Нуклеїнова кислота, яка кодує аутоактивувальний протеїн резистентності рослин до патогенних організмів

1. Нуклеїнова кислота, яка кодує самоактивувальний протеїн резистентності для створення резистентності рослин до патогенних організмів, яка відрізняється тим, що згадана нуклеїнова кислота містить обмежену частину NBS-LRR-гена резистентності, яка простягається від кінця 5' кодувальної ділянки NBS-LRR-гена резистентності в напрямі послідовності до початку NBS-домену NBS-LRR-гена резистентності, причому згаданий NBS-LRR-ген резистентності не є TIR-NBS-LRRгеном резистентності. 2. Нуклеїнова кислота за п. 1, яка кодує амінокислотну послідовність із мотивом DAE. 3. Нуклеїнова кислота за п. 1, яка кодує амінокислотну послідовність із мотивом AVLXDAE. 4. Нуклеїнова кислота за п. 1 із нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, до якої входять: a) послідовність нуклеотидів відповідно до ПОСЛІДОВНОСТІ № 1 або послідовність нуклеотидів, комплементарна до послідовності нуклеотидів відповідно до ПОСЛІДОВНОСТІ № 1, або послідовність нуклеотидів, яка гібридизується з послідовністю нуклеотидів відповідно до ПОСЛІДОВНОСТІ № 1 або з послідовністю нуклеотидів, комплементарною до послідовності нуклеотидів відповідно до ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; 2 (19) 1 3 91542 4 7. Конструкт нуклеїнової кислоти для створення резистентності рослин до патогенів, із: a) промотором, що індукується патогенами, та b) нуклеїновою кислотою за одним з пп. 1-6, що знаходиться під контролем згаданого промотора. 8. Конструкт нуклеїнової кислоти за п. 7, який відрізняється тим, що промотором, що індукується патогенами, є синтетичний промотор. 9. Конструкт нуклеїнової кислоти за п. 8, який відрізняється тим, що синтетичний промотор включає одну або кілька таких комбінацій циселементів: a) блок nxS-mxD, b) блок nxW2-mxD, c) блок nxGstl-mxD, (де n та m означають натуральні числа від 1 до 10). 10. Конструкт нуклеїнової кислоти за п. 9, який відрізняється тим, що комбінація цис-елементів включає: а) нуклеотидну послідовність відповідно до ПОСЛІДОВНОСТІ № 10 або b) нуклеотидну послідовність відповідно до ПОСЛІДОВНОСТІ № 11, або c) нуклеотидну послідовність відповідно до ПОСЛІДОВНОСТІ № 12, або d) похідне нуклеотидної послідовності а)-с) із порівнянними властивостями. 11. Трансгенна рослина з нуклеїновою кислотою або конструктом нуклеїнової кислоти за одним із попередніх пунктів. 12. Частини трансгенної рослини за п. 11. 13. Насіння або посівний матеріал трансгенної рослини за п. 11. 14. Застосування нуклеїнової кислоти або конструкту нуклеїнової кислоти за одним із пп. 1-10 для одержання трансгенної рослини. Цей винахід стосується нуклеїнової кислоти, яка кодує самоактивувальний протеїн резистентності для створення резистентності рослин до патогенних організмів, застосування цієї нуклеїнової кислоти для одержання трансгенних рослин, а також трансгенних рослин. Захворювання рослин, що викликаються грибками, вірусами, нематодами та бактеріями, спричиняють у світовому масштабі значні втрати врожаю, погіршення якості продуктів рослинництва та створюють потребу в обов'язковому застосуванні дорогих хімічних засобів захисту рослин, оскільки природні захисні заходи рослин, за допомогою яких забезпечується захист від численних потенціальних збуджувачів захворювань або обмежується та уповільнюється їхнє поширення, часто виявляються недостатніми. До таких захисних заходів належать гіперчутлива реакція, контрольована загибель клітин тканини-хазяїна, підвищення міцності стінок клітин рослини шляхом лігніфікації та утворення калози, утворення фітоалексинів та продукування PR-протеїнів (протеїнів, пов'язаних із патогенезом). Ключову роль при активуванні індукованих захисних заходів відіграють рослинні гени резистентності (R-гени). Згідно з ген-генною гіпотезою Флора (Flohr), протеїн R-гена взаємодіє з відповідним протеїном мікробного гена авірулентності (Avr-гена) і тим самим спричиняє індуковану захисну реакцію. Множину R-генів можна, залежно від будови R-протеінів, які вони кодують, поділити на 5 класів (Мартін та ін. — Martin et al., 2003). Клас 1 охоплює лише Pto-ген томатів, який кодує серин/треонінкіназу. Однак більшість рослинних Rгенів належить до надродини NBS-LRR-генів, які кодують «паратоп зв'язування нуклеотиду» (NBS) та «збагачене лейцином повторення» (LRR). NBSLRR-гени, які мають на своєму N-кінці структуру «біспіралі» (СС), наприклад, «лейцинової застібкиблискавки», належать до CC-NBS-LRR-генів класу 2. R-гени типу CC-NBS-LRR виявлено у всіх покритонасінних. До класу 3 зараховують R-гени типу TIR-NBS-LRR, які на N-кінці мають замість ССдомену послідовність, гомологічну з тваринною TIR-ділянкою («рецептором утриманого інтерлейкіну»). TIR-NBS-LRR-гени становлять 75% R-генів у Arabidopsis thaliana, але їх не виявлено ні у травах, ані у цукровому буряку (Тянь та ін. — Tian et al., 2004). Четвертий клас R-генів складають CF-гени томатів. CF-протеїни не містять NBS-домену, але мають трансмембранний домен (ТМ) та позаклітинне LRR. До п'ятого класу належить Ха21протеїн із рису, який складається з позаклітинного LRR-домену, трансмембранного домену та внутрішньоклітинного кіназного домену. В той час як R-гени лише слабко експресуються дією промоторів R-генів, сильна конститутивна експресія R-генів класу 1, класу 2 та класу 3 спричиняє активування захисту рослин від патогенних чинників навіть за відсутності відповідних продуктів гена авірулентності і, таким чином, самоактивування R-протеїнів (Танг та ін. — Tang et al., 1999; Олдройд та Стаскавіч — Oldroyd and Staskawicz, 1998; Бендахман та ін. — Bendahmane et al., 2002). Загалом, однак, конститутивна надлишкова експресія R-генів у трансгенних рослинах пов'язана з агрономічно небажаними властивостями, наприклад, із мікронекрозами (Танг та ін., 1999) або з низькорослістю рослин (Фрост та ін. — Frost et al., 2004). Іншим можливим засобом самоактивування Rпротеїнів класу 2 та класу 3 є мутагенез спеціальних стабільних збуджувальних фрагментів амінокислотних мотивів у повних CC-NBS-LRR- або TIRNBS-LRR-протеїнах. Мутагенез послідовностей у NBS- або LRR-домені Rx-гена картоплі (Бандахман та ін., 2002) та NBS-домені гена L6 льону (Гоулз та ін. — Howies et al., 2005) обумовлює утво 5 рення мутантів, які у відсутності відповідного гена авірулентності спричинюють тимчасову експресію загибелі клітин. Експерименти з делеції на Rx-гені показують, що продукти делеції, які складаються з СС-домену та частин NBS-домену, після їхньої тимчасової надлишкової експресії також можуть спричинювати загибель клітин, яка настає швидше, ніж при застосуванні повномірного R-гена. Ці продукти делеції потребують, окрім СС-домену, наявності ще Р-циклу, кінази-2 та повномірної кінази-3 NBSдомену. Навпаки, наслідком подальшого скорочення NBS-домену було сповільнення збудження HR у порівнянні з ефектом повномірного R-гена (Бендахман та ін. — Bendahmane et al., 2002). Самоактивування гена L10 льону — R-гена класу 3 — можна досягти шляхом утворення скороченого TIR-NBS-LRR-протеїну, який складається з TIR-домену та 34 амінокислот NBS-домену, що межує з ним, включаючи Р-цикл (Фрост та ін. — Frost et al., 2004). Незважаючи на те, що відомо кілька способів самоактивування R-генів, до цього часу не описані трансгенні рослини, у яких самоактивування Rпротеїнів мало наслідком підвищення резистентності до грибків без одночасного впливу на агрономічні властивості. Спроби досягти стабільної трансформації двох самоактивувальних варіантів повномірного L6-гена льону під контролем природних промоторів резистентності L6 або індукованого грибком промотора мали наслідком або рослини нормального росту, не резистентні до грибків, або малорослі рослини, резистентні до грибків (Гоулз та ін. - Howies et al., 2005). Таким чином, метою цього винаходу є зміна ефективності захисту рослини проти патогенних чинників таким чином, щоб захисні реакції рослини у випадку нападу патогенних організмів надійно активувалися, однак без негативного впливу на агрономічні властивості рослини. Згідно із цим винаходом, вищезгадана мета досягається за допомогою нуклеїнової кислоти, яка