8 мутантів з делецією. що включає щеплення тварини кількістю вищевкаАмінокислотна послідовність NLS2 області P129заної вакцини, ефективною для викликання імунd44/46/47: ного захисту від інфікування вірусом РРСС. SEQ ID NO: 21 Таблиця 8 мутантів з делецією. Винахід забезпечує спосіб вироблення генетиНуклеотидна послідовність NLS2 області P129чно модифікованого вірусу РРСС, що включає d44/46/47: мутацію ДНК послідовності, що кодує інфекційну SEQ ID NO: 22 Таблиця 8 мутантів з делецією. молекулу РНК, яка кодує вірус РРСС, як описано Амінокислотна послідовність NLS2 області P129вище, та експресування генетично модифікованоd46/47/48: го вірусу РРСС з використанням придатної систеSEQ ID NO: 23 Таблиця 8 мутантів з делецією. ми експресії. Нуклеотидна послідовність NLS2 області P129Вірус РРСС, дикого типу чи генетично модифіd46/47/48 кований, може бути експресований з ізольованої 7 89660 8 полінуклеотидної молекули з використанням приабо стану, що можуть бути виявлені, які виникають датних систем експресії, загальновідомих з рівня в результаті інфікування патогеном у щепленої техніки, приклади яких описані у цій заявці. Напритварини порівняно із твариною, яку не прищепили. клад, ізольована полінуклеотидна молекула може Ефективний імунозахисний відклик може бути вибути у формі плазміди, здатної експресувати кодокликаний у тварин, що не були раніше інфіковані ваний вірус у придатній клітині-хазяїні in vitro, як патогеном та/або не інфіковані патогеном на час більш детально описано нижче. проведення щеплення. Ефективний імунозахисний Інші відмітні ознаки будуть очевидні після розвідклик може також бути викликаний у тварин, вже гляду. інфікованих патогеном на час проведення щепУ даній заявці наведено опис способу атенуалення. ції вірулентного вірусу РРСС шляхом мутації або Генетично модифікований вірус РРСС є "атеделеції області NLS-2, області NoLS, або області нуйованим", якщо він менш вірулентний, ніж не NES у нуклеокапсиді або N протеїні (кодованому модифікований батьківський штам. Штам є "менш ORF7) вірусу, імуногенної композиції, що містить вірулентним", якщо він проявляє статистично знавказаний атенуйований вірус, та способу захисту чиме зниження одного чи більше параметрів, що свиней від РРСС шляхом щеплення вказаними визначають тяжкість захворювання. Такі параметімуногенними композиціями. Віруси РРСС, що бури можуть включати рівень віремії, лихоманку, ли атенуйовані цим способом, мають зберігати тяжкість респіраторного розладу, тяжкість репроантигенні характеристики вірулентного польового дуктивних симптомів, або кількість чи тяжкість штаму і, тому, бути спроможними надавати більш уражень легень та інш. ефективний захист, ніж вакцини на основі атену"Європейський вірус РРСС" відноситься до йованих вірусів клітинної культури. будь-якого штаму вірусу РРСС, що має генетичні Нуклеокапсидний протеїн (N) вірусу РРСС, кохарактеристики, пов'язані із вірусом РРСС, що був дований ORF7, є невеликим основним фосфоривперше ізольований в Європі близько 1991р. (див., льованим протеїном (Wootton, Rowland, and Yoo, наприклад, Wensvoort, G., et al. , 1991, Vet. Q. 2002) та утворює гомодимери (Wootton and Yoo, 13:121-130). "Європейський вірус РРСС" також 2003). Недавно була визначена його кристалічна іноді в рівні техніки наведений під назвою "Лелісструктура (Doan and Dokland, 2003). Знайдено, що тад-вірус". N протеїн виконує численні функції в інфікованій "Генетично модифікований", як вживається у клітині. Крім утворення сферичної капсидної струкцій заявці, якщо не вказано інше, означає генетичтури, в яку запакована геномна РНК, процесу, що но мутований втручанням людини, "мутований" відбувається у цитоплазмі, частина N протеїну означає заміщення амінокислоти на іншу або затранспортується в ядро та, конкретно, в ядерце міщення нуклеотиду, що кодує, на інший (наприінфікованої клітини. Амінокислотна послідовність клад, С на Т), тобто, так зване "заміщення", переN протеїну містить два сигнали ядерної локалізації важно таким чином, щоб була змінена кодована (NLS), сигнал ядерцевої локалізації (NoLS), та сигамінокислота, або будь-які інші мутації, такі, як нал ядерного експорту (NES), що сприяє транспо"делеція" або "інсерція". Мутація завжди проворту у ядра та ядерця, та експорту з ядра, відповіддиться у нуклеотидній послідовності, що кодує. но (Rowland et al., 1999; Rowland et al., 2003; "Клітина-хазяїн, здатна підтримувати реплікаRowland and Yoo, 2003). Знаходячись у ядерці, N цію вірусу РРСС" означає колонію клітин, здатних протеїн взаємодіє із малим ядерцевим РНКгенерувати інфекційні РРСС при інфікуванні вірузв'язаним протеїном фібриларином, та може регусом за даним винаходом. Такі клітини включають лювати процесінг рРНК та біогенез рибосом в інсвинячі альвеолярні клітини-макрофаги та похідні фікованій клітині для того, щоб сприяти вірусній свинячих альвеолярних клітин-макрофагів, клітини реплікації (Yoo et al., 2003). У даному винаході МА-104 та похідні клітин МА-104, клітини MARCпоказано, що мутації та делеції у NLS, NoLS та 145 та похідні клітин MARC-145, та клітини, транNES фрагментах N протеїну можуть призвести до сфековані рецептором вірусу РРСС. Особливо виникнення життєздатних вірусів із аберантними переважними для демонстрації фенотипу невелиядерними направленнями міграції, та що такі віруких бляшок за даним винаходом є клітини MARCси, що містять такі мутації, є корисними як вакцини 145. Термін "клітина-хазяїн, здатна підтримувати проти РРСС. реплікацію вірусу РРСС" може також включати Вірусні мутації такого типу є цінними, як окреклітини живої свині. мо, так і у комбінації з іншими мутаціями, що ате"Імунний відклик" в цілях даного винаходу нуюють, для розробки нових вакцин проти РРСС. означає продукування антитіл та/або клітин (таких, Визначення як Т-лімфоцити), направлених проти, або таких, "Ефективний імунозахисний відклик", "імунний що допомагають у розкладанні або інгібуванні конзахист", та подібні терміни, у цілях даного винахокретного антигенного епітопу або конкретних антиду, означають імунний відклик, направлений проти генних епітопїв. одного чи більше антигенних епітопів патогену "Північноамериканський вірус РРСС" означає таким чином, щоб захищати щеплену тварину від будь-який вірус РРСС, що має генетичні характеінфікування патогеном. В цілях даного винаходу, ристики, пов'язані із ізолятом Північноамерикансьзахист від інфікування патогеном включає не тілького вірусу РРСС, такі, як вірус РРСС, що був впеки абсолютне запобігання інфікування, але також рше ізольований у Сполучених Штатах на початку будь-яке зменшення ступеню інфікування патоге1990-х років (див., наприклад, Collins, J. Ε., et al., ном, що може бути виявлено, або будь-яке змен1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126); ізолят Півнішення тяжкості хвороби або будь-якого симптому чноамериканського вірусу РРСС MN-1b (Kwang, J. 9 89660 10 et al., 1994, J.Vet.Diagn.lnvest. 6:293-296); Квебекне входять у ці п'ять (незначна модифікація фрагський штам РРСС IAF-exp91 (Mardassi, Η. et al., менту "pat7" або "nuc2" описана Nakai & Kanehisa, 1995 , Arch. Virol. 