Спосіб інактивації вірусу ензоотичного енцефаломієліту (хвороби тешена) свиней

Спосіб інактивації вірусу ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней, що включає обробку вірусовмісного матеріалу інактивуючим реагентом, який відрізняється тим, що як інактивуючий реагент застосовують етиленімін концентрацією 0,02 %, при температурі 28 °С і експозиції 10 годин. (19) (21) u200714613 (22) 24.12.2007 (24) 25.03.2008 (46) 25.03.2008, Бюл.№ 6, 2008 рік (72) СОРОКА ВІКТОР ІВАНОВИЧ, UA, ДЕРЕВ'ЯНКО СТАНІСЛАВ ВАСИЛЬОВИЧ, UA, БАБІЧ НІН А ВАСИЛІВНА, U A, БОВА ТЕТЯНА ОЛЕКСАНДРІВН А, U A (73) ІНСТИТУТ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКОЇ МІКРОБІОЛОГІЇ УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ Н АУК, U A 3 31211 зразками антигенів з вірусом інактивованим 10 і 24 години (1,3 зразки таблиці 2), так і в імунізованих антигенами, виготовленими з інактивованого й неінактивованого вірусу (5, 1, 3 зразки таблиці 2) статистично недостовірна (Рівень значимості Р становить відповідно Р>0,5 та Р>0,1 і 0,2). Інактивацію вірусу проводять так: культур у клітин заражають вірусом і витримують в термостаті до прояву його цитопатичної дії. Потім вірусовміщуючу культуральну рідину освітлюють і обробляють хлороформом. Визначають в ній інфекційну активність вірусу і добавляють, як зазначено вище етиленімін. Для його нейтралізації, в кінці процесу інактивації, до рідини добавляють тіосульфат натрію. Ступінь інактивації вірусу визначають шляхом інокуляції культури клітин отриманими матеріалами з використанням 3-х послідовних пасажів. Спосіб інактивації вірусу демонструється прикладом 1. Приклад 1 Моношар перещеплюваної культури клітин лінії СНЕВ (ВНК-21, ПТП або інших чутливи х до тешовірусу культур) інфікують вірусом ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней (ВХТ) в дозі 105 ТЦД і витримують в термостаті при 37°С до прояву його цитопатичної дії на 75-100%. Культуральні ємності з інфікованою культурою клітин тричі заморожують при мінус 18°С і нижче й розморожують при температурі 37°С. Одержану вірусовміщуючу рідину центрифугують 20 хвилин при 3000 об/хв. і до двох частин надосадової рідини добавляють одну частину хлороформу. Суміш гомогенізують 5 хвилин, витримують при 4°С 30 хвилин, а потім знову центрифугують при 2500об/хв. 10 хвилин. Після чого в пробірочній культурі клітин титруванням визначають інфекційну активність вірусу. Потім до вказаної вірусовміщуючої культуральної рідини добавляють етиленімін в концентрації 0,02% і витримують при 28°С 10 годин. Для нейтралізації етиленіміну до рідини добавляють тіосульфат натрію до кінцевої концентрації 2% і витримують при кімнатній температурі 10-30 хвилин. Контролем служить вірусовміщуюча рідина без етиленіміну. Ступінь інактивації вірусу визначають шляхом інокуляції культури клітин отриманими матеріалами з використанням 3-х послідовних пасажів. Етиленімін у вказаній вище концентрації повністю інактивує ВХТ свиней і його цитопатична дія на культур у клітин не проявляється, в той час як в контролі вона характерна для тешовірусів. В таблиці 1 подані результати інактивації вірусу з різними інфекційними титрами і експозиціями. Збереження антигенної активності інактивованого вірусу хвороби Тешена свиней ілюструє приклад 2. Приклад 2 До вірусовміщуючої суспензії з інфекційним титром не нижче 7,0 lg ТЦД50/см 3 виготовленої, як зазначено вище, добавляли етиленімін в концентрації 0,02% і витримували в термостаті при температурі 28°С 10 й 24 години. Після перевірки на ступінь інактивації до суспензії добавляли 4 ад'юванти М6 та М4 згідно настанов по їх застосуванню. Виготовлені таким чином антигени вводили внутрішньом'язово кролям породи "Шиншила" вагою 2,0-2,5кг в дозі 2см 3. Титри антитіл в сироватках крові дослідних кролів визначали в реакції віруснейтралізації в культурі клітин. Контролем служили тварини, яким вводили антиген на основі неінактивованого вірусу. В таблиці 2 подані результати контролю антигенної активності вірусу після його інактивації. Із наведених прикладів видно, що етиленімін проявляє інактивуючу дію на ВХТ в концентрації у вірусовміщуючій культуральній суспензії 0,02%, при температурі інактивації 28°С і експозиції 10 годин. Інактивант не виявляє негативної дії на антигенну активність вірусу протягом 10 і 24 годин. Запропонований спосіб інактивації вірусу може бути застосований для екологічно безпечного виготовлення діагностикумів ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней та вакцини. Кінетика інактивації вірусу ензоотичн енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней е № досліду 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Концентрація етиленіміну (%) 0,02 0,04 0,06 0,08 од 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 Вихідний титр вірусу (lg ТЦД50 /см 3) 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,0 8,0 Інфекційний титр вірус 1 2 3 4 5 6 6,0 7,0 4,5 6,5 7,0 6,5 5,0 6,0 4,5 6,5 6,5 5,5 4,5 5,5 4,0 6,5 6,5 5,0 2,5 4,0 3,5 5,5 5,5 3,5 1,0 4,0 3,0 5,5 5,5 3,0 2,0 0 3,5 2,5 5,0 4,0 2,5 0 0 2,5 1,5 4,0 1,0 Примітка: (-) - інактивація не проводилась; (0) - інфекційну активність вірус не проявляє Титри антитіл в сироватках крові щеплен № зразка 1. 2. 3. 4. 5. Термін інактивації (год.) 10 10 24 24 Контроль Ад'ювант М6 М4 М6 М4 М6 Титри антитіл* через/діб 14 21 28 60 91 45 32 64 32 64 64 32 91 128 64 96 64 91 128 64 96 45 91 64 Примітка: * Величини обернені розведенню сироваток 5 31211 6