містить обмежену частину NBS-LRR-гена резистентності, яка простягається від кінця 5' кодувальної ділянки NBS-LRR-гена резистентності в напрямі послідовності до початку NBS-домену NBS-LRR-гена резистентності, причому згаданий NBS-LRR-ген резистентності не є TIR-NBS-LRRгеном резистентності. Таку нуклеїнову кислоту можна виділити з рослин або виготовити синтетичним способом. Обмежена частина NBS-LRR-гена резистентності починається біля стартового кодону трансляції (ATG-кодону) і досягає NBS-домену, який відрізняється, по суті, Р-циклом (мотивом кінази1а). Для функціювання частини NBS-LRR-гена резистентності охоплення Р-циклу не є обов'язковим. Інші відрізки NBS- та LRR-доменів NBS-LRRгена резистентності також можуть бути відсутніми. Однак окремі нуклеотиди NBS-домену, у тому числі Р-циклу, можуть залишатися, за умови, що вони не впливають на збудження HR. Термін «самоактивувальний протеїн» означає такий протеїн, який за відсутності відповідних продуктів гена авірулентності викликає активування 91542 6 захисту рослини від патогенних чинників. У цьому відношенні винахід має перевагу, яка полягає у тому, що взаємодія між протеїном резистентності та протеїном авірулентності не є необхідною для створення резистентності проти патогенів, внаслідок чого захисні реакції рослини можуть протікати значно більш безпосередньо і, в кінцевому підсумку, більш надійно. Самоактивування може досягатися, наприклад, внаслідок тимчасової надлишкової експресії гена резистентності. Термін «надлишкова експересія» означає, що інтенсивність експресії природного промотора R-гена перевищується до такого ступеня, що вона активується каскадом передавання сигналу, регульованим R-протеїном, за відсутності відповідного продукту гена авірулентності мікробного походження. Таким чином відбувається активування захисту проти патогенів, який виявляється у формі часткової або повної резистентності проти захворювань. Самоактивування протеїну резистентності може бути досягнуто також шляхом скорочення повномірних R-генів BvKWS3_165, BvKWS3_135, Bv13033 та Βν12069 цукрового буряка, а також гена StR3a картоплі до 5'-ділянки, яка кодує тільки N-кінець протеїну, який не містить NBS- та LRRдоменів, можливо, включно СС-домен. N-кінець, що не містить NBS-домену, означає в цьому випадку, що 5'-кінець кодувальної ділянки NBS-LRRгена резистентності простягається у бік 3'-кінця тільки до такого ступеня, що його ефективна структура не охоплює Р-цикл NBS-LRR-гена резистентності. У найпростішому випадку Р-цикл повністю видаляється. Однак у скороченому гені резистентності можуть залишатися окремі нуклеотиди Рциклу за умови, що вони не сповільнюють збудження HR. При скороченні NBS-LRR-гена резистентності до N-кінця видаляються також мотиви кінази-2, кінази-З, GLPC та MHD, у тому числі обмежувальні амінокислоти, відповідно до інформації банків даних Prosite (Берош та ін. — Bairoch et al., 1996) та Pfam (Зоннгаммер та ін. — Sonnhammer et al., 1997), а також визначень послідовностей, поданих у публікації Бендахмана та ін. (Bendahmane et al.) (2002). Застосування скорочених R-генів 165_#176, 135_#147, 13033_#159 та Bv12069, а також StR3a#1-155 викликає прискорене спричинення загибелі клітин у рослинних тканинах у порівнянні з впливом повномірних R-генів. Таким чином у комбінації з промотором, який може індукуватися патогенами, можна досягти покращення індукованого захисту рослин. Це твердження стосується також тих R-протеїнів, які не можуть самоактивуватися під впливом відомих мутацій в MHD- або VHDдоменах, як показує експресія генів 135_#147 та BvKWS3_135-D480V. Скорочені R-гени раніше набувають здатності до спричинення загибелі клітин, ніж повномірні Rгени, і у випадку скорочених R-генів для досягнення концентрації протеїну, критичної з точки зору захисту від патогенів, достатньою є менша експресія, як показано для R-гена 135_#147. Р-цикл або мотив кінази-1а є спільним із мотивом кінази-2 та кінази-3, характерним для протеї 7 нів, що гідролізують АТР або GTP (Траут - Traut, 1994), і знаходиться в NBS-домені NBS-LRR-гена. Р-цикл характеризує Т-кінцеву ділянку NBSдомену (Бендахман та ін. - Bendahmane et al., 2002). Консенс-послідовністю Р-циклу для R-генів Prf, Rx, Rpm1, BvKWS3_135, BvKWS3_133 та BvKWS3_165 є така: (I/V)VG(M/I)GG(L/I/S)GKTT(L/V). Несподівано виявлено, що особливо ефективне самоактивування можливе при застосуванні нуклеїнових кислот, які кодують послідовність амінокислот із мотивом DAE. Зокрема, такі нуклеїнові кислоти кодують мотив AVLXDAE. Консенс-мотиви DAE та AVLXDAE знаходяться, наприклад, у ПОСЛІДОВНОСТІ № 13 та ПОСЛІДОВНОСТІ № 15. Перевага віддається послідовностям нуклеїнових кислот із групи, до якої входять: а) послідовність нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 1 або послідовність нуклеотидів, комплементарна до послідовності нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 1, або послідовність нуклеотидів, яка гібридизується з послідовністю нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 1 або з послідовністю нуклеотидів, комплементарною до послідовності нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; b) послідовність нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 2 або послідовність нуклеотидів, комплементарна до послідовності нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 2, або послідовність нуклеотидів, яка гібридизується з послідовністю нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 2 або з послідовністю нуклеотидів, комплементарною до послідовності нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 2; c) послідовність нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 3 або послідовність нуклеотидів, комплементарна до послідовності нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 3, або послідовність нуклеотидів, яка гібридизується з послідовністю нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 3 або з послідовністю нуклеотидів, комплементарною до послідовності нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 3; d) послідовність нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 4 або послідовність нуклеотидів, комплементарна до послідовності нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 4, або послідовність нуклеотидів, яка гібридизується з послідовністю нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 4 або з послідовністюнуклеотидів, комплементарною до послідовності нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 4; є) послідовність нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 16 або послідовність нуклеотидів, комплементарна до послідовності нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 16, або послідовність нуклеотидів, яка гібридизується з послідовністю нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 16 або з послідовністю нуклеотидів, комплементарною до послідовності нуклеотидів із ПОСЛІДОВНОСТІ № 16. Обмежена частина NBS-LRR-гена резистентності у послідовностях нуклеотидів, яким віддається перевага, простягається, як вказано нижче: для ПОСЛІДОВНОСТІ № 1 від поз. 124 до поз. 654; для ПОСЛІДОВНОСТІ № 2 від поз. 155 до поз. 598; 91542 8 для ПОСЛІДОВНОСТІ № 3 від поз. 94 до поз. 573; для ПОСЛІДОВНОСТІ № 4 від поз. 194 до поз. 694. Поняття «гібридизація» у значенні, вживаному в цьому описі, означає гібридизацію у звичайних умовах, описаних Сембруком та ін. (Sambrook et al.,1989), у варіанті, якому віддається перевага, у жорстких умовах. Жорсткими умовами гібридизації є, наприклад, такі: гібридизація у 4xSSC при 65°С із подальшим кількаразовим промиванням 0,1xSSC при 65°С при загальній тривалості приблизно 1 год. Менш жорсткими умовами гібридизації є наприклад, такі: гібридизація у 4xSSC при 37°С із подальшим кількаразовим промиванням 1xSSC при кімнатній температурі. Вислів «жорсткі умови гібридизації» може означати також гібридизацію при 68°С у 0,25 Μ фосфаті натрію, рН 7,2, 7% SDS, 1 мМ EDTA та 1% BSA протягом 16 год із подальшим дворазовим промиванням 2xSSC та 0,1% SDS при 68°С. Відповідно до варіантів, яким віддається перевага, ген резистентності, який кодує самоактивувальний протеїн резистентності, походить із цукрового