140:1405-1418); та ізолят Північ1992; Rowland & Yoo, 2003). Як приклад, така посноамериканського вірусу РРСС VR 2385 (Meng, X.лідовність знаходиться на залишках N протеїну 41J et al., 1994 , J. Gen. Virol. 75:1795-1801), але не 47 ізоляту VR2332 Північноамериканського вірусу обмежуючись ними. Генетичні характеристики відРРСС, та представлена послідовністю PGKKNKKK носяться до подібності геномних нуклеотидних (SEQ ID NO: 1). У Європейських вірусах РРСС, послідовностей та подібності амінокислотних посNLS-2 має фрагмент "pat4" або "nuс1", що являє лідовностей штамів Північноамериканського вірусу собою безперервний фрагмент, що складається з РРСС. чотирьох основних амінокислот або трьох основ"Відкрита рамка зчитування", або "ORF", як них залишків, пов'язаних із гістидином або пролівживається у цій заявці, означає мінімальну нукном (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, леотидну послідовність, необхідну для кодування 2003). NLS-2 ізоляту Лелістад Європейського віруконкретного протеїну вірусу РРСС без проміжного су РРСС знаходиться на залишках 47-50 та предстоп-кодону. ставлений послідовністю KKKK. "Свинячий" у даній заявці відноситься до будь"Область NoLS N протеїну вірусу РРСС" або якої тварини - члена сімейства Suidae, такої як, "область NoLS ORF7 вірусу РРСС" відноситься до наприклад, свиня. Термін "вірус РРСС", що вживасигналу ядерцевої локалізації, загальна довжина ється у цій заявці, якщо не вказано інше, означає якого становить приблизно 32 амінокислоти, що будь-який штам Північноамериканського або Євінкорпорований в область NLS-2 близько до аміноропейського вірусів РРСС. термінусу. Як приклад, послідовність області NoLS "РРСС" охоплює симптоми хвороб у свиней, VR2332 знаходиться на залишках 41-72 та предвикликаних інфікуванням вірусом РРСС. Приклади ставлена послідовністю таких симптомів включають лихоманку, викидень у PGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSER вагітних самок, респіраторний розлад, ураження (SEQ ID NO: 2) (Rowland & Yoo, 2003), а відповідна легень, втрату апетиту та смертність у молодих послідовність ізоляту Лелістад знаходиться на свиней, але не обмежуються цим. Як вживається у залишках 42-73 та представлена послідовністю цій заявці, вірус РРСС, що "нездатний продукувати PRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQTER РРСС" відноситься до вірусу, що може інфікувати (SEQ ID NO: 3). свиню, але не продукує будь-які симптоми хворо"Область NES N протеїну вірусу РРСС" або би, зазвичай пов'язані із інфікуванням свиней "область NES вірусу РРСС ORF7" відноситься до РРСС. сигналу ядерного експорту, що містить фрагмент "N протеїн" вірусу РРСС, або "ORF7", як вжиLXL, що знаходиться біля карбокси-кінцевої облавається у цій заявці, визначено як поліпептид, що сті N протеїну. Фрагментом NES є X-R(2-5)-X-R2-Xкодується ORF7 або як Європейським, так і ПівнічR-Y, де X - лейцин, ізолейцин або валін, Υ - лейноамериканським генотипами вірусу РРСС. Прикцин, ізолейцин, валін або аланін, a R - будь-яка ладами специфічних ізотипів N протеїну, відомих амінокислота. Як показано нижче, ізоляти Північна даний час, є амінокислотний поліпептид 123 ноамериканських та Європейських прототипів відізоляту VR2322 Північноамериканського прототипу повідають цій схемі, коли обидва мають спейсер, РРСС, про який повідомлялось у Genbank під нощо складається з 5 залишків. мером доступу PRU87392, та залишок 128 N про"Трансфекована клітина-хазяїн" означає, практеїну ізоляту Лелістад Європейського прототипу тично, будь-яку клітину-хазяїн, що, як описано у РРСС, про який повідомлялось у Genbank під нопатенті США №5,600,662 при трансфекуванні РНК мером доступу А26843. вірусу РРСС можуть продукувати перший цикл "Область NLS-1 N протеїну вірусу РРСС" або вібріонів РРСС. Якщо є бажаним додаткове проду"область NLS-1 ORF7 вірусу РРСС" відноситься до кування інфекції, то можна використовувати "клісигналу ядерної локалізації "pat4" або "nuc1" (Nakai тину-хазяїн, здатну підтримувати реплікацію вірусу & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003), що місРРСС", як визначено нижче. тить чотири неперервні основні амінокислоти (ліПолінуклеотидні молекули можуть бути генезин або аргінін), або три основних залишки та гістично мутовані за допомогою рекомбінантних техтидин або пролін, розташовані приблизно у межах нологій, відомих фахівцю у цій галузі, включаючи перших 15 N-термінальних залишків зрілого N сайт-специфічний мутагенез, або неспецифічний протеїну. Як приклад, послідовністю області мутагенез, наприклад, викликаний впливом хімічVR2332 NLS-1 є KRKK, що знаходиться на залишних мутагенів або радіації, як відомо з рівня техніках 9-12, тоді як послідовністю ізоляту Лілестаду є ки. "Вказані мутації можуть бути здійснені стандарKKKK, що знаходиться на залишках 10-13 N протетними способами, відомими з рівня техніки, їну. наприклад, сайт-специфічним мутагенезом (див., "Область NLS-2 N протеїну вірусу РРСС" або наприклад, Sambrook et al. (1989) Molecular "область NLS-2 ORF7 вірусу РРСС" відноситься до Cloning: A Laboratory Manual, 2 (nd)ed., Cold Spring другого сигналу ядерної локалізації у N протеїні, Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) що може бути в одній з двох форм. У Північноамеінфікованого зразку, як описано (наприклад, риканському РРСС віруси NLS-2 мають конфігураMeulenberg et al., Adv. Exp. Med. Biol, 1998, цію, яку ми позначили фрагмент "pat8"; що почи440:199-206). нається з проліну, за трьома залишками якого Відповідно, заявлений винахід додатково заслідує послідовність з п'яти залишків, що містить, безпечує спосіб вироблення генетично модифікощонайменше, три основні залишки (K або R), що ваного Північноамериканського вірусу РРСС, що 11 89660 12 включає мутацію ДНК послідовності, що кодує інслоту, що має подібні властивості. Ілюстративні фекційну молекулу РНК, яка кодує вірус РРСС, як консервативні заміщення викладені у Таблиці 1 (з описано вище, та експресує генетично модифікоWO 97/09433, сторінка 10, опублікованого 13 беваний вірус РРСС з використанням придатної сисрезня 1997p. (PCT/GB96/02197. поданого 9/6/96)), теми експресії. Генетично модифікований вірус наведеній нижче. РРСС може експресуватись із ізольованої полінуклеотидної молекули з використанням придатних Таблиця 1 систем експресії, загальновідомих з рівня техніки, приклади яких описані у цій заявці. Наприклад, Консервативні заміщення І ізольована полінуклеотидна молекула може існувати у формі плазміди, здатної експресувати коБоковий ланцюг дований вірус у придатній клітині-хазяїні in vitro, як Характеристика Амінокислота більш детально описано нижче. Аліфатична Послідовності N протеїну ПівнічноамерикансьGAP Неполярна кого вірусу РРСС високо консервативні, а послідоILV вності, про які повідомлялось, мають приблизно CSTM Полярна-незаряджена 93-100% ідентичність одна з одною. N протеїни NQ Північноамериканського та Європейського вірусів DE Полярна-заряджена РРСС ідентичні на, приблизно, 