буряка або картоплі. Відповідно до інших варіантів, яким віддається перевага, нуклеїнова кислота за цим винаходом кодує амінокислотну послідовність з однією з консенс-послідовностей з ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 1315. У межах консенс-послідовностей функціонально рівноцінні амінокислоти можуть взаємно замінюватися, наприклад, Asp на Glu, Leu на Не, Ala або Val, Arg на Lys, Phe на Тгр і навпаки. Обидві консенс-послідовності з ПОСЛІДОВНОСТІ № 13 та ПОСЛІДОВНОСТІ № 14 являють собою два функціональні блоки, які можуть не знаходитися на фіксованій відстані один від одного. Відстань між обома блоками у варіанті, якому віддається перевага, визначається консенспослідовністю з ПОСЛІДОВНОСТІ № 15, а також консенс-послідовністю за Фіг. 10. Нуклеїнова кислота за цим винаходом у варіанті, якому віддається перевага, може бути комбінована з промотором, який може індукуватися патогенами. Промотор, який може індукуватися патогенами, активується у відповідь на інфікування тканини-хазяїна збудником захворювання, наприклад, шкідливим грибком, мікробом, вірусом або нематодою. Промотор, який може індукуватися патогенами, під час спроби інфікування або успішного інфікування рослинної тканини має вищу активність, ніж у неінфікованій рослинній тканині. Промотори, які можуть індукуватися патогенами, відомі фахівцям. Прикладами промоторів, які можуть індукуватися патогенами, є промотор хітинази (Самак та Шах - Samac and Shah, 1991), промотор глюканази (Генніг та ін. - Hennig et al., 1993) та промотор ргр-1 (Мартіні та ін. - Martini et al., 1993). Шляхом індукованої патогенами надлишкової експресії R-гена можна запобігти негативним наслідкам конститутивної експресії, наприклад, малорослості або зниженню врожайності рослин. 9 Особливо ефективними промоторами виявилися синтетичні промотори. Тут мова йде про промотори, одержані молекулярно-біологічними способами, які в таких варіантах не зустрічаються у природі. Синтетичним промотором є мінімалізований промотор, який, окрім мінімального промотора, містить один або кілька відповідно вибраних певних цис-елементів. Ці цис-елементи є місцями приєднання протеїнів зв'язування ДНК, наприклад, факторів транскрипції, і вони виділені з природних промоторів, є похідними раніше виділених циселементів або одержані відповідно орієнтованими способами рекомбінації та вибрані відповідними методами. У порівнянні з природним промотором синтетичний промотор внаслідок своєї простішої структури активується лише незначною кількістю екзогенних та ендогенних збудників і тому піддається більш специфічному регулюванню. Мінімальний промотор або «скелетний» промотор являє собою амінокислотну послідовність, яка включає місця приєднання базального комплексу транскрипційних факторів та уможливлює точне ініціювання транскрипції під впливом РНКполімерази II. Характерними мотивами послідовності мінімального промотора є блок ТАТА, елемент інитіатора (Іnr), «елемент розпізнавання TFBII» (BRE) та «елемент подальшого скелетного промотора» (DPE). Ці елементи можуть входити до складу мінімального промотора поодинці або в комбінації. Мінімальний промотор або мотиви його послідовності можна одержувати з будь-якого рослинного або вірусного гена. У межах обсягу цього винаходу розроблено нові синтетичні промотори, які самі по собі можуть бути застосовані для одержання резистентних до патогенів рослин у комбінації з відомими генами резистентності, які не обов'язково кодують самоактивувальний протеїн резистентності. При цьому мова йде про промотори типу мінімальних промоторів nxS-mxD, nxW2-mxD та nxGst1-mxD, отже, синтетичний промотор включає одну або кілька таких комбінацій цис-елементів: а) блок nxS-mxD, b) блок nxW2-mxD, c) блок nxGst1-mxD (де n та m означають натуральні числа від 1 до 10). БлокБ (CAGCCACCAAAGAGGACCCAGAAT) із нуклеотидною послідовністю з ПОСЛІДОВНОСТІ № 6, блок W2 (TTATTCAGCCATCAAAAGTTGACCAATAAT) із нуклеотидною послідовністю з ПОСЛІДОВНОСТІ № 7, блок D (TACAATTCAAACATTGTTCAAACAAGGAACC) із нуклеотидною послідовністю з ПОСЛІДОВНОСТІ № 9 та блок Gst (TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAAC), а також скелетні послідовності цих блоків, важливі для їхніх функцій, описані Раштоном та ін. (Rushton et al., 2002). Промотори відрізняються, залежно від вибору елементів (nxS-mxD, rrxW2-mxD або nxGst1-mxD), своєю базовою активністю, здатністю до індукування патогенами, кінетикою активації та силою 91542 10 промотора, як показано, наприклад, для промоторів із такими комбінаціями цис-елементів: 2xS-2xD із нуклеотидною послідовністю з ПОСЛІДОВНОСТІ № 10, 2xW2-2xD із нуклеотидною послідовністю з ПОСЛІДОВНОСТІ № 11 та 2xGst1-2xD із нуклеотидною послідовністю з ПОСЛІДОВНОСТІ № 12. Властивості синтетичного промотора можна модифікувати шляхом варіювання кількості циселементів (n, m=1...10) відповідно до потреб експресії гена. Зіставлення промотора 2xS-2xD із варіантами 2xS-4xD, 4xS-2xD та 4xS-4xD показує, що середня сила промотора підвищується при застосуванні тетрамерів у порівнянні з промотором, що складається з димерів. Крім того, здатність до індукування патогенами підвищується при переході від димер-димерного промотора (2xS-2xD) до тетрамер-димерного та димер-тетрамерного промоторів (4xS-2xD, 2xS-4xD) і далі до тетрамертетрамерного промотора (4xS-4xD) у всі часові моменти вимірювання. Паралельно з підвищенням сили промотора та здатності до індукування патогенами в описуваному прикладі має місце також підвищення базової активності промотора, що містить тетрамери. Цей приклад показує, що важливі властивості промоторів визначаються кількістю цис-елементів, та що для будь-якого технічного завдання можуть бути створені та ідентифіковані оптимальні варіанти промоторів. Відповідні результати, однак, можна одержати також із застосуванням комбінацій цис-елементів, які являють собою похідні нуклеотидних послідовностей з ПОСЛІДОВНОСТІ № 10, ПОСЛІДОВНОСТІ № 11 або ПОСЛІДОВНОСТІ № 12, та забезпечити порівнянні властивості комбінацій циселементів нуклеотидних послідовностей з ПОСЛІДОВНОСТІ № 10, ПОСЛІДОВНОСТІ № 11 або ПОСЛІДОВНОСТІ № 12. Промотори 2хS-2хD-мінімальний промотор та 2хW2-2хD-мінімальний промотор комбінуються, наприклад, із чотирма повномірними R-генами BvKWS3_133, BvKWS3_123, BvKWS3_135 та BvKWS3_165 та трансформуються у цукрових буряках. Випробування резистентності трансгенних рослин до грибків із застосуванням найважливішого шкідливого грибка цукрових буряків Cercospora beticola, який викликає плямистість листя, виявило підвищення резистентності під впливом кожного з вищезгаданих конструктів, причому трансгенні рослини не відрізнялися від нетрансгенних рослин ні ростом, ні іншими агрономічними властивостями. Ці результати свідчать, що при застосуванні промотора, що індукується патогенами, в принципі можливо досягти надлишкової експресії R-гена, який викликає загибель клітин, і тим самим забезпечити підвищену резистентність до захворювання без негативного впливу на розвиток рослин. Застосування промотора, оптимізованого шляхом вибору сприятливої кількості повторень циселементів, уможливлює подальше підвищення резистентності до захворювання. Цей винахід стосується також трансгенних рослин, трансформованих новим конструктом нуклеїнової кислоти, зокрема, цукрових буряків як цілих 11 рослин, частин таких рослин, наприклад, насіння або розсади, а також застосування нового конструкту нуклеїнової кислоти для одержання трансгенних рослин. Винахід описано нижче більш детально з посиланнями на рисунки та приклади. Винахід, описаний стосовно цукрового буряка, взятого за приклад, можна без ускладнень застосувати з іншими корисними рослинами, з яких можна виділити гени резистентності. Фігури На Фіг. 1 показано карту бінарного вектора pER-35Sluci, застосованого-для тимчасової експресії R-гена, індукованого Agrobacterium tumefaciens, у листі цукрових буряків. Цей вектор несе перерваний інтроном ген люциферази з Photinus pyralis, який не може експресуватися в A. tumefaciens. На Фіг. 2 показано спричинення загибелі клітин у листі цукрових буряків після тимчасової експресії R-гена BvKWS3_133 під впливом Agrobacterium tumefaciens. У той час як тимчасова експресія конструкту pER-35Sluci викликає сильну активність гена-репортера у листі буряків, експресія конструкту pER133-35Sluci спричинює загибель клітин, і, отже, активність гена-репортера не може бути виміряна. На Фіг. 3 показано вектор pCaMV-2, який був застосований для тимчасової біолістичної трансформації листя цукрових буряків. Повномірні та скорочені R-гени були одержані, як описано у цьому документі, під контролем подвоєного промотора 35S. На Фіг. 4 показано спричинення загибелі клітин у листі цукрових буряків після тимчасової експресії R-генів BvKWS3_123, BvKWS3_133 та BvKWS3_165 шляхом біолістичної трансформації. Гени BvKWS3_123, BvKWS3_133 та BvKWS3_165 знаходяться під контролем подвоєного промотора 35S (d35S) і були котрансформовані із застосуванням конструкта гена-репортера p70S-luc. Активність гена-репортера вимірювалася через 20 год після трансформації. Шляхом збудження гіперчутливої реакції активність гена-репортера знижується у порівнянні з контролем (порожнім вектором pCaMV-2 та p70S-luc). На фігурі представлено середні значення для трьох незалежних повторних досліджень, які включали в цілому 9 одиничних дослідів для кожного конструкта. Стандартне відхилення показано відрізками, які характеризують похибку. На Фіг. 5 показано посилене спричинення загибелі клітин під впливом експресії 5'-кінцевої ділянки R-гена BvKWS3_165 у порівнянні з експресією повномірного R-гена BvKWS3_165. N-кінцева ділянка та повномірний ген були котрансформовані під контролем промотора d35S (p70S-165_#175 та p70S-BvKWS3_165) конструктом p70S-luc шляхом біолістичної трансформації у листі цукрових буряків. На фігурі представлено середні значення для трьох незалежних повторних досліджень, які включали в цілому 9-12 одиничних дослідів для кожного конструкта. На Фіг. 6 показано спричинення загибелі клітин під впливом експресії повномірного R-гена 91542 12 BvKWS3_135 у порівнянні з посиленим спричиненням загибелі клітин під впливом 5'-кінцевої ділянки 135_#147 R-гена BvKWS3_135. Повномірний R-ген та N-кінцева ділянка 135_#147 були котрансформовані під контролем промотора d35S (p70SBvKWS3_135 та p70S-135_#147) конструктом p70S-luc шляхом біолістичної трансформації у листі цукрових буряків. На фігурі представлено середні значення для двох незалежних повторних досліджень, які включали в цілому 9-12 одиничних дослідів для кожного конструкта. На Фіг. 7 показано посилене спричинення загибелі клітин під впливом експресії 5'-кінцевої ділянки 13033_#159 R-гена Bvl3033 у порівнянні з експресією повномірного R-гена Βν13033. Повномірний R-ген та N-кінцева ділянка 13033_#159 були котрансформовані під контролем промотора d35S (p70S-13033 та p70S-13033_#159) конструктом p70S-luc шляхом біолістичної трансформації у листі цукрових буряків. На фігурі представлено середні значення для двох незалежних повторних досліджень, які включали в цілому 9-12 одиничних дослідів для кожного конструкта. На Фіг. 8 показано спричинення загибелі клітин під впливом експресії R-гена Bvl2069. На Фіг. 9 показано самоактивування протеїну BvKWS3_135 під впливом скорочення до 5'ділянки клону кДНК 135_#147 у порівнянні з мутацією мотиву VHD NBS-домену. На Фіг. 10а-с показано зіставлення амінокислотних послідовностей скорочених самоактивувальних протеїнів Bvl2069, Bvl3033_#159, BvKWS135_#147, BvKWS3_165_#175 та StR3a-#l155 між собою, а також із порівняльними послідовностями несамоактивувальних скорочених протеїнів резистентності з картоплі (RX-160) та StRl (355540), а також повномірні R-протеїни типу NBS-LRR з Arabidopsis thaliana (AtAB028617), квасолі (PvulgarisJ71), рису (OsativaAP003073), соєвих бобів (GmaxKR4) та томатів (Tomato-12). Виділено консенс-послідовності. На Фіг. 11 показано, що делеція амінокислот 147-175 значно знижує здатність протеїну 165_#175 до самоактивування. На Фіг. 12 показано активування синтетичного промотора 2xS-2xD у трансгенних цукрових буряках після ураження Cercospora beticola. На Фіг. 13 показано активування синтетичного промотора 2xW2-2xD у трансгенних цукрових буряках після ураження Cercospora beticola. На Фіг. 14 показано зіставлення активності генів-репортерів промоторів 2xS-2xD, 4xS-2xD, 2xS4xD та 4xS-4xD у трансгенних цукрових буряках після ураження Cercospora beticola. На Фіг. 15 та Фіг. 16 показано комбінації повномірних R-генів 123, 133, 135, 165 із синтетичним промотором 2xS-2xD. На Фіг. 17 та Фіг. 18показано комбінації повномірних R-генів 123, 133, 135, 165 із синтетичним промотором 2xW2-2xD. На Фіг. 19 показано підвищення резистентності трансгенної лінії цукрових буряків PR68-6 до шкідливого грибка Cercospora beticola у порівнянні з нетрансгенним контролем 3DC4156. 13 На Фіг. 20 показано підвищення резистентності трансгенної лінії цукрових буряків PR70-32 до Cercospora beticola у порівнянні з нетрансгенним контролем 3DC4156. На Фіг. 21 та Фіг. 22 показано комбінації Nкінцевих ділянок R-генів 165_#176 та 12069 із синтетичними промоторами 2xS-2xD та 2xW2-2xD. Приклади Виявлення збудження швидкої реакції резистентності у листі цукрових буряків під впливом надлишкової експресії гена BvKWS3 133 Тимчасова надлишкова експресія повномірного клону кДНК гена BvKWS3_133 у листі цукрових буряків під впливом Agrobacterium tumefaciens спричинює швидку загибель клітин без помітних явищ некрозу. Клон кДНК гена BvKWS3_133 був комбінований з промотором d35S та вбудований у бінарний вектор pER-35Sluci (Фіг. 1). Одержаний вектор має позначення pER133-35Sluci. Вектори pER-35Sluci та pER133-35Sluci трансформували у штамі Agrobacterium C58C1 (Ан — An, 1987). Позитивні агробактерії для тимчасової експресії культивували протягом 4-5 год у 50 мл середовища LB, яке містило 100 мг/мл спектиноміцину та 20 мкМ ацетосирінгону. Потім бактерії відділяли центрифугуванням, осад змішували з розчином 10 мМ MgCl2, 10 мМ MES, 100 мкМ ацетосирінгону та встановлювали густину бактерій OD600=0,1. Суспензію бактерій залишали на 2-3 год, після чого за допомогою шприца місткістю 2,5 мл впорскували через нижній бік у листя цукрових буряків (вік рослин 10 тижнів). Після інкубування при 25°С у культивувальній шафі на 1-й день, 2-й день та 5-й день після інокуляції у трансформованому листі вимірювали активність гена-репортера люциферази Photinus pyralis. З цією метою визначали активність люциферази із застосуванням системи для проб на люциферазу (Luciferase Assay System, виробник фірма Promega, Маннгайм, Німеччина) та люмінометра Sinus (виробник фірма Berthold Detection System GmbH, Пфорцгайм, Німеччина) за методикою виробника. Для одержання придатного для вимірювання екстракту ферменту для кожного вимірювання вирізали два зразка листя. Для кожного конструкту виконували 8 вимірювань кожного дня. Проби листя з доданням морського піску гомогенізували у ступці з 10-кратним об'ємом (на одиницю маси) пасивного лізисного буфера (PLB). Надосадову рідину переносили у пробірку Епендорфа місткістю 1,5 мл і центрифугували протягом 5 хв при 4° С та 20000g. Прозору надосадову рідину відбирали, і для кожного вимірювання активності люциферази використовували 10 мкл необробленого екстракту. У листі цукрових буряків, трансформованому контрольним конструктом pER-35Sluci, виявлено у перший день незначну активність люциферази, а на другий та третій дні — активність відповідно 124000 та 116000 RLU/мг листової тканини. У листі, трансформованому із застосуванням конструкту pER133-35Sluci, у всіх трьох дослідах не виявлено підвищення активності у порівнянні з показниками для листя, інокульованого MgCl2 (Фіг. 2). Таким чином, тимчасова експресія клону кДНК BvKWS3_133 спричи 91542 14 няє дуже швидку загибель клітин в інокульованому листі цукрових буряків. Спричинення загибелі клітин у листі цукрових буряків під впливом конститутивної експресії генів BvKWS3 123. BvKWS3 133 та BvKWS3 165 R-ген BvKWS3_133, а також R-ген BvKWS3_165 із нуклеотидною послідовністю з ПОСЛІДОВНОСТІ № 5 та R-ген BvKWS3_123 були комбіновані з подвійним промотором 35S вектора pCaMV-2 (Фіг. 3). Одержані вектори мають позначення p70S-BvKWS3_133, p70S-BvKWS3_l65 та p70S-BvKWS3_123. Для випробування функціональності R-генів