57-59%, та мають KR спільні структурні фрагменти. Ароматична HFWY Як приклад, послідовність області NES Інше NQDE VR2332 знаходиться на залишках 106-117 та представлена послідовністю LPTHHTVRLIRV (SEQ Як альтернатива, консервативні амінокислоти ID NO: 4) (Rowland & Yoo, 2003), a послідовність можуть бути груповані, як описано у Lehninger, ізоляту Лелістад знаходиться на залишках 107-118 [Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. та представлена послідовністю LPVAHTVRLIRV NY:NY (1975), pp. 71-77], як викладено у Таблиці 2, (SEQ ID NO: 5). наведений нижче. У консенсусі, наведеному нижче, що містить усі послідовності у послідовностях ПівнічноамериТаблиця 2 канського вірусу РРСС у Genbank, положення, відмічені (*), є повністю консервативними. Під кожКонсервативні заміщення II ним положенням показані альтернативні амінокислоти. Боковий ланцюг Характеристика Амінокислотa Неполярна (гідрофобна) А. Аліфатична: ALIVP В. Ароматична: FW С Сірковмісна: Μ D. Перехідна: G Незаряджена-полярна А. Гідроксил: STY Нумерація амінокислот, вказаних вище, відпоВ. Аміди: NQ відає записам у вказаній базі даних. В усіх інших С. Сульфгідрил: С ізолятах РРСС, що можуть нумеруватись іншим D. Перехідна: G чином, ідентифікація належних областей легко Позитивно заряджена (Основна): K R Η досягається шляхом ідентифікації збережених Негативно заряджена (Кислотна): D E характерних амінокислот у штамі РРСС, що розглядається, та його співставлення з реперним Як ще одна альтернатива, ілюстративні консештамом. Об'єктом даного винаходу є модифікація рвативні заміщення викладені у Таблиці 3, навевірусу РРСС або нуклеїнових кислот, що його коденій нижче. дують, таким чином, щоб одна чи більше консервативних областей були видалені заміщенням, Таблиця 3 делецією, або інсерцією таким чином, щоб це призвело до утворення атенуйованого фенотипу. Консервативні заміщення III Делеції, інсерції, або заміщення, що елімінують консервативний фрагмент NLS-2, область Вихідний залишок Ілюстративне заміщення NoLS, або фрагмент NES, вводяться шляхом модифікації полінуклеотидів у віруси, що кодують, за Аlа (А) Val, Leu, lle даним винаходом. У переважному втіленні, делеArg (R) Lys, Gln, Asn ція або інсерція, що містить 1, 2, 3, 4 або 5 аміноAsn (N) Gln, His, Lys, Arg кислот, призводить до видалення консервативного Asp (D) Glu фрагменту та до утворення атенуйованого вірусу. Cys (C) Ser Амінокислоти можуть бути класифіковані відGln (Q) Asn повідно до їх фізичних властивостей та внеску у Glu (E) Asp вторинну та третинну протеїнову структуру. КонHis (H) Asn, Gln, Lys, Arg сервативним заміщенням у рівні техніці вважаєтьlle (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, ся заміщення однієї амінокислоти на іншу аміноки 13 89660 14 рипти можуть бути також одержані транскріпцією Leu (L) lle, Val, Met, Ala, Phe in vitro з лігованих in vitro кДНК фрагментів часткоLys (K) Arg, Gln, Asn вої довжини, що містять повний вірусний геном. В Met (M) Leu, Phe, lle усіх випадках, транскрибована РНК містить усі Phe (F) Leu, Val, lle, Ala модифікації, що були введені у кДНК та що можуть Pro (P) Gly бути використані для подальшого переносу вірусу, Ser (S) Thr модифікованого таким чином. Thr(T) Ser Приготування інфекційного клону ізоляту ЄвTrp (W) Tyr ропейського вірусу РРСС або вірусу Лілестад опиTyr(Y) Trp, Phe, Thr, Ser сано у патенті США №6,268,199, що включений до Val(V) lle, Leu, Met, Phe, Ala цієї заявки у повному обсязі шляхом посилання. Приготування інфекційного клону кДНК ізоляту Приготування генетично модифікованого віруПівнічноамериканського вірусу РРСС, позначеного су РРСС Р129 (Lee et al., 2005; Yoo et al., 2004), описано у Технологія рекомбінації ДНК включає надзвипатенті США №6,500,662, що включений до цієї чайно різноманітні та потужні методи молекулярзаявки у повному обсязі шляхом посилання. Посної біології, направлені на модифікацію нуклеїнолідовність кДНК Р129 описана у Genbank під нових кислот на ДНК рівні та надає можливість мером доступу AF494042 та у патенті США аналізувати та модифікувати геноми на молекуля№6,500,662. У нашій роботі, описаній нижче, викорному рівні. У цьому відношенні, такі віруси, як ристовується такий інфекційний клон, який у випаРРСС, через невеликі розміри його геному, частдку плазміди експресується безпосереднім раннім ково піддаються таким маніпуляціям. Проте, техпромотором CMV, що був позначений як pCMV-Sнологія рекомбінації ДНК не застосовна безпосеP129 та також описаний у патенті США редньо до не-ретровіральних вірусів РНК через те, №6,500,662. Як описано у патенті США що ці віруси не охоплюють проміжний ДНК у своїй №6,500,662, існують інші плазміди та промотори реплікації. Для таких вірусів мають бути розробледля застосування за цим винаходом. ні інфекційні клони кДНК до того, як технологія Маючи повну послідовність будь-якою відкрирекомбінантної ДНК зможе бути застосована до їх тої рамки зчитування, що представляє інтерес, та геному для генерації модифікованого вірусу. Інфеположення амінокислотного залишку, що предстакційні клони можуть бути одержані шляхом консвляє інтерес, фахівцю у цій галузі для того, щоб труювання повної (геномної довжини) кДНК (у цій розробити заміщення у конкретних бажаних полозаявці використовується у широкому значенні, як женнях, буде потрібно тільки звернутись до табДНК копія РНК, а не тільки строго як ДНК копія лиці кодонів. Таблиця амінокислот та абревіатур, iРНК) вірусу, що вивчається, після чого інфекційсимволів та кодонів, що їх презентують, викладена ний транскрипт синтезують in vivo в клітинах, транижче у Таблиці 4. нсфекованих повною кДНК, але інфекційні транскТаблиця 4 Амінокислота Аланін Цистеїн Аспарагінова кислота Глютамінова кислота Фенілаланін Гліцин Гістидин Ізолейцин Лізин Лейцин Метіонін Аспарагін Пролін Глютамін Аргінін Серін Треонін Валін Триптофан Тирозин Аббрев. Ala Cys Asp Glu Phe Gly His lle Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Символ A С D Ε F G Η I K L Μ N Ρ Q R S Τ V W Υ Кодони складають триплетні послідовності нуклеотидів у іРНК та їх відповідних молекулах кДНК. Кодони характеризуються основним ураци GCA UGC GAC GAA UUC GGA CAC AUA AAA UUA AUG AAC CCA CAA AGA AGC АСА GUA UGG UAC GCC UGU GAU GAG UUU GGC CAU AUC AAG UUG AAU CCC CAG AGG AGU ACC GUC Кодон(и) GCG GCU GGG GGU AUU CUA CUC CCG CCU CGA UCA ACG GUG CGC UCC ACU GUU CUG CUU CGG UCG CGU UCU UAU лом (U), коли вони присутні у молекулі іРНК, але коли вони присутні у ДНК, то характеризуються основним тимідином (Т). Просте заміщення у ко 15 89660 16 доні на той же самий амінокислотний залишок у з таблиці, наведеній вище, слідує, що двома можполінуклеотиді не змінить послідовність або струкливими триплетними послідовностями є ААА та туру кодованого поліпептиду. Очевидно, що коли у AAG. Гліцин кодується GGA, GGC, GGT (GGU у випадку фрази, де вказується, що конкретна 3-х випадку РНК) та GGG. Для заміщення лізину на нуклеотидна послідовність "кодують(кодує)" будьгліциновий залишок у кодованому протеїні, можна яку конкретну амінокислоту, то фахівець у цій газамінити триплет ААА або AAG на будь-який GGA лузі визнаватиме, що у таблиці, наведеній вище, та GGC, GGT або GGG у нуклеїновій кислот, що надані засоби ідентифікації конкретних нуклеотикодує. Послідовність, що кодує, протеїну N або дів, що розглядаються. Як приклад, якщо конкретORF7 з ізоляту Р129 наведена нижче. на трьох-нуклеотидна послідовність кодує лізин, то Конструкція полінуклеотидної послідовності мутанту N протеїну, модифікованої в областях NLS-2, показана у Прикладі 2 як ілюстративний приклад. До уваги буде прийнято, що мутації в областях NLS-1, NoLS або NES можуть бути здійснені за аналогічними методиками та з аналогічними результатами. Обґрунтування того, що генетично модифікований вірус РРСС є атенуйованим Для того, щоб продемонструвати, що конкретний генетично модифікований штам є атенуйованим, може бути проведений експеримент, описаний нижче. У кожне випробування було включено, щонайменше, 10 свиней на групу, одержаних з ферми, вільної від вірусу PPCCV. Тварин тестували антитілами специфічної сироватки, що не містила вірусу РРСС та була негативною по відношенню до вірусу РРСС. Усі тварини, включені до випро бування, були однакового походження та однієї породи. Розподіл тварин по групах був випадковим. Зараження було здійснено на 90 день вагітності шляхом інтраназального застосування 1мл вірусу РРСС з 105 TCID50 на ніздрю. Кожний тест був проведений, щонайменше, на трьох групах: одна група для зараження Р129; одна тестова група для зараження можливо атенуйованим вірусом; та одна суворо контрольна група. Дослідження вважається валідним, якщо групи суворого контролю залишаються негативними до вірусу РРСС протягом часу проведення дослідження та, щонайменше, 25% живих здорових поросят народжуються у групі, зараженій Р129, порівняно із групою суворого контролю. Атенуація, іншими словами, менша вірулентність, визначається як статистично значима зміна одного чи більше параметрів, що визначають репродуктивну здатність або інша симптоматологія: 17 89660 18 На атенуацію може вказувати значне змен(наприклад, наявність або відсутність одного чи шення, щонайменше, одного з наступних парамебільше симптомів або зменшення тяжкості одного трів для тестової групи (можливо атенуйованого чи більше симптомів, таких, якціаноз, пневмонія, вірусу) порівно із групою, інфікованою неураження легень та інш.). модифікованим батьківським штамом: Неуражена свиня - це свиня, яка або не була a) частота мертвонароджень піддана дії інфекційного агента репродуктивноb) викидні на 112 день вагітності або раніше респіраторної хвороби, або яка була піддана дії c) кількість муміфікованих поросят інфекційного агента репродуктивно-респіраторної d) кількість менш життєздатних та слабких похвороби, але не проявляє симптомів хвороби. росят Уражена свиня - свиня, що проявляє симптоми e) смертність у поросят, що перебувають на РРСС або з якої можна виділити вірус РРСС. грудному вигодовуванні Вакцини за даним винаходом можуть бути Додатково переважним є значне зростання складені за загальноприйнятими правилами таким одного з наступних параметрів для тестової групи чином, щоб включати носії, придатні для тварин, порівняно із групою, інфікованою не модифіковавключаючи людей (якщо застосовно), такі, як станим батьківським штамом: ндартні буфери, стабілізатори, розріджувачі, конf) кількість поросят, вигодуваних однією свисерванти, та/або солюбілізатори, та можуть також нею бути складені таким чином, щоб сприяти повільg) кількість здорових поросят, народжених одному вивільненню. Розріджувачі включають воду, нією свинею сольовий розчин, декстрозу, етанол, гліцерин та Як альтернатива, з метою встановлення атеподібні розріджувачі. Допоміжні речовини для нуації можуть бути вивчені респіраторні симптоми створення ізотонічності включають, серед іншого, та інші симптоми інфікування вірусом РРСС, як хлорид натрію, декстрозу, манітол, сорбіт та лакописано у Прикладі 3, наведеному нижче. тозу. Стабілізатори включають, серед іншого, альВакцини бумін. Інші придатні основи та допоміжні речовини Аенуйований штам є цінним для приготування вакцин, включаючи такі, що особливо корисні у вакцин. складах модифікованих живих вакцин, відомі або Ця вакцина є ефективною, якщо вона захищає будуть очевидні для фахівця у цій галузі. Див., свиней від інфікування вірусом РРСС. Вакцина наприклад, Remington's Pharmaceutical Science, захищає свиню від інфікування вірусом РРСС, 18th ed, 1990, Mack Publishing, включений до цієї якщо, після введення вакцини одній чи більше заявки шляхом посилання. неураженим свиням, наступне зараження біологічВакцини за даним винаходом можуть додатконо чистим вірусним ізолятом (наприклад, VR 2385, во містити один чи більше додаткових імуномодеVR 2386, Р129 та інш.) призводить до зменшення люючих компонентів, таких, як, наприклад, серед тяжкості величини або до гістологічних змін (наіншого, ад'ювант або цитокін. He-лімітуючі приклаприклад, уражень легень) та/або симптомів хвороди ад'ювантів, що можуть бути використані у вакби порівняно із такими змінами або симптомами, цині за даним винаходом, включають ад'ювантну що типово викликаються ізолятом у подібних несистему RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), галун, мізахищених свиней (тобто, відносно відповідного неральні гелі, такі, як гель гідроксиду алюмінію, контролю). Більш конкретно, може бути показана емульсії типу «масло у воді», емульсії типу «вода ефективність даної вакцини при її введенні одній в маслі», такі, як, наприклад, повні та неповні чи більше придатним свиням, що потребують цьоад'ювантні системи Фройнда, Блок-кополімер го, потім через належний проміжок часу (напри(CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., клад, 3 тижні), зараженні більшою пробою (10(3-7) Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), TCID50) біологічно чистого ізоляту вірусу РРСС. ад'ювант AMPHIGEN, сапонін, Quil А або інші Потім, через, приблизно один тиждень, у заражесапонінові фракції, монофосфорильний ліпід А та них свиней взяли пробу крові та здійснили спробу ліпід-амінний ад'ювант Аврідін. Не-лімітуючі приквиділити вірус із проби крові (наприклад, див. пролади емульсій типу "масло у воді", корисні у вакцедуру виділення вірусу, викладену у Експерименцинах за даним винаходом, включають модифікоті VIII, наведеному нижче). Виділення більшої кільвані 1/2 склади SEAM62 та SEAM. Модифікована кості вірусу вказує на те, що вакцина може бути не SEAM62 є емульсією типу "масло у воді", що місефективна, тоді як виділення зменшеної кількості тить 5% (об'ємних) сквалену (Sigma), 1% (об'ємвірусу (або відсутність вірусу) вказує на те, що них) детергенту SPAN 85 (ICI Surfactants), 0,7% вакцина може бути ефективною. (об'ємних) детергенту TWEEN 80 (ІСІ Surfactants), Таким чином, ефективність даної вакцини мо2,5% (об'ємних) етанолу, 200пг/мл Quil A, 100 [мгр] же бути оцінена кількісно (тобто, зниження процег/мл холестерину та 0,5% (об'ємних) лецитіну. Монтного вмісту ущільненої легеневої тканини порівдифікована SEAM 1/2 є емульсією типу "масло