конструкти p70S-BvKWS3_133, P70S-BvKWS3_l65 та P70S-BvKWS3_123 тимчасово експресували з вектором гена-репортера p70Sluc у листі цукрових буряків шляхом біолістичної трансформації за Шмідтом та ін. (Schmidt et al., 2004). Як позитивний контроль застосовували порожній вектор pCaMV-2 у комбінації з вектором гена-репортера p70S-luc. На відміну від роботи Шмідта та ін. (Schmidt et al., 2004), нормалізувальний вектор не застосовували. Активність люциферази визначали через 20 год після трансформування із застосуванням системи Luciferase Assay System (виробник фірма Promega, Маннгайм, Німеччина). Експерименти з трансформування повторювали тричі, причому в кожному експерименті використовували по 9 паралельних проб для кожного конструкту. Після одержання середніх значень із трьох експериментів виявлено, що у порівнянні з активністю люциферази в дослідах із порожнім вектором (позитивним контролем), взятою за 100%, активність гена-репортера в дослідах із p70S-BvKWS3_133 становила лише 37,7%, у дослідах із p70S-BvKWS3_165 - лише 66% та у дослідах із p70S-BvKWS3_123 - лише 68,7% (Фіг. 4). Таким чином, сильна експресія R-генів BvKWS3_133, BvKWS3_165 та BvKWS3_123 під впливом промотора d35S спричинює загибель клітин або гіперчутливу реакцію у частині трансформованих клітин, яка перешкоджає коекспресії спільно трансформованого вектора генарепортера. Тим самим показано, що сильна експресія трьох згаданих R-генів спричиняє загибель клітин або HR у відсутності відповідного продукту гена авірулентності. Прискорення загибелі клітин під впливом 5'ділянки гена BvKWS3 165 v порівнянні з повномірним клоном кДНК BvKWS3 165 Виходячи з повномірного клону кДНК BvKWS3_165 із нуклеотидною послідовністю з ПОСЛІДОВНОСТІ № 5, у конструкті p70SBvKWS3_165 була ампліфікована 5'-ділянка гена за допомогою Pfu-полімерази (стратагена) із застосуванням праймерів S316 (CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG) та S318 (CTGGATCCTCACCTCCGTTCTTCATGTTGCTCTA CC), та одночасно у кодувальну ділянку був введений стоп-кодон. Ампліфікована ділянка відповідає нуклеотидній послідовності з ПОСЛІДОВНОСТІ № 1 та кодує амінокислотну послідовність 1-175 BvKWS3_165 (Фіг. 10). У цьому випадку амінокислотна послідовність охоплює лише N-кінцеву ділянку BvKWS3_l65 та не включає ні NBS-, ні LRRдоменів (Фіг. 10). Продукт PCR був фрагментова 15 ний за допомогою рестрикційних ферментів SacII та ВатНІ та клонований у вектор pCaMV-2. Одержаний вектор має позначення p70S-165_#175. Придатність конструктів p70S-BvKWS3_l65 та p70S-l65_#175 для спричинення загибелі клітин у листі цукрових буряків кількісно оцінювали шляхом тимчасових біолістичних трансформацій. Для цього кожний вектор котрансформували з вектором гена-репортера p70S-luc. Як позитивний контроль застосовували порожній вектор pCaMV-2 у комбінації з вектором гена-репортера p70S-luc. У порівнянні з трансформацією порожнього вектора (pCaMV-2), трансформація p70S-BvKWS3_165 спричиняє вимірювану активність гена-репортера 65%, а трансформація p70S-165_#175 — лише 38% (Фіг. 5). Цей результат свідчить, що ексклюзивна експресія N-кінця 165_#175, який охоплює 175 амінокислот, спричиняє більш інтенсивну загибель клітин у листі цукрових буряків, ніж застосування повномірного протеїну BvKWS3_165, який містить 1066 амінокислот. Під впливом експресії 165_#175 гине більша кількість трансформованих клітин листя, ніж у випадку експресії BvKWS3_165. Причиною цієї відмінності є нова, більш інтенсивна форма самоактивування R-протеїну, яка спричиняється скороченням до N-кінця. Прискорення загибелі клітин під впливом 5'ділянки гена BvKWS3 135 у порівнянні з повномірним клоном кДНК BvKWS3_135 Виходячи з повномірного клону кДНК BvKWS3__135, у конструкті p70S-BvKWS3_135 була ампліфікована 5'-ділянка гена за допомогою Pfu-полімерази (стратагена) із застосуванням праймерів S316 (CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG) та S330 (CTGGATCCTCAGGGAGAACTCCATCTGGGTGGT CC), та одночасно у кодувальну ділянку був введений стоп-кодон. Ампліфікована ділянка відповідає нуклеотидній послідовності з ПОСЛІДОВНОСТІ № 2 та кодує амінокислотну послідовність 1-147 BvKWS3_135 (Фіг. 10). У цьому випадку амінокислотна послідовність охоплює лише N-кінцеву ділянку BvKWS3_135 та не включає ні NBS-, ні LRRдоменів або мотивів із цих доменів. Продукт PCR був фрагментований за допомогою рестрикційних ферментів SacII та ВаmНІ та клонований у вектор pCaMV-2. Одержаний вектор має позначення p70S-135_#147. Придатність конструктів p70SBvKWS3_135 та p70S-135_#147 для спричинення загибелі клітин у листі цукрових буряків кількісно оцінювали шляхом тимчасових біолістичних трансформацій. Для цього кожний вектор котрансформували з вектором гена-репортера p70S-luc. Як позитивний контроль застосовували порожній вектор pCaMV-2 у комбінації з вектором генарепортера p70S-luc. У порівнянні з трансформацією порожнього вектора (pCaMV-2), трансформація p70S-BvKWS3_135 спричиняє вимірювану активність гена-репортера 74,5%, а трансформація p70S-135_# 147 - лише 58,5% (Фіг. 6). Цей результат свідчить, що експресія повномірного клону BvKWS3_135 спричиняє спричинення загибелі клітин у трансформованій тканині. Однак ексклюзивна експресія N-кінця 135_#147, який охоплює 175 амінокислот, спричиняє більш інтенсивну за 91542 16 гибель клітин у трансформованому листі цукрових буряків, ніж застосування протеїну BvKWS3_135, що складається з 844 амінокислот. Під впливом експресії 135_#147 гине більша кількість трансформованих клітин листя, ніж у випадку експресії BvKWS3_135. Причиною цієї відмінності є нова, більш інтенсивна форма самоактивування Rпротеїну, яка спричиняється скороченням до Nкінця. Прискорення загибелі клітин під впливом 5'ділянки гена Вv13033 у порівнянні з повномірним клоном кДНК Вv13033 Виходячи з повномірного клону кДНК Вv13033, у конструкті p70S-13033 була ампліфікована 5'ділянка гена за допомогою Pfu-полімерази (стратагена) із застосуванням праймерів S316 (CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG) та S333 (CTGGATCCTCAAGAACAAGTCTCAGGCCTTCTGT T), та одночасно у кодувальну ділянку був введений стоп-кодон. Ампліфікована ділянка відповідає нуклеотидній послідовності з ПОСЛІДОВНОСТІ № 3 та кодує амінокислотну послідовність 1-159 Вv13033 (Фіг. 10). У цьому випадку амінокислотна послідовність охоплює лише N-кінцеву ділянку Вv13033 та не включає ні NBS-, ні LRR-доменів або мотивів із цих доменів. Продукт PCR був фрагментований за допомогою рестрикційних ферментів SacII та ВатНІ та клонований у вектор pCaMV2. Одержаний вектор має позначення p70S13033_#159. Придатність конструктів p70S-13033 та p70S-13033_#159 для спричинення загибелі клітин у листі цукрових буряків кількісно оцінювали шляхом тимчасових біолістичних трансформацій. Для цього кожний вектор котрансформували з вектором гена-репортера p70S-luc. Як позитивний контроль застосовували порожній вектор pCaMV2. У порівнянні з трансформацією порожнього вектора (pCaMV-2), трансформація p70S-13033 спричиняє вимірювану активність гена-репортера 95%, а трансформація p70S-13033_#159 - лише 68% (Фіг. 7). Цей результат свідчить, що експресія повномірного клону Вv13033 спричиняє лише слабке спричинення загибелі клітин у трансформованій тканині. Ексклюзивна експресія N-кінця 13033_#159, який охоплює 159 амінокислот, спричиняє інтенсивну загибель клітин у трансформованому листі цукрових буряків. Причиною цієї відмінності є нова, більш інтенсивна форма самоактивування R-протеїну, яка спричиняється скороченням до N-кінця. Спричинення загибелі клітин листя цукрових буряків 5'-ділянкою гена Вv12069 R-ген Bv12069 з нуклеотидною послідовністю з ПОСЛІДОВНОСТІ № 4 кодує N-кінцеву ділянку Rпротеїну, яка включає 166 амінокислот. Протеїн Bv12069 не включає ні NBS-, ні LRR-доменів, але виявляє чітку гомологію з N-кінцями самоактивуваьних R-протеїнів 165_#175, 135_#147 та 13ОЗЗ_#159, які містять відповідно 175, 147 та 159 амінокислот (Фіг. 10). Цей клон кДНК був комбінований за допомогою подвійного промотора 35S вектора pCaMV-2 (Фіг. 3) з одержанням вектора p70S-12069. Для випробування функціональності гена Bv12069 конструкт p70S-12069 був тимчасово