у няно із відповідною контрольною групою) або воді", що містить 5% (об'ємних) сквалену, 1% якісно (наприклад, виділенням вірусу РРСС з кро(об'ємних) детергенту SPAN 85, 0,7% (об'ємних) ві, виявленням антигену РРСС з проб тканин ледетергенту Tween 80, 2,5% (об'ємних) етанолу, гень, мигдалин або лімфатичного вузла шляхом 100мкг/мл Quil А, та 50мкг/мл холестерину. Інші імунного аналізу). Симптоми репродуктивноімуномодуляторні агенти, що можуть бути включереспіраторної хвороби свиней можуть бути оцінені ні у вакцину, включають, наприклад, один чи бількількісно (наприклад, температура/лихоманка), ше інтерлейкинів, інтерферонів або інших відомих напів-кількісно (наприклад, тяжкість респіраторноцитокинів. го розладу [детально пояснена нижче], або якісно 19 89660 20 Вакцини за даним винаходом можуть бути неВеличина ефективної дози вірусу, інфекційної обов'язково складені з метою повільного вивільмолекули РНК, плазміди або вірусного вектору за нення вірусу, інфекційної молекули РНК, плазміди даним винаходом може бути визначена за допоабо вірусного вектору за даним винаходом. Прикмогою відомих методик, враховуючи фактори, що лади складів такого повільного вивільнення вклюможуть бути визначені фахівцем у цій галузі, такі, чають вірус, інфекційну молекулу РНК, плазміду як маса тварини, що має бути щеплена. Величина або вірусний вектор у комбінації з композитами дози вірусу за даним винаходом у вакцині за дабіосумісних полімерів, таких, як, наприклад, поним винаходом, переважно, знаходиться у діапалі(молочна кислота), полі(кислота кополімеру мозоні від, приблизно, 101 до, приблизно, 108 БУО лочної та гліколевої кислот), метилцелюлоза, гіа(бляшкоутворюючих одиниць), більш переважно луронова кислота, колаген та інш. Структура, від, приблизно, 102 до, приблизно, 108 БУО, та відбір та використання полімерів, що розпадаютьбільш переважно, від, приблизно 10З до, приблизся, у засобах доставки ліків були розглянуті у декіно, 107 БУО. Величина дози плазміди за даним лькох публікаціях, включаючи A. Domb et al., 1992, винаходом у вакцині за даним винаходом, переPolymers for Advanced Technologies 3: 279-292, що важно, знаходиться у діапазоні від, приблизно, включена до цієї заявки шляхом посилання. Дода0,1мкг до, приблизно, 100мг, більш переважно, від, ткові інструкції щодо відбору та використання поприблизно, 1мкг до, приблизно, 10мг, навіть більш лімерів у фармацевтичних складах можна знайти у переважно від, приблизно, 10мкг до, приблизно, текстах, відомих з рівня техніки, наприклад, М. 1мг. Величина дози інфекційної молекули РНК за Chasin and R. Langer (eds), 1990, "Biodegradable даним винаходом у вакцині за даним винаходом Polymers as Drug Delivery Systems" y: Drugs and the переважно, знаходиться у діапазоні від, приблизPharmaceutical Sciences, Vol. 45, M. Dekker, N.Y., но, 0,1 до, приблизно, 100мг, більш переважно, яка також включена до цього документу шляхом від, приблизно, 1мкг до, приблизно, 10мг, навіть посилання. Альтернативно, або додатково, вірус, більш переважно від, приблизно, 10мкг до, прибплазміда або вірусний вектор можуть бути мікроінлизно, 1мг. Величина дози вірусного вектору за капсульовані для покращення введення та підвиданим винаходом у вакцині за даним винаходом щення ефективності. Способи мікроінкапсулюванпереважно, знаходиться у діапазоні від, приблизня антигенів добре відомі з рівня техніки, та но, 101 БУО до, приблизно, 109 БУО, більш перевключають методики, описані, наприклад, у патенважно від, приблизно, 102 БУО до, приблизно, 108 ті США №3,137,631; патенті США №3, 959,457; БУО, навіть більш переважно від, приблизно, 103 патенті США№ 4,205,060; патенті США до, приблизно, 107 БУО. Придатний об'єм дози №4,606,940; патенті США №4,744,933; патенті знаходиться у діапазоні від, приблизно, 0,5мл до, США №5,132,117; та міжнародній патентній публіприблизно, 10мл, навіть більш переважно від, кації WO 95/28227, усі вони включені у цей докуприблизно, 1мл до, приблизно, 5мл. мент шляхом посилання. Як приклад, вакцини можуть бути доставлені Для забезпечення повільного вивільнення віорально, парентерально, інтрадермально, підшкірусу, плазміди або вірусного вектору можуть також рно, внутрішньомязово, інтраназально або внутрівикористовуватись ліпосоми. Детальний опис того, шньовенно. Оральна доставка може включати, як готувати та використовувати ліпосомні склади наприклад, додавання композицій у їжу або напої можна знайти, серед іншого, у патенті США для тварин. Фактори, що впливають на дозування №4,016,100; патенті США №4,452,747; патенті вакцини включають, наприклад, масу та вік свині. США №4,921,706; патенті США №4,927,637; патеДаний винахід додатково забезпечує спосіб нті США №4,944,948; патенті США №5,008,050; та приготування вакцини, що містить вірус РРСС, патенті США №5,009,956, усі вони включені у цей інфекційну молекулу РНК, плазміду або вірусний документ шляхом посилання. вектор, описаний у цій заявці, цей спосіб включає Ефективна кількість будь-якої з вище описаних поєднання ефективної кількості одного з вірусів вакцин може бути визначена традиційними метоРРСС, інфекційної молекули РНК, плазміди або дами, починаючи з малої дози вірусу, плазміди вірусного вектору за даним винаходом, з носієм, або вірусного вектору, та наступного збільшення придатним для фармацевтичного або ветеринардози при моніторингу ефекту. Ефективну кількість ного використання. можна одержати після однократного введення Додатково, жива атенуйована вакцина за давакцини або після багаторазового введення вакним винаходом може бути модифікована, як опицини. При визначенні оптимальної дози для однієї сано у патенті США №6,500,662, так, щоб кодувати тварини можна врахувати відомі фактори. Вони гетеролічний антигенний епітоп, введений у вірусвключають вид, розмір, вік та загальний стан тваний геном РРСС з використанням відомих рекомрини, наявність інших ліків у тварині і тому подіббінантних технологій. Антигенні епітопи, корисні як не. Дійсну дозу переважно вибирають після вигетерологічні антигенні епітопи за даним винаховчення результатів, одержаних з інших досліджень дом, включають антигенні епітопи, одержані зі тварин. свинячого патогену, іншого, ніж вірус РРСС, що Один зі способів виявлення, чи був досягнутий включає антигенний епітоп, одержаний зі свинячоадекватний імунний відклик полягає у визначенні го патогену, вибраного з групи, що складається зі сероконверсії титру антитіл у тварин після щепсвинячого парвовірусу, свинячого цирвовірусу, лення. Хронометраж щеплення та кількість бустесвинячого ротавірусу, свинячої інфлуенци, вірусу рів, якщо такі є, переважно визначатимуться лікахвороби Ауескі, трансмісивного гастроентеритного рем або ветеринаром на основі аналізу усіх вірусу, свинячого респіраторного коронавірусу, релевантних факторів, деякі з них описані вище. вірусу класичної свинячої лихоманки, вірусу сви 21 89660 22 нячої Африканської лихоманки, вірусу енцефалокації за наступних умов; денатурація при 95°С міокардиту, свинячого параміксовірусу, протягом 30 секунд, гібридизація праймеру при Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, 55°С протягом 1 хвилини, та витягували при 72°С Bacillus anthraci, Bordetella bronchiseptica, протягом 3 хвилин. Продукт ПЦР клонували у векClostridium haemolyticum, Clostridium perfringens, тор pTrueBlue з використанням набору для клонуClostridium tetani, Escherichia coli, Erysipelothdix вання TrueBlue MicroCartridge ПЦР XL (Genomics rhusiopathiae, Haemophilus parasuis, Leptospira One; Buffalo, New York) для вироблення pTBspp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma shuttle-PPCC вірусу-3997. hyorhinis, Mycoplasma hyosynovia, Pasteurella Приклад 2: Модифікація послідовності NLS-2 multocida, Salmonella choleraesuis, Salmonella для вироблення вірусу P129-GG typhimuhum, Streptococcus equismilis ma Для модифікації сигналу ядерної локалізації Streptococcus suis, але не обмежується цим. Нук2(NLS-2) фрагменту, що знаходиться у амінокислеотидні послідовності, що кодують антигенні епілотних положеннях 41-47 нуклеокапсидного протетопи вищевказаних свинячих патогенів, відомі з їну (N), використовували сайт-специфічний мутарівня техніки та можуть бути одержані із таких генез на основі ПЦР. Серед вірусів РРСС громадських генних баз даних, як GenBank Північноамериканського генотипу, цим фрагмен(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Genbank/index.htm том NLS є, зазвичай, PGKKNKK (як у прототипноl), що містяться у NCBI. му ізоляті VR-2332 або у Канадському ізоляті РАДодаткові ознаки та варіації винаходу будуть 8), або його похідне, таке, як PGKKSKK (знайдеочевидними для фахівців у цій галузі з усієї цієї ний в ізолятах Р129 та 93-47324). Вважається, що заявки, включаючи детальний опис, та усі такі наявність кратно позитивно заряджених залишків ознаки призначені бути аспектами цього винаходу. лізину (K) або аргініну (R) є важливою для повнісАналогічно, ознаки винаходу, описаного у цій заятю функціонального сигналу NLS. Залишки лізину вці, можуть бути повторно скомбіновані із додату положеннях 43 та 44 N (нуклеотидні положення ковими втіленнями, що також призначені бути ас14,999-15,004 геному Р129) були заміщені залишпектами цього винаходу, незалежно від того, чи ками гліцину з використанням човникової плазміди описана вище комбінація ознак конкретно як аста мутагенної праймерної пари KK43/44GG-Fwd пект або втілення даного винаходу. Також, тільки (5'такі обмеження, що описані у цій заявці, як критичGGCAAGGGACCGGGAGGGGGAAATAAGAAGAAA ні для даного винаходу, мають бути розглянуті як AAC - 3') (SEQ ID NO: 10)-: геномні положення такі; варіації даного винаходу, де відсутні обме14,984-15,019) та KK43/44GG-Rev (5'ження, що не були описані у цій заявці як критичні, GTTTTTCTTCTTATTTCCCCCTCCCGGTCCCTTGC призначені бути аспектами даного винаходу. Буде C - 3') (SEQ ID NO: 11)-: геномні положення 14,984очевидно, що цей винахід може бути здійснений 15,019), де підкреслення вказують на зміни кодонів на практиці іншим чином, ніж той, що детально для амінокислотних заміщень від KKS до GGN. описаний у наведеному вище описі та прикладах. Були проведені ПЦР ампліфікації з використанням У світі цих ідей можливі численні модифікації 5нг pTB-shuttle-PPCCV-3997 плазмідної ДНК, 300нг та варіації даного винаходу, що знаходяться тому кожного з прямого та зворотного праймерів; 1мМ у межах винаходу. концентрацій кожного з dCTP, dGTP, dATP та Даний винахід додатково проілюстрований наdTTP, 1ПЦР буферу [10мМ KСІ, 10мМ (NH4)2SO4, ступними прикладами, але не обмежується ними. 20мМ Tris-HCI (рН 8,8), 2мМ MgSO4, 0,1% Triton XПриклад 1: Структура човникової плазміди 100]; та 2,5 U бляшкоутворюючої ДНК полімерази pTB-shuttle-PPCCV-3997 (Stratagene). Проби піддали 16 циклам ампліфікаЧовникова плазміда була сконструйована для ції за наступних умов: денатурація при 94°С протятого, щоб сприяти введенню конкретних модифігом 30 секунд, гібридизація праймерів при 55°С кацій у повний геномний клон кДНК вірусу РРСС. протягом 1 хвилини, та подовження праймерів при Фрагмент 3,997 bр, що представляє собою кінець 68°С протягом 12 хвилин 30 секунд. Після цикліза3' вірусного геному (нуклеотидні положення ції ПЦР, ПЦР-продукт дігестували з 10 одиницями 11,504-15,416, включаючи поліаденозидний хвіст, Орлі для видалення метильованої темплати плазщо містить 21 залишок) та 84 bp з нижніх вектормідної ДНК. Клітини E .coli XL1-Blue перетворюваних послідовностей, був ПЦР-ампліфікований. ли тепловим ударом 4мкл ПЦР-Dрn І дігестованої ПЦР-реакція включала 5нг pCMV-S-P129 плазмідреакційної суміші, що містила мутовані плазміди ної ДНК (патент США №6,500,662 В1), 300нг прята поміщали на LB агарову планшету, що містила ' мого праймеру P-shuttle-Fwd (5 пеніцилін. Колонії зібрали довільно та культивуваACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG - 3') (SEQ ли всю ніч. Плазмідну ДНК готували з використанID NO: 8) : положення 11,504-11,530), 300нг звороням набору Spin Miniprep QIAprep (Qiagen). Наявтного праймеру P-shuttle-Rev праймерів (5'ність бажаної мутації (PGGGNKK) перевіряли ATCTTATCATGTCTGGATCCCCGCGGC - 3') (SEQ нуклеотидним секвенуванням, а плазміді, що ID NO: 9): положення 15,500 дo 15,475), 1мМ кожутворилась у результаті, дали назву pTB-shuttle-Nної з dCTP, dGTP, dATP та dTTP, 1 ПЦР буферу GG. [10мМ KСІ, 10мМ (NH4)2SO4, 20мМ Tris-HCI (рН Як човникова плазміда, що містить GG мута8,8), 2мМ MgSO4, 0,1% Triton Х-100], та 2,5 U бляцію (pTB-shuttle-N-GG), так і повний геномний клон шкоутворюючої ДНК-полімерази (Stratagene) з дикого типу (pCMV-S-P129), містять унікальні сайвикористанням GeneAmp ПЦР системи 2400 ти BsrG І та Spe І (у положеннях 1,192 та 3,963, та (Perkin Elmer). Реакційну суміш нагрівали протягом у положеннях 12,692 та 15,463, відповідно). Після 5 хвилин при 95°С та піддали 35 циклам ампліфідігестії за допомогою цих двох ферментів, фраг 23 89660 24 мент 2,772 bp BsrG I-Spe І був виділений гельрення, а титри, що визначили, дорівнювали 1x102, очищенням з pTB-shuttle-N-GG, а фрагмент 16,120 5x102 та 5x103 БУО/мл для пасажів 1, 2 та 3, відbp BsrG I-Spe І був виділений гель-очищенням з повідно. Вірус Р129 дикого типу генерували з pCMV-S-P129. Ці два фрагменти були ліговані з pCMV-S-P129 та титрували паралельно, резульвикористанням Т4 ДНК-лігази (Invitrogen) для констуючі титри дорівнювали 1x103, 1x104 та 5x105 труювання GGN-модифікованого повного геномноБУО/мл для пасажів 1, 2 та 3, відповідно. Приклад 3: Інфікування свиней вірусом P129го клону кДНК. Штам Е. coli DH5- перетворили GG та парентеральним вірусом Р129 (демонстра10мкл реакційної лігаційної суміші. Бактеріальні ція атенуації вірусу P129-GG) колонії зібрали з планшет LB, що містили ампіциДвадцять одну здорову, кросбредову свиню, лін, та приготували плазмідні ДНК. Ґрунтуючись на що не хворіли на хвороби, викликані вірусом РРСС дігестивних типах, були відібрані повні клони Хmа та Mycoplasma hyopneumoniae та не були щеплені І. Відібрані клони секвенували з метою підтверпроти них, довільно розподілили на 3 лікувальні дження наявності модифікації GGN у повному гегрупи по 7 свиней