експресований шляхом біолістичної трансформації 17 у комбінації з вектором гена-репортера p70S-luc у листі цукрових буряків. Активність гена-репортера у - листі, трансформованому p70S-12069 та p70Sluc, при трьох незалежих дослідах становила лише 51% активності, виміряної для позитивного контроля (порожнього вектора pCaMV-2 та p70S-luc) (Фіг. 8). Таким чином, експресія протеїну Bvl2069, який містить 166 амінокислот, спричинює загибель клітин у цукрових буряках. Скорочення гена BvKWS3 135 спричиняє утворення самоактивувального R-протеїну, однак без мутагенезу домену МНР Механізм самоактивування за цим винаходом шляхом скорочення R-протеїну типу NBS-LRR до N-кінця, який не містить ні NBS, ні LRR, порівнювали зі способом самоактивування шляхом мутагенезу мотиву MHD. Мутагенез мотиву MHD Rxгена картоплі та гена G6 льону спричиняв самоактивування згаданих генів (Бендахман та ін. Bendahmane et al., 2002; Гоулз та ін. - Howies et al., 2005). Клон кДНК BvKWS3_135 кодує мотив МРВ, який відповідає мотиву MHD та часто виявляється в R-генах спільно з мотивом MHD (Гоулз та ін. Howies et al., 2005). Відповідну мутацію вводили у повномірний клон BvKWS3_135 способом, описаним Бендахманом та ін. (Bendahmane et al., 2002). Для цього амінокислоту аспарагін у мотиві VHD гена BvKWS3_135 замінювали на амінокислоту валін. Одержаний ген має позначення BvKWS3_135_D480V. Ефективність генів 135_#147, BvKWS3_135_D480V та немодифікованого гена BvKWS3_135 випробовували із застосуванням тимчасової надлишкової експресії у листі цукрових буряків під впливом Agrobacterium tumefaciens. Для цього клон кДНК BvKWS3_135 був комбінований із промотором d35S та вбудований у бінарний вектор pER-35Sluci. Одержаний вектор має позначення pER135-35Sluci. Аналогічні операції були проведені зі скороченим клоном кДНК 135_#147, нуклеотидна послідовність якого відповідає ПОСЛІДОВНОСТІ № 2, а також із мутагенізованим клоном кДНК BvKWS3_135_D480V. Одержані вектори мають позначення pER135_#147-35Sluci та pER135_D480V-35Sluci. Ці вектори трансформували у штамі Agrobacterium C58C1, як описано вище, та впорскували у листя цукрових буряків разом із позитивним контролем pER-35Sluci. На 1-й, 2-й та 3-й дні після інокуляції у трансформованому листі вимірювали активність гена-репортера люциферази Photinus pyralis. У листі цукрових буряків, трансформованому контрольним конструктом pER-35Sluci, виявлено у перший день незначну активність люциферази, а на другий та третій дні — активність відповідно 299000 та 433000 RLU/мг листової тканини. У листі, трансформованому конструктом pER13535Sluci, виявлено на другий та третій дні активність люциферази відповідно 190000 та 245000 RLU/мг листової тканини, тобто вимірний ступінь загибелі клітин у порівнянні з позитивним контролем pER-35Sluci. Активність гена-репортера конструкту pER135_D480V-35Sluci на другий та третій дні становила 188000 та 206000 RLU/мг (Фіг. 9). При цьому введення мутації MHD у ген BvKWS3_135 не спричиняло самоактивування або 91542 18 викликало лише слабке самоактивування, яке ледве піддавалося вимірюванню. Навпаки, скорочений за цим винаходом R-ген 135_#147 показав на другий та третій дні активність гена-репортера відповідно 90000 та 63000 RLU/мг (Фіг. 9) і, таким чином, значно сильніше спричинення загибелі клітин та самоактивування, ніж конструкта pER13535Sluci та pER135_D480V-35Sluci. Ідентифікування спільних амінокислотних мотивів у N-кінцях R-протеїнів BvKWS3 165, BvKWS3_ 135, Вv13033 та Bvl2069 та StR3a З метою ідентифікування спільних мотивів послідовностей було проведено зіставлення гомології N-кінців R-протеїнів BvKWS3_165, BvKWS3_135, Bvl3033 та Βν12069 (кількість амінокислот відповідно 175, 147, 159 та 166) із N-кінцем гена R3a картоплі (Хуан та ін. - Huang et al, 2005), що містить 155 амінокислот. Це зіставлення дозволило ідентифікувати кілька консенс-послідовностей в Nкінцях самоактивувальних R-протеїнів. Спільні мотиви у послідовностях виділено на Фіг. 10а як консенс-послідовність. Одна консенс-послідовність відповідає амінокислотній послідовності з ПОСЛІДОВНОСТІ № 13: AVLXDAEXKQXXXXXLXXWLXDLKDXYDXDDILDE. Інша консенс-послідовність відповідає амінокислотній послідовності з ПОСЛІДОВНОСТІ № 14: IXEIXXKLDDL. Літерою X тут позначено будь-яку амінокислоту. Обидві консенс-послідовності в описаній формі містяться тільки у таких N-кінцях R-протеїнів типу CC-MBS-LRR, експресія яких спричиняє самоактивування. Наприклад, СС-домен RX-гена, який включає 160 амінокислот, нездатний спричиняти загибель клітин або гіперчутливу реакцію (Бендахман та ін. - Bendahmane et al., 2002). Тимчасова експресія N-кінця (177 амінокислот) R-гена BvKWS3_133_e08 цукрового буряка та N-кінця (540 амінокислот) R1-гена картоплі (Балльвора та ін. - Ballvora et al., 2002) не спричиняє посилену загибель клітин у порівнянні з повномірним геном BvKWS3_133_e08 або взагалі не спричиняє загибелі клітин у випадку R1-гена (дані не наводяться). Зіставлення амінокислотних послідовностей Nкінців BvKWS3_165_#176, BvKWS3_135_#147, Bvl3033_#159, Bvl2069 та StR3a-#1-155 з амінокислотними послідовностями СС-доменів Rx-, StR1та BvKWS3_133_#177-протеїнів свідчить про відсутність описаних консенс-послідовностей у несамоактивувальних N-кінцях (Фіг. 10b). Зокрема, важливим допоміжним засобом для ідентифікування R-протеїнів, N-кінці яких є самоактивувальними, є мотив DAE у послідовностях. За допомогою мотиву DAE у консенс-послідовностях можна виявити у численних видах рослин R-гени, придатні для самоактивування, як показано на Фіг. Юс на прикладах Arabidopsis thaliana (AtAB028617), квасолі (PvulgarisJ71), рису (osativaAp003073), соєвих бобів (GmaxKR4) та томатів (Tomato-12). Важливість амінокислотної послідовності 147175 для самоактивування R-протеїну 165 #175 Для ідентифікування амінокислотних фрагментів у протеїні 165_#175, що мають важливе значення для самоактивування N-кінця MBS-LRR 19 протеїнів, кодувальну ділянку клону кДНК 165_#175 було скорочено. Клони кДНК 165_#93 та 165_#146 кодують відповідно амінокислоти 1-93 та 1-146 протешу 165_#175. Тимчасовий біолістичний тест конструктів p70S_165_#93, p70S_165_#146 та _p70S_165_#175 показав, що інтенсивну загибель клітин спричиняє тільки протеїн 165_#175, але не протеши 165_#93 та 165_#146 (Фіг. 11). Таким чином, істотне значення для самоактивування MBSLRR-протеїнів має фрагмент 146-175 послідовності. До цієї ділянки належить мотив, який зберігається у всіх досліджених протеїнах (Фіг. 10а). Швидке активування синтетичних індукованих патогенами промоторів 2xS-2xD та 2xW2-2xD під впливом ураження грибками Для індукованої патогенами надлишкової експресії повномірних або фрагментованих генів резистентності особливо придатні синтетичні промотори типів nxS-mxD, nxW2-mxD та nxGstl-mxD, де n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 та пг=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Як приклади, промотори типів 2xS-2xD з ПОСЛІДОВНОСТІ № 10, 2xW2-2xD з ПОСЛІДОВНОСТІ № 11, а також 2xGst1-2xD з ПОСЛІДОВНОСТІ № 12.комбінували з геном люциферази з Photinus pyralis, трансформували у цукрових буряках та досліджували таким чином реакцію на ураження грибками. Для трансформування рослин було застосовано бінарні вектори 2xS-2xD-luc-kan, 2xW2-2xDluc-kan та 2xGst1-2xD-luc-kan. Бінарні вектори були трансформовані у штамі Agrobacterium tumefaciens C58C1 із резидентною плазмідою pGV2260 за способом прямого трансформування ДНК (Ан - An, 1987). Селекцію рекомбінантних клонів A. tumefaciens виконано із застосуванням антибіотика канаміцину (50 мг/л). Трансформування цукрових буряків виконано за Ліндсеєм та ін. (Lindsey et al., 1991) із застосуванням антибіотика канаміцину. Трансгенність рослин випробувано із застосуванням PCR. Результатом застосування праймерів GTGGAGAGGCTATTCGGTA та CCACCATGATATTCGGCAAG була ампліфікація фрагмента ДНК розміром 553 bр з гена nptll. Досліди з PCR було виконано із застосуванням 10 нг геномної ДНК, концентрації праймерів 0,2 мкМ при температурі витримування 55°С у приладі Multicycler PTC-200 (виробник фірма MJ Research, Уотертаун, США). Для дослідження здатності промоторів до індукування під впливом патогенів трансгенні цукрові буряки в умовах in vitro інфікували збуджувачем плямистості листя (Cercospora beticola). У кожному досліді 4 рослини трансгенної лінії занурювали у суспензію фрагментів міцел С. beticola (400000 фрагментів/мл) та 4 рослини для контролю — у розведений овочевий сік. Потім інфіковані рослини та контрольні рослини інкубували у культивувальній шафі при 25°С в режимі 16 год освітлення. Через 1, 2, 3, 4 та 6-7 діб після інокуляції відбирали проби інфікованого та неінфікованого листя та визначали активність гена-репортера люциферази із застосуванням системи Luciferase Assay System (виробник фірма Promega, Маннгайм, Німеччина), як описано вище. 91542 20 Як промотор 2xS-2xD, так і 2xW2-2xD виявляли швидку та сильну здатність до індукування патогенами на ранній фазі інфікування, однак відрізнялися один від одного за базовою активністю та силою промотора (Фіг. 12-13). Промотор 2xS-2xD у трансгенних лініях PR39/11, PR39/48 та PR39/49 індукувався дуже швидко вже в перший день після інокуляції в 11-59 разів сильніше, а на другий день — у 21-380 разів сильніше у порівнянні з неінфікованими рослинами (Фіг. 12). У той час як у перший день ще спостерігалося проростання гіфів грибка в епідерміс, на другий день відбувалося проникнення стом у листя і, таким чином, проникнення у листову тканину. У пізній фазі інфекції (на сьомий день) при видимому розвитку некрозу визначено посилення індукування промотора у 113-792 рази. Базова активність промотора 2xS-2xD, виміряна як активність гена-репортера у неінфікованих рослинах, є дуже низькою і перевищує активність люциферази, виміряну в нетрансгенних рослинах, лише в 1-10 разів. Активування промотора 2xW2-2xD протікає дещо повільніше, ніж промотора 2xS-2xD. В перший день після інфікування промотор 2xW2-2xD виявляє лише 2-17-кратне індукування, а у другий день — 5-56-кратне індукування під впливом патогенів. При виникненні некрозів на 7-й день досягається максимальне індукування під впливом патогенів, кратність якого становить 318-672 рази (Фіг. 13). Базова активність промотора 2xW2-2xD, що відповідає 10-50-кратному підвищенню активності гена-репортера у порівнянні з нетрансгенними рослинами, вище, ніж у випадку промотора 2xS2xD. Однак промотор 2xW2-2xD явно відрізняється від промотора 2xS-2xD своєю приблизно 10-кратно підвищеною силою промотора. Оптимізація властивостей промотора шляхом зміни кількості цис-елементів Властивості синтетичних промоторів типів nxS-mxD, nxW2-mxD та nxGstl-mxD, де n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 та m=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, можна модулювати та оптимізувати шляхом варіювання кількості цис-елементів залежно від потреб експресії генів. Ця можливість показана на прикладі промотра типу nxS-mxD. Окрім бінарного вектора 2xS-2xD-luc-kan, були виготовлені бінарні вектори 4xS-2xD-luc-kan, 2xS-4xD-luc-kan та 4xS-4xD-luckan та трансформовані у цукрових буряках. Трансгенні рослини були інфіковані С beticola, як описано вище, і після інокуляції грибка щоденно виконувалися вимірювання активності гена-репортера. Були одержані результати вимірювань для 13 незалежних ліній 2xS-2xD-luc, 14 незалежних ліній 4xS-2xD-luc, 15 незалежних ліній 2xS-4xD-luc та 15 незалежних ліній 4xS-4xD-luc; зіставлялися середні значення сили промотора, індукування патогенами та базової активності. Зіставлення властивостей промотора 2xS-2xD із варіантами 2xS-4xD, 4xS-2xD та 4xS-4xD свідчить, що середня сила промотора підвищується при застосуванні тетрамерів у порівнянні з промотором, що складається з димерів (Фіг. 14). Крім того, здатність до індукування під впливом патогенів підвищується у всі моменти вимірювання при переході від димер-димерного промотора (2xS 21 91542 2xD) до тетрамер-димерного та димертетрамерного промоторів (4xS-2xD, 2xS-4xD) і далі до тетрамер-тетрамерного промотора (4xS-4xD) (Таблиця 1). Таблиця 1. Здатність промоторів 2xS-2xD, 4xS-2xD, 2xS-4xD та 4xS-4xD до індукування під Промотор (кількість трансформантів) 2xS-2xD (13 ліній) 4xS-2xD (14 ліній) незалежних Промотор (кількість незалежних трансформантів) 2xS-4xD (15 ліній) 4xS-4xD (15 ліній) впливом патогенів у трансгенних цукрових буряках після інфікування Cercospora beticola. Представлено середні значення здатності до індукування патогенами для 13-15 незалежних трансформантів (ліній) кожного конструкту промотора через 1-4 доби після інокуляції 1-й день 2-й день 3-й день 4-й день 1,9 3,1 3,6 4,8 27 52 59 135 1-й день 2-й день 3-й день 4-й день 1,4 2,9 9,2 9,8 54 90 87 93 Паралельно з підвищенням сили промотора та здатності до індукування під впливом патогенів підвищується базова активність промоторів, які містять тетрамери (Таблиця 2). Промотор (кількість незалежних трансформантів) 2xS-2xD (13 ліній) 4xS-2xD (14 ліній) 2xS-4xD (15 ліній) 4xS-4xD (15 ліній) 22 Таблиця 2. Базова активність промоторів 2xS2xD, 4xS-2xD, 2xS-4xD та 4xS-4xD у листі трансгенних цукрових буряків 1-й день 2-й день 3-й день 4-й день 4,7 14,2 24,6 35,5 5,5 21 13,3 20,3 5,2 7,8 7 6,3 2,6 11 22,3 20 Представлено середні значення базової активності для 13-15 незалежних трансформантів (ліній) кожного конструкту промотора, які вимірювалися у чотиридобовому досліді з інфікування як неінфіковані контрольні значення. Базова активність характеризує відношення активності генарепортера у трансгенних рослинах до неспецифічної фонової активності у нетрансгенних рослинах. Цей приклад свідчить, що важливі з точки зору цього винаходу властивості промоторів, наприклад, силу промотора, здатність до індукування під впливом патогенів та базову активність, можна регулювати шляхом зміни кількості цис-елементів та що для кожного конкретного технічного завдання можна створити оптимальні варіанти промоторів. Оптимальна кількість цис-елементів у промоторах, здатних до індукування патогенами, в даному прикладі з точки зору здатності до індукування патогенами перевищує кількість, описану Раштоном та ін. (Rushton et al., 2002) для димерних варіантів. Одержання резистентних до грибків цукрових буряків шляхом трансформації генів резистентності, що індукуються патогенами Для підвищення резистентності цукрових буряків до грибків промотори 2xS-2xD або 2xW2-2xD комбінували з одним із чотирьох R-генів BvKWS3_123, BvKWS3_133, BvKWS3_135 та BvKWS3_165 та трансформували у цукрових буряках. Для цього бінарні вектори 2xS-2xD-luc-kan та 2xW2-2xD-luc-kan розміром відповідно 13959 та 13969 kb фрагментували за допомогою Sad та місце фрагментації доповнювали Т4-ДНКполімеразою. Потім ці вектори фрагментували Xhol, виділяли способом гель-електрофорезу, і вектори розміром відповідно 12284 та 12294 kb відділяли від гена люциферази розміром 1675 kb та ізолювали. Ізоляцію гена ZR резистентності виконували, виходячи з векторів p70S-BvKWS3_123, p70SBvKWS3_133, p70S-BvKWS3_135 та p70SBvKWS3_l65. Для цього вектори спочатку лінеаризували за допомогою NotI та місця фрагментації доповнювали шляхом обробки за Кленовим (Klenow). Потім вектори фрагментували Xhol та ізолювали R-гени. Одержані вектори мають позначення 2xS-2xD-BvKWS3_123, 2xS-2xDBvKWS3_133, 2xS-2xD-BvKWS3_135 та 2xS-2xDBvKWS3_165, або відповідно 2xW2-2xDBvKWS3_123, 2xW2-2xD-BvKWS3_133, 2xW2-2xDBvKWS3_135 та 2xW2-2xD-BvKWS3_165 (Фіг. 1518). Ці бінарні вектори застосовували для одержання трансгенних цукрових буряків, як описано вище. Ідентифікування резистентних до грибків цукрових буряків шляхом випробування резистентності із застосуванням шкідливого грибка Cercospora beticola Підвищену резистентність рослин до грибків спостерігали при випробуваннях резистентності, описаних нижче на прикладі випробування резистентності цукрових буряків до грибків Cercospora beticola. Для інфікування цукрових буряків збудником плямистості листя С beticola у теплиці вирощували, окрім трансгенних рослин, цукрові буряки генотипу 3DC4156, який застосовували для трансформування. За 2 тижні до запланованого терміну інокуляції на планшети з овочевим соком (40% 23 овочевий сік за Албані) висіювали агресивний ізолят С. beticola Ahlburg та інкубували при 25°С. Безпосередньо перед інокуляцією агар із пророщеними грибками зчищали за допомогою