кожна. У віці, приблизно, 6 тижномному клоні кДНК. Одну з утворених в результанів, свині Т01 одержали плацебо, тоді як свині Т02 ті плазмід позначили як pCMV-S-P129-GG. та Т03 були інтраназально заражені 2,0мл вірусноКлітини MARC-145 вирощували у середовищі го матеріалу, розведеного до 2,5x104 БУО/мл Ігла, модифікованому за способом Дульбекко (5,0x104 БУО/доза) генетично модифікованого ві(DMEM) до якого додали 8% сироватки бичачих русу P129-GG (генерованим з плазміди pCMV-Sзародків (FBS; Gibco BRL), пеніцилін (100 U/мл), та P129-GG) або батьківського вірусу Р129 РРСС стрептоміцин (50мкг/мл) при 37°С з 5% СО2. Кліти(генерованого з плазміди pCMV-S-P129), відповідни висіяли у планшети діаметром 35мм та вироно. Усіх свиней спостерігали кожен день з метою щували до конфлюентності у 70%. Клітини трансвиявлення клінічних ознак, включаючи загальний фекували протягом 24 годин 2мкг плазмідної ДНК стан, депресію, втрату апетиту, чхання, кашель, та pCMV-S-P129-GG з використанням Ліпофектіну респіраторний розлад. Реєстрували ректальні те(Invitrogen). Трансфековані клітини інкубували при мператури та масу тіла. На 0, 4, 7, 10, 14, 21, та 28 37°С у DMEM з додаванням 8% FBS протягом 5 день були взяті зразки крові для виділення вірусу днів. Через 3 дні після трансфекції спостерігався РРСС та серології. Автопсію проводили на 14 (2 РРСС вірусно-специфічний цитопатичний ефект свині/група) та 28 (5 свиней/група) дні, та зібрали (СРЕ) та через 5 днів після трансфекції спостеріпроби тканин (легень та мигдалин). Провели оцінгалось подальше розповсюдження на сусідні кліку тяжкості ураження легень та ущільнення у відтини. Специфічність СРЕ підтвердили шляхом сотках кожної долі легень. У свиней у групах Т02 імунофлюоресцентного клітинного забарвлення з та T03 розвилися ознаки помірного інфікування використанням імунної сироватки кроликів для вірусом РРСС, злущування вірусу у сироватку та неструктурованих протеїнів nsp2 та nsp3 та Nсероконверсії. Неінфіковані контрольні свині (Т01) специфічного MAb SDOW17 (див. Фігуру 1). Кульзалишились негативними до сироваткової віремії туральну надосадкову рідину, одержану з транста негативними по відношенню до антитіл вірусу фекованих клітин, зібрали через 5 днів після транРРСС. сфекції та помітили як 'Р129- GG пасаж 1' (Р1). Порівняно із свинями, інфікованими батьківсьВірус пасажу-1 використовували для інокуляції ким вірусом Р129 (T03), свині, інфіковані вірусом свіжих клітин Маrс-145, а збір клітин, що виросли P129-GG (Т02) злущили меншу кількість вірусу у за 5 днів, позначили як 'пассаж-2' (Р2). Вірус 'пасироватці (Фігури 2а та 2b) та виробили меншу саж-3' (Р3) приготували аналогічно до Р2. Кожен кількість антитіла анті-РРСС ELISA (Фігура 2С та пасаж вірусу перед використанням зберігали в 2D), та нейтралізуючого антитіла (Фігура 2е). аліквотах по 1мл при -80°С. Кожен пасаж вірусу P129-GG титрували шляхом аналізу бляшкоутво 25 89660 26 Титри нейтралізації сироватки визначали як у групі Т02, так і у групі T03 на 7, 14, 21 та 28 день після інфікування. Титри нейтралізації визначали за допомогою TCID50 у планшеті на 96 лунок у двох екземплярах. У кожній лунці 200 БУО вірусу Р129 дикого типу в об'ємі 100мкл поєднали зі 100мкл серійного 2-кратного розведення сироваток (попередньо інактивованих шляхом нагрівання при 56°С протягом 30 хвилин). Суміш інкубували протягом 1 години при 37°С, з наступним інфікуванням клітин. Інфіковані клітини інкубували протягом 5 днів, та були визначені СРЕ. Дані наведені нижче та показують, що у свиней, інфікованих вірусом-мутантом, середні значення титрів нейтралізації були вищими, ніж у свиней, інфікованих батьківським вірусом дикого типу. Однією з ознак інфікування вірусом РРСС є персистенція вірусу у мигдалинах. Тому у всіх інфікованих свиней та у двох фіктивно інфікованих контрольних свиней зібрали мигдалини наприкінці дослідження (через 4 тижні після інфікування) та вивчили вірусну персистенцію шляхом ПЦР зі зворотною транскрипцією. N ген був виявлений шляхом ПЦР зі зворотною транскрипцією в усіх свиней, інфікованих або вірусом GG, або вірусом Р129, тоді як мигдалини, взяті від фіктивно інфіко ваних свиней, залишились негативними. Це вказує на те, що усі інфіковані свині злущили вірус через 4 тижні після інфікування. Для дослідження можливих мутацій у NLS N гену, були секвеновані ПЦР продукти з мигдалин. Для усіх п'яти свиней було знайдено, що вірус GG, стійкий у мигдалинах, мутував у послідовності NLS-2 шляхом введення аргініну у положенні 43 або 44. Вірус Р129 дикого типу з мигдалин не мутував та зберігав послідовність NLS-2 дикого типу. 27 89660 28 Приклад 4: Мутації NLS-2, стійкі до реверсій іншого фрагменту NLS шляхом мутацій. Приклади Мутація P129-GG, описана у Прикладі 2, була таких мутацій, "стійких до реверсій", показані у створена шляхом заміни шести нуклеотидів. Як Таблиці 6 та призначені бути скоріш репрезентапоказано у Прикладі 3, цей вірус здатний до часттивними, ніж обмежуючими. Маючи цю інформакової чи повної реверсії та може відновлювати цію, фахівець у цій галузі зможе представити собі батьківський NLS-негативний фенотип при відносприклади мутацій, стійких до реверсій. но високій частоті завдяки довільній мутації та У Таблиці 8, мутантний вірус P129-d43/44 є природному відбору. Переважні втілення даного делецією амінокислот 43 та 44. Додатково, кодон винаходу, особливо для вакцин, міститимуть досерину у положенні 45 замінено з AGT на ТСТ для даткові нуклеотидні заміщення та/або делеції, зменшення вірогідності його мутації у лізиновий чи призначені для мінімізації вірогідності реверсії та аргініновий кодон. Також, аспарагіновий кодон у вірогідності мутацій інших фланкуючих залишків положенні 49 (ААС) замінений на сериновий кодон до основних залишків, таких, як лізин та аргінін, (ТСС) з тих же причин. Серин, знайдений у половідновлюючи таким чином функціональний фрагженні 49 у деяких польових ізолятах, що зустрічамент NLS в області. Кодони, що потребують дві ються у природі, таким чином, має бути добре пеабо три індивідуальні нуклеотидні заміни для муреносимим. Мінімальний фрагмент pat 7 NLS тації кодонів, що кодують основний залишок, є (PGSKKKS) залишається у цьому мутанті, та може переважними порівняно із тими, що потребують мати часткову активність NLS. Передбачено, що тільки однієї зміни. Вірогідність реверсії мутацій з віруси, що мають часткову активність NLS мають делеціями дуже мала через видалення частини фенотипи, перехідні між вірусом дикого типу (баобласті. Альтернативні кодони можуть бути обрані тьківським) та повними нокаутованими мутаціями з фланкуючих амінокислот, з метою зменшення NLS. Такі віруси можуть бути особливо корисними вірогідності повторного виникнення pat7, pat4, або як вакцини. Інші три мутанти, показані у Таблиці 8 (P129d43/44/46, P129-d44/46/47, та Р129-d46/47/48) є трьома амінокислотами, та також мають заміни кодонів у положеннях 45 та 49, що обговорені вище. Ці мутації відсутні у фрагменті NLS та передбачається, що вони повністю нокаутують актив ність NLS. Очікується, що ці віруси атенуйовані у свиней та особливо корисні як вакцини. Прямий та зворотний праймери для мутацій, описаних у Таблиці 8, наступні: 29 89660 30 був делетований. 15. Композиція за пунктом 14, де обидва залишки 43 та 44 N протеїну були делетовані. 17. Композиція за пунктом 14, де залишки 43, 44 та 46 N протеїну були делетовані. Композиція за пунктом 14, де залишки 44, 46, та 47 N протеїну були делетовані. 19. Композиція за пунктом 14, де залишки 46, 47 та 48 N протеїну були делетовані. 20. Композиція за пунктами 1-19, що містить додаткову нуклеотидну мутацію, заміщення та/або делеції, призначені для мінімізації вірогідності реверсії. 21. Вакцина для захисту свині від інфікування вірусом РРСС, що містить композицію за будьяким з пунктів 1-20 у кількості, ефективній для виклику імунного захисту від інфікування вірусом РРСС; та носій, придатний для ветеринарного використання. 22. Спосіб захисту свиней від інфікування вірусом РРСС, що включає щеплення Опис та приклади, наведені вище, демонструтварини кількістю вакцини за пунктом 20, ефектиють, що області NLS-2 не потрібні для розмноженвною для виклику імунного захисту від інфікування ня вірусу, проте є важливим вірулентним фактовірусом РРСС. 23. Трансфекована клітина-хазяїн, ром для вірусу РРСС, що продемонстровано тим, що містить композицію за будь-яким з пунктів 1-20. що мутував тільки вірус, стійкий у мигдалинах. Ми 24. Спосіб вироблення генетично модифіковатакож показуємо, що NLS у N протеїні вірусу РРСС ного та атенуйованого вірусу РРСС, що включає: позитивно корелює з більшою кількістю титрами а.) мутування послідовності ДНК, що кодує інфекнейтралізуючих антитіл та ELISA. Таким чином, ційну молекулу РНК, що кодує вірус РРСС, для нами було встановлено, що мутації, що знищують вироблення генетично модифікованого вірусу фрагмент NLS-2 послідовності, призводять до РРСС, що містить N протеїн, що був модифіковаутворення атенуйованого штаму вірусу РРСС. ний у, щонайменше, одній консервативній області, Нумерований опис винаходу вибраній з групи, що складається з області NLS-2, 1. Композиція, що містить інфекційний агент області NoLS та області NES, таким чином, щоб РРСС, вибраний з групи, що складається з: а.) консервативна область була елімінована; b.) ввегенетично модифікованого вірусу РРСС, що місдення генетично модифікованого вірусу РРСС у тить N протеїн, що був модифікований у, щонайклітину-хазяїн, здатну підтримувати реплікацію менше, одній консервативній області, вибраної з РРСС. 25. Спосіб за пунктом 24, в якому генетично групи, що складається з області NLS-2, області модифікованим вірусом РРСС є ПівнічноамериNoLS та області NES, таким чином, щоб консерваканський вірус РРСС. 26. Спосіб за пунктом 24, в тивна область була елімінована, та в якій генетичякому генетично модифікованим вірусом РРСС є но модифікований вірус РРСС є атенуйованим; b.) Європейський вірус РРСС. 27. Спосіб за пунктом інфекційної молекули РНК, що кодує генетично 24, в якому клітиною-хазяїном, що здатна підтримодифікований вірус РРСС за а.); та с.) ізольовамувати реплікацію РРСС, є клітина MARC-145. 28. ної полінуклеотидної молекули, що містить посліСпосіб за пунктом 24, в якому клітина-хазяїн, здатдовність ДНК, яка кодує інфекційну молекулу РНК на підтримувати реплікацію РРСС, міститься у b.). 2. Композиція за пунктом 1, що була додатково живій свині. 29. Будь-який з винаходів, описаних у модифікована для того, щоб призвести до елімінуцій заявці або будь-яка з комбінацій пунктів, опивання консервативної області NLS-1. 3. Композисаних вище. ція за пунктом 1, де консервативна область була Цитовані посилання елімінована шляхом введення заміщення некон1. Doan, D. N. P., and Dokland, T. (2003). Structure сервативної амінокислоти. 4. Композиція за пункof the nucleocapsid protein of porcine reproductive том 1 або 2, де консервативна область була, щоand respiratory syndrome virus. Structure 11(11), найменше, частково делетована. 5. Композиція за 1445-1451 пунктом 1, де консервативною областю є область 2. Lee, С, Calvert, J. G., Welch, S.-K. W., and Yoo, D. NoLS. 6. Композиція за пунктом 1, де консерватив(2005). A DNA-launched reverse genetics system for ною областю є область NLS-2. 7. Композиція за porcine reproductive and respiratory syndrome virus пунктом 1, де консервативною областю є область reveals that homodimerization of the nucleocapsid NES. 8. Композиція за пунктом 1, де вірусом РРСС protein is essential for virus infectivity. Virology 331, є Північноамериканський вірус РРСС. 9. Компози47-62. ція за пунктом 1, де вірусом РРСС є Європейський 3. Rowland, R. R., Kervin, R., Kuckleburg, C, вірус РРСС. 10. Композиція за пунктом 8, де конSperlich, Α., and Benfield, D. A. (1999). The сервативною областю є область NLS-2. 11. Компоlocalization of porcine reproductive and respiratory зиція за пунктом 10, де залишками 42 та 43 N проsyndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus теїну є гліцини. 12. Композиція за пунктом 10, де of infected cells and identification of a potential залишками 42 та 43 N протеїну є гліцин, а залишnucleolar localization signal sequence. Virus ком 44 є аспарагін. 13. Композиція за пунктом 10, Research 64(1), 1-12. де область NLS-2 була, щонайменше, частково 4. Rowland, R. R. R., Schneider, P., Fang, Y., делетована. 14. Композиція за пунктом 13, де, Wootton, S., Yoo, D., and Benfield, D. A. (2003). щонайменше, один із залишків 43-48 N протеїну 31 89660 32 Peptide domains involved in the localization of the 7. Wootton, S. K., and Yoo, D. (2003). Homoporcine reproductive and respiratory syndrome virus oligomerization of the porcine reproductive and nucleocapsid protein to the nucleolus. Virology respiratory syndrome virus nucleocapsid protein and 316(1), 135-145. the role of disulfide linkages. Journal of Virology 5. Rowland, R. R. R., and Yoo, D. (2003). Nucleolar77(8), 4546-4557. cytoplasmic shuttling of PPCCV nucleocapsid protein: 8. Yoo, D., Wootton, S. K., Li, G., Song, C, and a simple case of molecular mimicry or the complex Rowland, R. R. (2003). Colocalization and interaction regulation by nuclear import, nucleolar localization of the porcine arterivirus nucleocapsid protein with the and nuclear export signal sequences. Virus Research small nucleolar RNA-associated protein fibrillarin. 95(1-2), 23-33. Journal of Virology 77(22), 12173-12183. 6. Wootton, S. K., Rowland, R. R. R., and Yoo, D. 9. Yoo, D., Welch, S.-K. W., Lee, C, and Calvert, J. G. (2002). Phosphorylation of the porcine reproductive (2004). Infectious clones of porcine reproductive and and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein. respiratory syndrome virus and their potential as Journal of Virology 76(20), 10569-10576. vaccine vectors. Veterinary Immunology and Immunopathology 102, 143-154. 33 89660 34 35 89660 36 37 89660 38 39 89660 40 41 89660 42 43 89660 44 45 89660 46 47 89660 48 49 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 89660 Підписне 50 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601