предметного скла та деякої кількості води. Концентрацію фрагментів міцел та грибкових спор визначали за допомогою лічильної камери. Доводили густину інокуляту до концентрації 20000 фрагментів/мл шляхом розведення водою. Для інфікування рослини (вік 10-12 тижнів) повністю занурювали у заповнену інокулятом склянку міскістю 5 л. Інокулювали по 30 рослин для кожної досліджуваної лінії та висаджували їх у теплицю, розподіляючи випадковим способом. Після інокуляції рослини інкубували у теплиці протягом 4 діб при 28°С та відносній вологості по 91542 24 вітря 95%. По збіганні четвертої доби вологість повітря знижували до 60-70%. Через 2 тижні, 3 тижні та 4 тижні після інокуляції визначали ступінь ураження листя оптичним способом, застосовуючи 9-бальну схему оцінювання посівного матеріалу за Кляйнванцлебеном (Kleinwanzleben) (KWS) (1=здорове листя; 9=100% зруйноване листя). Трансгенні лінії, трансформовані одним із конструктів 2xS-2xD-BvKWS3_123, 2xS-2xD-BvKWS3_133, 2xS-2xD-BvKWS3_165, 2xW2-2xD-BvKWS3_123, 2xW2-2xD-BvKWS3_133, 2xW2-2xD-BvKWS3_135 або 2xW2-2xD-BvKWS3_165, показали підвищену резистентність до грибка у порівнянні з контролем (Таблиця 3). Таблиця 3 Підвищення резистентності трансгенних цукрових буряків до шкідливого грибка Cercospora beticola Контроль (не трансгенний Трансгенні лінії Конструкт 1 2 1 2 Т3 AUDPC Лінія Т3 AUDPC 6,0 220 PR68-6 4,6 169 2xS-2xD-BvKWS3_133 6,8 193 PR74-73 6,1 157 2xS-2xD-BvKWS3_123 4,1 167 PR75-8 2,8 132 2xS-2xD-BvKWS3_165 6,0 220 PR69-15 5,3 177 2xW2-2xD-BvKWS3_133 7,0 226 PR70-32 5,5 182 2xW2-2xD-BvKWS3_123 6,8 193 PR77-42 5,6 155 2xW2-2xD-BvKWS3_135 6,8 229 PR71-41 5,6 182 2xW2-2xD-BvKWS3_165 *Третя та остання оцінка ступеня резистентності (1=здорове листя; 9=100% ураження поверхні листя). 2 Значення AUDPC (площа під кривою розвитку захворювання), визначене по трьох термінах оцінювання (Т1-Т3). Значення AUDPC характеризує перебіг ступеня ураження на протязі кількох термінів оцінювання одним числом Аналіз часового перебігу розвитку ураження трансформантів PR68-6 та PR70-32 протягом трьох термінів оцінювання свідчить, що при збільшенні тривалості досліду різниця у розвитку ураження між контролем та трансгенною лінією збільшується (Фіг. 19 та Фіг. 20). Ці результати свідчать, що індукована експресія різних R-генів цукрового буряка за допомогою патогенспецифічних промоторів викликає підвищення резистентності до грибків. Одержання резистентних до грибків цукрових буряків шляхом трансформації N-кішіевих ділянок R-генів під контролем патоген-реактивних промоторів. Для одержання резистентних до грибків рослин із застосуванням N-кінцевих фрагментів Rгенів скорочені R-гени 13033_#159, 135_#147, 165_#175 та Bvl2069 комбінували з промоторами 2xS-2xD та 2xW2-2xD та трансформували у цукрових буряках. Для цього бінарні вектори 2xS-2xD-luc-kan та 2xW2-2xD-luc-kan розміром відповідно 13959 та 13969 kb фрагментували за допомогою Sad та місце фрагментації доповнювали Т4-ДНКполімеразою. Потім ці вектори фрагментували Xhol, виділяли способом гель-електрофорезу, і вектори розміром відповідно 12284 та 12294 kb відділяли від гена люциферази розміром 1675 kb та ізолювали. Ізоляцію скорочених R-генів виконували, виходячи з векторів p70S-12069, p70S-13033_#159, p70S-135_#147 та p70S-165_#175. Для цього вектори спочатку лінеаризували за допомогою ХbаІ, ДНК-кінці доповнювали шляхом обробки за Кленовим (Klenow), після чого вектори фрагментували Xhol. Ізольовані фрагменти R-генів клонували у підготовлених бінарних векторах. Одержані вектори мають позначення 2xS-2xD-12069, 2xS-2xD13033_#159, 2xS-2xD-135_#147, 2xS-2xD-165_#175 або відповідно 2xW2-2xD-12069, 2xW2-2xD13033_#159, 2xW2-2xD-135_#147, 2xW2-2xDl65_#175 (Фіг. 21-22). Ці бінарні вектори застосовували для одержання трансгенних цукрових буряків, як описано вище, і резистентні до грибків рослини ідентифікували за допомогою випробування резистентності із застосуванням Cercospora beticola. ПОСИЛАННЯ Altschul S.F. et al., (1990). Basic Local Alignment search tool, J. Мої. Biol. 215: 403-410. An G., (1987). Binary Ті vectors for plant transformation and promoter analysis. Methods Enzymol. 153, 292-305. Bairoch et al., (1996) The PROSITE database, its status in 1995. Nucleic Acids Res. 24:189-96. Ballavora Α., Ercolana M.R., Weiss J., Meksem K., Bormann C.A.I., Oberhagemann P., -Salamini R, Gebhardt C, (2002). The Rl gene for potato 25 resistance to late blight (Phytophthora infestans) belongs to the leucine zipper/NBS/LRR class of plant resistance genes. Plant J. 30(3): 361-371. Bendahmane Α., Farnham G., Moffett P. and Baulcombe D.C., (2002). Constitutive gain-of-function mutants in a nucleotide binding site-leucine rich repeat protein encoded at the Rx locus of potato. Plant J. Oct;32(2): 195-204. Frost D., Way H., Howies P., LuckJ., Manners J., HardhamA., FinneganJ., and Ellis J., (2004). Tobacco transgenic for the flax rust resistance gene L expresses allele-speciflc activation of defense responses. Мої. Plant Microbe Interact. 17(2): 224232. HennigJ., DeweyR.E., Cutt J.R. and Klessig D.F., (1993). Pathogen, salicylic acid and developmental dependent expression of a beta-l,3-glucanase/GUS gene fusion in transgenic tobacco plants. Plant J. 4(3): 481-493. Howies P., Lawrence G., Finnegan J., McFadden H., Ayliffe M., Dodds D. and Ellis J., (2005). Autoactive Alleles of the Flax L6 Rust Resistance Gene Induce Non-Race-Specific Rust Resistance Associated with the Hypersensitive Response. Мої. Plant Microbe Interact. 18(6): 570-582. Huang S., an der Vossen E.A., Kuang H., Vlesshouwers V.G., Zhang N., BormTJ., vanEckHJ., Baker В., Jacobsen Ε., and Visser R.G., (2005). Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato. Plant J. 42(2): 251-261. Lindsey K,. Gallois P. and Eady C, (1991). Regeneration and transformation of sugar beet by Agrobacterium tumefaciens. Plant Tissue Culture Manual B7:l-13; Kluwer Academic Publishers. Lupas Α., Van Dyke M. and Stock J., (1991). Predicting coiled coils from protein sequences. Science 252: 1162-1164. Martin G.B., Bogdanove A.J. and Sessa G., (2003). Understanding the functions of plant disease resistance proteins. Annu. Rev. Plant Biol. 54: 23-61. 91542 26 Martini N., Egen M., Riintz I. and Strittmatter G., (1993). Promoter sequences of a potato pathogenesis-related gene mediate transcriptional activation selectively upon fungal infection. Мої. Gen. Genet. 236: 179-186. Oldroyd G.E.D. and Staskawicz B.J., (1998). Genetically engineered broad-spectrum disease resistance in tomato. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95(17): 10300-10305. Rushton P.J., Reinstadler Ά., LipkaV., Lippok В., Somssich I.E., (2002). Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen-and wound-induced signaling. Plant Cell 14(4): 749-762. Samac D.A. and Shah D.M., (1991). Developmental and Pathogen-Induced Activation of the Arabidopsis Acidic Chitinase Promoter. Plant Cell. 3(10): 1063-1072. Schmidt K., Heberle В., Kurrasch J., Nehls R., and Stahl D.J., (2004). Suppression of phenylalanine ammonia lyase expression in sugar beet by the fungal pathogen Cercospora beticola is mediated at the core promoter of the gene. Plant Мої. Biol., 55: 835-852. Sonnhammer E.L, Eddy S.R. and Durbin R.D. (1997) Pfam: A comprehensive database of protein domain families based on seed alignments. Proteins 28: 405-420. TangX., XieM., KimYJ., ZhouJ., Klessig D.F., Martin G.В., (1999). Overexpression of Pto activates defense responses and confers broad resistance. Plant Cell 11(1): 15-29. TianY., FanL, Thurau Т., Jung С. and Cai D., (2004). The absence of TIR-type resistance gene analogues in the sugar beet (Beta vulgaris L.) genome. J. Мої. Evol. 58(1): 40-53. Traut T.W., (1994). The functions and consensus motifs of nine types of peptide segments that form different types of nucleotide binding sites. Eur. J. Biochem. 222: 9-19. 27 91542 28 29 91542 30 31 91542 32 33 91542 34 35 91542 36 37 91542 38 39 91542 40 41 91542 42 43 91542 44 45 91542 46 47 91542 48 49 Комп’ютерна верстка І.Скворцова 91542 Підписне 50 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601